Document Type : Research Paper
Authors
1 M.Sc. of Genetics & Plant Breeding, Imam Khomeini International University, Qazvin, Iran.
2 Assistant professor, Department of Horticulture, Imam Khomeini International University, Qazvin, Iran.
Abstract
Keywords
جداسازی ملکولی cDNA کدکننده N-methylstylopine hydroxylase از مامیران کبیر (Chelidonium majus L.) و افزایش بیان آن در پاسخ به محرک غیرزیستی شوری
زهرا سلیمانی1، صدیقه فابریکی اورنگ*2، سودابه مفاخری3
1 دانشآموخته کارشناسی ارشد ژنتیک و بهنژادی گیاهی، دانشگاه بینالمللی امام خمینی(ره)، قزوین، ایران.
2 استادیار، گروه ژنتیک و بهنژادی گیاهی، دانشگاه بینالمللی امام خمینی(ره)، قزوین، ایران.
3 استادیار، گروه باغبانی، دانشگاه بینالمللی امام خمینی(ره)، قزوین، ایران.
تاریخ دریافت: 03/04/1397، تاریخ پذیرش: 30/04/1397
چکیده
مامیران کبیر (Chelidonium majus L.) حاوی ترکیبات آلکالوئیدی مهم از جمله سنگوئینارین است. سنگوئینارین یک آلکالوئید فعال دارای خواص دارویی بالقوه ضدمیکروبی، ضدالتهابی و ضدتوموری میباشد که بهطور گسترده در گیاهان خانواده خشخاش وجود دارد. در این تحقیق جداسازی و تعیین توالی cDNA کد کننده آنزیم (s)-cis-N-methylstylopine 14-hydroxylas (MSH) در مامیرانکبیر بهعنوان یکی از آنزیم‌های کلیدی مسیر تولید سنگوئینارین انجام شد. سپس تغییرات بیان ژن cmMSH در سه اندام ریشه، برگ و ساقه در چهار سطح شوری (صفر، 25، 50 و100 میلیمولار) بهصورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی بررسی شد. در پژوهش حاضر cDNA کد کننده آنزیم cmMSH از بافت ریشه جداسازی، با موفقیت در ناقل پلاسمیدیPTG19-T درج و سپس در باکتری E .coli همسانهسازی شد. پس از تأیید همسانههای نوترکیب با روش PCR، پلاسمید باکتریهای نوترکیب استخراج و قطعه ژنی توالییابی شد. قطعه توالییابی شده دارای 784 نوکلئوتید با یک چارچوب قرائت باز 261 اسیدآمینهای بود و مشخص گردید پروتئین حاصل با داشتن دامینهای کارکردی helix K region، heme-binding region و aromatic region متعلق به خانواده پروتئینی Cytochrome-P450 میباشد. در درخت فیلوژنی، توالی پروتئینی ژن cmMSH جداسازی شده بیشترین شباهت را با آنزیم methylstylopine 14-hydroxylase گیاه خشخاش داشته است. مقایسه میانگین بیان نسبی ژن نشان داد که شوری50 میلیمولار بیشترین تأثیر را بر افزایش بیان ژن cmMSH در بافت ریشه دارد. همچنین بررسی الگوی تغییرات بیان ژن نشان داد که با افزایش سطح شوری تا 50 میلیمولار، بیان ژن cmMSH در دو اندام برگ و ریشه زیاد شده و با افزایش شدت شوری به 100 میلیمولار میزان بیان ژن بهمقدار 35 درصد در هر دو اندام کاهش یافت.
واژههای کلیدی: آنزیمcmMSH ، بنزیلایزوکوئینولینها، سنگوئینارین، شوری، مامیران.
مقدمه
متابولیتهای ثانویه گیاهی منابع بینظیری برای داروها، افزودنیهای غذایی و ترکیات مهم صنعتی هستند که در مسیرهای بیوشیمیایی مختلفی سنتز میشوند. افزایش کاربرد گیاهان دارویی و ترکیبات آنها و نیز مقادیر پایین متابولیتهای ثانویه (کمتر از یک درصد وزن خشک) در این گیاهان، اهمیت توجه به افزایش کمیت و کیفیت این ترکیبات را موجب میگردد ((Alamgir, 2017; Singh & Dwivedi, 2018. مامیران یا "مامیرانکبیر" گیاهی دارویی با نام علمی Chelidonium majus L. از خانواده خشخاش (Papaveraceae) است که گاه گیاه پرستو نیز نامیده میشود. تمامی قسمتهای این گیاه و نیز شیرابه آن مصرف دارویی دارند و حاوی آلکالوئیدهای مختلفی مانند سنگوئینارین[1]، کلیدونین[2]و کلریترین[3] میباشد (Meng et al., 2009). مامیران در استانهای شمالی ایران یعنی گیلان، گرگان و مازندران رشد می‌کند (Ghanavi et al., 2015). آلکالوئیدهای گروه بنزیل ایزوکوئینولین[4] (BIAs) متشکل از 2500 ترکیب نیتروژندار هستند که در گیاهانی از قبیل خانواده خشخاش یافت میشوند. بسیاری از این آلکالوئیدها دارای خاصیت دارویی مانند مرفین و کدئین (مسکن و ضد درد)، نوسکاپین (ضد سرفه و ضدسرطان)، سنگوئینارین و بربرین (ضد میکروب) و پاپاورین (گشادکنندهی عروق) میباشند (Farrow et al., 2012). بیوسنتز آلکالوئیدهای BIA با tyrosine آغاز میشود و با انجام چند واکنش آنزیمی به (S)-reticuline تبدیل میشود. این ترکیب توسط آنزیم BBE[5] به (S)-scoulerine تبدیل میشود که این ماده به نوبه خود در یک مسیر متشکل از چند واکنش آنزیمی به سنگوئینارین تبدیل میشود (شکل 1). یکی از آنزیم‌های کلیدی این مسیر (S)-cis-N-methyl stylopine 14-hydroxylase (MSH) میباشد که (S)-cis-N-methylstylopine را به Protopine تبدیل می‌کند (Beaudoin & Facchini, 2013). متابولیتهای ثانویه، مواد آلی با ساختار شیمیایی پیچیدهای هستند که گیاهان در طول حیات خود تولید مینمایند؛ ولی در رشد و نمو و فعالیتهای حیاتی گیاهان نقش ندارند و عمدتاً بهمنظور دفع آفات، جذب حشرات گرده افشان و مبارزه با بیماریهای میکروبی تولید میشوند (.(Kumar & Gupta, 2008 برخی از این ترکیبات مانند ترکیبات با اثرات ضد سرطانی از ارزش اقتصادی بالایی برخوردارند و قیمت آنها از چند دلار تا چند هزار دلار به ازای هر کیلو تغییر می‌کند. تولید انبوه و سریع این مواد پیچیده در مقیاس زیاد از طریق روشهای شیمیایی عمدتاً مشکل و یا غیر ممکن میباشد و از سویی محدودیتهای مختلف مانع تأمین این مواد از طبیعت است (Bourgaud et al., 2001; Kheradmand et al., 2017; Rao & Ravishankar, 2002; Mulabagal & Tsay, 2004). هر چند امروزه نقش دفاعی متابولیتهای ثانویه برای همه تقریباً پذیرفته شده است اما هنوز بررسی سازوکار تاثیر تنشهای محیطی بر تولید این مواد تصویر پیچیده و پر ابهامی پیش روی ما میگذارد، شواهد زیادی نشان میدهند که در شرایط تنش، تولید برخی از این ترکیبها تا چندین برابر افزایش مییابد، اما دلایل زیادی نیز وجود دارد که این تاثیر همیشگی نیست (Tripathi & Tripathi, 2003). مطالعات در زمینه گیاهان دارویی بیشتر بر شناسایی مسیر بیوسنتزی و ژنهای داخلی، بهمنظور یافتن راهکارهای مناسب برای تولید بیشتر با هزینه کمتر متمرکز میباشد (Mehrabani et al., 2013). از یکسو، روشنسازی مسیرهای بیوسنتزی و تعیین توالی ژنها و مشخصکردن نقش متابولیتهای ثانویه در یک اکوسیستم میتواند افق جدیدی را در زمینه توسعه کشاورزی پایدار ایجاد کند و از سویی دیگر، با توجه به اهمیت اقتصادی ترکیبات آلکالوئیدی، دستورزی متابولیسم آلکالوئیدهای گیاهی توجه زیادی را در بیوتکنولوژی گیاهی به خود معطوف داشته است. بنابراین، با توجه به اهمیت آلکالوئیدها، در این تحقیق اقدام به شناسایی و جداسازی ژن کد کننده آنزیم (s)-cis-N-methyl stylopine 14-hydroxylas (MSH) از گیاه مامیرانکبیر شد و در قدم بعدی میزان بیان ژن مذکور در اندامهای مختلف این گیاه تحت تاثیر محرک غیرزیستی تنش شوری مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
بهمنظور شناسایی و جداسازی cDNA کدکننده آنزیم MSH نیاز به طراحی آغازگر بود که برای این منظور از کتابخانههای EST گیاه مامیران استفاده شد. اطلاعات این کتابخانهها و توالیهای EST آنها از پایگاه اطلاعاتی [6]NCBI بهدست آمد. بهمنظور پیدا کردن توالیهای EST که با ژن cmMSH مرتبط بودند از Blastn استفاده شد. از این‌رو با استفاده از توالی ژنهای MSH ،P6H،CYP82X1،CYP82X2، CYP82Y1 گیاه خشخاش (Papave somniferum) EST هایی که با توالی مورد نظر ما شباهت بالایی داشتند را انتخاب و با نرمافزار EGassembler[7] همگذاری انجام شد. چارچوب قرائت باز توالی توافقی بهدست آمده با برنامه ORF finder[8] بهدست آمد. بهمنظور جداسازی cDNA کد کننده آنزیم MSH از گیاه مامیران، برای توالی توافقی بهدست آمده آغازگرهای اختصاصی طراحی و پس از بررسی خصوصیات آغازگرها با استفاده از برنامه Oligo analyzer[9] سنتز آنها توسط شرکت Bioneer (کره جنوبی) انجام شد (جدول 1). برای تهیه نمونه گیاهی بهمنظور جداسازی ژن مورد نظر و نیز بررسی بیان آن در اندامهای مختلف؛ بذر گیاه مامیران کبیر تهیه شده از موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور در گلخانه کاشته شدند. برای بررسی اثرات تنش شوری بر میزان بیان ژن cmMSH در گیاه مامیران، آزمایشی فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار سطح شوری (غلظتهای صفر، 25، 50، 100 میلیمولار) در سه تکرار اجرا گردید. پس از چهار هفته از رشد گیاهان، تنشها در سه زمان متوالی بهمدت 14 روز اعمال شد و پس از اعمال آخرین تنش نمونه برداری از اندامهای ریشه، ساقه و برگ انجام گرفت.
جدول 1- توالی جفت آغازگرهای مورد استفاده بهمنظور جداسازی و بررسی بیان ژن cmMSH در گیاه مامیران کبیر.
Table 1- The sequences of primers used for Isolation and cmMSH gene expression in Chelidonium majus L.
|
ژن هدف Target gene |
طول قطعه تکثیری (bp) Product size |
دمای اتصال (C˚) Annealing temperature |
توالی آغازگر(3′→5′) Primer sequence |
نام آغازگر Primer name |
|
cmMSH |
784 |
57 |
TGTACCCAGCAGGACCATTG |
MSH-F |
|
TACACGCTCCCATCTCGTTG |
MSH-R |
|||
|
cmMSH |
128 |
58 |
TTGAGAGGTTTGGTTGGAGG |
qMSH-F |
|
GGCTAATTAGTCCTGCACTTTC |
qMSH-R |
|||
|
ef-alpha |
111 |
58 |
AGATGATTCCAACCAAGCCCA |
Elf-F |
|
CCTTGATGACACCAACAGCAACT |
Elf-R |
استخراج RNA از بافتهای ریشه، ساقه و برگ با استفاده از بافر استخراج RNA (RNX- Plus Solution, Sinaclon,) طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. ساخت cDNA با استفاده از آنزیم رونوشتبردار معکوس (Thermofisher scientific, EPO441) و آغازگر الیگو T 18(dT) (Vivantis) انجام شد. پس از یافتن بهترین دمای اتصال جفت آغازگرها، واکنش زنجیرهای پلیمراز برای جداسازی cDNA آنزیم cmMSH از گیاه مامیران با استفاده از مخلوط واکنش PCR (Amplicon) انجام شد. در ادامه پس از خالصسازی، قطعات DNA از ژل آگارز با استفاده از کیت خالصسازی ExpinTM Combo GP (GeneAll) انجام گرفت و قطعه تخلیص شده در پلاسمید pTG19 (Vivantis) درج و با روش شوک حرارتی در سلولهای مستعد شدهE. coli سویه DH5α (با روش کلرید کلسیم) (Sambrook & Russel, 2001) همسانهسازی گردید. بهمنظور غربال اولیه باکتریهای نوترکیب از محیط انتخابگر حاوی آنتیبیوتیک آمپیسیلین استفاده شد و برای اطمینان از حضور قطعه مورد نظر در پلاسمید،PCR با آغازگرهای اختصاصی انجام شد و توالییابی با آغازگرهای عمومی M13 و T7 توسط شرکت Bioneer انجام گرفت. بررسی نتایج حاصل از توالییابی قطعه مورد نظر، توسط نرمافزار CLC main workbench (V5.5) انجام گرفت. با استفاده از این نرمافزار، توالیهای اضافی که شامل توالی ناقل بودند از توالی حذف گردید و توالی نوکلئوتیدی بدست آمده برای بررسیهای بیشتر مورد استفاده قرار گرفت و در پایگاه اطلاعاتی NCBI ثبت گردید. مطالعه و مقایسه میزان بیان ژن cmMSH در اندامهای مختلف (ریشه، ساقه و برگ) و تیمارهای مختلف شوری (صفر، 25، 50 و100 میلیمول بر لیتر) با Real Time-PCR و آغازگرهای اختصاصی و نیز با استفاده از ژن Elangation factor بهعنوان ژن مرجع انجام گرفت.
نتایج و بحث
بیوسنتز متابولیت مهمی نظیر سنگوئینارین در مامیران کبیر در مسیری متشکل از هفت مرحله آنزیمی از (S)-reticulin انجام می‌گیرد (شکل 1). آنزیم N-methylstylopine hydroxylase (MSH) در این مسیر تبدیل (S)-stylopine به پروتوپین را انجام می‌دهد. با توجه به اینکه اطلاعاتی از cDNA کدکننده این آنزیم در مامیران کبیر وجود نداشت؛ در این راستا اقدام به جداسازی آن گردید. لازم به ذکر است که نتایج مطالعات مختلف در گیاهان هم‌خانواده حاکی از این مطلب بود که تجمع رونوشتهای این ژن در ریشه بیش از سایر اندام‌هاست (Facchini et al., 2013)؛ بنابراین در پژوهش حاضر جداسازی cDNA کد کننده cmMSH از بافت ریشه انجام شد (شکل 2-الف). پس از تأیید همسانههای نوترکیب با روش PCR (شکل 2-ب)، نتایج توالییابی نشان داد که قطعه مورد نظر دارای 784 نوکلئوتید با یک چارچوب قرائت باز 261 اسیدآمینهای میباشد که با شماره دسترسی KX646397 در پایگاه داده NCBI ثبت گردید. توالی پروتئینی حاصل دارای دامین اصلی p450 بود که نشان می‌دهد پروتئین مورد مطالعه به خانواده پروتئینی Cytochrome-P450 تعلق دارد. لازم به ذکر است که از ویژگیهای خانواده پروتئینی P450 دامینهای helix K region، heme-binding region و aromatic region میباشد که در یوکاریوتها حفاظت شده میباشد (Takemura et al., 2013). دامینهای ذکر شده در توالی اسیدآمینهای جداسازی شده در این مطالعه نیز در انتهای کربوکسیل یافت شد. توالی MSH جداسازی شده از مامیرانکبیر (cmMSH) با پروتئینهای P450 دیگر؛ بهویژه آن دسته از پروتئینها که در بیوسنتز آلکالوئیدهای ایزوکوئینولین نقش دارند (EcCYP82N2V2, PsCYP719B1, PsCYP82N4, EcCYP80B1V2, PsCYP719A25, EcCYP719A5) مقایسه شدند (شکل 3) (Gesell et al., 2009; Ikezawa et al., 2007; Takemura et al., 2013; Beaudoin and Facchini, 2013).
شکل 1- مسیر بیوسنتزی سنگوئینارین که در این مسیر S-رتیکولین طی هفت مرحله آنزیمی به ماده نهایی سنگوئینارین تبدیل میشود (برگرفته از Beaudoin & Facchini, 2013).
Figure 1- Sanguinarine biosynthesis pathway which in this pathway S-reticulin is converted to the sanguinarine in seven enzyme phases (derived from Beaudoin & Facchini, 2013).
شکل 2– الف) قطعه تکثیر شده cmMSH (چاهک 1) از روی cDNA ریشه مامیران کبیر و ب) نتیجه روش PCRبا همسانههای رشد کرده روی محیط گزینشگر (Clony PCR) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی (M- نشانگر اندازه ملکولی (Vivantis, 1kb)، چاهک 1 الی 3- همسانههای دارای ناقل نوترکیب، 4- کنترل مثبت (cDNA ریشه به عنوان الگو).
Figure 2- (a) the amplified segment of cmMSH (well 1) from the root cDNA of greater celandine; b) the result of PCR test with selection cultures grown colons using specific primers (M: ladder, wells 1- 3: clones with recombinant vector, well 4: positive control (root cDNA as template).
از ویژگیهای خانواده پروتئینی CYP82 دنباله آمینواسیدی Gly/Ala در ناحیه helix I میباشد. از سویدیگر دنباله Thr در این ناحیه در پروتئینهای منواکسیژناز P450 حفاظت شده است (شکل 3)؛ بنابراین وجود این دنبالههای آمینواسیدی حفاظت شده در helix I بیانگر این است که پروتئین موردنظر بهعنوان یک آنزیم از نوع منواکسیژناز فعالیت دارد (Takemura et al., 2013). در درخت فیلوژنی ترسیم شده (شکل 4)، cmMSH از خانوادههای پروتئینی CYP80 و CYP719 تفکیک شد. بهطوریکه در بین پروتئینهای P450، پروتئین cmMSH بیشترین شباهت را با PsCYP82N4 (77 درصد یکسانی) سپس با PsCYP82Y1 (59 درصد یکسانی) و PsCYP82X2 (57 درصد یکسانی) داشت. در بین پروتئینهایی که در بیوسنتز آلکالوئیدهای ایزوکوئینولین نقش دارند، cmMSH بیشترین شباهت را با آنزیم methylstylopine 14-hydroxylase گیاه خشخاش داشت (شکل 4).
نتایج حاصل از دادههای qRT-PCR بهمنظور بررسی تأثیر تنش شوری بر بیان ژن cmMSH در اندامهای مختلف (ریشه، ساقه و برگ) گیاه مامیران، بیانگر تنوع بیان ژن مذکور در سطوح مختلف تنش و نیز در اندامهای مختلف بود. براساس نتایج تجزیه واریانس (جدول 2)، میزان تغییرات بیان ژن cmMSH در سطوح مختلف شوری صفر (شاهد)، 25، 50 و 100 میلیمولار اختلاف معنیداری را در سطح احتمال یک درصد (P≤0.01) نشان داد که این امر نشان از تأیید تأثیرگذاری تنش شوری بر بیان ژن مذکور بود. مقایسه میانگین بیان ژن در غلظتهای مختلف شوری نشان داد که شوری50 میلیمولار بیشترین تاثیر را بر بیان ژن cmMSH دارد و کمترین میزان بیان ژن مربوط به شرایط بدون تنش (شاهد) بود. با بررسی روند تغییرات بیان مشخص گردید که با افزایش میزان شوری تا 50 میلیمولار (شوری ملایم) بیان ژن cmMSH افزایش یافته و پس از آن با افزایش شدت شوری از میزان بیان ژن کاسته شده است.
شکل 3- همردیفی توالی آمینواسیدی cmMSH جداسازی شده و تعدادی از پروتئینهای خانواده P450. (نواحی مشخص شده با کادر قرمز نشان دهنده دامینهای حفاظت شده پروتئینهای P450 یوکاریوتی است. ناحیه زیرخطدار مربوط به توالی توافقی helix I است و علامت *: مربوط به دنباله Gly/Ala و Thr حفاظت شده است).
Figure 3- Alignments for amino acid sequence of cmMSH and related P450 proteins family. (Red boxes indicate the conserved domains of eukaryotic P450 proteins, Underlined indicates Helix I consensus sequence and * sign indicates conserved Gly/Ala and Thr residue).
شکل 4- روابط فیلوژنتیک براساس توالیهای پروتئینی اعضای خانواده سیتوکروم P450 با الگوریتم Neighbor Joining (NJ).
Figure 4- Phylogenetic relationships based on protein sequences of the cytochrome P450 family with Neighbor Joining (NJ) algorithm.
بررسی میزان بیان ژن cmMSH در اندامهای مختلف گیاه مامیران (ریشه، ساقه و برگ)، بیانگر تفاوت اثر اندام در میزان بیان بود (جدول 2). بهطوریکه بیشترین میزان بیان ژن مذکور در ریشه (6/1 برابر برگ و 5/2 برابر ساقه) و کمترین میزان بیان ژن در ساقه مشاهده گردید (شکل 5). در توافق با نتایج حاصل از این تحقیق، در گیاه خشخاش نیز بالابودن فراوانی نسبی رونوشتهای ژن cmMSH در ریشه و بهدنبال آن تجمع سنگوئینارین در ریشههای این گیاه گزارش شده است بهطوریکه رونوشتهای این ژن در تمام اندامها وجود دارد ولی در ریشه تجمع بیشتری داشته است (Beaudoin & Facchini, 2013) که با نتایج این تحقیق همراستا میباشد. بر اساس نتایج مشاهده شده فراوانی رونوشتهای cmMSH در تمام اندامها در تنش شوری ضعیف افزایش یافت تا اینکه به بالاترین میزان خود در تنش ملایم (50 میلیمولار) در بافت ریشه رسید و سپس با افزایش شدت تنش کاهش یافت که این نتایج با افزایش فراوانی رونوشتهای ژن MSH در اندامهای مختلف گیاه خشخاش تحت تأثیر محرک قارچی Botrytis cinerea مطابقت دارد (Beaudoin & Facchini, 2013).
شکل 5- مقایسه بیان نسبی ژن cmMSH در اندامهای مختلف (ریشه، ساقه و برگ) گیاه مامیران.
Figure 5- Comparison of the mean relative expression of cmMSH gene in various organs (root, stem and leaf) of greater celandine.
با توجه به گزارش‌های تجمع حداکثری سنگوئینارین در ریشه مامیران کبیر (Holkova et al., 2010; Samanani et al., 2004)، سطح بالای رونوشت ژنهای کنترل کننده این مسیر ازجمله cmMSH در ریشه آن قابل انتظار بود. البته رونوشتهای این ژن در اندام ساقه که سنگوئینارین قابل تشخیصی در آن تجمع نمییابد نیز وجود دارد. در واقع بهنظر میرسد محل سنتز سنگوئینارین منحصر به ریشه که در آن تجمع مییابد نباشد و ممکن است در ساقه نیز سنتز شود. در تأیید این موضوع میتوان به سنتز مرفین در ساقه اشاره کرد، که با وجود اینکه مرفین فقط در اندام هوایی در درون کپسول تجمع مییابد (Facchini & De Luka, 1995)، اما آنزیم سالوتاردینول سینتتاز که در بیوسنتز مرفین نقش دارد بهطور گسترده در ریشه و ساقه حتی فعالتر از کپسول وجود دارد و نشاندهنده این موضوع است که مرفین در ریشه و ساقه سنتز شده و توسط شیره گیاهی به درون کپسول منتقل میشود (Gerardy & Zenk, 1993b). در واقع میتوان بیان داشت که بیان یک ژن در یک اندام الزاما به معنای تجمع مواد تولیدی آن در همان اندام نیست. در این راستا، انتقال نیکوتین و هیوسیامین از ریشه توسط آوند چوبی به برگها یک مثال مشهود از آلکالوئیدهایی است که در ریشه سنتز میشوند و در اندامهای هوایی ذخیره میشوند (Hashimoto & Yamada, 1992). با توجه به اطلاعات فوق میتوان نتیجه گرفت که ممکن است چنین مکانیسمی برای سنگوئینارین نیز در مامیران وجود داشته باشد، بهاینصورت که سنگوئینارین سنتز شده در ساقه به سمت ریشه انتقال بیابد. نتایج تجزیه واریانس اختلاف معنیداری را در اثر متقابل تنش شوری و اندامهای مختلف گیاه مامیران بر میزان بیان ژن cmMSH نشان داد (جدول 2).
جدول 2- تجزیه واریانس بیان نسبی ژن cmMSH تحت تأثیر تنش شوری در اندامهای مختلف مامیران کبیر.
Table 2- Analysis of variance for cmMSH gene relative expression under salinity stress in greater celandine organs.
|
F |
میانگین مربعات (MS) |
مجموع مربعات (SS) |
درجه آزادی (df) |
منبع تغییرات (S.O.V) |
|
|
**150.36 |
21.05 |
63.15 |
3 |
شوری Salinity |
|
|
**129.5 |
18.13 |
36.27 |
2 |
اندام Organ |
|
|
**60.85 |
8.52 |
51.13 |
6 |
شوری×اندام Salinity×Organ |
|
|
|
0.140 |
3.35 |
24 |
خطای آزمایش Error |
|
|
|
11.85 |
|
|
CV% |
|
** : اختلاف معنیدار در سطح احتمال یک درصد.
با توجه به الگوی تغییرات بیان ژن در اندامهای مختلف تحت شوریهای متفاوت (شکل 6)، تنش شوری 25 میلیمولار، بیشترین تأثیر و درصد افزایش را بر بیان ژن cmMSH در اندام ساقه و کمترین تأثیر را بر بیان ژن مذکور در اندام برگ نشان داد؛ بهطوریکه در این سطح از تنش، بیان ژن cmMSH در تمام اندامهای مامیران نسبت به تیمار شاهد (بدون شوری) افزایش چشمگیر و معنیداری داشت (شکل 6). از سوی دیگر در شوری50 میلیمولار بیان ژن cmMSH نسبت به تیمار شاهد و شوری 25 میلیمولار در هر دو اندام ریشه و برگ افزایش قابل ملاحظهای داشت، در حالیکه در شوری50 میلیمولار نسبت به شوری 25 میلیمولار کاهش قابل ملاحظهای در بیان این ژن در اندام ساقه مشاهده شد. البته بیشترین میزان بیان ژن در این سطح از تنش شوری (50 میلیمولار)، مربوط به ریشه و کمترین میزان بیان مربوط به ساقه بود. در جمعبندی اثر متقابل شوری و اندام همانطور که مشاهده میشود (شکل 6) با شوری اولیه، میزان بیان ژن cmMSH در تمام اندامها بهخصوص در ساقه و با اختلاف معنیداری از شاهد افزایش یافت. اما با افزایش سطح شوری از 50 میلیمولار به 100 میلیمولار میزان بیان این ژن در تمام اندامها سیر نزولی نشان داد؛ که علت آن میتواند افزایش شدت تنش و مدت زمان طولانی مواجه شدن گیاه با شرایط تنش باشد. البته باید توجه داشت که در شوری 100 میلیمولار همچنان بیان ژن cmMSH در برگ و ریشه نسبت به عدم شوری (تیمار شاهد) افزایش یافته است (شکل 5). در همین راستا نیز نتایج حاصل از تاثیر محرک زیستی بر بیان ژن DIOX2 (از ژنهای موثر در سنتز سنگوئینارین) حاکی از روند کاهشی بیان ژن فوقالذکر در ساعات پایانی القاء بهدلیل مواجهه طولانی با محرکها در سوسپانسیون سلولی میباشد Hagel & Facchini, 2010)).
شکل 6- مقایسه اثر متقابل شوری و اندامهای گیاه مامیران بر بیان ژن cmMSH (شاهد: بدون تنش؛ تنش ضعیف: شوری 25 میلیمولار؛ تنش متوسط: شوری 50 میلیمولار؛ تنش شدید: شوری 100 میلیمولار).
Figure 6- Mean comparison of salinity × greater celandine organs interaction on cmMSH gene expression (control: non stress; weak stress: 25 mM salinity; mild stress: 50 mM salinity; severe stress: 100 mM salinity).
نتیجهگیری
برای اولین بار در این مطالعه cDNA کد کننده cmMSH از گیاه مامیران کبیر جداسازی و توالییابی شد. نتایج حاصل از بررسی بیوانفورماتیکی قطعه توالییابی شده، دامینهای کارکردی و اصلی خانواده پروتئینی Cytochrome-P450 را در ژن جدا شده نشان داد. از نظر بیانی نتایج حاصل از ریل تایم پیسیآر نشان داد که تنش شوری ملایم 50 میلیمولاری میتواند در گیاه دارویی مامیران کبیر باعث افزایش بیان ژن cmMSH با حداکثر میزان در ریشه و سپس برگ گردد.
منابع
Alamgir ANM (2017). Therapeutic Use of Medicinal Plants and Their Extracts: Volume 1: Pharmacognosy. Springer.
Beaudoin GA, Facchini PJ (2013). Isolation and characterization of a cDNA encoding (s)- cis-N-methylstylopine 14- hydroxylase from opium poppy, a key enzyme in sanguinarine biosynthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications 431: 597-603.
Bourgaud F, Gravot A, Milesi S, Gontier E (2001). Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science 161: 839-851.
Facchini PJ, De Luca V (1995). Phloem-specific expression of tyrosine/dopa decarboxylase in opium poppy. Journal of Biological Chemistry 269: 26684-26690.
Farrow SC, Hagel JM, Facchini PJ (2012). Transcript and metabolite profiling in cell cultures of 18 plant species that produce benzylisoquinoline alkaloids. Hytochemistry 77: 79-88.
Gerardy R, Zank MH (1993b). Formation of salutaridine from (R)- reticuline by a membrane-bound cytochrome P-450, enzyme from Papaver somniferum. Phytochemistry 32: 79-86.
Gesell A, Rolf M, Ziegler J, Vez ML, Huang FC, Kutchan TM (2009). CYP719B1 salutaridine synthase, the C-C phenol-coupling enzyme of morphine biosynthesis in opium poppy. The Journal of Biological Chemistry 284: 24432-24442.
Ghanavi Z, Molaei S, Babaei AR, Gasempour AR (2015). Quantitative measurements of alkaloids in Chelidonium majus at different altitudes of north Iran. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants 31: 307-314.
Hagel JM, Facchini PJ (2010). Dioxygenases catalyze the O-demethylation steps of morphine biosynthesis in opium poppy. Nature Chemical Biology 6: 273-275.
Hashimoto T, Yamada Y (1992). Tropane alkaloid biosynthesis: regulation and application. In proceedings of the 7th Annual Pennsylvania State symposium on plant physiology. American Society of Plant Physiologists 122-134.
Holkova I, Bezakova L, Bilka FS, Bala_zova A, Vanko M, Blanarikova V (2010). Involvement of lipoxygenase in elicitor-stimu lated sanguinarine accumulatio n in Papaver somniferum suspension cultures. Plant Physiology and Biochemistry 48: 887-892.
Ikezawa N, Iwasa K, Sato F (2007). Molecular cloning and characterization of methylenedioxy bridge-forming enzymes involved in stylopine biosynthesis in Eschscholzia californica. The Federation of European Biochemical Societies Journal 274: 1019-1035.
Kheradmand Prouch M, Shahriari Ahmadi F, Moshtaghi N (2017). The effect of methyljasmonate elicitor on tropan alkaloid production in hairy roots of Atropa belladonna. Journal of Agricultural Biotechnology 9: 61-74.
Kumar J, Gupta PK (2008). Molecular approaches for improvement of medicinal and aromatic plants. Plant Biotechnology Reports 2: 93-112.
Mehrabani B, Nazeri S, Piri Kh (2013). Evaluation of total produced phenol in Chaei Koohi (Stachys lavandulifolia Vahi) callus culture and possibility of its enhancement using Elicitors. Journal of Agricultural Biotechnology 2: 77-88.
Meng F, Zuo G, Hao X, Wang G, Xiao H, Zhang J (2009). Antifungal activity of the benzo[c] phenanthridine alkaloids from Chelidonium majus Linn against resistant clinical yeast isolates. Journal of Ethnopharmacology 125: 494-496.
Mulabagal V, Tsay HS (2004). Plant cell cultures-an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites. International Journal of Applied Science and Engineering 2: 29-48.
Rao SR, Ravishankar GA (2002). Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances 20: 101-153.
Samanani N, Liscombe DK, Facchini PJ (2004). Molecular cloning and characterization of norcoclaurine synthase, an enzyme catalyzing the first committed step in benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis. The Plant Journal 40: 302-313.
Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork, USA.
Singh A, Dwivedi P (2018). Methyl-jasmonate and salicylic acid as potent elicitors for secondary metabolite production in medicinal plants: A review. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 7: 750-757.
Takemura T, Ikezawa N, Iwasa K, Sato F (2013). Molecular cloning and characterization of a cytochrome P450 in sanguinarine biosynthesis from Eschscholzia californica cells. Phytochemistry 91: 100-8.
Tripathi L, Tripathi JN (2003). Role of biotechnology in medicinal plants. International Institute of Tropical Agriculture 2: 243-253.
Molecular isolation of cDNA encoding N-methylstylopine hydroxylase from greater celandine (Chelidonium majus L.) and its expression enhancement in response to salinity abiotic elicitor
Soleimani Z.1, Fabriki-Ourang S.2*, Mafakheri S.3
1 M.Sc. of Genetics & Plant Breeding, Imam Khomeini International University, Qazvin, Iran.
2 Assistant professor, Department of Genetics & Plant Breeding, Imam Khomeini International University, Qazvin, Iran.
3 Assistant professor, Department of Horticulture, Imam Khomeini International University, Qazvin, Iran.
Abstract
The greater celandine (Chelidonium majus L.) contains important alkaloids such as Sanguinarine. Sanguinarine is an active alkaloid with potentially antimicrobial, anti-inflammatory and anti-tumor properties that is widely found in plants of Papaveraceae family. In this research, the isolation and sequencing of (s)-cis-N-methyl stylopine 14-hydroxylas (MSH) coding gene was performed as one of the key enzymes in Sanguinarine pathway from celandine. Then, the changes in cmMSH gene expression were investigated in roots, leave and stems at four salinity levels (0, 25, 50, and 100 mM) in a factorial experiment based on completely randomized design. In the present study, the cDNA encoding MSH enzyme was isolated from root and successfully integrated into PTG19-T plasmid and cloned at E. coli. After confirmation of recombinant clones by PCR, plasmids of recombinant bacteria were extracted and the gene segment sequenced. The sequenced segment had 784 nucleotides with an open reading frame of 261 amino acids which the derived protein with functional domains including helix K region, heme-binding region and aromatic region belonged to the Cytochrome-P450 protein family. In the phylogeny tree, the protein sequence of isolated cmMSH gene had the most similarity with methylstylopine 14-hydroxylase enzyme of poppy species. Mean comparison of gene relative expression showed that 50 mM salinity had maximal effect on increasing of cmMSH gene expression in root tissue. Also, the expression pattern showed that with increment the salinity up to 50 mM, the expression of cmMSH gene increased in leaves and roots, but with increment the salinity to 100 mM the gene expression decreased 35% in both tissues.
Key words: Benzylisoquinoline, Celandine, cmMSH, Salinity, Sanguinarine.
* نویسنده مسئول: صدیقه فابریکی اورنگ تلفن: 09195382099 s.ourang910@gmail.com :Email
[1]-Sanguinarine
[2]- Chelidonine
[3]-Chelerythrine
4- Benzylisoquinoline alkaloids; BIAs
[5]-Berberine Bridge Enzyme; BBE
[6] -https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
[7]- http://www.genome.jp/tools/egassembler
[8]- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder
[9]- https://eu.idtdna.com/calc/analyzer
* Corresponding Author: Fabriki S. Tel:09195382099 Email: s.ourang910@gmail.com
)
