Agrobacterium-mediated transformation of wheat (Triticum aestivum) using chitinase and glucanase genes

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

Production of transgenic wheat (Triticum Aestivum) was studied by chitinase and glucanase genes by Agrobacterium-mediated transformation and also pBI121 plasmid containing neomycin phospho transferasa selectable marker gene under control of Nos promoter. In addition, chitinase and glucanase genes were individually expressed under control of CaMV35S promoter. Immature embryo explants excised from seeds then were co-cultivated with bacterial suspension containing the recombinant plasmid and they were placed to callus induction medium supplemented with 50 mg/l kanamycin. Embryonic calluses, were selected and they were transferred to regeneration medium with 25 mg/l kanamycin in order to producing shoots and roots. Maximum percent of transformation by Agrobacterium-mediated transformation was 0.31% for transformed ARTA with C58 strain and then 0.074% for transformed ARTA with LBA4404 . There was not any transgenic plant in other cultivars or strains and transformation percent was 0%. PCR and Dot blot analysis showed that the putative transgenic plants consist at least one copy of either, chitinase, glucanase and neomycin phospho transferase genes in their genome in comparison with control plants. 

Keywords


تراریزش گیاه گندم بواسطه اگروباکتریوم به منظور انتقال ژن‌های کیتیناز و گلوکاناز

 

نگین محمدی ‌زاده*1، مسعود توحیدفر2، مطهره محسن‌پور3

1کارشناس ارشد بیوتکنولوژی پژوهشکده بیوتکنولوژی کرج  

2عضو هیئت علمی پژوهشکده بیوتکنولوژی کرج

3دانشجوی دکتری دانشگاه مازندران

 

چکیده

به منظور تولید گیاهچه تراریخته گندم Triticum aestivum)) مقاوم به قارچ‌های فوزاریوم و ارایزیف، از 4 سویه اگروباکتریوم LBA4404، AGL،  EHA101و C58، حامل پلاسمید pBI121 نوترکیب، حاوی ژن‌های کیتیناز و گلوکاناز هر کدام به طور جداگانه تحت کنترل پیشبرCaMV35S  و نیز ژن انتخابگر نئومایسین فسفوترانسفراز تحت کنترل پیشبر NOS استفاده شد. ریزنمونه‌های جنین نارس 5 ژنوتیپ از ارقام (مغان، آرتا، سایسون و گاسکوژن) و لاین A، پس از هم‌کشتی با سوسپانسیون باکتری به محیط گزینشی کالوس‌دهی حاوی 50 میلی گرم بر لیتر کانامایسین منتقل شدند. کالوس‌های جنین‌زا پس از رشد در محیط گزینشی، انتخاب و به محیط باززایی حاوی ۲۵ میلی‌گرم بر لیترکانامایسین انتقال یافتند. دراین پژوهش دو گیاهچه حاصل از تلقیح با سویه C58 با درصد تراریزش (31/0) درصد و 1 گیاهچه حاصل از تلقیح با سویه LBA4404 با درصد تراریزش (074/0) درصد از رقم آرتا حاصل شد. در سایر ارقام و سویه‌ها هیچ گیاهچه تراریخته‌ای مشاهده نشد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و آنالیز لکه‌گذاری DNA نشان داد که گیاهان تراریخته احتمالی در مقایسه با شاهد حداقل یک نسخه از ژن‌های کیتیناز، گلوکاناز و نیز نئومایسین فسفوترانسفراز را در ژنوم خود دارا هستند.

کلمات کلیدی: اگروباکتریوم، کیتیناز، گلوکاناز، گندم تراریخته.

 



مقدمه

گندم مهمترین محصول ایران و جهان است. سطح زیر کشت این محصول در دنیا برابر 230-220 میلیون هکتار و در ایران در حدود 5/6 میلیون هکتار است که از سایر غلات بیشتر و برابر 22 درصد سطح زیر کشت کلیه غلات است (Kazemi Arbat, 2005). تولید کل غلات در جهان برابربا 8/1 میلیارد تن می باشد که بیشترین میزان آن (حدود 500 تا 600 میلیون تن) به گندم اختصاص دارد و از نظر سطح زیر کشت و تولید سالانه نیز گندم در درجه اول اهمیت قرار دارد (Safikhani, 2007)، به همین علت غذای عمدة بیش از ۴۰ کشور جهان می‌باشد که جوابگوی ۳۵ درصد جمعیت دنیاست (Bushuk, 1998). در ایران نیز این محصول تامین کننده بیشترین نیاز غذایی کشور بوده و روزانه حدود 47 درصد از کالری مصرفی سرانه کشور را تامین می‌نماید (Safikhani, 2007). بوته‌های گندم در تمام مراحل رشد و در تمام محیط‌های طبیعی در معرض تنش‌های گوناگون مکانیکی، فیزیولوژیکی و زیستی قرار دارند که رشد، عملکرد و تکامل طبیعی آن‌ها را مختل می‌سازد. از جمله عوامل عمده زنده در کاهش عملکرد، بیماری‌های قارچی هستند که بزرگترین و قدیمی‌ترین گروه پاتوژن‌های گندم‌اند (Shahcheraghi and Masoumi, 1997) و از آن جمله می‌توان به قارچ فوزاریوم[1] و ارایزیف‌گرامینیس[2] اشاره کرد. با وجود پیشرفت‌هایی که از طریق روش‌های اصلاحی استاندارد صورت گرفته، اما اصلاح مقاومت به روش‌های مرسوم، یک فرایند سخت، وقت‌گیر و مداوم است، بدان علت که، در اکثر موارد، صفات تحت کنترل چندین ژن بروز یافته و حتی هنگامی که ارقام مقاوم حاصل می‌شوند، به علت نمو دائمی و نیز موتاسیون پاتوژن‌ها، این ارقام نمی‌توانند برای مدت زمان طولانی، مقاومت پایداری از خود نشان دهند (Friesen et al., 2006). در سال‌های اخیر، بیوتکنولوژی گیاهی منبعی سرشار از ابداع و خلاقیت بوده و انتقال ژن‌های مطلوب ویژه را، بدون همراهی با هیچ ژن نا‌مطلوبی، به گیاه زراعی میسر ساخته است (Farsi and Zolala, 2006). ارزیابی ژرم‌پلاسم گندم مقدار بسیار ناچیزی از مقاومت به قارچ را نشان می‌دهد، به همین علت، ورود ژن‌های آنتی‌توکسین و ضد قارچی منحصر به فرد از طریق تراریزش ژنتیکی، موجب افزایش پتانسیل مقاومت در ارقام گندم می شود. ژن‌های ضد قارچی، گروهی از پروتئین‌ها به نام پروتئین‌های مربوط به بیماریزایی را رمز می کنند که موجب تخریب دیواره‌های سلول قارچی، ایجاد اختلال در غشا‌های سلولی آن، تقویت سیستم پاسخ دفاعی میزبان، دخالت در بیماریزایی و سنتز پروتئین‌های ضد قارچی می شوند (Dahleen et al., 2001). یک گروه از این ژن‌ها پروتئین‌هایی مانند β - 1 و3 گلوکاناز و کیتیناز را رمز می‌کنند (Mackintosh et al., 2007). سوبسترای آنزیم کیتیناز، کیتین است. کیتین عبارت است از یک همو‌پلیمر خطی از واحد‌های N ـ استیل‌ ـ دی ‌‌ـ گلوکز آمین که با پیوندهای β ـ 4،1 به هم متصل هستند. کیتیناز پیوند بین کربن‌های 1و4 از دو N - استیل گلوکز امین متوالی در ساختمان کیتین را می‌شکند (Shin  et al., 2008). آنزیم β – 1 و 3 گلوکاناز نیز، پیوند پلی‌ساکارید بین کربن‌های 1و3 در ساختمان گلوکان موجود در دیواره سلولی قارچ را تخریب می‌کند (Leah  et al., 1991). در بافت‌های بیمار تجمع کیتینازها به ویژه به موازات تجمع β– 1 و 3 گلوکاناز‌ها انجام می‌گیرد که این امر موجب ایجاد مقاومت افزایشی به قارچ‌ها می‌شود و در صورت وجود این دو آنزیم در گیاه گندم، این گیاه قادر خواهد بود که مقاومت بهتر و پایداری را در برابر قارچ‌های عامل بیماری زنگ زرد، قهوه‌ای، سیاهک، سفیدک و فوزاریوم از خود نشان دهد. بنابراین مهندسی ژن‌های رمز کننده کیتیناز به همراه سایر ژن‌های رمز کننده پروتئین‌های ضد قارچی در گیاهان، حفاظت آنها را در برابر پاتوژن‌های قارچی افزایش می‌دهد (Tohidfar  et al., 2005). این مسیر می‌تواند منجر به کنترل طیف وسیعی از پاتوژن‌های قارچی گردد (Mauch  et al.,1988). تکنولوژی نوین مهندسی ژنتیک، ورود نه تنها یک ژن، بلکه چندین ژن را، با روش‌های دقیق، قابل کنترل و قابل پیش‌بینی‌تر از آنچه در روش‌های مرسوم اصلاحی انجام می‌شده است، فراهم می‌کند. بنابراین به‌کار‌گیری مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی برای فراهم نمودن غذا جهت رویارویی با نیازمندی‌ها در آینده نزدیک مورد نیاز است و می‌توان پیشرفت‌های زیادی را در چارچوب زمانی کوتاه‌تر نسبت به روش‌های مرسوم که در گذشته صورت گرفته‌اند، انجام داد (Kole and Timothy, 2008). هدف از این پژوهش، تراریزش گندم با استفاده از دو ژن کیتیناز و گلوکاناز برای مقاومت به بیماری‌های قارچی به ویژه فوزاریوم[3] و ارایزیف[4] می‌باشد که می‌تواند به کاهش مصرف سموم قارچکش منجر گردد.

 

مواد گیاهی

بذور 4 رقم تجاری گندم نان شامل ارقام پائیزه (سایسون و گاسکوژن) و ارقام بهاره (آرتا، مغان) و نیز لاین A از بخش غلات موسسه تحقیقات و اصلاح نهال و بذر کرج تهیه و به عنوان مواد گیاهی استفاده شد.

سازه ژنی و سویه‌های باکتری

در این پژوهش از 4 سویه اگروباکتریوم نوترکیب شامل LBA4404، AGL،  EHA101و C58، حامل پلاسمید pBI121-ChiGlu(-) (Mohsenpour  et al., 2008)، به منظور تلقیح ریز‌نمونه‌‌ها استفاده شد. همچنین جنین نارس گندم به عنوان ریز‌نمونه جهت تراریزش با اگروباکتریوم مورد استفاده قرار گرفت.

 

آماده‌سازی سوسپانسیون باکتریایی تلقیح

سویه‌های اگروباکتریوم جهت انتقال ژن، در محیط LB مایع حاوی 50 میلی‌گرم‌ بر‌ لیتر کانامایسین و 75 میلی‌گرم‌ بر‌ لیتر ریفامپیسین، در دمای 28 درجه سانتی‌گراد در دستگاه شیکر - انکوباتور با دور rpm200 کشت شدند‌. پس از طی مدت زمان 22-18 ساعت، به منظور افزایش کارایی تراریزش، 500 میکرولیتر از محلول باکتری رشدیافته به همراه ماده القاء‌گر استوسرینگون با غلظت 400 میکرو مولار، به 3 میلی‌لیتر محیط LB جدید حاوی آنتی‌بیوتیک‌های کانامایسین و ریفامپیسین اضافه شده و برای رشد باکتری‌های تازه، در دستگاه شیکر – انکوباتور قرار گرفت، nm٦۰۰OD مناسب باکتری جهت تلقیح در این پژوهش 2/1-1 در نظر گرفته شد.

آماده‌سازی و تلقیح ریزنمونه‌ها

در ادامه، بذور مورد آزمایش در گلدان کشت و پس از طی کلیه مراحل داشت در گلخانه، بذور نارس آنها در فاصله زمانی 12 الی 18 روز پس از گرده‌افشانی برداشت شد. بذور نارس ابتدا به مدت 5 دقیقه در الکل 70 درصد ضد‌عفونی و سپس آبشویی شده، پس از آن به مدت 20 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد به طور کامل ضد‌عفونی شدند و پس از آبشویی و خشک شدن بر روی کاغذ خشک‌کن استریل در مقابل هود کشت، در زیر میکروسکوپ جدا شده و بر روی پتری دیش‌‌های حاوی 35 میلی‌لیتر محیط کشت کالوس‌دهی شامل نمک‌ها و ویتامین‌های MS، ۲ میلی‌گرم‌بر‌لیتر توفوردی، ۴۰ میلی‌گرم‌بر‌لیتر تیامین، 200 میلی‌گرم‌بر‌‌‌‌‌‌‌‌‌لیتر کازئین، ۵۰۰ میلی‌گرم‌بر‌لیتر گلوتامین، ۳۰ گرم‌بر‌لیتر ساکارز، ۸ گرم‌بر‌لیتر آگار و ۸/5pH=  قرار گرفتند، به گونه‌ای که سپرچه جنین رو به بالا و سمت دیگر آن که بر اثر برش مریستم ساقه-ریشه، زخمی شده، بر روی محیط قرار گیرد. پس از آن محلول باکتری با 2/1-1 = nm٦۰۰OD، به وسیله سمپلر بر روی تک تک ریز نمونه‌ها قطره‌گذاری شد. سپس جنین‌های نارس آغشته به باکتری، به مدت 20 دقیقه در مقابل هود خشک شده و پس از بستن درب پتریدیش، به مدت ۲ الی ۳ روز تحت شرایط تاریکی و دمای 26 درجه سانتی گراد در فیتوترون قرار گرفتند. این زمان جهت رشد و نفوذ باکتری به جنین مورد نیاز است. پس از طی این مدت، جنین‌ها با محلول سفوتاکسیم با غلظت 250 میلی‌گرم‌ بر‌ لیتر شستشو و بر روی کاغذ صافی خشک شدند.

 

باززایی گیاهچه‌های تراریخته احتمالی

جنین‌های تلقیح شده به محیط کالوس‌دهی انتخابی حاوی 50 میلی‌گرم‌ بر‌ لیتر کانامایسین و 250 میلی‌گرم ‌بر ‌لیتر سفوتاکسیم جهت کنترل رشد باکتری منتقل شده و تحت شرایط تاریکی و دمای ۲٦ درجه سانتی‌گراد در فیتوترون به مدت ۱۵ تا ۱۸ روز نگهداری شدند. در طی این مدت، فاکتور‌هایی نظیر درصد کالوس‌دهی (نسبت کالوس‌های تولید شده به کل جنین‌های نارس × 100) و درصد جنین‌زایی (نسبت کالوس‌های جنین‌زا به کل کالوس‌ها × 100) بررسی شد. پس از طی مدت زمان کالوس‌دهی، کالوس‌های جنین‌زا به محیط باززایی انتخابی شامل نمک‌ها و ویتامین‌های MS، 2 میلی‌گرم‌بر‌لیترBAP، ۱/۰ میلی‌گرم‌بر‌لیتر IAA، ۳۰ گرم‌بر‌لیتر ساکارز، ٧ گرم‌ بر ‌لیتر آگار و ٧/۵ pH= به همراه 25 میلی‌گرم‌ بر‌ لیتر کانامایسین و 250 میلی‌گرم‌ بر‌ لیتر سفوتاکسیم جهت کنترل رشد باکتری و همچنین تحریک شاخه‌زایی و ریشه‌زایی، تحت شرایط دمایی ۲٦ درجه سانتی‌گراد و ۱٦ ساعت نور با شدت 10000 لوکس و ۸ ساعت تاریکی، به فیتوترون، انتقال یافتند. کالوس‌های جنین‌زا، به رنگ کرم روشن بوده و ظاهری ترد و شکننده دارند. در مراحل بعدی با مشاهده شاخه‌زایی، آنتی‌بیوتیک‌ها از محیط حذف شده و گیاهچه‌های باززا شده، به محیط باززایی حاوی ۵/۱ گرم‌بر‌لیتر ذغال فعال جهت تولید ریشه منتقل شدند. واکشت نمونه‌ها هر دو هفته یکبار انجام و فاکتور‌هایی نظیر درصد شاخه‌زایی (نسبت کالوس‌های جنین‌زای شاخه‌دار‌شده به کل کالوس‌های جنین‌زا × 100) و ریشه‌زایی (نسبت گیاهچه‌ها و کالوس‌های جنین‌زا‌ی ریشه‌دار‌شده به کل کالوس‌های جنین‌زا × 100) و در صد تراریزش (نسبت گیاهچه‌های تراریخته به کل جنین‌های نارس تلقیح‌شده با اگروباکتریوم × 100) بررسی شد. گیاهچه‌های باززاشده در درون شیشه، ابتدا به گلدان‌های کوچک در شرایط فیتوترون و سپس به گلدا‌ن‌های بزرگ در شرایط گلخانه منتقل شدند.

 

تائید مولکولی گیاهچه‌های تراریخته

استخراج DNA از برگ گیاهچه‌های گندم به روش دلاپورتا (Dellaporta et al., 1983) انجام گرفت. به منظور اثبات تلفیق ژن‌های کیتیناز، گلوکاناز و nptII، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در حجم 25 میکرولیتری حاوی یک واحد آنزیم DNA پلیمراز Taq، 25 نانوگرم DNA، 5/2 میکرولیتر dNTPs (2/0 میلی مولار)، 2 میکرولیتر MgCl2 (25 میلی‌مولار) و 5/2 میکرولیتر بافر X10 PCR و 10 پیکو‌مول از آغازگر‌های اختصاصی انجام گرفت. برای اثبات حضور ژن کیتیناز از آغاز‌گر‌های اختصاصی رو به عقب ژن کیتیناز و رو به جلو پیشبر CaMV35S استفاده شد. همچنین جهت اثبات حضور ژن گلوکاناز نیز از آغازگر‌های اختصاصی رو به عقب ژن گلوکاناز و رو به جلو پیشبر CaMV35S استفاده شد. برای هر دو ژن، واکنش در 94 درجه سانتی‌گراد 5 دقیقه و 35 چرخه (هر چرخه شامل یک دقیقه در 94 درجه، 30 ثانیه در 60 درجه و یک دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد و تکمیل بسط در 72 درجه 7 دقیقه) انجام شد. این برنامه، برای اثبات تلفیق ژن نشانگر انتخابی nptII در ژنوم گیاهان تراریخته احتمالی، با استفاده از آغاز‌گر‌های اختصاصی رو به عقب و رو به جلو ژن نئومایسین فسفو‌ترانسفراز، با دمای بهینه اتصال 58 درجه سانتی‌گراد انجام شد. در هر سه واکنش از نمونه آب (فاقد هر گونه DNA ) و DNA گیاه شاهد به عنوان کنترل منفی و از نمونه پلاسمید به عنوان کنترل مثبت، برای تائید تراریزش گیاه استفاده گردید. همچنین برای تایید بیشتر تلفیق ژن، آزمون لکه گذاری DNA با استفاده از کاوشگرهای اختصاصی برای ژن nptII و پیشبر CaMV35S، براساس روش Sambrook and Russell (2001) انجام شد. عمل نشاندار کردن کاوشگر‌ها نیز به روش کیتDIG Labeling شرکت Roche انجام شد. توالی آغازگر‌ها در جدول 1 آمده است. برای اثبات حضور ژن کیتیناز، با آغازگرهای اختصاصی رو به عقب ژن کیتیناز و رو به جلو پیشبر CaMV35S و برای اثبات حضور ژن گلوکاناز با آغازگرهای اختصاصی رو به عقب ژن گلوکاناز و رو به جلو پیشبر CaMV35S و نیز برای اثبات حضور ژن nptII با آغاز‌گر‌های اختصاصی رو به عقب و رو به جلو ژن نئومایسین فسفو‌ترانسفراز، بررسی شدند.

 

 


جدول 1- آغازگر‌های مورد استفاده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز جهت تایید تراریزش گیاهان تراریخته احتمالی.

توالی

Sequence

آغازگر ها

Primersا

 قطعه تکثیری (bp)

Amplified Fragment

گلوکاناز

gluconase

Forward : CAGGTCCAAGGGCATCAACG

Reverse : CTCCGACACCACCACCTTC

629

کیتیناز

chitinase

Forward : GAGTGGTGTGGATGCTGTTG

Reverse : GCCATAACCGACTCCAAGCA

872

نئومایسین فسفوترانسفراز

nptII

Forward : GAACAAGATGGATTGCACGC Reverse : GAAGAACTCGTCAAGAAGGC

786

35S پیشبر

35S Promoter

Forward : CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG

Reverse : TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTC

123

35S کیتیناز-

35S- chitinase

 

Forward : CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG Reverse : GCCATAACCGACTCCAAGCA

1096

35S گلوکاناز-

35S- gluconase

Forward : CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG

Reverse : TCTCCGACACCACCACCTTC

972

       

Table 1- Primers used in PCR analysis for accuracy of putative transgenic plants.

 


نتایج

در این تحقیق 5 گیاهچه باززا شده رقم آرتا بدست آمد که از میان آن‌ها 3 گیاهچه، شامل 1 گیاهچه حاصل تلقیح با سویه LBA4404 با درصد تراریزش اولیه 074/0 درصد و دو گیاهچه حاصل تلقیح با سویه C58 با درصد تراریزش اولیه 31/0 درصد، تراریختی را نشان دادند (جدول 2). بیشترین درصد کالوس‌دهی 77 درصد و بیشترین درصد شاخه‌زایی 1/2 درصد مربوط به رقم آرتا تلقیح شده با سویه LBA4404 و بیشترین درصد جنین‌زایی 3/23 درصد و نیز بیشترین درصد ریشه‌زایی 9/1 درصد مربوط به رقم آرتا تلقیح شده با سویه C58 بدست آمد (جدول 2). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز نشان داد که 3 گیاهچه تراریخته احتمالی در مقایسه با شاهد، حداقل یک نسخه از ژن‌های کیتیناز، گلوکاناز و نئومایسین فسفوترانسفراز ((nptII را در ژنوم خود دارا هستند (شکل های 4، 5 و 6). آنالیز لکه‌گذاری DNA تلفیق ژن‌های فوق را در ژنوم این 3 گیاهچه در مقایسه با گیاه شاهد نشان داد که تائید بیشتری بر نتایج حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بود. این 3 گیاه، در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و آزمون لکه‌گذاری DNA پاسخ مثبت نشان دادند (شکل های 7 و 8).

 

 

 

شکل 1- وکتور دوگانه pBI121 نوترکیب حاوی ژن‌های کیتیناز و گلوکاناز.

Figure 1- pBI121 Recombinant binary vector containing chitinase and gluconase genes.

 

 

شکل 2- گیاهچه آلبینو در محیط کشت دارای آنتی بیوتیک کانامایسین.

Figure 2- Albino explants in medium containing kanamycin.

 

 

 

جدول 2- فراوانی تراریزش گیاهچه های باززا شده از جنین های نارس گندم در تراریزش با اگروباکتریوم.

درصد تراریزش*

The percent of transformation

تعداد گیاهچه تراریخت

The number of transgenic explant

درصد ریشه زایی

The percent of rooting

درصد شاخه زایی

The percent of shooting

درصد جنین زایی

The percent of embryogenesis

درصد کالوس دهی

The percent of callus induction

تعداد ریز نمونه جنین نارس

The number of immature embryo

سویه اگروباکتریوم

Agrobacterium strain

ارقام

cultivars

0

0

0.09

0.03

1.7

9

315

LBA4404

سایسون  Sison

0

0

0.02

0.1

2.5

15

470

LBA4404

گاسکوژن Gascogen

0

0

1.2

1.7

12

37

425

LBA4404

مغان Mogan

0.074

1

1.8

2.1

21

77

1350

LBA4404

آرتا Arta

0

0

0.7

1.2

5.5

17

65

LBA4404

لاین A:Line A

0

0

0.04

0.15

2.2

11

125

AGL

سایسون Sison

0

0

0.01

0.02

2.7

16.5

245

AGL

گاسکوژن Gascogen

0

0

1.3

1.1

13.6

42

273

AGL

مغان Mogan

0

0

1.4

1.2

19.5

65

520

AGL

آرتا Arta

0

0

1.2

0.8

6.8

15.1

42

AGL

لاین A: Line A

0

0

0

0.04

1.3

7.8

75

EHA101

سایسون Sison

0

0

0

0.25

1.6

12

87

EHA101

گاسکوژن Gascogen

0

0

1.4

1.86

11

32

145

EHA101

مغان Mogan

0

0

0.98

1.15

16.2

67

240

EHA101

آرتا Arta

0

0

1.1

1

7.7

15.6

35

EHA101

لاین A: Line A

0

0

0

0

2.1

8.2

335

C58

سایسون Sison

0

0

0

0

1.8

10

546

C58

گاسکوژن Gascogen

0

0

1.03

1.8

10.5

47

377

C58

مغان Mogan

0.31

2

1.9

1.83

23.3

72

630

C58

آرتا Arta

0

0

0.9

0.3

4.9

12.7

28

C58

لاین A: Line A

 

* درصد تراریزش از (نسبت گیاهچه‌های تراریخت به تعداد جنین‌های نارس تلقیح شده با اگروباکتریوم × 100)، بدست آمد.

Table 2- Transformation Frequency of regenerated explants from wheat immature embryo using Agrobacterium-mediated transformation.

 

 

استفاده از آنتی‌بیوتیک کانامایسین به عنوان نشانگر انتخابی در محیط‌های کشت کالوس‌دهی و باززایی اثرات سوئی نظیر عدم شاخه‌زایی، عدم ریشه‌زایی و فراوانی بالای آلبینیسم را به همراه داشت. نتایج حاصل از این مشاهدات نشان دادند که آنتی‌بیوتیک کانامایسین به میزان 50 میلی‌گرم بر لیتر در محیط کالوس‌دهی و باززایی موجب عدم باززایی می‌شود. همچنین با استفاده از مقادیر 50 میلی‌گرم بر لیتر کانامایسین در محیط کالوس‌دهی و 25 میلی‌گرم بر لیتر در محیط باززایی، شاخه زایی به میزان بسیار کم دیده شد که این تعداد نیز پس از چند روز دچار رنگ‌پریدگی شده و در نهایت آلبینیسم را نشان دادند (شکل 2). با حذف کانامایسین از محیط‌ کالوس‌دهی و استفاده از غلظت 25 میلی‌گرم بر لیتر در محیط باززایی، شاخه‌زایی بطور بارز مشاهده شد اما ریشه‌زایی دیده نشد. گیاهچه‌های فوق نیز پس از مدتی دچار رنگ‌پریدگی شدند. با انتقال گیاهچه‌ها به محیط باززایی فاقد کانامایسین و حاوی 5/1 گرم در لیتر ذغال فعال، رنگ سبز گیاهچه‌ها مجددا پدیدار شد. ذغال فعال در محیط باززایی، علاوه بر جلوگیری از تولید ترکیبات فنولی که موجب عدم ریشه‌زایی می شوند، محیطی کم نور، مناسب با رشد ریشه را نیز فراهم می‌آورد (شکل 3- ج). از این رو، به منظورجلوگیری از تاثیر سوء آنتی‌بیوتیک کانامایسین بر باززایی ارقام آرتا، مغان، سایسون، گاسکوژن و نیز لاین A، کالوس‌های جنین‌زا که دارای ظاهری ترد و شکننده و رنگ کرم روشن بودند، در محیط کالوس‌دهی و باززایی فاقد کانامایسین قرار گرفتند. مراحل مختلف رشد گیاهچه تراریخته احتمالی در شکل 3 نشان داده شده است. هر 3 گیاهچه باززا شده، به واکنش زنجیره ای پلیمراز (شکل4، 5 و 6 ) و آزمون لکه‌گذاری DNA (شکل های 7 و 8) پاسخ مثبت نشان دادند و تراریزش آنها حداقل در وجود یک نسخه از هر کدام از ژن‌های کیتیناز، گلوکاناز و نئومایسین‌فسفو‌ترانسفراز تایید شد. آزمون لکه‌گذاری DNA، حضور ژن نئومایسین فسفوترانسفراز و پیشبر CaMV35S، رادر 3 گیاه تراریخته تایید کرد.

 

 

 

 

 

 

 

A

 

 

B

 

 

C

 
 

 

D

 

E

 

 

F

 

شکل 3- مراحل مختلف رشد گیاه تراریخته. الف) کالوس در ابتدای باززایی، ب) کالوس باززا شده، ج) گیاهچه باززا شده در شیشه، د) گیاهچه باززا شده در گلدان، ه) انتقال گیاهچه‌ها به گلخانه، ی) بذور تراریخته.

Figure 3- different stages of transgenic plant growth. (A) initial callus regeneration, (B) regenerated callus, (C) invitro regenerated explants, (D) regenerated explant in pot, (E) transferring explants to green house, (F) transgenic seeds.

 

 

 

شکل 4- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغازگر‌های اختصاصی رو به جلو و رو به عقب ژنnptII  برای اثبات تراریختی رقم آرتا، M، نشانگر وزن ملکولی DNA (plus  1 Kb)، چاهک 1 پلاسمید (کنترل مثبت)، چاهک 2 گیاه شاهد، چاهک 3 گیاه تراریخته آرتا تلقیح شده با سویه LBA4404، چاهک 4 و 5 گیاهان تراریخته آرتا تلقیح شده با سویه C58، چاهک 6 نمونه آب (واکنش PCR بدون الگوی DNA).

 

Figure 4- PCR analysis using nptII gene forward and reverse specific primers for accuracy of Arta cultivar transformation, M : DNA molecular weigth (1 Kb plus) ladder, lane 1 : plasmid (positive control), lane 2 : control plant, lane 3 : Arta transgenic plant inoculated by LBA4404 strain, lane 4 and 5 : Arta transgenic plants inoculated by C58 strain, lane 6 : water sample (PCR reaction without DNA template).

 

 

 

 

شکل 5- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغاز‌گر‌های اختصاصی رو به جلوی پیشبر CaMV 35S و رو به عقب ژن کیتیناز برای اثبات تراریختی رقم آرتا، M، نشانگر وزن ملکولی DNA ( 1 Kb)، چاهک 1 . پلاسمید (کنترل مثبت)، چاهک 2 . نمونه آب (واکنش PCR بدون الگوی DNA )، چاهک 3 و 4 . گیاهان تراریخته آرتا تلقیح شده با سویه C58، چاهک 5 . گیاه شاهد، چاهک 6 . گیاه تراریخته آرتا تلقیح شده با سویه LBA4404.

Figure 5- PCR analysis using CaMV 35S  forward and chitinase gene reverse primers for accuracy of Arta cultivar transformation, M : DNA molecular weigth (1 Kb) ladder, lane 1 : plasmid (positive control), lane 2 : water sample (PCR reaction without DNA template), lane 3 and 4 : Arta transgenic plants inoculated by C58 strain, lane 5 : control plant, lane 6 : Arta transgenic plant inoculated by LBA4404 strain.

 

 

شکل 6- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغاز‌‌گر‌های اختصاصی رو به جلوی پیشبر CaMV 35S و رو به عقب ژن گلوکاناز برای اثبات تراریختی رقم آرتا، M، نشانگر وزن ملکولی DNA (1 Kb)، چاهک 1 پلاسمید (کنترل مثبت)، چاهک 2 نمونه آب (واکنش PCR بدون الگویDNA (، چاهک 3 و 4 گیاهان تراریخته آرتا تلقیح شده با سویه C58، چاهک 5 گیاه تراریخته آرتا تلقیح شده با سویه  LBA4404، چاهک 6 گیاه شاهد.

 

Figure 6- PCR analysis using CaMV 35S  forward and gluconase gene reverse primers for accuracy of Arta cultivar transformation, M : DNA molecular weigth (1 Kb) ladder, lane 1 : plasmid (positive control), lane 2 : water sample (PCR reaction without DNA template), lane 3 and 4 : Arta transgenic plants inoculated by C58 strain, lane 5 : Arta transgenic plant inoculated by LBA4404 strain, lane 6 : control plant.

 

 

 

شکل 7- آزمون لکه‌گذاری برای اثبات تراریختی گندم با استفاده از کاوشگر تهیه شده برای پیشبر CaMV35S. نمونه 1، 3 و 4 گیاهچه‌های تراریخت، نمونه 2 پلاسمید (کنترل مثبت)، نمونه 5 گیاه شاهد(کنترل منفی).

Figure 7- Dot blot analysis for accuracy of wheat transformation using synthesized prob of CaMV35S promoter, sample 1,3 and 4 : transgenic plants, sample 2 : plasmid (positive control), sample 5 : control plant (negative control).

 

شکل 8- آزمون لکه‌گذاری برای اثبات تراریختی گندم با استفاده از کاوشگر تهیه شده برای ژن نئومایسین فسفوترانسفراز. نمونه 1 گیاه شاهد(کنترل منفی)، نمونه 2، 3 و 4 گیاهچه‌های تراریخت، نمونه 5 پلاسمید (کنترل مثبت(

Figure 8- Dot blot analysis for accuracy of wheat transformation using synthesized prob of nptII gene, sample 1 : control plant (negative control), Sample 2 ,3 and 4 : transgenic plants, sample 5 : plasmid (positive control).

 

 


بحث

با وجود آنکه انتقال ژن به روش زیست‌پرتابی روشی موفق برای تراریزش ژنتیکی گندم بوده و بدون وجود هر گونه محدودیت بیولوژیکی یا محدودیت میزبانی، به طور رایج، برای تولید مفید ژرم پلاسم گندم تراریخت مورد استفاده قرار می‌گیرد، (Rakszegi  et al., 2001)، اما به علت ورود چندین نسخه از ژن خارجی گرایش بالا برای خاموشی ژن و در نتیجه کارایی کم تراریزش را به همراه دارد (Montemurro et al., 2008). در مقابل، استفاده از روش انتقال ژن به واسطه اگروباکتریوم مزایای متعددی از جمله، توانایی انتقال و الحاق قطعه DNA با بازآرایی کمتر درون ژنوم میزبان، ورود تعداد نسخه‌های کمتر و پایدار ژن خارجی، عدم حضور توالی‌های بدنه ناقل و نیز هزینه کمتر آزمایشات را در پی خواهد داشت، علاوه بر آن در تراریزش به واسطه اگروباکتریوم، DNA در صورت ورود به درون ناحیه فعال رونویسی، فعالیتی مطمئن از رونویسی و بیان ژن‌های خارجی را نشان می‌دهد. با این حال کاربرد این روش در مقیاس گسترده در ژنوتیپ‌های مختلف دارای محدودیت است (Patnaik  et al., 2006). فاکتور‌هایی مانند ژنوتیپ، سویه اگروباکتریوم، ریزنمونه، ناقل دوگانه، نشانگر انتخابی، پیشبر، شرایط و محیط‌های تلقیح و هم‌کشتی، تیمار‌های اسمزی، غلظت اگروباکتریوم، کشت بافت و محیط باززایی ممکن است بر سودمندی تراریزش و بهبود پایداری سلول‌های گیاهی، پس از آلوده‌سازی با اگروباکتریوم تاثیر بگذارند (Montemurro et al., 2008). با ارزیابی صفات (کالوس‌دهی، جنین‌زایی، شاخه‌زایی و ریشه‌زایی) در ارقام (سایسون، گاسکوژن، آرتا، مغان) و لاین A، مشاهده شد که ارقام بهاره در مقایسه با ارقام پائیزه، پس از تراریزش با اگروباکتریوم، عملکرد مناسب‌‌تری در جهت تراریختی از خود نشان می‌دهند. یکی از دلایل مهم که می‌توان به آن اشاره کرد، نوع ژنوتیپ است. همانطور که گفته شد، تراریزش با اگروباکتریوم به نوع ژنوتیپ‌ها و واریته‌های مورد آزمایش بستگی دارد و فقط تعداد محدودی از واریته‌ها تراریخته می‌شوند، که اساسا به علت تفاوت‌های زیاد در توانایی تولید کالوس و باززایی در میان واریته‌های گندم پس از آلوده‌سازی با اگروباکتریوم اتفاق می‌افتد (Machii  et al., 1998). در روش انتقال ژن به واسطه اگروباکتریوم، تراریزش حاصل تلفیق ژن خارجی در کروموزوم گیاه می‌باشد. به همین علت برای انتخاب کالوس‌های تراریخته احتمالی، از ژن‌های نشانگر انتخابی که به همراه ژن‌های هدف در ژنوم میزبان وارد می‌شوند، استفاده می شود. ژن نئومایسین فسفو‌ترانسفراز (nptII)، موجب مقاومت گیاه در برابر آنتی‌بیوتیک کانامایسین می‌شود، همچنین به دلیل اینکه این ژن همراه با ژن‌های کیتیناز و گلوکاناز بر روی پلاسمید قرار دارد، با انتخاب گیاه بر اساس مقاومت به این آنتی‌بیوتیک در محیط کشت، به طور غیر‌‌مستقیم نه با احتمال 100 درصد، گیاهانی که حاوی ژن‌های هدف می‌باشند، انتخاب می‌گردند. با این وجود در این تحقیق پس از اعمال آنتی‌بیوتیک کانامایسین در محیط‌های کشت کالوس‌دهی و باززایی، پدیده هایی نظیر عدم شاخه‌زایی، عدم ریشه‌زایی و آلبینیسم به میزان بالایی بیش از حد انتظار دیده شد. نتایج بدست آمده از مشاهدات این نکته را بیان داشت که آنتی‌بیوتیک کانامایسین حتی در مقادیر کم نیز موجب از بین رفتن سبزینه گیاه در ارقام فوق شده و از ریشه‌زایی آنها جلوگیری به عمل می‌آورد، از این‌رو بهتر است به جای کانامایسین از آنتی‌بیوتیک دیگری نظیر جنیتیسین استفاده کرد. در ادامه با حذف آنتی‌بیوتیک کانامایسین از محیط کشت باززایی، اکثریت کالوس‌های جنین‌زا به تدریج شاخه‌زایی، ریشه‌زایی و نیز باززایی را نشان دادند، سپس از طریق واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و آنالیز لکه‌گذاری DNA تراریختی آن‌ها بررسی شد. نکته بسیار مهم دیگر در این تحقیق، وجود توالی‌هایی مشابه با ژن‌های کیتیناز و گلوکاناز در ژنوم گیاه شاهد است به همین علت استفاده از این ژن‌ها برای تشخیص تراریختی گیاه به دلیل دیده شدن باند مورد انتظار در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز گیاه شاهد، با مشکل مواجه خواهد شد. استفاده از آغاز‌گر‌های طراحی شده نظیر توالی پیشبر، توالی پایانبر و نیز نشانگر انتخابی، به تنهایی و یا همراه با یکی از آغازگر‌های ژن‌های کیتیناز و گلوکاناز، به علت هم‌جواری با این ژن ها در ناحیه T-DNA و در نتیجه عدم حضور این توالی ها در ژنوم گیاه غیر‌تراریخت، اثبات تراریزش را ممکن خواهد ساخت. انتظار می‌رود گیاهان حاصل با دریافت دو ژن کد‌کننده پروتئین‌های ضد‌قارچی مقاومت پایداری را نسبت به بیماری‌های قارچی از خود نشان دهند. از این رو آنالیز‌های‌ بیشتری برای اثبات حضور و بیان ژن‌های وارد شده و نیز آزمایشات زیست‌سنجی جهت اثبات مقاومت به بیماری‌های قارچی و در نهایت آنالیز نسل‌های تراریخته برای اثبات پایداری ژن در آینده مورد نیاز خواهد بود.

 

 

منابع

 

Bushuk W (1998). Wheat breeding for end product use. Euphytica 100: 137-145

Dahleen L, Okubara PA, Blech AE (2001). Transgenic Approaches to Combat Fusarium Head Blight in Wheat and Barley. Crop Science 41: 628–637.

Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB (1983). A plant DNA mini preparation: version II. Plant Molcular Biology Report 1:19-21.

Farsi M, Zolala J (2006). Principle of Plant Biotechnology. Publication of Mashhad ferdosi university. Pp. 425.

Friesen TL, Stukenbrock EH, Liu Z, Meinhardt S, Ling H, Faris JD, Rasmussen JB, Solomon PS, McDonald BA, Oliver RP (2006). Emergence of a new disease as a result of interspecific virulence transfer. Natural Genetics 38:953–956.

Kazemi Arbath H (2005). Cereal Morphology and Physiology. Tabriz university Publication. Pp. 104

Kole C, Timothy C  )2008(. Compendium of Transgenic Crop Plants: Transgenic Cereals and Forage Grasses. Blackwell Publishing Ltd. ISBN 978-1-405-16924-0.

Leah R, Tommerup H, Svendsen I, Mundy J (1991). Biochemical and molecular characterization of three barley seed proteins with anti-fungal properties. Journal Biological Chemistry 266:1464-1473.

Machii H, Mizuno H, Hirabayashi T, Li H, Hagio T (1998). Screening wheat genotypes for high callus induction and regeneration capability from anther and immature embryo cultures. Plant Cell Tissue and Organ. Culture 53: 67-74.

Mackintosh CA, Lewis J, Radmer LE, Shin S, Heinen SJ, Smith LA, Wyckoff MN, Muehlbauer GJ (2007). Overexpression of defense response genes in transgenic wheat enhances resistance to Fusarium Head Blight. Plant Cell Report 26:479–488.

Mauch F, Mauch Mani B, Boller T (1988). Antifungal hydrolases in pea tissue, II: Inhibitation of fungal growth by combination of chitinase and beta-1,3-glucanase. Plant Physiology 88: 936-942.

Mohsenpour M, Babayian jelodar NA, Tohidfar M, Habashi AA (2008). Design and Constract of Four Recombinant Plasmid Vector for Plant transformation by Chitinase, Glucanase and Bt genes. Journal of Agricultural Science and Natural resources of Gorgan 4: 68-80.

Montemurro C, Sabatta W, Stinbiss HH, Soltesz A, Blanco A, Crosatti C (2008). Agrobacterium-mediated transformation in durum wheat. Poster Abstract – E.09.

Patnaik D, Vishnudasan D, Khurana P (2006). Current Science 3:307-330.

Rakszegi M, Tamas S, Szucs P, Tamas L, Bedo Z (2001). Current status of wheat transformation. Plant Biotechnology 3:67-81.

Safikhani S (2007). Monthly of Domestic animal. Plant and Industry. 94: 58

Sambrook J, Russell DW (2001). Molecular cloning. A Laboratory manual. 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA.

Shahcheraghi M, Masoumi M (1997). Guide of Wheat diseases. Publication center of Tehran University 11-36.

Shin S, Mackintosh CA, Lewis J, Heinen SJ, Radmer L, Dill Macky R, Baldridge GD, Zeyen RJ, Muehlbauer GJ (2008). Transgenic wheat expressing a barley class II chitinase gene has enhanced resistance against Fusarium graminearum. Journal of Experimental Botany 9:2371–2378.

Tohidfar M, Mohammadi M, Ghareyazie B (2005). Agrobacterium-mediated transformation of cotton (Gossypium hirsutum) using a heterologous bean chitinase gene. Plant Cell Tissue Organ and Culture 83: 83–96.

 


 

Agrobacterium-mediated transformation of wheat (Triticum aestivum) using chitinase and glucanase genes

 

Mohammadizadeh N.*1, Tohidfar M. 2, Mohsenpour M. 3

 

1 MSc of Agricultural Biotechnology Institute, Karaj, Iran

2 Academic member of Agricultural Biotechnology Institute, Karaj, Iran

3 PhD student of Mazandaran University, Sari, Iran

 

 

Abstract

Production of transgenic wheat (Triticum Aestivum) was studied by chitinase and glucanase genes by Agrobacterium-mediated transformation and also pBI121 plasmid containing neomycin phospho transferasa selectable marker gene under control of Nos promoter. In addition, chitinase and glucanase genes were individually expressed under control of CaMV35S promoter. Immature embryo explants excised from seeds then were co-cultivated with bacterial suspension containing the recombinant plasmid and they were placed to callus induction medium supplemented with 50 mg/l kanamycin. Embryonic calluses, were selected and they were transferred to regeneration medium with 25 mg/l kanamycin in order to producing shoots and roots. Maximum percent of transformation by Agrobacterium-mediated transformation was 0.31% for transformed ARTA with C58 strain and then 0.074% for transformed ARTA with LBA4404 . There was not any transgenic plant in other cultivars or strains and transformation percent was 0%. PCR and Dot blot analysis showed that the putative transgenic plants consist at least one copy of either, chitinase, glucanase and neomycin phospho transferase genes in their genome in comparison with control plants. 

Key word: Agrobacterium, chitinase, glucanase, transgenic wheat

 



* نویسنده مسئول: نگین محمدی‌زاده                  تلفن: 09133706936                   Email: ne.mohammadi@yahoo.com

 

[1] Fusarium

[2] Erysiph graminis

[3] Fusarium

[4] Erysiph

*   Corresponding Author: N. Mohammadizadeh         Tel: 09133706936        Email: ne.mohammadi@yahoo.com

Bushuk W (1998). Wheat breeding for end product use. Euphytica 100: 137-145
Dahleen L, Okubara PA, Blech AE (2001). Transgenic Approaches to Combat Fusarium Head Blight in Wheat and Barley. Crop Science 41: 628–637.
Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB (1983). A plant DNA mini preparation: version II. Plant Molcular Biology Report 1:19-21.
Farsi M, Zolala J (2006). Principle of Plant Biotechnology. Publication of Mashhad ferdosi university. Pp. 425.
Friesen TL, Stukenbrock EH, Liu Z, Meinhardt S, Ling H, Faris JD, Rasmussen JB, Solomon PS, McDonald BA, Oliver RP (2006). Emergence of a new disease as a result of interspecific virulence transfer. Natural Genetics 38:953–956.
Kazemi Arbath H (2005). Cereal Morphology and Physiology. Tabriz university Publication. Pp. 104
Kole C, Timothy C  )2008(. Compendium of Transgenic Crop Plants: Transgenic Cereals and Forage Grasses. Blackwell Publishing Ltd. ISBN 978-1-405-16924-0.
Leah R, Tommerup H, Svendsen I, Mundy J (1991). Biochemical and molecular characterization of three barley seed proteins with anti-fungal properties. Journal Biological Chemistry 266:1464-1473.
Machii H, Mizuno H, Hirabayashi T, Li H, Hagio T (1998). Screening wheat genotypes for high callus induction and regeneration capability from anther and immature embryo cultures. Plant Cell Tissue and Organ. Culture 53: 67-74.
Mackintosh CA, Lewis J, Radmer LE, Shin S, Heinen SJ, Smith LA, Wyckoff MN, Muehlbauer GJ (2007). Overexpression of defense response genes in transgenic wheat enhances resistance to Fusarium Head Blight. Plant Cell Report 26:479–488.
Mauch F, Mauch Mani B, Boller T (1988). Antifungal hydrolases in pea tissue, II: Inhibitation of fungal growth by combination of chitinase and beta-1,3-glucanase. Plant Physiology 88: 936-942.
Mohsenpour M, Babayian jelodar NA, Tohidfar M, Habashi AA (2008). Design and Constract of Four Recombinant Plasmid Vector for Plant transformation by Chitinase, Glucanase and Bt genes. Journal of Agricultural Science and Natural resources of Gorgan 4: 68-80.
Montemurro C, Sabatta W, Stinbiss HH, Soltesz A, Blanco A, Crosatti C (2008). Agrobacterium-mediated transformation in durum wheat. Poster Abstract – E.09.
Patnaik D, Vishnudasan D, Khurana P (2006). Current Science 3:307-330.
Rakszegi M, Tamas S, Szucs P, Tamas L, Bedo Z (2001). Current status of wheat transformation. Plant Biotechnology 3:67-81.
Safikhani S (2007). Monthly of Domestic animal. Plant and Industry. 94: 58
Sambrook J, Russell DW (2001). Molecular cloning. A Laboratory manual. 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA.
Shahcheraghi M, Masoumi M (1997). Guide of Wheat diseases. Publication center of Tehran University 11-36.
Shin S, Mackintosh CA, Lewis J, Heinen SJ, Radmer L, Dill Macky R, Baldridge GD, Zeyen RJ, Muehlbauer GJ (2008). Transgenic wheat expressing a barley class II chitinase gene has enhanced resistance against Fusarium graminearum. Journal of Experimental Botany 9:2371–2378.
Tohidfar M, Mohammadi M, Ghareyazie B (2005). Agrobacterium-mediated transformation of cotton (Gossypium hirsutum) using a heterologous bean chitinase gene. Plant Cell Tissue Organ and Culture 83: 83–96.