Document Type : Research Paper
Authors
1 Former MSc Student in Agricultural Biotechnology, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Tabriz University, Tabriz, Iran.
2 Professor, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Tabriz University, Tabriz, Iran.
3 Cenetr of Excellence in Cereal Molecular Breeding, University of Tabriz, Tabriz, Iran
Abstract
Keywords
تنوع نوکلئوتیدی ژنهای مقاومت به زنگ قهوهای در ژنوتیپهای مقاوم و حساس گندم نان
رحیمه همتی گوگه1، سید ابوالقاسم محمدی*2و3، سعید اهریزاد2
1 فارغالتحصیل کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه بهنژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران
2 استاد، گروه بهنژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران
3 قطب علمی اصلاح مولکولی غلات، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران
تاریخ دریافت: 21/10/1396، تاریخ پذیرش: 12/03/1397
چکیده
زنگ قهوهای (Leaf rust) یکی از بیماریهای مهم گندم در سطح جهان است که اپیدمی آن منجر به کاهش عملکرد و کیفیت گندم نان میشود. در این مطالعه، تغییرات ساختاری و تنوع نوکلئوتیدی ژنهای مقاومت به زنگ قهوهایLr1، Lr21، Lr51 وLr39 در هفت ژنوتیپ گندم نان با واکنش متفاوت به زنگ قهوهای بررسی گردید. ژنهای مقاومت به زنگ قهوهای و یا نواحی پیوسته با این ژنها با استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده بر اساس توالیهای موجود در بانکهای اطلاعاتی تکثیر شدند. قطعات تکثیری در باکتری E. coli همسانهسازی و توالییابی گردیدند. همردیف کردن توالی ژنهای مورد مطالعه با توالیهای موجود در بانک اطلاعاتی NCBI، شباهت بالای آنها را با توالی ژنهای مقاومت از جمله
ژنهای خانواده NBS-LR و RGAها نشان داد. همردیفی قطعات تکثیر شده از ژنهای مورد مطالعه با توالیهای موجود در NCBI نشان دهنده شباهت قطعه تکثیر شده از ژن Lr51، با ژن agp2 بود. توالی ژن Lr39 با ژن VRN1، مسئول بهارهسازی در گندم زمستانه، 88 شباهت درصد داشت. نتایج بدست آمده از همردیف کردن توالیها و گروهبندی آنها، حاکی از وجود تغییرات ساختاری و تنوع نوکلئوتیدی این ژنها در ارقام مورد مطالعه بود. نسبت جایگزینیهای همنام به ناهمنام Ka/Ks)) در قطعات تکثیر شده از ژن Lr1 با استفاده از جفت آغازگرهای Lr1-2، Lr1-3 وLr1-4 و ژنهای Lr21 وLr39 کوچکتر از یک و نشان دهنده گزینش منفی برای جایگزینی یک اسیدآمینه در این ناحیه از این ژنها بود. در قطعه ژن تکثیر شده از ژن Lr1 با استفاده از جفت آغازگر Lr1-5 نسبت Ka/Ks بیشتر از یک و نشان دهنده گزینش مثبت یا گزینش در جهت ایجاد تنوع برای جایگزینی یک اسیدآمینه است. از نظر توالی ژنهای Lr1، Lr21، Lr39 وLr51، ژنوتیپهای مورد مطالعه فقط از نظر چند نوکلئوتید تفاوت داشتند که براساس این تفاوتهای نوکلئوتیدی میتوان آغازگرهای اختصاصی مبتنی بر SNPها جهت شناسایی ژنوتیپهای حساس و مقاوم طراحی کرد.
کلمات کلیدی: زنگ قهوهای، تنوع نوکلئوتیدی، ژنهای مقاومت به بیماری.
مقدمه
در بین گیاهان زراعی، گندم نان بزرگتــــرین ژنــوم را دارا است (Arumuganathan & Earle, 1991) که حدود 90–80 درصد آن دارای توالیهای تکراری بوده و 70 درصد عناصر متحرک [1] (TEs) میباشد (Feuillet et al., 2003; Li et al., 2004). زنگ قهوهای یکی از بیماریهای قارچی مهم گندم است که بیشترین پراکنش را در سطح جهان دارد و تولید گندم را تحت تاثیر قرار میدهد. در نقاطی که ارقام حساس کشت شده باشند و شرایط محیطی برای ایجاد آلودگی بوسیله یوردینیا مناسب باشد، به میزان زیادی روی پهنک برگها مشاهده میشود. اپیدمی این بیماری خسارت شدیدی به عملکرد دانه وارد کرده و کیفیت غذایی آن را پائین میآورد (Ling et al., 2004).
گیاهان دارای مکانیسمهای دفاعی موثری برای شناسایی و پاسخ به آلودگیهای ایجاد شده توسط پاتوژنها میباشند. آنالوگهای ژنهای مقاومت گیاهی ([2]RGAs) بعنوان ژنهای کاندیدا، دارای موتیفها و دومینهای حفاظتشدهای هستند که نقش خاصی را در مقاومت به پاتوژن ایفا مینمایند (Sekhwal et al., 2015). شناخته شدهترین RGAها دارای ناحیه اتصال به نوکلئوتید، ناحیه غنی از لوسین، شبه گیرندههای کینازی[3]RLK، و شبه گیرندههای پروتئینی RLP[4] میباشند. با استفاده از ویژگیهای فوق تاکنون پنج گروه از ژنهای مقاومت شناسائی شدهاند. بزرگترین گروه این ژنها پروتئینهایی را با جایگاه [5]NBS–LRR رمز میکنند (Huang et al., 2003). این پروتئینها یک جایگاه مرکزی با یک مکان اتصال به نوکلئوتید دارند (Hommand–Kosak & Jones, 1997). مرکز این جایگاه میتواند دارای یک جایگاه P–loop/Kinase1–a، جایگاه کیناز2، کیناز3 و یک جایگاه آبگریز باشد. با استفاده از آغازگرهای طراحی شده بر اساس (GLPL) P–loop/Kinase همولوگ های زیادی از NBS را در گونههای مختلف گیاهی شناسایی شده است (Mayerse et al., 1999). این پروتئینها دارای یک جایگاه حفاظت شده دیگر در انتهای آمینی با بنیانهای تکراری غنی از لوسین میباشند. جایگاه LRR در برخی از محصولات ژنهای R بعنوان جایگاه اتصال برای لیگاند[6] محسوب میشود، این لیگاند در نتیجه فعالیت ژن Avr ایجاد میگردد (Bent, 1996).
بیش از 50 ژن مقاومت به زنگ قهوهای در ژرم پلاسمهای گندم و گونههای خویشاوند وحشی آن شناسایی و تعدادی از آنها در
برنامههای اصلاحی گندم استفاده شده است (Feuillet et al., 2003). جایگاه کروموزومی اغلب ژنهای مقاومت به زنگ قهوهای تعیین و تحت نامهای Lr1 تا Lr51 شمارهگذاری شدهاند (Kolmer, 1996). سه ژن Lr1، Lr10 و Lr21 از گندم هگزاپلوئید جداسازی و همسانه سازی شدهاند (Cloutier et al., 2007; Feuillet et al., 2003; Huang et al., 2003). ژن Lr1 اولین بار از رقمMalacof گزارش (Mains et al., 1923; Ausemus et al., 1946) و سپس در گندم هگزاپلوئید Glenlea نیز شناسایی گردید (Sambroski, 1973 ; Dyck et al., 1985; McVey, 1989). Lr1 یک ژن مقاومت به بیماری با جایگاه Coiled Coil، NBS و LRR میباشد (Cloutier et al., 2007).
ژن Lr21 از گونه Aegilops tauschii به رقم Thacher گندم نان منتقل شده است (Rowland & Kerber, 1974). این ژن اولین بار توسط Huang et al. (2003) جداسازی و همسانه شد. ژن Lr21 در ناحیه غنی از ژن در قسمت انتهایی بازوی کوتاه کروموزوم 1D گندم نان به طول 4359 جفت باز قرار دارد و ناحیه رمزکننده ژن Lr21، پروتئینی با یک جایگاه NBS حفاظت شده و 13 تکرار غنی از لوسین ناقص متعلق به خانواده NBS–LRRرا رمز می کند (Huang et al., 2003).
ژن Lr51 از کروموزوم 1S Triticum speltoides از طریق جابجائی یک قطعه کروموزومی به بازوی بلند کروموزوم 1B گندم نان منتقل شده است (Helguera et al., 2005). ژن Lr39 روی بازوی کوتاه کروموزوم 2D قرار دارد و مقاومت به زنگ قهوهای را در مرحله گیاهچه و گیاه بالغ القاء میکند. بررسیها نشان داده است که این ژن از سایر ژنهای Lr متفاوت میباشد. از هشت نشانگر ریزماهواره برای تجزیه پیوستگی این ژن در کروموزوم 2D استفاده شده است. منشاء این ژن گونه Ae. tauschii بوده و از طریق تلاقی بینگونهای به گندم نان منتقل شده است (Raupp et al., 2001).
هدف از این بررسی، جداسازی قطعاتی از ژنها یا نواحی پیوسته با آنها، همسانه کردن و توالییابی ژنهای مقاومت به زنگ قهوهای Lr1، Lr21، Lr51 و Lr39 در هفت ژنوتیپ گندم نان با واکنش متفاوت به زنگ قهوهای جهت یافتن تنوع نوکلئوتیدی موجود در این نواحی بود.
مواد و روشها
مواد گیاهی شامل هفت ژنوتیپ گندم نان با درجات متفاوت مقاومت به زنگ قهوهای در مرحله گیاهچه و گیاه کامل بودند که از موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کشور تهیه شدند (جدول 1).
جدول 1- واکنش ژنوتیپهای گندم نان مورد مطالعه به زنگ قهوهای در مرحله گیاهچه و گیاه کامل.
Table 1- Response of the he studied bread wheat genotypes to leaf rust at seedling and adult plant stages.
|
ژنوتیپ Genotype |
مرحله گیاهچه Seedling Stage |
مرحله گیاه کامل adult plant stage |
|
MV-17 |
حساس – نیمه حساس Susceptible- Semi susceptible |
مقاوم – نیمه مقاوم Resistance- semi resistance |
|
بولانی Bolani |
حساس Susceptible |
حساس Susceptible |
|
پیشتاز Pishtaz |
حساس Susceptible |
حساس – نیمه حساس Susceptible- semi susceptible |
|
N-80-6 (مغان3) |
حساس Susceptible |
حساس – نیمه حساس Susceptible- semi susceptible |
|
MKH3 |
مقاوم resistance |
نیمه مقاوم – نیمه حساس Semi resistance- semi susceptible |
|
MKH4 |
حساس Susceptible |
نیمه مقاوم – نیمه حساس Semi resistance- semi susceptible |
|
بولوئیکا (بهار) (M-79-7) |
حساس Susceptible |
نیمه مقاوم – نیمه حساس Semi resistance- semi susceptible |
استخراج DNAژنومی با روش CTAB (Saghai-Maroof et al., 1984) انجام و کمیت و کیفیت نمونههای DNA با استفاده از اسپکتروفتومتر و الکتروفورز ژل آگارز 8/0 درصد تعیین شد. برای تکثیر ژنهای مقاومت به زنگ قهوهای Lr1، Lr21، Lr51 و Lr39 از جفت آغازگرهای طراحی شده بر اساس اطلاعات موجود در NCBI استفاده شد (جدول 2).
جدول 2- آغازگرهای مورد استفاده برای تکثیر ژنهای مقاومت به زنگ قهوهای Lr1، Lr21، Lr51 و Lr39 و دمای اتصال آنها.
Table 2- The primer used for amplification of leaf rust resistance genes Lr1, Lr21, Lr51, and Lr39 and their annealing temperatures.
|
دمای اتصال Annealing temperature |
ژن Gene |
توالی آغازگرها Primer sequences |
آغازگر Primer |
|
52 ºC |
Lr1 |
5'–TCC ACG CCA CCA ACT ACG –3' 5'–GCC GAG CAA ATCAGA GAC –3' |
Lr1–2F Lr1–2R |
|
53 ºC |
Lr1 |
5'–ACA CCC TGT TTC TGT TCT TCC –3' 5'–CTG CTG CTT CCT TCT TC –3' |
Lr1–3F Lr1–3R |
|
53 ºC |
Lr1 |
5'–CTG GTT CTT GTG CCT GAG G –3' 5'– GGT TGA CTG CGA TGA GAG G –3' |
Lr1–4F Lr1–4R |
|
52 ºC |
Lr1 |
5'– AGG AGA AGG AGA ATG GAG GAG –3' 5'–GGT TGA CTG CGA TGA GAG G –3' |
Lr1–5F Lr1–5R |
|
62 ºC |
Lr21 |
5΄– CGC TTT TAC CGA GAT TGG TC –3΄ 5΄– CCA AG AGC ATC CAT GGT GT –3΄ |
D14–L, D14–F |
|
49.6 ºC |
Lr39 |
5΄– CCT GCT CTG CCC TAG ATA CG –3΄ 5΄– TGG CTG CTC AGA AAA CTG GAC C –3΄ |
Gdm35–L Gdm35–R |
|
56.8 ºC |
Lr51 |
5΄– GCA TCA ACA AGA TAT TCG TTA TGA CC –3΄ 5΄– TGG CTG CTC AGA AAA CTG GAC C–3΄ |
S30–13L, AGA7–759R |
واکنش زنجیرهای پلیمراز در حجم نهایی
µl10 و با استفاده از پروتکل سیمیت (CIMMYT, 2005) انجام شد. قطعات تکثیری پس از جداسازی از ژل به ناقل pTZ57RT الحاق و در باکتری E. coli سویهDH5α همسانه شدند. تهیه سلولهای مستعد با استفاده از روش کوهن و همکاران (Cohen et al., 1972) انجام و کلنیهای سفید رنگ حاوی قطعات تکثیری برای استخراج پلاسمید انتخاب گردیدند. استخراج پلاسمید براساس روش پیشنهادی بیرنبوئیم و دالی (Birnboim & Doly, 1979) صورت گرفت و قطعات برای توالییابی به شرکت ماکروژن [7] کرهجنوبی ارسال شد. توالیهای حاصله با استفاده از برنامه Chromas Lit 2.01 تجزیه و تحلیل شد. مقایسه توالیها با همولوگهای آن با استفاده از الگوریتم همردیفی چندگانه در Clastalx ver. 1.8 وClastalw ver 1.6 انجام و دندروگرام با استفاده از لگوریتم Neighbor Joining (Saitou & Nei, 1987) و ضریب فاصله P-distance در برنامه MEGA 4 ترسیم گردید (Kulmar et al., 2008). تنوع نوکلئوتیدی بین ارقام و میزان جایگزینیهای همنام (Ks) و جایگزینیهای غیرهمنام (Ka) در ژنهای مورد بررسی با استفاده از برنامه DNAsp ver 4.0 برآورد شد (Rozas et al., 2010). میزان شباهت ها و تفاوتها با توالی های موجود در بانکهای اطلاعاتی از جمله [8]NCBI از طریق بلاست این توالیها بدست آمد.
نتایج و بحث
با استفاده از جفت آغازگر D14، قطعاتی به طول 1500 جفت باز از ژن Lr21 تکثیر شد. شکلa1 نشانگر ناحیه تکثیر شده از این ژن با استفاده از آغازگر و شکل a2 نشان دهنده قطعات پس از همسانه سازی و برش آنزیمی میباشد. تنوع نوکلئوتیدی برابر با 4/0 بود. جستجو در بانکهای اطلاعاتی NCBI و UniProt برای دومینهای حفاظت شده نشان داد که این ژن متعلق به خانواده NB-ARC superfamily با 192 آمینواسید است (شکل 1). طول کامل ناحیه رمز کننده این ژن برابر با 3243 جفت باز با توالی موجود در NCBI با شماره دسترسی FJ876280 در گندم نان مشابهت داشت. همردیف کردن توالی این ژن در ژنوتیپهای مورد مطالعه با توالیهای موجود درNCBI نشان دهنده شباهت 99 درصدی آنها با توالیهای ژن Lr21 درNCBI و الل نوترکیب S مربوط به ژن Lr21 ازAe. tauschii بود. همچنین توالی ژن Lr21 در ژنوتیپهای مورد مطالعه با RGAها از گروه LZ–NBS–LRR، پروتئینهای دفاعی شبه [9]HCBT و LZ–NBS–LRR از Ae. tauschii نمونه TA2468، شباهت90 درصدی نشان دادند. اطلاعات مربوط به ژنها و درصد شباهت آنها در جدول 3 آورده شده است. هانگ و همکاران (Huang et al., 2003) نیز با استفاده از نشانگر اختصاصی STS،KSUD14-STS قطعه 1410 جفتبازی را در گندمهای تراریزش شده بوسیله کلون کاسمید 1-7-69 تکثیر کردند. علاوه بر این، در برخی از ارقام مقاوم به پاتوژن، یک قطعه 1360 جفت بازی از این ژن تکثیر شد. بر اساس توالییابی مجدد مبتنی بر جمعیت، چهار حذف/اضافه (indel) (2 جفت باز در ناحیه اسید آمینهای، 88 یا 105 جفت باز در اولین اینترون، یک جفت باز در ناحیه NBS و یک حذف و اضافه در ناحیه LRR) و 13 چندشکلی تک نوکلئوتیدی SNP در ارقام گندم معرفی شده در زمان های مختلفی در ژن Lr21 شناسایی شد (Fu et al., 2010). در پژوهشی Neelam et al. (2013) نیز آغازگرهای اختصاصی آلل برای ارزیابیهای KASPar در محدوده ناحیه اتصال حذف/اضافه در موقعیت 1346 جفت بازی طراحی کردند. با استفاده از چهار جفت آغازگر Lr1-2، Lr1-3، Lr1-4 وLr1-5 بترتیب قطعاتی به طول 244، 226، 788 و 780 جفت باز از ژن Lr1 تکثیر شد (شکل b2). قطعات ژن Lr1 با توالی ژن Lr1 موجود در NCBI رقم Glenlea شباهت 100 درصد و با ژن Lr34 شباهت 88 درصد نشان داد که میتواند نشان دهنده شباهت ساختاری این دو ژن باهم باشد. قطعه تکثیر شده با آغازگر Lr1-5 با پروتئین RLP: Receptor-like protein 12 از T. urartu با شماره دسترسی EMS65378.1 دارای شباهت 75 درصدی بود (شکل a4). این پروتئین با نام LRR-RI (تکرارهای غنی از لوسین- بازدارنده ریبونوکلئاز)، معمولا در غشای پلاسمایی واقع شده و در روابط متقابل پروتئین – پروتئین دخالت دارد. همچنین قطعه تکثیر شده با آغازگر Lr1-3 نیز متعلق به Lr1 و خانواده بزرگ دومین P-loop NTPase در گندم نان با شماره دسترسی ABS29034.1 بود (شکل b4). این قطعه با پروتئین مقاومت به بیماری RGA3 از
Ae. tauschii subsp. tauschii با شماره دسترسی XP_020148468.1 نیز شباهت 100 درصدی داشت که این پروتئین هم دارای یک
NB-ARC domain میباشد (شکل 3). در پژوهشی Qiu et al. (2007) براساس چهار RGA از ارقام مقاوم و حساس، آغازگرهای اختصاصی طراحی و قطعاتی را تکثیر، همسانه سازی و توالییابی کردند. آنها اختلافات موجود بین لاینهای مادری جمعیت هدف، جهت تعیین نقشه فیزیکی، را شناسایی نموده و بر پایه تفاوت های نوکلئوتیدی موجود توانستند آغازگرهای Lr1RGA1 و Lr1RGA2 را طراحی کنند. با استفاده از نشانگر CAPS به نام Lr1RGA1 قطعاتی بطول 760 جفت باز تکثیر شد.
جدول 3- شباهت قطعه توالی یابی شده از ژن Lr21 با توالیهای موجود در NCBI.
Table 3- Similarity of sequenced fragments from Lr21 gene with the sequences available in NCBI.
|
درصد شباهت Identification percentage |
مشخصات توالی Sequence features |
شماره دسترسی Accession NO |
|
99% |
Triticum aestivum strain CN 106423 wheat leaf rust resistance Lr21 pseudogene, partial sequence |
|
|
99% |
Triticum aestivum strain CN 11999 wheat leaf rust resistance Lr21 pseudogene, partial sequence |
|
|
99% |
Triticum aestivum Lr21 gene, Lr21-S allele, partial sequence |
|
|
|
Aegilops tauschii clone TA2471 Lr21 pseudogene, complete sequence |
|
|
99% |
Triticum aestivum Lr21 gene, complete sequenc |
|
|
99% |
Triticum aestivum clone w Lr21 pseudogene, complete sequence |
|
|
99% |
Triticum aestivum Lr21 gene, Lr21-R-S recombinant allele, partial sequence |
|
|
90% |
||
|
99% |
AH012974.2 |
|
|
90% |
AF446141.1 |
با استفاده از جفت آغازگر S30–13L و AGA7–759R، قطعاتی از ژن Lr51 بطول 793 جفت باز در چهار رقم بولانی (792 جفت باز)، N-80-6 (مغان 3) (672)، پیشتاز (677) و بولوئیکا (بهار) (69 جفت باز) تکثیر و توالییابی شد (در سه ژنوتیپ MKH3، MKH4 و MV17 قطعهای تکثیر نشد). بلاست توالیها نشان داد که این ژن با ژن agp2 رمز کننده زیر واحد بزرگ ADP– گلوکز پیروفسفوریلاز، شباهت 98 درصدی و با پروتئین Glucose-1-phosphate adenylyltransferase large subunit 1 شباهت 99 درصدی دارد. این پروتئین در کلروپلاست و آمیلوپلاست واقع شده و ساختار سه بعدی آن در شکل 5 آورده شده است.
شکل2- a1) قطعه 1442 جفت بازی از ژن Lr21، a2) الگوی نواری پلاسمیدهای برشیافته با آنزیمهای EcoRI و HindIII. و قطعه درجی 1442جفت بازی، b) قطعه 300 جفت بازی از ژن Lr1.، c) قطعه 500 جفت بازی از ژن Lr39 و (d نشانگر100 جفتبازی.
Figure 2- a1) 1442 bp fragment from Lr21 gene, a2) Banding pattern of plasmids digested with EcoRI and HindIII enzymes, b) inserted fragment with length of 244 bp from Lr1, c) 500bp fragment for Lr39 gene and d) 100bp ladder.
شکل3- ساختار سه بعدی دومین حفاظت شده NB-ARC در ژن Lr21.
Figure 3- Three dimensional structure of conserved NB-ARC domain in Lr21 gene.
شباهت 90 درصدی این قطعه با قطعه ژن Lr51 از رقم Neepawa با شماره دسترسی AY589011.1 و شباهت 98 درصدی با توالی دیگر این ژن با شماره دسترسی AY589012.1 مشاهده شد. هلگوئرا و همکاران (Helguera et al., 2005) نیز قطعات 790 و 800
جفتبازی از این ژن را تکثیر کردند.
با استفاده از آغازگر Gdm35 قطعاتی با طولهای 227، 247، 192، 224، 269، 197 و 190 جفت بازی به ترتیب در بولانی، بولوئیکا، MKH3، MKH4، پیشتاز، MV17 و N-80-6 تکثیر و توالی یابی شد (شکل 2c, 2d). راپ و همکاران (Raupp et al., 2001) با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره GWM296 و GWM210 به ترتیب قطعاتی بطول 145 و 190 جفت باز در گندمهای مقاوم و نمونه TA1675
Ae. tauschii تکثیر کردند. همردیفی
توالی ژن Lr39 با توالیهای موجود در پایگاه اطلاعاتی NCBI نشاندهنده شباهت 77 درصدی آن با توالی ژن Lr1 از رقم Glenlea بود. توالی ژن Lr39 در ارقام مورد مطالعه با توالی ژن VRN1 با شماره دسترسی AY188331.1 که مسئول بهارهسازی در گندم زمستانه است، نیز شباهت 88 درصدی داشت.
شکل 4- (aساختار سه بعدی Receptor like protein در ژن Lr1، (b ساختار سه بعدی پروتئین متعلق به Lr1 از خانواده P-loop NTPase domain superfamily .
Figure 4- a) Three dimensional structure of Receptor like protein in Lr1 gene, b) Three dimensional structure of protein belonging to Lr1 gene from P-loop NTPase domain superfamily.
گروهبندی ژنوتیپها براساس توالی ژنهای مورد بررسی در شکل 5 آورده شده است. براساس توالی ژنهای Lr1 و Lr21، رقم مقاوم MV-17 و رقم حساس بولانی در گروههای مجزا قرار گرفتند (شکلهای 5aو 5c) که این به دلیل تفاوت ساختاری این ژنها در ارقام مقاوم و حساس است. نتایج بدست آمده از همردیف کردن توالیها و گروه بندی آنها، حاکی از وجود تغییرات ساختاری و تنوع نوکلئوتیدی در بین ارقام بود. در گروه بندی با Lr1-3 و Lr1-5 رقم MV-17 و پیشتاز در یک گروه، N-80-6، بولانی و بولوئیکا در نیز در یک گروه و MKH3 و MKH4 نیز در گروه جدا قرار گرفتند. میتوان گفت براساس گروه بندی با Lr1، Lr39 و Lr21 ارقام حساس و مقاوم جدا شدهاند. اما این گروهبندی نتوانست ارقام نیمه حساس- حساس، نیمه مقاوم – حساس را جدا کند. برای ژن Lr51، قطعهای از رقم مقاوم MV-17 تکثیر نشد.
همردیفی قطعات تکثیر شده از ژن Lr39، Lr1-2 و Lr51 در شکل 6 و هم ردیفی قطعات تکثیر شده از ژن Lr21 در شکل 7 نشان داده شده است. ژنهای Lr21 وLr1 تکثیر شده توسط سه آغازگر فقط از نظر چند نوکلئوتید در بین ارقام تفاوت نشان دادند، ولی از نظر توالی ژنهای Lr51 وLr39 تفاوت بالایی مشاهده شد. این تفاوت بالا احتمالاً میتواند بدلیل وجود توالیهای تکراری و ترانسپوزونها باشد. وجود تعداد زیاد توالیهای تکراری و بزرگ بودن ژنوم گندم نان از عواملی است که شناسایی و همسانهسازی ژنها را با مشکل مواجه میسازد (Feuillet et al., 2003). محققان دیگر (Huang et al., 2003) نیز بعد از توالییابی مشاهده کردند که بعضی از این توالیها با اجزای شبه ترانسپوزونی یا با پروتئینهایی که عملکرد آنها شناخته شده نیست، همردیف میشوند. پروتئینهای گیاهی که بوسیله ژنهای مقاومت به بیماری رمز میشوند، در شناسایی حمله پاتوژنها و سپس در فعال کردن مکانیسمهای دفاعی دخالت دارند. نوع
(CNL: Coiled coil Nucleotide binding site Leucine rich region) از ژنهای مقاومت به بیماری در همه گونههای گیاهی وجود دارند.
مطالعهای توسط Benson et al. (2014) با هدف شناسایی عناصر تنظیم کننده با فعالیت Cis (CREs) در ژنهای مقاومت به بیماری CNL، تعیین تنوع وتوزیع آنها در بین 6 گونه گیاهی Oryza sativa ، Glycine max، Populus trichocarpa، Medicago truncatula، Phaseolus vulgaris و Arabidopsis thaliana انجام شد. آنها به روش تجزیه in silico نشان دادند که هشت CRE در همه ژنها مشترک بود و 30 مورد از CREها فراوانی بیشتر از 10 در هر ژن داشتند. O. sativa به عنوان تنها تک لپهای موجود در این گروه بطور قابل توجهی تعداد پائینتری CRE نسبت به گونههای دولپهای داشت. این مطالعه نشان داد که هشت CRE شناسایی شده در 2 کیلو باز ناحیه بالاتر از ژن در همه ژنهای CNLهای نمونهبرداری شده وجود داشتند. آنها نتیجه گرفتند که این CREها در شروع فرایندهای رونویسی دخالت دارند. بنابراین، شناسایی و بکارگیری آنها در تعیین ژنهای مقاومت پایدار که به روشهای قابل پیشبینی رونویسی شوند و در فرایندهای انتخاب طبیعی در تولید گیاهان مقاوم اهمیت دارد و میتواند در اصلاح گیاهان مقاوم به بیماری مفید واقع شود بود.
در جدول 4 میزان جایگزینیهای همنام (Ka) و ناهمنام Ks)) در ژنهای مورد مطالعه آورده شده است. نسبت Ka/Ks در قطعه ژن Lr1 تکثیر شده با جفت آغازگرهای Lr1-2، Lr1-3 وLr1-4 و در قطعات تکثیر شده از ژنهای Lr21 وLr39 کوچکتر از یک (Ka/Ks [10] برای جایگزینی یک اسیدآمینه در این ناحیه از ژن Lr1 و ژنهای فوق میباشد. این حالت در جهت حذف جایگزینیهای نامطلوب اتفاق میافتد. در قطعه ژن تکثیر شده از ژن Lr1 با جفت آغازگر Lr1-5 نسبت Ka/Ks بزرگتر از یک (Ka/Ks >1) بود که نشان میدهد گزینش مثبت یا گزینش در جهت ایجاد تنوع[11] برای جایگزینی یک اسیدآمینه اتفاق افتاده است. این حالت گاهی اوقات در پروتئینهای آنتیژنی رمزشده بوسیله پاتوژنها مشاهده میشود که تحت فشار گزینشی شدید در جهت ایجاد تغییر به منظور اجتناب از واکنشهای ایمنی در میزبان است. این نوع گزینش برای تثبیت جایگزینیهای مطلوب استفاده میشود. بالاترین نسبت جایگزینیهای همنام در قطعه ژن Lr1 تکثیر شده با جفت آغازگر Lr1-5 مشاهده شد که نشان دهنده گزینش مثبت در این ناحیه از ژن Lr1
میباشد. در Lr51 این نسبت محاسبه نشد، که بدلیل عدم تکثیر در برخی از ژنوتیپها بود.
در پژوهشی Jiang et al. (2007) با بررسی تنوع نوکلئوتیدی ناحیه LRR در ژنهای مقاومت گیاهان گزارش کردند که میزان تنوع نوکلئوتیدی و نسبت جایگزینیهای مشابه به جایگزینیهای غیر مشابه در واحدهای LRR بطور معنیداری متفاوت است. آنها در کل ناحیه LRR یک نسبت معنیداری از Ka>Ks در چهار ژن L، P، RPP13 و RPP8 را شناسایی کردند. این نسبت نشان میدهد که ناحیه LRR در برخی از ژنهای مقاومت تحت فشار گزینشی در جهت ایجاد تنوع قرار گرفته است.
سپاسگزاری
از قطب علمی اصلاح مولکولی غلات دانشگاه تبریز که هزینه این پژوهش را تامین کرده است تشکر و قدردانی می شود.
شکل 5- گروهبندی ارقام گندم مورد مطالعه براساس توالی ژنهای Lr1 (5a)، Lr39 (5b)، Lr21 (5c) و Lr51 (5d).
Figure 5- Grouping of wheat genotypes based on Lr1 (5a), Lr39 (5b), Lr21 (5c) and Lr51 (5d) genes sequence.
جدول 4- نسبت جایگزینیهای مشابه و غیرمشابه در ژنهای مقاومت به زنگ قهوهای مورد بررسی.
Table 4- Synonymous and nonsynonymous substitution rates in the studied leaf rust resistance genes.
|
|
|
|
انتخاب منفی Purifying selection |
انتخاب مثبت Diversifying selection |
|
|
|
ژن Gene |
جایگزینیهای ناهمنام Ks (nonsynonymous substitution) |
جایگزینیهای همنام Ka(synonymous substitution) |
Ka/Ksb |
Ka>Ks |
Ks>Ka |
aπ |
|
Lr1-2 |
0.097 |
0.03585 |
0.2709 |
+ |
- |
0.0062 |
|
Lr1-3 |
0.097 |
0.03585 |
0.2709 |
+ |
- |
0.0075 |
|
Lr1-4 |
1.52349 |
1.99043 |
0.83601 |
+ |
- |
0.6631 |
|
Lr1-5 |
2.4639 |
2.3245 |
1.142 |
- |
+ |
0.7756 |
|
Lr21 |
0.5327 |
0.5502 |
0.92706 |
+ |
- |
0.3943 |
|
Lr39 |
1.5797 |
1.9035 |
0.9486 |
+ |
- |
0.6847 |
a The mean of nucleotide diversity in all Pairs of comparisons in the studied genes.
b میانگین نسبت Ka/Ks در همه جفت مقایسات در ژنهای مورد بررسی.
b The mean of Ka/Ks rates in all Pairs of comparisons in the studied genes.
شکل 6- هم ردیفی توالی 244، 396 و 158 جفت بازی بترتیب از ژنهای Lr1 ، Lr39 و Lr51 . از جفت آغازگر Lr1-2، Gdm35،S30–13L و AGA7–برای تکثیر ژنهای مربوط در هفت ژنوتیپ استفاده شد. جایگاههای چندشکل با رنگ متفاوتنشان داده شدهاند.
Figure 6- Sequence alignment of 244, 396, and 158 bp fragments from Lr1, Lr39 and Lr51 genes, respectively. Primer pairs Lr1-2, Gdm 35, AGA7–759R and S30–13L were used to amplify the genes in seven genotypes. Polymorphism sites are shown with different colors.
شکل 7- توالی همردیف شده ژن Lr21 بطول 1500 جفتباز تکثیر شده با استفاده از آغازگر D14. جایگاههای چندشکل به رنگ آبی و به رنگ سیاه مشاهده میشوند.
Figure 7- Sequence alignment for Lr21 gene with 1500bp in length amplified with D14 primer. Polymorphism sites are shown with blue and black colors.
منابع
Arumuganathan K, Earle D (1991). Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Molecular Biology 9: 208–218.
Ausemus ER, Harrington JB, Reitz LP, Worzella WW (1946). A summary of genetic studies in hexaploid and tetraploid wheats. Journal Agronomy 38: 1082–1099.
Benson BV, Nepal MP, Davison LG, Duwadi PB, Moore BG (2014). In sillico analysis of Cis-Regulatory elements of disease resistance genes across six plant species. The South Dakota Academy of Science 93: 133.
Bent AF (1996). Plant disease resistance genes: Function meets structure. Plant Cell 8: 1757–1771.
Birnboim HC, Doly J (1979). A rapid alkaline procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research 7: 1513–1523.
CIMMYT 2005. Laboratory Protocols: CIMMYT Applied Molecular Genetics Laboratory. Third Edition. Mexico DF: CIMMYT.
Cloutier S, McCallum BD, Loutre C, Banks TW, Wicker T, Feuillet C, Keller B, Jordan MC (2007). Leaf rust resistance gene Lr1, isolated from bread wheat (Triticum aestivum L.) is a member of the large psr567 gene family. Plant Molecular Biology 65: 93–106.
Cohen SN, Chang ACY, Hsu L (1972). Non-chromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic transformation of Escherichia coli by R–factor DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 69: 2110–2114.
Dyck PL, Kerber ER (1985). Resistance of the race- specific type. In: Roelfs AP, Bushnell WR (eds) The cereal rusts Vol. II. Disease, distribution epidemiology and control. Academic Press, Orlando pp. 456-500.
Fu YB, Peterson GW, McCallum BD, Huang L (2010) Population based resequencing analysis of improved wheat germplasm at wheat leaf rust resistance locus Lr21. Theoretical and Applied Genetics 121: 271–281.
Feuillet C, Travella S, Stein N, Albar L, Nublat A, Keller B (2003). Map–based isolation of the leaf rust disease resistance gene Lr10 from the hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) genome. Proceedings of the National Academy of Sciences 100: 15253–15258.
Helguera M, Khan JA, Dubcovshy J (1999). Development of PCR markers for the wheat leaf rust resistance gene Lr47. Theoretical and Applied Genetics 100: 1137–1143.
Helguera M, Vanzetti L, Soria M, Khan IA, Kolmer J, Dubcovsky J (2005). PCR markers for Triticum speltoides leaf rust resistance gene Lr51 and their use to develop isogenic hard red spring wheat. Crop Science 45: 728–734.
Hommand–Kosak KE, Jones JDG (1997). Plant disease resistance genes. Plant Molecular Biology 48: 575–607.
Huang L, Brooks SA, Li W, Fellers JP, Trick HN, Gill BS (2003). Map–based cloning of leaf rust resistance gene Lr21 from the large and polyploidy genome of bread wheat. Genetics 164: 655–664.
Jiang H, Wang C, Ping L, Tian D, Yang S (2007). Pattern of LRR nucleotide variation in plant resistance genes. Plant Science 173: 253–261.
Kolmer JA (1996). Genetics of resistance to wheat leaf rust. Annual Review Phtology 34: 435–455.
Kulmar S, Dudley J, Nei M, Tamura K (2008). MEGA: A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Briefings in Bioinformatics 9: 299-306.
Li W, Zhang P, Feliers JB, Friebe B, Gill BS (2004). Sequence composition, organization and evolution of the core triticeae. Genome Plant Journal 40: 500-511.
Ling HQ, Qiu J, Singh RP, Keller B (2004). Identification and characterization of an Aegilops tauschii ortholog of the wheat leaf rust resistance gene. Theoretical and Applied Genetics 109: 1133–1138.
Mains EB, Jakson MS (1923). Strains of the leaf rust of wheat in the United States. Phytopathology 13: 36.
McVey DV (1989). Verification of infection–type data for identification of genes for resistance to leaf rust in some hard red spring wheats. Crop Science 29: 304–307.
Mayerse BC, Dickerman AW, Michelmore RW, Sivaramakrishnan S, Sobral BW, Young NY (1999). Plant disease resistance genes encode members of and diverse protein family within the nucleotide–binding superfamily. Plant Journal 20: 317–332.
Neelam K, Brown-Guedira G, Huang L (2013). Development and validation of a breeder-friendly KASPar marker for wheat leaf rust resistance locus Lr21. Molecular Breeding 31: 233–237
Qiu J-W, Schurch AC, Yahiaoui N, Dong L-L, Fan H-J, Zhong Z-J, Keller B, Ling H-Q (2007). Physical mapping and identification of a candidate for leaf rust resistance gene Lr1 of wheat. Theoretical and Applied Genetics 115: 159- 168.
Rowland GC, Kerber ER (1974). Telocentric mapping in hexaploid wheat of genes for leaf rust resistance and other characters derived from Aegilops squarrosa. Canadian Journal of Genetics and Cytology 16: 137-144.
Raupp WJ, Singh S, Brown–Guedira GL, Gill BS (2001). Cytogenetic and molecular mapping of leaf rust resistance Lr39 in wheat. Theoretical and Applied Genetics 102: 347–352.
Rozas, J, Librado p, Sánchez-DelBarrio V, Messeguer X ,Rozas R (2010). Dnasp version 3: an integrated program for molecular population genetics and molecular evolution analysis. Bioinformatics 15: 174-175.
Saghai-Maroof MA, Soliman K, Jorgensen RA, RW Allard (1984). Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosome location and population dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 8014-8018.
Sambroski DJ (1973). Leaf rust of wheat in Canada in 1972. Canadian Plant Disease Survey 52: 168-170.
Saitou N, Nei M (1987). The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4: 406-25.
Sekhwal M, Li P, Lam I, Wang X, Cloutier S, You FM (2015). Disease Resistance Gene Analogs (RGAs) in Plants. International Journal of Molecular Sciences 16: 19248-19290.
Nucleotide diversity of leaf rust resistance genes in resistant and susceptible bread wheat genotypes
Hemati R.1, Mohammadi S.A.*2,3, Aharizadeh S.2
1Former MSc Student in Agricultural Biotechnology, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Tabriz University, Tabriz, Iran.
2
Professor, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Tabriz University, Tabriz, Iran.
3
Cenetr of Excellence in Cereal Molecular Breeding, University of Tabriz, Tabriz, Iran
Abstract
Leaf rust caused by Puccinia triticina, is one of the most important diseases of wheat worldwide. Epidemics of this disease can lead to severe loss of grain yield and nutritional quality. In this study, structural changes and nucleotide diversity in some of the leaf rust resistance genes was investigated in seven bread wheat genotypes. Leaf rust resistance genes or regions linked to the genes were amplified using gene specific primers designed based on the sequences available on GenBank. The amplified fragments were cloned in E. coli and sequenced. Based on the blast results, isolated gene sequences revealed high similarity with resistance gene sequences such as NBS-LRR genes and RGAs. Alignment of the resistant gene sequences with the sequences available in NCBI revealed the similarity of Lr51 with agp2 gene. Lr39 showed 88% similarity with VRN-1 gene a vernilization gene in winter wheat. The result of sequence alignment and grouping revealed structural changes and nucleotide diversity of these genes in the studied wheat genotypes. Synonymous /non synonymous substitution rate (Ka/Ks) in Lr1 gene fragments amplified using Lr1-2, Lr1-3, Lr1-4, Lr21 primer pairs and Lr39 gene was smaller than one indicating negative selection for substitution of amino acid residue in this area of Lr1 and Lr39 genes. In the amplified fragments of Lr1 gene amplified using Lr1-5 primer pair, Ka/Ks was greater than one indicating positive selection for generating diversity in order to replacing an amino acid residue. The studied genotypes had few nucleotides differences for L1, Lr21, Lr39 and Lr51 genes sequences which could use for development of SNP specific primers for identification of resistant and susceptible genotypes.
Key words: Leaf rust, Disease resistance genes, Nucleotide diversity.
* نویسنده مسئول: سید ابوالقاسم محمدی تلفن: 09143114335 Email: mohammadi@tabrizu.ac.ir
1 Transposable Elements
[2] Resistance gene analogs
[3] Receptor Like Kinase
[4] Receptor Like Protein
[5] Nucleotide binding site – Leucine-rich repeats
[6] Ligand
[7] Macrogen
8 National Center for Biotechnology Information
9 N–hydroxycinnamoyl/benzoyltransferas HCBT–Like Putative Pathogenesis Related
10 Negative Selection (Purifying Selection)
11 Positive (or Diversifying) Selection
* Corresponding Author: Mohammadi A. Tel: 0912065060 Email: mohammadi@tabrizu.ac.ir
)