The Effect of Different Light Intensities on Callogenesis and Calli Pigments Content of Shoot and Floral Explants of Rosa damascena Mill. and Rosa miniature

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

This study was conducted to compare the ability of callus production between shoot (leaf, petiole and stem) and flower (petal, pistil and anther) organs, as well as chlorophyll and anthocyanin accumulation in calli obtained from these explants in dark and light in Rosa miniature and Rosa damascena. Miniature rose and damask rose have become increasingly popular and economically important in recent years. In vitro regeneration method has a great commercial value in the rose propagation industry. The sterilized explants were cultured in modified MS medium supplemented by various concentrations of 2, 4-D (1, 2, 3, and 4 mg.l-1) and BAP (0.1, 0.5, 1 and 1.5 mg.l-1). The samples were kept under 1000 and 2000 lux white light intensities and dark. Combinations of 4 mg l-1 2, 4-D and 1.5 mg l-1 BAP in Rosa damascena were the most suitable treatments for callus production whereas various explants of Rosa miniature had different response to different growth regulator combinations. In the dark, callus initiation was quicker compared to the light. In addition, callus production of shoot explants were begun faster than floral ones. Callus initiation of floral explants from Rosa miniature occurred in 2th week after culturing, whereas in Rosa damascena observed in 3th week. The growth rate of calli from all explants (except anther) of Rosa miniature was more than Rosa damascena. The dark grown calli contained very low chlorophyll and anthocyanin concentrations whereas these contents increased remarkably at 1000 and 2000 lux (especially 2000 lux) light intensity. Leaf calli in Rosa damascena and stem calli in Rosa miniature produced maximum values of chlorophyll pigments whereas in both, anther and petiole calli had minimum amounts. The calli obtained of petal and pistil explants accumulated high concentration of anthocyanin pigments whereas the lowest values recorded from anther and petiole calli in Rosa miniature and petiole calli in Rosa damascena.

Keywords


اثر شدت­های مختلف نوری بر کالوس­زایی و میزان رنگیزة کالوس­ها در جداکشت­های گلی و رویشی گل محمدی Rosa damascena Miller.) و گل سرخ مینیاتور (Rosa miniature)

سمیه عبدی راد*1، فرخنده رضانژاد2، خسرو منوچهری کلانتری3

1 فارغ التحصیل مقطع کارشناسی ارشد، بخش زیست شناسی، دانشگاه شهید باهنر کرمان

2 دانشیار بخش زیست شناسی، دانشگاه شهید باهنر کرمان

3 استاد بخش زیست شناسی، دانشگاه شهید باهنر کرمان

تاریخ دریافت: 10/08/1390، تاریخ پذیرش: 29/11/1390

 

چکیده

در این پژوهش، اثر نور و تاریکی بر کالوس­زایی جداکشت­های رویشی (برگ، دمبرگ و ساقه) و گلی (گلبرگ، بساک و مادگی) و میزان رنگیزه­های (کلروفیل و آنتوسیانین) کالوس­ها در دو گونه­ی Rosa damascena Mill. و Rosa miniature مقایسه شده است. ریزنمونه های سترون روی محیط MS که غلظت­های مختلف 6 بنزیل آمینوپورین (BAP) و 2 و 4 دی کلروفنوکسی استیک اسید (2, 4-D) به آن اضافه گردیده بود، کشت شده و در شدت نوری 1000، 2000 لوکس و تاریکی تیمار شدند. در مرحله تولید کالوس از جداکشت­های گل محمدی، غلظت­های 4 میلی­گرم در لیتر 2, 4-D و 5/1 میلی­گرم در لیتر BAP بهترین بازدهی را داشتند. بر عکس در گل سرخ مینیاتور جداکشت های مختلف در فرایند کال زایی نسبت به غلظت های مختلف هورمونی به شکل متنوعی پاسخ دادند. در همة جداکشت­ها، نور، بنیان گذاری کالوس را به تاخیر انداخت و تاریکی روند کالوس زایی را بسیار تسریع نمود. به علاوه، کال­زایی جداکشت­های رویشی در هر دو گونه زودتر از جداکشت­های گلی شروع شد. قابل ذکر است که بنیان گذاری کالوس از ریز نمونه­های گلی ورد مینیاتور یک هفته زودتر از گل محمدی آغاز گردید. نرخ رشد کالوس نیز در جداکشت­های ورد مینیاتور بیشتر از ورد محمدی مشاهده شد. بررسی میزان کلروفیل و آنتوسیانین کالوس­ها نشان داد که در تاریکی، تولید و تجمع این رنگدانه ها بسیار کم و در نور این مقدار به شکل قابل توجهی افزایش می­یابد. در گل محمدی کالوس­های برگی و در گل سرخ مینیاتور کالوس­های ساقه­ای بیشترین مقدار کلروفیل و در هر دو گونه، کالوس­های دمبرگی و بساکی کمترین مقدار را در خود ذخیره کردند. همچنین میزان آنتوسیانین در کالوس های گلبرگ و مادگی هر دو گونه بیشتر از کالوس دیگر ریزنمونه ها بود در حالی که کمترین مقدار در کالوس بساک و دمبرگ گل سرخ مینیاتور و بساک گل محمدی مشاهده شد.

واژه­های کلیدی: کشت بافت، کالوس، کلروفیل، آنتوسیانین، گل محمدی، گل سرخ مینیاتور.


مقدمه

گل سرخ محمدی در بیشتر مناطق و استان­های کشور، به­خصوص آذربایجان، اصفهان، کرمان و فارس سابقه کشت و کار دارد. از ورد محمدی در تهیه­ی گلاب، اسانس، مربا، در طراحی فضای سبز برای پرچین و به صورت تک تک و در طب سنتی نیز برای درمان اسهال، دردهای روماتیسمی و ناهنجاری­های خونی و گلودرد استفاده می­شود (Jabbarzadeh, 2003). به علاوه، گلبرگ آن به دلیل داشتن تانن، قابض است و دم کرده آن، برطرف کننده نفخ شکم، تپش قلب، کم­خوابی، اسهال خونی و معمولی، حالت تهوع، التهاب و غم و اندوه می­باشد. گلاب نیز در طب سنتی برای دردهای روماتیسمی، معدوی، قلبی، تقویت اعصاب، و رفع برخی سردردها، حالت تهوع و بیهوشی کاربرد دارد. ترکیبات موثرة شناخته شدة آن شامل مقداری تانن، اسید گالیک، اسانس، اسیدهای چرب و مواد رنگی در گلبرگ و اسید­آسکوربیک (ویتامین C) در میوه می­باشد (Kafi and Riyazi, 2001; Mahmood et al.,1996; Boskabady et al., 2006; Rakhshandeh and Hosseini, 2006 ). گل سرخ مینیاتور نیز، یکی دیگر از گونه­های فراوان ورد است که به دلیل زیبایی­های منحصر به فردش، مردم­پسند، محبوب و تجاری می­باشد. ورد مینیاتور بومی ایران نیست ولی در کشور ما طرفداران بسیاری دارد. در مناطق مختلف دنیا انواع واریته­های این ورد زیبا در طیف وسیعی از رنگ­ها و طرح­ها، زینت بخش گل­خانه­ها، پارک­ها، فضای سبز و گل­فروشی­ها است. گلبرگ بعضی از واریته­های آن دارای مقادیری عطر و اسانس است و مانند دیگر گونه­های گل سرخ از خواص دارویی، خوراکی و آرایشی برخوردار است. ازدیاد این دو گونه از ورد به وسیله بذر، پاجوش، سخت تیل (قلمه چوب سخت)، نیمه سخت تیل (قلمه چوب نیمه سخت)، پیوند و کوپیوند (پیوند جوانه) صورت می گیرد (Horn, 1992; Hudson et al.,2002; Jabbarzadeh and Khosh-Khui, 2005). روش های سنتی افزایشی (قلمه و کوپیوند) نه تنها بسیار کند و زمان­بر می­باشند، بلکه مشکلاتی همچون محدودیت در گیاه مادری و زمان تولید نیز وجود دارد. تولید انبوه در زمان کوتاه (در تمام فصول)، دستکاری­های ژنتیکی مفید، تولید متابولیت­های ثانویه باارزش از کالوس و تکثیر گونه­های مردم پسند از مزایای روش کشت بافت[1] می­باشد و می­تواند بازارگل را رونق بیشتری بخشد. یکی دیگر از مزایای استفاده از این روش، یکسان و استاندارد بودن اسانس­های تهیه شده از گل محمدی تولید شده در شیشه[2] است که در بازار جهانی از اهمیت بسزایی برخوردار است (Jabbarzadeh, 2003).

کلروفیل، رنگدانه­ای سبزرنگ است که نور را جذب کرده و در فتوسنتز گیاهان نقش اصلی را ایفا می­کند. مطالعه­ی بافت­های کلروفیلی برای بررسی سطوح متابولیسمی، سلامت و بیماری گیاه و همچنین تعیین میزان رشد اتوتروفی صورت می­گیرد (Hildebrandt et al,. 1963). میزان کلروفیل ارتباط مستقیم با سلامت و شادابی گیاه دارد و ابزار قدرتمند و موثری برای مطالعه تأثیرات تنش­های مختلف و شرایط متغیر محیطی روی فرایندهای فیزیولوژیکی گیاهان می­باشد (Schneider, 2005). به دلیل پایین بودن سمیت آنتوسیانین، از آن به عنوان رنگ­کننده­ی مواد غذایی استفاده می­شود (Timberlake and Henry, 1986). در سال­های اخیر اثرات فارماکولوژیکی آن در پایین آوردن شاخص­های آتروژنیکی، کاهش سطوح تری­گلیسریدها و اسید­های چرب، مهار سرعت رشد تومورهای سرطانی در بدن مشخص شده است (Igarashi and Inagaki 1991). در این پژوهش توانایی کالوس­زایی جداکشت­های مختلف (ساقه، برگ، دمبرگ، گلبرگ، بساک و مادگی) و همچنین محتویات کلروفیلی و آنتوسیانینی در کالوس­های دو گونه گل سرخ (گل محمدی،Rosa damascena Mill. و گل سرخ مینیاتور Rosa miniature) مطالعه شده است.

اگر چه مطالعات مختلفی بر کشت درون شیشه این دو گونه ورد صورت گرفته است (Seeni and Gnanam, 1981; Banthorpe and Barrow, 1983; Salehi and Khosh-Khui, 1996; pati et al., 2005 )، اما مطالعات مروری ما نشان داد که مقایسه انواع جداکشت­ها و بررسی میزان کلروفیل و آنتوسیانین کالوس­های حاصل از آن­ها انجام نشده است، بنابراین در این مطالعه، این مقایسه صورت گرفته، بدین منظور که بهترین جداکشت ها و بهینه ترین شرایط برای تولید کالوس و سنتز رنگدانه ها تحقیق و بررسی شود.

مواد و روش­ها

انتخاب و آماده­سازی جداکشت[3]­ها

ساقه­ها، برگ­ها، دمبرگ ها و اجزای گلی (گلبرگ، مادگی و بساک) گل سرخ محمدی و گل سرخ مینیاتور با دقت با محلول شوینده (مایع ظرفشویی) شسته و به مدت 30 دقیقه زیر آب جاری قرار گرفتند. گندزدایی مطابق مراحل زیر انجام شد: اتانول 70 درجه به مدت 30 ثانیه تا یک دقیقه، محلول 20-15 درصد سدیم­هیپوکلریت و محلول یک گرم در لیتر کلرید جیوه (Hg2Cl2) به مدت 4-3 دقیقه، 5-3 بار شستشو با آب مقطر سترون، بریدن بخش­های انتهایی و قهوه­ای شده و غوطه­ور شدن در محلول 100 میلی­گرم در لیتر آنتی­بیوتیک­های آمپی سیلین و تتراسایکلین به مدت 15 دقیقه.

 

آماده سازی محیط و کشت ریز نمونه­ها

جداکشت­های مختلف در محیط MS (Murashige and Skoog) حاوی ویتامین­ها، ساکارز (30 گرم در لیتر)، پلی وینیل پیرولیدون (10 میلی­گرم در لیتر) و آگار (9-8 گرم در لیتر) قرار گرفتند. این محیط پایه با غلظت­های مختلفی از بنزیل آمینوپورین (1/0، 5/0، 1 و 2 میلی­گرم در لیتر) و 2 و 4 دی کلروفنوکسی استیک اسید (2, 4-D) (1، 2، 3 و 4 میلی­گرم در لیتر) تکمیل و بررسی شد. کشت­ها در دمای ºC 1±25 در تیمار تاریکی و تناوب نوری 16 ساعتی با شدت های 1000 و 2000 لوکس (لامپ­های فلورسنت) نگهداری شدند. واکشت ریزنمونه­ها به محیط کشت تازه و مشابه، هر 25 روز یک بار انجام گردید.

 

استخراج کلروفیل

برای سنجش میزان کلروفیل، 50 میلی­گرم از کالوس­های تازه­ی 20، 40، 60 و 80 روزه در ‌ها‌ون چینی با 10 میلی‌لیتر استون 80 درصد سائیده شد. سانتریفیوژ در دور g4000 به مدت 15 دقیقه انجام گرفت و جذب محلول رویی با دستگاه ‌اسپکتروفتومتر در طول موجهای، 647 و 663 نانومتر خوانده شد. غلظت رنگیزه‌های کلروفیلی با استفاده ‌از رابطه‌های زیر محاسبه گردید  (Kaul and Sabhrwal, 1974; Clairmont et al.,1986):

 

 

 

 

استخراج آنتوسیانین

از روش موری[4] (Mori et al., 1993) به منظور اندازه گیری مقدار آنتوسیانین­های کالوس ها استفاده شد. 100 میلی­گرم از کالوس تازه هر یک از ریزنمونه­ها با 10 میلی لیتر متانول اسیدی (متانول خالص واسید کلریدریک خالص به نسبت حجمی 100 به 1) به طور کامل سائیده شد. محلول مورد نظر، به مدت 24 ساعت در تاریکی و در دمای 25 درجه سانتی گراد قرار گرفت. سپس به مدت 15 دقیقه با دور g4000 سانتریفیوژ و جذب محلول بالایی در طول موج 530 نانومتر اندازه گیری شد. برای محاسبه غلظت، ضریب خاموشی (ε) 33000 سانتیمتر بر مول در­نظر­گرفته شد. مقدار آنتوسیانین با استفاده از فرمول زیر بدست آمد:

 

در این رابطه A = جذب، b = عرض کووِت که برابر با 1 سانتی متر است و c= غلظت آنتوسیانین بر حسب مول بر گرم وزن تر کالوس می­باشد (Mori et al., 1993; Nakamura et al., 1999).

 

بررسی آماری

در این آزمایش که با استفاده از روش فاکتوریل و طرح کاملاً تصادفی اجرا شد، هر پتری (15 عدد جداکشت) به عنوان یک تکرار و هر تیمار دارای سه تکرار بود. مقایسه میانگین­ها وآنالیز واریانس با استفاده از آزمون دانکن توسط نرم­افزار SPSS و با ضریب اطمینان 95% انجام شد.

 

نتایج

در این پژوهش ترکیبی از غلظت­های مختلف هورمونی به منظور بهینه­سازی فرایند کالوس­زایی، استفاده شد که ریزنمونه­های دو گونه­ی مورد آزمایش، پاسخ­های متفاوتی نشان دادند. بیشترین بازدهی در کالوس­زایی جداکشت­های گل محمدی در غلظت­های 4 میلی­گرم در لیتر 2 و 4 دی کلروفنوکسی استیک اسید (2, 4-D) و 5/1 میلی­گرم در لیتر  بنزیل­آمینوپورین (BAP) رخ داد. در این ترکیب هورمونی 53/75، 20/82، 53/95، 80/77، 86/88 و 60 درصد موفقیت در کالوس­زایی به ترتیب در دمبرگ، برگ، ساقه، گلبرگ، مادگی و بساک گل محمدی مشاهده شد. به استثنای گلبرگ که در نسبت 3 به 1 2, 4-D به BAP نیز بازدهی نسبتا خوبی داشت (53/55 درصد موفقیت)، فرایند کال­زایی در بقیه جداکشت­ها و در دیگر محیط­های مورد تحقیق موفقیت چشمگیری (معنی­دار) کسب نکرد (جدول 1).

بررسی کالوس­زایی ریزنمونه­های مختلف ورد مینیاتور در ترکیب­های مختلف هورمونی BAP و 2, 4-D نشان داد که بر خلاف جداکشت­های گل محمدی که همگی در نسبت 4 به 5/1 توفوردی به بنزیل­آمینوپورین پاسخ یکسان و بالایی نشان دادند، در گل سرخ مینیاتور نسبت های مختلف تاثیرات متفاوتی بر ریزنمونه­های مختلف داشتند. میزان کالوس­زایی برگ و دمبرگ در نسبت های 4 به 5/1 و 3 به 1 (میلی گرم بر لیتر) توفوردی به بنزیل آمینوپورین، نسبت به جداکشت های دیگر، بالا و به ترتیب در برگ برابر 80/97 و 67/86 و در دمبرگ­ها 33/73 و 13/91 درصد بود. بیشترین بازدهی در کالوس­زایی ساقه در نسبت های 3 به 1 و 2 به 5/0 به ترتیب با 73/97 و 13/91 درصد مشاهده شد. کال­زایی گلبرگ نیز در نسبت های غلظتی 3 به 1، 2 به 5/0 و 4 به 5/1 2, 4-D به BAP، به ترتیب برابر 67/66، 80/57 و 53/55 درصد بود. همچنین بهترین بازدهی در فرایند کالوس­زایی مادگی (67/86) در محیط کشت MS با 3 میلی گرم در لیتر 2, 4-D و 1 میلی گرم در لیتر BAP به دست آمد، در حالی که پینه زایی بساک­های گل سرخ مینیاتور در ترکیب­های هورمونی مختلف تفاوت معناداری نشان نداد (جدول 2). تاریکی، نور 1000 و 2000 لوکس عوامل محیطی موثری بودند که برکالوس­زایی و میزان رنگیزه های کالوس اثر معنی­دار گذاشتند. نتایج بنیان گذاری[5] کالوس در جداکشت­های گلی (گلبرگ، مادگی و بساک) و نوشاخه­ای (برگ، دمبرگ و ساقه) هر دو گونه تحت تاثیر این عوامل محیطی در زمان­های مختلف نشان داده شده است (جدول­های 3 و 4).

شروع کالوس ­زایی همه­ی ریزنمونه­های هر دو گونه­ی مورد مطالعه، در تاریکی سریع­تر از نور صورت گرفت. بدین صورت که در هفته اول درصد بسیاری بالایی ازجداکشت­های رویشی (برگ، دمبرگ و ساقه) دو گونه­ی ورد که در تاریکی قرار داشتند، بنیان گذاری کالوس را آغاز کردند در حالی­که در ریز نمونه­های گلی (گلبرگ، بساک و مادگی) به همراه همه­ی جداکشت­هایی که در نور قرار داشتند، واکنش محسوسی آغاز نشده بود. جداکشت­های گلی ورد مینیاتور در هفته­ی دوم و جداکشت­های گلی ورد محمدی در هفته­ی سوم بنیان گذاری کالوس را در تاریکی آغاز کردند. نور 1000 و 2000 لوکس بنیان گذاری را تا هفته­های بعدی به تاخیر انداخت (جدول­های 3 و 4).

 

 

 

جدول 1- بررسی غلظت های مختلف هورمون های BAP و 2, 4-D بر پینه­زایی ریزنمونه های مختلف گل محمدی (Rosa damascena).

Table 1- Effects of BAP and 2, 4-D ratio on callogenesis of different explants of R. damascena.

 

جداکشت ها    Explants

تنظیم کننده­های رشد

(میلی­گرم در لیتر)

Plant Growth Regulators (mg l-1)

دمبرگ

Petiole

برگ

Leaf

ساقه

Stem

گلبرگ

Petal

مادگی

Pistil

بساک

Anther

2, 4-D

BAP

75.53%±

1.45 Abcd

82.20%±

0.88 ab

95.53%±

0.67 A

77.80%±

1.85 Abc

88.86%±

1.20 A

60.00%±

3.00 bcde

4

1.5

48.86%±

0.88 Efgh

55.53%±

0.88 cdef

62.20%±

1.76 Bcde

55.53%±

1.20 Cdef

62.20%±

1.20 Bcde

28.86%±

1.53 gh

3

1.0

38.40%±

0.67 Efgh

44.46%±

0.67 efgh

51.73%±

1.76 Defg

28.86%±

1.53 Gh

60.00%±

0.58 Bcde

31.13%±

0.67 fgh

2

0.5

48.86%±

0.33 Efgh

55.53%±

0.88 cdef

51.73%±

1.45 Defg

24.46%±

0.67 H

57.80%±

0.88 Cde

26.66%±

1.00 gh

1

0.1

 

 

 

 

 

 

 

جدول 2- بررسی غلظت های مختلف هورمون های BAP و 2, 4-D بر پینه­زایی ریزنمونه های مختلف گل سرخ مینیاتور (Rosa miniature).

Table 2- Effects of BAP and 2, 4-D ratio on callogenesis of different explants of R. miniature.

 

جداکشت   Explants

تنظیم کننده­های رشد

(میلی­گرم در لیتر)

Plant Growth Regulators (mg l-1)

دمبرگ

Petiole

برگ

Leaf

ساقه

Stem

گلبرگ

Petal

مادگی

Pistil

بساک

Anther

2, 4-D

BAP

73.33%±

1.20 Bc

97.80%±

0.33 A

48.87%±

0.88 Defg

55.53%±

0.88 Cdef

37.80%±

1.20 fg

53.33%±

0.58 defg

4

1.5

91.13%±

0.33 Ab

86.67%±

1.45A b

97.73%±

0.33 A

66.67%±

0.58 Cd

86.67%±

0.58 ab

60.00%±

0.58 cde

3

1.0

37.80%±

1.20 Fg

46.67%±

0.58 defg

91.13%±

0.88 Ab

57.80%±

0.88 Cdef

44.47%±

0.88 efg

40.00%±

0.58 efg

2

0.5

42.20%±

1.45 Efg

51.33%±

1.20 defg

57.80%±

0.88 Cdef

33.33%±

1.53 G

42.2%±

0.88 efg

33.33%±

1.53 g

1

0.1

 

 

 

 

 

 

 

جدول 3- اثر تاریکی و نور بر زمان تشکیل کالوس در انواع جداکشت­های ورد محمدی (Rosa damascena)

Table 3- Effects of dark and different light intensities on callus initiation of different explants in R. damascena.

زمان (هفته)

 Time (week)

جداکشت     Explants

شدت نور (لوکس)

Light intensity (lux)

 

مادگی

Pistil

بساک

Anther

گلبرگ

Petal

ساقه

Stem

برگ

Leaf

دمبرگ

Petiole

 

هفته

اول

First week

0 o

0 o

0 o

97.78%±

0.33 A

84.44%±

1.33 Ab

77.78%±

1.85 abcd

تاریکی

Dark

0 o

0 o

0 o

28.89%±

0.88 hijkl

20.00%±

1.15 Ijklmno

8.89%±

0.88 klmno

1000

0 o

0 o

0 o

15.56%±

0.33 jklmno

20.00%±

0.58 Ijklmno

26.67%±

1.53 ijklm

2000

هفته

دوم

Second week

6.67%±

0.00 Lmno

6.67%±

0.58 Lmno

8.89%±

0.33 klmno

97.78%±

0.33 a

84.44%±

1.33 Ab

77.78%±

1.85 abcd

تاریکی

Dark

4.44%±

0.33 Mno

2.22%±

0.33 No

4.44%±

0.33 mno

35.56%±

1.33 ghij

26.67%±

1.53 Ijklm

17.78%±

0.33 ijklmn

1000

0 o

4.44%±

0.33 mno

6.67%±

0.58 lmno

31.11%±

0.88 hijk

20.00%±

0.58 Ijklmno

26.67%±

1.53 ijklm

2000

هفته

سوم

Third week

82.22%±

1.76 Abc

51.11%±

1.20 efgh

55.56%±

0.88 defg

97.78%±

0.33 a

84.44%±

1.33 Ab

77.78%±

1.85 abcd

تاریکی

Dark

31.11%±

1.20 Hijk

20.00%±

1.00 ijklmno

24.44%±

1.20 ijklmn

80.00%±

0.58 abc

66.67%±

0.58 Bcde

60.00%±

1.53 cdef

1000

40.00%±

1.15 Fghi

28.89%±

0.88 hijkl

28.89%±

0.88 hijkl

73.33%±

1.53 bcde

64.44%±

1.20 Bcde

64.44%±

1.77 bcde

2000

جدول 4- اثر تاریکی و نور بر زمان تشکیل کالوس در انواع جداکشت­های ورد مینیاتور (Rosa miniature)

Table 4- Effects of dark and different light intensities on callus initiation of different explants in R. miniature.

زمان (هفته)

 Time (week)

جداکشت     Explants

شدت نور (لوکس)

Light intensity (lux)

 

مادگی

Pistil

بساک

Anther

گلبرگ

Petal

ساقه

Stem

برگ

Leaf

دمبرگ

Petiole

 

هفته

اول

First week

13.33%±

0.58 Efgh

6.67%±

0.00 hi

6.67%±

0.58 hi

97.78%±

0.33 a

91.11%±

0.33 Ab

84.44%±

0.88 Ab

تاریکی

Dark

6.67%±

0.00 Hi

11.11%±

0.33 fghi

4.44%±

0.33 hi

17.18%±

0.33 efgh

24.44%±

0.88 defg

20.00%±

0.58Defgh

1000

4.44%±

0.33 Hi

8.89%±

0.33 ghi

0i

8.89%±

0.33 ghi

11.11%±

0.67 fghi

8.89%±

0.33 Ghi

2000

هفته

دوم

Second week

91.11%±

0.88 Ab

86.67%±

0.58 ab

64.44%±

0.88 c

97.78%±

0.33 a

91.11%±

0.33 Ab

84.44%±

0.88 Ab

تاریکی

Dark

6.67%±

0.00 Hi

11.11%±

0.33 fghi

4.44%±

0.33 hi

17.18%±

0.33 efgh

24.44%±

0.88 defg

20.00%±

0.58Defgh

1000

11.11%±

0.33 Fghi

8.89%±

0.33 ghi

8.89%±

0.33 ghi

11.11%±

0.33 fghi

11.11%±.67 fghi

17.78%±

1.20 Efgh

2000

هفته

سوم

Third week

91.11%±

0.88 Ab

86.67%±

0.58 ab

86.67%±

0.58 ab

97.78%±

0.33 a

91.11%±

0.33 Ab

84.44%±

0.88 Ab

تاریکی

Dark

31.11%±

1.20 De

20.00%±

1.00 defgh

24.44%±

1.20 defg

77.78%±

0.88 bc

75.56%±

1.20 Bc

86.67%±

0.58 Ab

1000

33.33%±

0.58 De

26.67%±

0.58 def

35.56%±

1.20 d

75.56%±

1.20 bc

66.67%±

1.53 C

80.00%±

1.15 Bc

2000

 

 

نرخ رشد[6] کالوس (حجم کالوس در زمان معین) در همه­ی جداکشت­های دو گونه مقایسه گردید. نتایج نشان داد که پینه­های 20 روزه (20 روز پس از بنیان گذاری)، بهترین نمونه­ها برای تشخیص بهتر نرخ رشد در دو گونه بودند (نتایج زمان­های دیگر نشان داده نشده است). کالوس­های 20 روزه­ی گل سرخ مینیاتور نسبت به گل محمدی حجم بیشتر و در نتیجه نرخ رشد بالاتری داشتند (شکل­های 1 و 2). کالوس­زایی در بساک بر اساس شکل 2، تفاوت قابل توجهی را بین دو گونه نشان نمی­دهد.

در هر دو گونه، تاریکی مانع تشکیل رنگدانه های آنتوسیانین و کلروفیل شده و نور این فرایند را القا و راه­اندازی نمود. برخلاف گل محمدی، در ورد مینیاتور، به استثنای کالوس­های برگی و ساقه­ای که در این دو نوع افزایش میزان کلروفیل در نور 2000 لوکس مشاهده شد، سایر کالوس­ها، بین دو شدت نوری، تفاوت معنی داری نشان نمی­دهند. به­علاوه میزان رنگیزه­ی آنتوسیانین کالوس­های گل سرخ مینیاتور و گل محمدی (ورد محمدی) به دست آمده از شدت­های نوری 2000 نیز در مقایسه با شدت 1000 لوکس افزایش قابل توجهی نشان داد (شکل­های 3، 4، 5 و 6).

در هر دو شدت نوری، با گذر زمان از 20 روز به 80 روز مقادیر کلروفیلی افزایش یافته است به جز در کالوس دمبرگ گل سرخ مینیاتور و کالوس­های برگی، ساقه­ای و گلبرگی ورد محمدی که بین دوره­های زمانی 60 و 80 روزه تفاوت محسوسی دیده نمی­شود (در 60 روز به حد ماکزیمم می­رسند). همچنین با افزایش سن به 80 روز، میزان رنگیزه آنتوسیانین کالوس های در معرض نور نیز افزایش یافت (به استثنای کالوس­های 60 روزه­ی برگ و ساقه گل سرخ مینیاتور که در 60 روز، میزان بیشینه­ی رنگیزه را نشان دادند) (شکل های 3، 4، 5 و 6).

مطالعه­ی میزان سبزینه در گل سرخ مینیاتور نشان می­دهد که مقدار این رنگیزه در کالوس ساقه (72/1 میلی گرم کلروفیل بر گرم کالوس) و سپس برگ (65/1 میلی گرم کلروفیل بر گرم کالوس) از همه بیشتر و در بساک (27/1 میلی گرم کلروفیل بر گرم کالوس) و دمبرگ (26/1 میلی گرم کلروفیل بر گرم کالوس) از همه کمتر است. میزان کلروفیل درگلبرگ و مادگی نیز به ترتیب در حدود 51/1 و 48/1 میلی­گرم در گرمِ کالوس می­باشد. این مقادیر در گل محمدی، در کالوس برگ (60/1 میلی گرم بر گرم کالوس) از همه بیشتر و در بساک (88/0 میلی­گرم بر گرمِ کالوس) از همه کمتر است. پس از برگ بیشترین مقدار به ساقه، گلبرگ، مادگی و دمبرگ تعلق دارد که به ترتیب برابر با 33/1، 26/1، 25/1 و 21/1 می­باشند (شکل های 3 و 5).

میزان آنتوسیانین در کالوس گلبرگ (78 میکرومول در هر گرم کالوس) و مادگی (69 میکرومول در هر گرم کالوس) گل سرخ مینیاتور نسبت به سایر ریزنمونه­ها بیشتر و در دمبرگ (34/44 میکرومول در هر گرم کالوس) و بساک (23/40 میکرومول در هر گرم کالوس) از همه کمتر بود. کالوس­های حاصل از برگ و ساقه نیز به ترتیب با ذخیره کردن حدود 59 و 34/56 میکرومول آنتوسیانین بر گرم کالوس حدواسط بودند. پینه­های مشتق از گلبرگ و مادگی گل محمدی نیز به ترتیب با ذخیره­ی حدود 70/66 میکرومول و 16/41 میکرومول آنتوسیانین در هر گرم کالوس بیشترین مقادیر را به خود اختصاص دادند. کمترین میزان آن در دمبرگ (57/13) مشاهده شد. هر گرم از کالوس­های حاصل از ساقه، بساک و برگ نیز به ترتیب حدود 20/25، 95/23 و 39/19 میکرومول آنتوسیانین در خود ذخیره کردند (شکل های 4 و 6).

 

بحث

کالوس­زایی جداکشت­ها در محیط MS انجام شد. این محیط پایه برای کشت در شیشه­ی بسیاری از گیاهان مناسب است (Murashige and Skoog, 1962; Vaezi and Kakhki, 2001; Pati et al., 2005 ). در این پژوهش، دو گونه­ی مورد مطالعه در غلظت­های مختلف هورمونی واکنش­های متفاوتی نشان دادند. کالوس­زایی جداکشت­های گل سرخ مینیاتور در مقایسه با گل محمدی در ترکیب­های مذکور، بازدهی موفق­تری داشتند. به نظر می­رسد که ریزنمونه های ورد مینیاتور در فرایند تولید کالوس، انعطاف بیشتری از خود نشان داده و نسبت به ورد محمدی ساده­تر و راحت­تر کالوس­زایی می­کنند. اکسین­ها و سیتوکینین­ها اصلی ترین فاکتورهای رشد در روش کشت بافت هستند که نوع و غلظت موثر آنها در جداکشت­ها و نیز در جنس­ها، گونه­ها و رقم­های مختلف متفاوت است (Rout et al., 1992; Hill, 1967; Lloyd et al., 1988; Hsia and Korban, 1996; Salehi and Khosh-Khui, 1996). اغلب مطالعات نشان می­دهد به طور معمول از میان اکسین­ها، توفوردی، برای تمایز‌زدایی و تولید کالوس موثرتر می باشد و BAP نیز نسبت به دیگر سیتوکینین­ها در تولید و رشد پینه کارایی بالاتری دارد (Dixon and Gonzales, 1996). گزارشات بسیاری مبنی بر استفاده از BAP و 2, 4-D به عنوان اصلی ترین تنظیم کننده­های رشد در فرایند کالوس­زایی وجود دارد (Lloyd et al.,1988; Burger et al.,1990; Arene et al.,1993; Hsia and Korban, 1996; Prasertsongskun, 2003; Islam et al., 2005; Pontaroli and Camadro, 2005; Wang and Bao, 2007; Yi-xun et al., 2009). القای کال­زایی در واریته­های مختلف گیاهان، تنوع زیادی نشان داده و براساس پژوهش­های حاضر، به نظر می­رسد که غلظت­های هورمونی در حد زیادی وابسته به ژنوتیپ هستند (Islam et al., 2005).

 

 

 

   
   
   

 

شکل 1- مقایسه­ی نرخ پینه­زایی (بر اساس حجم کالوس در زمان معین) جداکشت­های شاخه­ای (برگ، ساقه و دمبرگ) دو گونه­ی گل محمدی و گل سرخ مینیاتور، 20 روز پس از بنیان گذاری کالوس. A: برگ گل سرخ مینیاتور، B: برگ گل محمدی، C:ساقه گل سرخ مینیاتور، D:ساقه گل محمدی، E: دمبرگ گل سرخ مینیاتور ، F:دمبرگ گل محمدی، (A، B و E: بزرگنمایی5/2×x)، (D و C: بزرگنمایی5/1× x)، (F: بزرگنمایی5/3×x).

Figure 1- Comparison of growth rate of vegetative or shoot explants in R. miniature and R. damascena, 20 days after callus initiation. A: leaf of R. miniature, B: leaf of R. damascena, C: stem of R. miniature, D: stem of R. damascena, E: petiole of R. miniature, F: petiole of R. damascena.

   
   
   

 

شکل 2- مقایسه­ی نرخ پینه­زایی (بر اساس حجم کالوس در زمان معین) جداکشت­های گلی (گلبرگ، مادگی و بساک) دو گونه­ی گل محمدی و ورد مینیاتور، 20 روز پس از بنیان گذاری کالوس. A: گلبرگ ورد مینیاتور، B: گلبرگ گل محمدی، C: مادگی ورد مینیاتور ، D: مادگی گل محمدی، E: بساک ورد مینیاتور ، F: بساک گل محمدی، (A: بزرگنمایی2×x)، (D و C: بزرگنمایی 9×x)، (B: بزرگنمایی 5×x)، (E: بزرگنمایی 12×x)، (F: بزرگنمایی 15×x).

Figure 2- Comparison of growth rate of floral explants in R. miniature and R. damascena, 20 days after callus initiation. A: petal of R. miniature, B: petal of R. damascena, C: pistil of R. miniature, D: pistil of R. damascena, E: anther of R. miniature, F: anther of R. damascena.

   
   
   

 

شکل 3- اثر تاریکی، نور 1000 و 2000 لوکس بر میزان کلروفیل کالوس برگ، ساقه، دمبرگ، بساک، گلبرگ و مادگی گل محمدی (Rosa damascena) در 20، 40، 60 و 80 روز پس از بنیان گذاری کالوس (با ضریب اطمینان %95).

Figure 3- Effects of dark and light (1000 and 2000 lux) on chlorophyll content of calli from leaf, petiole, stem, pistil, petal and anther explants of Rosa damascena during 20, 40, 60 and 80 days after callus initiation.

   
   
   

 

شکل 4- اثر تاریکی، نور 1000 و 2000 لوکس بر میزان آنتوسیانین کالوس برگ، ساقه، دمبرگ، بساک، گلبرگ و مادگی گل محمدی (Rosa damascena) در 20، 40، 60 و 80 روز پس از بنیان گذاری کالوس (با ضریب اطمینان %95).

Figure 4- Effects of dark and light (1000 and 2000 lux) on anthocyanin content of calli from leaf, petiole, stem, pistil, petal and anther explants of Rosa damascena during 20, 40, 60 and 80 days after callus initiation.

 

   
   
   

 

شکل 5- اثر تاریکی، نور 1000 و 2000 لوکس بر میزان کلروفیل کالوس برگ، ساقه، دمبرگ، بساک، گلبرگ و مادگی گل سرخ مینیاتور (Rosa miniature) در 20، 40، 60 و 80 روز پس از بنیان گذاری کالوس (با ضریب اطمینان %95).

Figure 5- Effects of dark and light (1000 and 2000 lux) on chlorophyll content of calli from leaf, petiole, stem, pistil, petal and anther explants of Rosa miniature during 20, 40, 60 and 80 days after callus initiation.

   
   
   

 

شکل 6- اثر تاریکی، نور 1000 و 2000 لوکس بر میزان آنتوسیانین کالوس برگ، ساقه، دمبرگ، بساک، گلبرگ و مادگی گل سرخ مینیاتور (Rosa miniature) در 20، 40، 60 و 80 روز پس از بنیان گذاری کالوس (با ضریب اطمینان %95).

Figure 6- Effects of dark and light (1000 and 2000 lux) on anthocyanin content of calli from leaf, petiole, stem, pistil, petal and anther explants of Rosa miniature during 20, 40, 60 and 80 days after callus initiation.

 

 

بررسی بنیان گذاری کالوس که به معنای مشاهده­ی اولین تورم سلولی در جداکشت می­باشد، در ریزنمونه­های مختلف دو گونه­ی مورد آزمایش تحت شرایط تاریکی و روشنایی نشان داد که در هر دو گونه، جداکشت­های رویشی در معرض تاریکی، در هفته­ی اول، کالوس­زایی را با درصد بالایی آغاز کردند و نور این رخداد را تا هفته­های بعدی به تاخیر انداخت. به علاوه، در تاریکی، جداکشت­های زایشی گل سرخ مینیاتور در هفتة دوم و جداکشت­های گل محمدی در هفته­ی سوم، بنیان­گذاری بالای کالوس را نشان دادند. در نور، این جداکشت­ها مشابه شرایط تاریکی کالوس­زایی را با تاخیر شروع کردند. بنابراین، تاریکی و جداکشت­های رویشی، اثر تحریکی روی القای کالوس­زایی در فاصله­ی زمانی کوتاه­تر داشتند. گزارشات بسیاری وجود دارد که تاریکی را به عنوان عامل موثر در شروع کال­زایی معرفی نمودند (Nakamura et al., 1999; Asano et al., 2001; Prasertsongskun, 2003; Islam et al., 2005; Pontaroli and Camadro, 2005). در پژوهشی (Tabaeezadeh and Khosh-Khui, 1980) که تولید کالوس از بساک­های دو گونه­ی Rosa damascena و Rosa hybrid با موفقیت انجام شد، گزارش گردید که نه تنها نور، برای تحریک و تشکیل کالوس ضروری نمی باشد بلکه این فرایند را مهار می کند. گزارشات دیگری نیز مبنی بر اثر ممانعتی نور بر کالوس­زایی در گیاهان دیگر وجود دارد. در پژوهش دیگری گزارش شد که در حضور نور، فعالیت IAA اکسیداز افزایش یافته که سبب تغییر در تعادل اندوژنی بین اکسین و سیتوکینین گشته و تحریک کالوس­زایی را کاهش و به تاخیر می­اندازد (Gasper et al., 1989). القای کالوس­زایی در واریته­های مختلف گیاهان، تنوع زیادی نشان داده وبر اساس پژوهش­های انجام شده تاکنون، به نظر می­رسد که این فرایند به فعل و انفعالات ژنوتیپی مرتبط بوده و برای واریته­های مختلف اختصاصی عمل می­کند (Birsin et al., 2001; Islam et al., 2005).

گزارشی مبنی بر مقایسه جداکشت­ها در این دو جنس وجود ندارد. به نظر می­رسد که پتانسیل پرتوانی و میزان تمایز اندام­ها و در نتیجه توانایی تمایززدایی آنها که در اندام­های گلی (گلبرگ، بساک و مادگی) و نوشاخه­ای متفاوت است، عامل موثری در تفاوت زمان بنیان گذاری کالوس در جداکشت­های مختلف باشد. قابل ذکر است که در فرایند بنیان گذاری کالوس، ابتدا تمایززدایی و سپس تقسیم و رشد انجام می­شود که انجام و سرعت این فرایندها به نوع گونه­ی گیاهی و نوع جداکشت­های مختلف بستگی دارد.

مطالعه­ی نرخ رشد نشان داد که کالوس­های 20 روزه­ی گل سرخ مینیاتور نسبت به گل محمدی حجم بیشتر و در نتیجه نرخ رشد بالاتری داشتند به غیر از بساک که در دو گونه تفاوت محسوسی نشان نداد. احتمال می­دهیم نوع گونه­ی گیاهی و ژنوتیپ که تاثیر قابل توجه آن در بالا نیز ذکر شد، در ایجاد این ویژگی، عامل موثری باشد و به طور کلی گل سرخ مینیاتور در فرایند ریز افزایی[7]، کال زایی، بنیان گذاری و نرخ رشد کالوس موفقیت بیشتری نشان داد.

محتویات کلروفیلی و آنتوسیانینی کالوس­های سفید رنگ رشد یافته در تاریکی، نسبت به انواعی که تحت نور 1000 و 2000 لوکس قرار داشتند، بسیار کم و ناچیز بود در حالی­که کالوس­های در معرض نور، غلظت­های قابل توجهی از این رنگدانه ها را در سلول­های خود ذخیره کردند. مقایسه­ی جداکشت­ها در گل محمدی نشان داد که کالوس برگ در مقایسه با سایر جداکشت­ها بیشترین و بساک و دمبرگ کمترین میزان کلروفیل را دارا بودند. کلروفیل کالوس جداکشت­های ساقه، گلبرگ و مادگی حدواسط این میزان بود. به طور مشابه در گل سرخ مینیاتور نیز کالوس­های ساقه­ای، برگی، مادگی و گلبرگی نسبت به دمبرگ و بساک محتوی غلظت­های بیشتری از کلروفیل بودند. همچنین میزان آنتوسیانین کال­های گلبرگ و مادگی هردو گونه نسبت به سایر جداکشت ها بیشتر بودند. به طور کلی کالوس­ها نسبت به نور و تاریکی پاسخ­های متفاوتی نشان می­دهند و محتویات رنگدانه­ای آنها یکی از عواملی است که بسیار وابسته به نورمی­باشد. نور، بر روی فرایند نمو کلروپلاست و در نتیجه بر میزان کلروفیل موثر است. به­طور کلی، تولید کلروپلاست از پیش­کلروپلاست (پروپلاست) یک پروسه وابسته به نور است که در اثر کمبود نور به مسیر دیگری مانند تشکیل اتیوپلاست منحرف می­گردد (Schoefs, 2000). واسیل[8] و هیلدربرانت[9] (1965) گزارشاتی مبنی بر پاسخ متفاوت بافت­ها و اندام­های مختلف به مسیر تولید کلروفیل در نور دارند که دلیلی بر تایید نتایج به دست آمده، می باشد (Vasil and Hildebrandt, 1965). براساس مشاهدات ثبت شده در این پژوهش، کالوس جداکشت­های گل سرخ مینیاتور در تولید و ساخت کلروفیل تواناتر از گل محمدی می باشند که این تفاوت به همراه تفاوت­های قبلی (بنیان گذاری و نرخ رشد کالوس)، مربوط به تفاوت­های ژنتیکی و گونه­ای­می باشند.

مطالعه­ی دو گونه نشان داد که در هر دو شدت نوری، محتویات آنتوسیانینی کالوس­ها نسبت به تاریکی افزایش قابل توجهی دارد. بیوسنتز آنتوسیانین در بافت­های گیاهی یا وابسته به نور است و یا به­وسیله­ی آن تسهیل و افزایش می­یابد (Vinterhalter et al., 2007; Simoes et al., 2009; Ram et al., 2011). نور یک سیگنال مهم نموی در گیاهان است که بر تجمع آنتوسیانین­ها (محصول رنگین و نهایی مسیر پلی فنولیک) به­واسطه­ی فعال کردن فاکتورهای رونویسی که مسیر بیوسنتزی فلاونوئیدها را تنظیم می­کنند، موثر است (Irani and. Grotewold, 2005; Vinterhalter et al., 2007). آنزیم مهم مسیر سنتز فلاونوئیدها، چالکون سینتاز (CHS) می­باشد که به ­وسیله­ی نور، پس از یک فاز تاخیری چند ساعته فعال می­گردد یعنی برای فعال­سازی آنها به چند ساعت نور نیاز دارد. این ویژگی اثر نور در بیوسنتز فلاونوئیدها از جمله آنتوسیانین­ها را نشان می­دهد (Irani and Grotewold, 2005). همچنین گزارشات زیادی وجود دارد که نشان می­دهد، جنس­ها، گونه­ها و حتی واریته­های یک گونه واکنش­های متفاوتی را نسبت به مراحل مختلف کشت بافت و تولید رنگدانه­ها نشان می­دهند (Salehi and Khosh-Khui, 1996; Pati et al., 2005).

 

نتیجه گیری کلی

نتایج حاصل از مراحل مختلف نشان داد که تمامی فاکتورهای مقایسه ای و مورد تحقیق در این پژوهش (تعیین نسبت های هورمونی مناسب، بنیان گذاری کالوس، نرخ رشد کالوس و میزان سنتز رنگیزه ها) هم در سطح جداکشت و هم در سطح گونه ای، تفاوت معنی دار داشته و وابسته به ژنوتیپ، نوع سلول، بافت، و اندام و همچنین پتانسیل پرتوانی و میزان تمایز آن ها (تفاوت در توانایی تمایززدایی) است. در این پژوهش نور به عنوان عامل بازدارنده در بنیان گذاری کال ها و عامل تحریک کننده در سنتز کلروفیل و آنتوسیانین معرفی شد.

 

سپاس گذاری

با تشکر فراوان از جناب آقای دکتر علی مصطفوی عضو هیئت علمی گروه شیمی دانشگاه شهید باهنر کرمان و جناب مهندس معاذاللهی و پرسنل زحمت­کش کارخانه­ی گلاب زهرا که در مراحل مختلف این پژوهش، همکاری صمیمانه مبذول داشتند.

 

 

منابع

Arene L, Pellegrino, C, Gudin, SA (1993). Comparison of the somaclonal variation level of Rosa hybrida L. cv. Meirutral plants regenerated from callus or direct induction from different vegetative and embryonic tissues. Euphytica 71: 83–90.

Asano S, Ohtsubo S, Nakajima M, Kusunoki M, Kaneko K, Katayama H, Nawa Y (2001). Production of anthocyanins by habituated cultured cells of nyoho strawberry (Fragaria ananassa Duch.). Food Science Technology Research 8: 64–69.

Banthorpe DV, Barrow SE (1983). Monoterpene biosynthesis in extracts from cultures of Rosa damascena. Phytochemistry 22: 2727–2728.

Birsin MA, Onde S, Ozgen M (2001). Callus induction and plant regeneration from mature embryos of oat (Avena sativa L.). Turkish Journal Biology 25: 427–434.

Boskabady MH, Kiani S, Rakhshandeh H (2006). Relaxant effects of Rosa damascena on guinea pig tracheal chains and its possible mechanism(s). Journal of Ethnophurmacology 106: 377–382.

Burger DW, Liu L, Zary KW, Lee CI (1990). Organogenesis and plant regeneration from immature embryos of Rosa hybrida L. Plant Cell Tissue Organ Culture 21: 147–152.

Clairmont KB, Hagar WG, Davis EA (1986). Manganese toxicity to chlorophyll synthesis in tobacco callus. Plant Physiology 80: 291–293.

Dixon RA, Gonzales RA (1996). Plant Cell Culture : A Practical Approach. 2nd Ed. IRL Press, pp. 1–230, ISBN 0-19-963402-5.

Gasper T, Penel C, Thorpe T, Greppin H (1982). Peroxidases: A Survey of Their Biochemical and Physiological Roles in Higher Plants. University of Geneva press, Geneva, Switzerland.

Hildebrandt AC, Wilmar JC, Johns AJ, Riker H (1963). Growth of edible chlorophyllous plant tissue in vitro. American Journal of Botany 50: 248–254.

Hill GP (1967). Morphogenesis of shoot primordia in cultured stem tissue of a garden rose. Nature 216: 596–597.

Horn W (1992). Micropropagation of roses, In: Bajaj YPS (Ed.), Biotechnology in Agriculture and Foresty. Springer-Verlag, Germany. pp. 320–342.

Hsia C, Korban SS (1996). Organogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures of Rosa hybrida and Rosa chinensis minima. Plant Cell Tissue and Organ Culture 44: 1–6.

Hudson TH, Dale EK, Davies FT, Geneve RL (2002). Plant propagation principles and practices. 6th ed Prentice Hall of India Private Limited. New Delhi, India. pp. 1–770.

Igarashi K, Inagaki, K (1991). Effects of the major anthocyanin of wild grape (Vitis coignetiae) on serum lipid levels in rats. Agricultural and Biological Chemistry-Journal 55: 285–287.

Irani NG, Grotewold E (2005). Light-induced morphological alteration in anthocyanin-accumulating vacuoles of maize cells. BMC Plant Biology 20 (5): 7.

Islam MM, Ahmed M, Mahaldar D (2005). In Vitro callus induction and plant regeneration in seed explants of Rice (Oryza Sativa L.). Research Journal of Agriculture and Biological Sciences 1: 72–75.

Jabbarzadeh Z (2003). Effective factors on micropropagation of Damask rose. MS.c. Thesis, Shiraz University, Shiraz, Iran.

Jabbarzadeh Z, Khosh-Khui M (2005). Factor affecting tissue culture of Damask rose (Rosa damascena Mill.). Scientia Horticulturae 105: 475–482.

Kafi M, Riyazi Y (2001). Culture of Damask rose and production of Golab. Nashre Parchin, Iran.

Kaul K, Sabharwal PS (1974). Kinetin-induced changes in a-aminolevulinic acid dehydratase of tobacco callus. Plant Physiology 54: 644–648.

Lloyd D, Roberts AV, Short KC (1988). The induction in vitro of adventitious shoots in Rosa. Euphytica 37: 31–36.

Mahmood N, Piacente S, Pizza C, Barke A, Khan IA, Haj AJ (1996). The Anti-HIV activity and mechanisms of action of puru compounds isolated from Rosa damascena. Biochemical and Biophysical Research Communications 229: 73–79.

Mori T, Sakurai M, Shigeta J, Yoshida K, Kondo T (1993). Formation of anthocyanins from cells cultured from different parts of strawberry plants. Journal of Food Science 58: 788–792.

Murashige T, Skoog FA (1962). Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plant 15: 473–497.

Nakamura M, Takeuchi Y, Miyanaga K, Seki M, Furusaki Sh (1999). High anthocyanin accumulation in the dark by strawberry (Fragaria ananassa) callus. Biotechnology Letters 21: 695–699.

Pati PK, Rath SP, Sharma M, Sood A, Ahuja PS (2005). In vitro propagation of rose—a review. Biotechnology Advances.  Available online at www.sciencedirect.com.

Pontaroli AC, Camadro EL (2005). Plant regeneration after long term callus culture in clones of Asparagus officinalis L. Biocell 29: 313–317.

Prasertsongskun S (2003). Plant regeneration from callus culture of vetiver (Vetiveria zizanioides Nash). Songklanakarin Journal of Science Technology 25: 637–642.

Rakhshandeh H, Hosseini M (2006). Potentiation of pentobarbital hypnosis by Rosa damascena in mice. Indian Journal Exprimental Biology 44: 910–912.

Ram M, Prasad KV, Kaur C, Singh SK, Arora A, Kumar S (2011). Induction of anthocyanin pigments in callus cultures of Rosa hybrida L. in response to sucrose and ammonical nitrogen levels. Plant cell, tissue and organ culture 104: 171–179.

Rout GR, Debata BK, Das P (1992). In vitro regeneration of shoots from callus cultures of Rosa hybrida L. cv. Landora. Indian Journal Exprimental Biology 30: 15–18.

Salehi H, Khosh-Khui M (1996). Micropropagation of miniature rose cultivars. Iran Agricalture Research 15: 51–67.

Schneider F (2005). Effect of different cultural conditions on micropropagation of rose (Rosa sp. L.) and globe artichoke (Cynara scolymus L.), Ph.D. Thesis. Technical University Munich, Freising. Germany. 145.

Schoefs B (2000). The formation of chlorophyll from chlorophyllide in leaves containing proplastids is a four-step process. the FEBS Journals 458: 243–246.

Seeni S, Gnanam A (1981). Relationship between chlorophyll concentration and photosynthestic potential in callus cells. Plant and Cell Physiology 22: 1131–1135.

Simoes C, Bizarri CHB, da Silva CL, de Castro TC, Coutada LCM, da Silva AJR, Albarello N, Mansur E (2009). Anthocyanin production in callus cultures of Cleome rosea: modulation by culture conditions and characterization of pigments by means of HPLC-DAD/ESIMS. Plant Physiology and Biochemistry 47: 895–903

Tabaeezadeh Z, Khosh-Khui M (1981). Anther culture of Rosa. Scientia Horticulturae 15: 61–66.

Timberlake CF, Henry BS (1986). Plant pigments as natural food colors. Endeavour 10: 31.

Vaezi K (2001). Micropropagation of Narvane Rana by Tissue culture. Nashriye Daneshgahe Tarbiyat Moallem 11: 3–4.

Vasil IK, Hildebrandt AC (1965). Growth and chlorophyll production in plant callus tissues grown in vitro. Planta 68: 69–82.

Vinterhalter B, Ninkovic S, Kozomara, Vinterhalter D (2007). Carbohydrat nutrition and anthocyanin accumulation in light grown and etiolated shoot cultures of carob (Ceratonla siliqual). Archives of Biological Sciences 59: 51–56.

Wang J, Bao MZ (2007). Plant regeneration of pansy (Viola wittrockiana) ‘Caidie’ via petiole-derived callus. Scientia. Horticulturae 111: 266–270.

Yi-xun Y, Ling L, Juan-xu L, Jing W (2009). Plant regeneration by Callus-mediated protocorm-like body induction of Anthurium andraeanum. Horticultural and Agricultural Science in China 8: 572–577.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

The Effect of Different Light Intensities on Callogenesis and Calli Pigments Content of Shoot and Floral Explants of Rosa damascena Mill. and Rosa miniature

 

Abdirad S.*1, Rezanejad F.2, Kalantari K.F.3

1 MSc Student, Department of Biology, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.

2 Associate Professor, Department of Biology, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.

3 Professor, Department of Biology, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.

 

Abstract

This study was conducted to compare the ability of callus production between shoot (leaf, petiole and stem) and flower (petal, pistil and anther) organs, as well as chlorophyll and anthocyanin accumulation in calli obtained from these explants in dark and light in Rosa miniature and Rosa damascena. Miniature rose and damask rose have become increasingly popular and economically important in recent years. In vitro regeneration method has a great commercial value in the rose propagation industry. The sterilized explants were cultured in modified MS medium supplemented by various concentrations of 2, 4-D (1, 2, 3, and 4 mg.l-1) and BAP (0.1, 0.5, 1 and 1.5 mg.l-1). The samples were kept under 1000 and 2000 lux white light intensities and dark. Combinations of 4 mg l-1 2, 4-D and 1.5 mg l-1 BAP in Rosa damascena were the most suitable treatments for callus production whereas various explants of Rosa miniature had different response to different growth regulator combinations. In the dark, callus initiation was quicker compared to the light. In addition, callus production of shoot explants were begun faster than floral ones. Callus initiation of floral explants from Rosa miniature occurred in 2th week after culturing, whereas in Rosa damascena observed in 3th week. The growth rate of calli from all explants (except anther) of Rosa miniature was more than Rosa damascena. The dark grown calli contained very low chlorophyll and anthocyanin concentrations whereas these contents increased remarkably at 1000 and 2000 lux (especially 2000 lux) light intensity. Leaf calli in Rosa damascena and stem calli in Rosa miniature produced maximum values of chlorophyll pigments whereas in both, anther and petiole calli had minimum amounts. The calli obtained of petal and pistil explants accumulated high concentration of anthocyanin pigments whereas the lowest values recorded from anther and petiole calli in Rosa miniature and petiole calli in Rosa damascena.

Keywords: Callus, Chlorophyll, Anthocyanin, Dark, Light, Rosa damascena, Rosa miniature.

 

 

 

 

 

 

 

 



* نویسنده مسئول: سمیه عبدی راد                                     تلفن: 09175375788                 Email: abdirad_60@yahoo.com

[1]Tissue Culture

[2] In Vitro

[3] Explant

[4] Mori

[5] Initiation

[6] Growth Rate

[7] Micropropagation

[8] Vasil

[9] Hildebrandt

*  Corresponding Author: Abdirad S.                       Tel: 09175375788           Email: abdirad_60@yahoo.com   

Arene L, Pellegrino, C, Gudin, SA (1993). Comparison of the somaclonal variation level of Rosa hybrida L. cv. Meirutral plants regenerated from callus or direct induction from different vegetative and embryonic tissues. Euphytica 71: 83–90.
Asano S, Ohtsubo S, Nakajima M, Kusunoki M, Kaneko K, Katayama H, Nawa Y (2001). Production of anthocyanins by habituated cultured cells of nyoho strawberry (Fragaria ananassa Duch.). Food Science Technology Research 8: 64–69.
Banthorpe DV, Barrow SE (1983). Monoterpene biosynthesis in extracts from cultures of Rosa damascena. Phytochemistry 22: 2727–2728.
Birsin MA, Onde S, Ozgen M (2001). Callus induction and plant regeneration from mature embryos of oat (Avena sativa L.). Turkish Journal Biology 25: 427–434.
Boskabady MH, Kiani S, Rakhshandeh H (2006). Relaxant effects of Rosa damascena on guinea pig tracheal chains and its possible mechanism(s). Journal of Ethnophurmacology 106: 377–382.
Burger DW, Liu L, Zary KW, Lee CI (1990). Organogenesis and plant regeneration from immature embryos of Rosa hybrida L. Plant Cell Tissue Organ Culture 21: 147–152.
Clairmont KB, Hagar WG, Davis EA (1986). Manganese toxicity to chlorophyll synthesis in tobacco callus. Plant Physiology 80: 291–293.
Dixon RA, Gonzales RA (1996). Plant Cell Culture : A Practical Approach. 2nd Ed. IRL Press, pp. 1–230, ISBN 0-19-963402-5.
Gasper T, Penel C, Thorpe T, Greppin H (1982). Peroxidases: A Survey of Their Biochemical and Physiological Roles in Higher Plants. University of Geneva press, Geneva, Switzerland.
Hildebrandt AC, Wilmar JC, Johns AJ, Riker H (1963). Growth of edible chlorophyllous plant tissue in vitro. American Journal of Botany 50: 248–254.
Hill GP (1967). Morphogenesis of shoot primordia in cultured stem tissue of a garden rose. Nature 216: 596–597.
Horn W (1992). Micropropagation of roses, In: Bajaj YPS (Ed.), Biotechnology in Agriculture and Foresty. Springer-Verlag, Germany. pp. 320–342.
Hsia C, Korban SS (1996). Organogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures of Rosa hybrida and Rosa chinensis minima. Plant Cell Tissue and Organ Culture 44: 1–6.
Hudson TH, Dale EK, Davies FT, Geneve RL (2002). Plant propagation principles and practices. 6th ed Prentice Hall of India Private Limited. New Delhi, India. pp. 1–770.
Igarashi K, Inagaki, K (1991). Effects of the major anthocyanin of wild grape (Vitis coignetiae) on serum lipid levels in rats. Agricultural and Biological Chemistry-Journal 55: 285–287.
Irani NG, Grotewold E (2005). Light-induced morphological alteration in anthocyanin-accumulating vacuoles of maize cells. BMC Plant Biology 20 (5): 7.
Islam MM, Ahmed M, Mahaldar D (2005). In Vitro callus induction and plant regeneration in seed explants of Rice (Oryza Sativa L.). Research Journal of Agriculture and Biological Sciences 1: 72–75.
Jabbarzadeh Z (2003). Effective factors on micropropagation of Damask rose. MS.c. Thesis, Shiraz University, Shiraz, Iran.
Jabbarzadeh Z, Khosh-Khui M (2005). Factor affecting tissue culture of Damask rose (Rosa damascena Mill.). Scientia Horticulturae 105: 475–482.
Kafi M, Riyazi Y (2001). Culture of Damask rose and production of Golab. Nashre Parchin, Iran.
Kaul K, Sabharwal PS (1974). Kinetin-induced changes in a-aminolevulinic acid dehydratase of tobacco callus. Plant Physiology 54: 644–648.
Lloyd D, Roberts AV, Short KC (1988). The induction in vitro of adventitious shoots in Rosa. Euphytica 37: 31–36.
Mahmood N, Piacente S, Pizza C, Barke A, Khan IA, Haj AJ (1996). The Anti-HIV activity and mechanisms of action of puru compounds isolated from Rosa damascena. Biochemical and Biophysical Research Communications 229: 73–79.
Mori T, Sakurai M, Shigeta J, Yoshida K, Kondo T (1993). Formation of anthocyanins from cells cultured from different parts of strawberry plants. Journal of Food Science 58: 788–792.
Murashige T, Skoog FA (1962). Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plant 15: 473–497.
Nakamura M, Takeuchi Y, Miyanaga K, Seki M, Furusaki Sh (1999). High anthocyanin accumulation in the dark by strawberry (Fragaria ananassa) callus. Biotechnology Letters 21: 695–699.
Pati PK, Rath SP, Sharma M, Sood A, Ahuja PS (2005). In vitro propagation of rose—a review. Biotechnology Advances.  Available online at www.sciencedirect.com.
Pontaroli AC, Camadro EL (2005). Plant regeneration after long term callus culture in clones of Asparagus officinalis L. Biocell 29: 313–317.
Prasertsongskun S (2003). Plant regeneration from callus culture of vetiver (Vetiveria zizanioides Nash). Songklanakarin Journal of Science Technology 25: 637–642.
Rakhshandeh H, Hosseini M (2006). Potentiation of pentobarbital hypnosis by Rosa damascena in mice. Indian Journal Exprimental Biology 44: 910–912.
Ram M, Prasad KV, Kaur C, Singh SK, Arora A, Kumar S (2011). Induction of anthocyanin pigments in callus cultures of Rosa hybrida L. in response to sucrose and ammonical nitrogen levels. Plant cell, tissue and organ culture 104: 171–179.
Rout GR, Debata BK, Das P (1992). In vitro regeneration of shoots from callus cultures of Rosa hybrida L. cv. Landora. Indian Journal Exprimental Biology 30: 15–18.
Salehi H, Khosh-Khui M (1996). Micropropagation of miniature rose cultivars. Iran Agricalture Research 15: 51–67.
Schneider F (2005). Effect of different cultural conditions on micropropagation of rose (Rosa sp. L.) and globe artichoke (Cynara scolymus L.), Ph.D. Thesis. Technical University Munich, Freising. Germany. 145.
Schoefs B (2000). The formation of chlorophyll from chlorophyllide in leaves containing proplastids is a four-step process. the FEBS Journals 458: 243–246.
Seeni S, Gnanam A (1981). Relationship between chlorophyll concentration and photosynthestic potential in callus cells. Plant and Cell Physiology 22: 1131–1135.
Simoes C, Bizarri CHB, da Silva CL, de Castro TC, Coutada LCM, da Silva AJR, Albarello N, Mansur E (2009). Anthocyanin production in callus cultures of Cleome rosea: modulation by culture conditions and characterization of pigments by means of HPLC-DAD/ESIMS. Plant Physiology and Biochemistry 47: 895–903
Tabaeezadeh Z, Khosh-Khui M (1981). Anther culture of Rosa. Scientia Horticulturae 15: 61–66.
Timberlake CF, Henry BS (1986). Plant pigments as natural food colors. Endeavour 10: 31.
Vaezi K (2001). Micropropagation of Narvane Rana by Tissue culture. Nashriye Daneshgahe Tarbiyat Moallem 11: 3–4.
Vasil IK, Hildebrandt AC (1965). Growth and chlorophyll production in plant callus tissues grown in vitro. Planta 68: 69–82.
Vinterhalter B, Ninkovic S, Kozomara, Vinterhalter D (2007). Carbohydrat nutrition and anthocyanin accumulation in light grown and etiolated shoot cultures of carob (Ceratonla siliqual). Archives of Biological Sciences 59: 51–56.
Wang J, Bao MZ (2007). Plant regeneration of pansy (Viola wittrockiana) ‘Caidie’ via petiole-derived callus. Scientia. Horticulturae 111: 266–270.
Yi-xun Y, Ling L, Juan-xu L, Jing W (2009). Plant regeneration by Callus-mediated protocorm-like body induction of Anthurium andraeanum. Horticultural and Agricultural Science in China 8: 572–577.