باکتری‌های حل‌کننده فسفات: جداسازی باکتری‌ها و ژن‌های رمزکننده حل‌کنندگی فسفات، مکانیسم و ژنتیک انحلال فسفات

باکتری‌های حل‌کننده فسفات: جداسازی باکتری‌ها و ژن‌های رمزکننده حل‌کنندگی فسفات، مکانیسم و ژنتیک انحلال فسفات

محمدرضا ساریخانی*¹، محمدعلی ملبوبی²، میترا ابراهیمی³

¹ استادیار بیولوژی و بیوتکنولوژی خاک، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز

² دانشیار بخش بیوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

³ دانشجوی دکترای بیولوژی و بیوتکنولوژی خاک، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا همدان

تاریخ دریافت: 16/07/1390، تاریخ پذیرش: 31/02/1392

چکیده

فسفر یکی از عناصر غذایی مهم برای گیاهان می‌باشد که در خاک فراهمی کمی دارد. فسفر در خاک به دو شکل آلی و معدنی یافت می‌شود. باکتری‌های تحریک‌کننده رشد گیاه یا PGPR، باکتری‌های موجود در خاک و ریزوسفر گیاهان هستند که با سازوکار‌های مختلف به رشد گیاه کمک می‌کنند. توانایی برخی ریزسازواره‌ها به منظور تبدیل فسفر نامحلول به شکل قابل استفاده مانند ارتوفسفات، ویژگی مهمی در PGPR می‌باشد که باعث افزایش عملکرد گیاهان می‌شود. گونه‌هایی از جنس Pseudomonas، Bacillus، Pantoea وRhizobium  از قوی‌ترین حل‌کنندگان فسفات به شمار می‌آیند. سازوکار اصلی برای انحلال فسفات معدنی تولید اسیدهای آلی است و در انحلال اشکال فسفر آلی اسید فسفاتازها نقش اصلی را در خاک بازی می کنند. روش مرسوم در جداسازی این دسته از باکتری‌ها استفاده از منابع فسفاته معدنی و آلی کم محلول یا نامحلول در محیط کشت‌های مایع یا جامد می‌باشد، که از طریق پایش تولید فسفات آزاد شده و کاهش pH در محیط مایع یا مشاهده هاله شفاف در اطراف کلنی‌ها و تولید کلنی‌های رنگی (سبز ، آبی و زرد) در صورت استفاده از سوبستراهای رنگزا در محیط کشت جامد دنبال می‌شود. گر چه دانش ژنتیک انحلال فسفات هنوز اندک می‌باشد، چندین ژن رمزکنندة فسفاتاز مشخص گردیده و همسانه‌سازی شده‌اند و تعدادی ژن درگیر در انحلال فسفات معدنی جداسازی شده است. روش‌های زیست‌شناسی مولکولی رویکردی مفید برای به دست آوردن و تشخیص سویه‌های PGPR کاآمد می‌باشد. انتقال و بیان ژن‌های درگیر در انحلال فسفات (فسفات آلی یا معدنی) در باکتری‌ها یا گیاهان یک راهکار جدید برای بهبود ظرفیت ریزسازواره‌ها به عنوان مایه تلقیح میکروبی است.

واژه‌های کلیدی: باکتری‌های حل کننده فسفات، فسفاتاز، فیتاز، اسیدهای آلی

مقدمه

با افزایش روزافزون جمعیت، تامین غذا به عنوان یکی از مهمترین چالش‌های پیش رو خواهد بود. انقلاب سبز اگرچه توانست انسان را در تامین غذای مورد نیازش یاری دهد ولیکن با روند رو به رشد جمعیت و نیاز به مواد غذایی بیشتر، ضرورت نیاز به انقلاب سبز دیگری با تاکید بر رعایت اصول زیست محیطی و حفظ منابع و پایداری آنها بیشتر احساس می‌شود، به طوری که تا 20 سال آینده قادر به تامین افزایش 50 درصدی مواد غذایی باشد (Khan et al., 2007). انقلاب سبز که با معرفی و عرضه کودهای شیمیایی شکل گرفت، در کنار افزایش تولید مخاطراتی را برای محیط زیست و بشر به دنبال داشت. لذا بشر را بر آن داشت که برای حفظ تولید و حفظ منابع پایه خود با پایه‌ریزی کشاورزی پایدار با تاکید بیشتری بر پتانسیل‌ها و توان‌های زیستی خاک از روش‌هایی استفاده نماید که با طبیعت سازگارتر باشد و تعادل زیست بومی خاک و محیط را حفظ نماید. در این رهگذر روی آوردن به کودهای زیستی به جای کودهای شیمیایی جایگزینی مناسب به نظر می‌رسد. در نیم قرن گذشته بیشترین توجه به باکتری‌های تثبیت‌کننده ازت معطوف بوده است. اما در دو دهه اخیر استفاده از باکتری‌های مفید دیگر برای رفع نیازهای تغذیه‌ای و احیای فلور طبیعی خاک تحت عنوان مهندسی ریزوسفر نیز مورد علاقه پژوهشگران این رشته بوده است. کودهای زیستی فسفاته با توجه به اهمیت و نقش فسفر در تغذیه گیاه در این مقاله مورد بررسی قرار می‌گیرد. سعی می‌شود روش‌های جداسازی این دسته از باکتری‌ها و سازوکارهای درگیر در انحلال فسفات بیشتر مورد توجه قرار گیرد و در ادامه ژنتیک انحلال فسفات و ژن‌های درگیر در انحلال فسفات از دید زیست فناوری مورد بررسی قرار می‌گیرد.

1- فسفر در خاک و اهمیت آن برای گیاه

با وجود ترکیبات فسفاته فراوان در خاک، گیاهان فسفر مورد نیاز خود را به شکل آنیون فسفات (H₂PO₄^- یا HPO₄^2-) از محلول خاک جذب می‌کنند. بر خلاف نیتروژن که اتمسفر یکی از منابع عمده آن به شمار می‌رود این عنصر فاقد چنین منبعی می‌باشد (Ezawa et al., 2002). این عنصر برخلاف عناصر پرمصرف دیگر دارای حداقل تحرک در خاک و گیاه است. توسعه ریشه، قوام ساقه، تشکیل گل و دانه، تشکیل میوه رسیدگی آن، تثبیت ازت در گیاهان لگوم، کیفیت محصول و مقاوم بودن به بیماری‌ها مواردی است که با تغذیه فسفر رابطه مستقیم دارند (Fageria, 2009). فسفر یکی از اجزاء ضروری متابولیسم انرژی، بخشی از اسیدهای نوکلئیک و غشاهای زیستی می‌باشد. فرایندهای اصلی بیوشیمیایی از قبیل فتوسنتز و تنفس به وسیله فسفات معدنی (Pi) یا مشتقات آلی آن فعال می‌شود (Raghothama and Karthikeyan, 2005). فسفر، تثبیت ازت را در گیاهان لگوم تحریک کرده و برای تولید قندها ضروری می‌باشد (Saber et al., 2005). تفاوت فاحشی بین میزان فسفر درون سلول‌های گیاهی (در حد میلی‌مولار، mM) و فسفر محلول در خاک (در حد میکرومولار، μM) وجود دارد. به طور میانگین اغلب عناصر معدنی موجود در محلول خاک در مقادیر میلی‌مولار موجودند، در حالی که فسفر در حد میکرومولار حضور دارد (Ozanne, 1980). البته فسفر در خاک‌ها به دو شکل آلی و معدنی به مقدار فراوان (Khan et al., 2007) و در محدوده mg kg^-1 1200-400 می‌باشد (Rodriguez and Fraga, 1999). غلظت فسفات محلول در خاک معمولاً خیلی پایین است و مقدار آن mg kg^-1 1 یا کمتر می‌باشد (Paul, 2007). سطوح بسیار پایین فسفات قابل جذب در ریزوسفر باعث می‌شود که این عنصر به عنوان یکی از اصلی‌ترین فاکتورهای محدود‌کننده رشد در بسیاری از زیست بوم‌ها شناخته شود. تثبیت معدنی فسفات قابل استفاده در خاک و تشکیل کمپلکس‌های آلی از دلایل اولیه برای فراهمی کم این عنصر به شمار می‌رود (Raghothama and Karthikeyan, 2005). بزرگترین منابع فسفر در کره زمین، صخره‌ها و دیگر رسوبات از قبیل آپاتیت‌های اولیه و دیگر اشکال معدنی اولیه حاصل شده از دوران‌های زمین‌شناسی است (Rodriguez and Fraga, 1999; Paul, 2007). شکل غالب فسفات در شرایط قلیایی، تری‌کلسیم فسفات می‌باشد. سنگ‌های فسفات معدنی از قبیل فلوروآپاتیت[1] و فرانکولیت[2] از جمله منابع فسفات کلسیم می‌باشند که در خاک نامحلول بوده و تامین‌کننده نیاز گیاه نخواهند بود (Goldstein, 2000). پویایی فسفات در خاک تحت تاثیر فرایند فیزیکوشیمیایی (جذب[3] و واجذب[4]) و زیستی (غیرمتحرک شدن[5] و معدنی شدن[6]) است (Paul, 2007; Fageria, 2009). مقادیر عمده‌ای از فسفات که در قالب کود به خاک اضافه می‌شود تشکیل رسوب می‌دهد و از دسترس گیاه خارج می‌شود، این موضوع به واکنش‌پذیری بسیار بالای یون ارتوفسفات با کاتیون‌های فلزی از قبیل Al³⁺ و Fe³⁺ در شرایط خاک‎‌های اسیدی و با یون Ca²⁺ در خاک‌های خنثی تا آهکی مربوط می‌شود (Gyaneshwar et al., 2002; Hao et al., 2002 ; Norrish and Rosser, 1983; Lindsay et al., 1989). نیاز به جایگزینی مناسب برای کودهای شیمیایی فسفاته زمانی احساس می‌شود که بدانیم استفاده زیاد از کودهای شیمیایی مخاطرات محیطی و خطراتی برای سلامت انسان به همراه دارد. در عمل بازدهی کودهای شیمیایی فسفاته بین 25-10 درصد می‌باشد  (Isherword, 1998) و تقریباً 90-75 درصد آن در خاک در اثر واکنش با کاتیون‌های فلزی به صورت رسوب و غیرقابل استفاده گیاه تبدیل می‌شود (Stevenson, 2005)، از طرف دیگر انرژی لازم برای تولید سالانه کودهای شیمیایی فسفاته چیزی بالغ بر 4 میلیارد دلار می‌باشد (Goldstein et al., 1993)، که با صرف هزینه بالایی همراه است. ضرورت یافتن جایگزینی مناسب برای رهاسازی فسفات‌های تجمع یافته در خاک زمانی بیشتر احساس می‌شود که بر این امر واقف گردیم که منابع فسفاته موجود در خاک قابلیت تامین فسفات مورد نیاز گیاهان برای تولید بهینه آنها را تا 100 سال دارا می‌باشد (Goldstein et al., 1993)، و کافی است که این منبع عظیم فسفر را به صورتی برای گیاه قابل جذب و استفاده نمود. فراهمی زیستی[7] فسفر قابل جذب در خاک به نوع گیاه، شرایط و سطح تغذیه‌ای و فلور میکروبی خاک بستگی دارد (Khan et al., 2007). قسمت اعظم جمعیت میکروبی خاک در ریزوسفر می‌باشد و باکتری‌های حل‌کننده فسفات از نظر نوع و توزیع جمعیت در شرایط خاک‌های مختلف فرق می‌کند و جمعیت آن به خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک، میزان ماده آلی و مقدار فسفر آن و عملیات کشاورزی بستگی دارد.

2- PGPR^[8]و باکتری‌های حل‌کننده فسفات

جامعه میکروبی خاک حاصلخیزی آن را از طرق تجزیه، معدنی کردن، ذخیره‌سازی و رهاسازی عناصر غذایی تحت تاثیر قرار می‌دهند. با توجه به آزادسازی حدود 40 درصد از مواد فتوسنتزی در ریزوسفر گیاه، این محیط شرایط مساعدی را برای حضور جمعیت میکروبی فراهم نموده است، باکتری‌های تحریک کننده رشد گیاه یا PGPRها شامل باکتری‌های احاطه‌کنندة ریشه‌اند که باعث افزایش رشد گیاه می‌شوند. امروزه PGPRها به عنوان زاد مایه[9] میکروبی به شکل کودهای زیستی و یا کنترل‌گرهای زیستی استفاده می‌شوند (Ping and Boland, 2004). سازوکار‌هایی که به وسیله آن PGPRها بر رشد گیاه تاثیر می‌گذارند به اثرات مستقیم و غیر مستقیم تقسیم می‌شود. اثر غیرمستقیم بیشتر از طریق تولید متابولیت‌هایی میکروبی است که اثر منفی بر عوامل بیماریزا دارند از قبیل آنتی‌بیوتیک‌ها، سایدروفورها[10] یا HCN و با ممانعت از رشد ریزسازواره‌های بیماریزا باعث افزایش رشد گیاه می‌شوند (Rodriguez and Fraga, 1999 Ramesh kumar et al., 2002; Timmusk and Wagner, 1999;). اما اثر مستقیم آنها می‌تواند از راه‌های سنتز هورمون‌های گیاهی[11]، تسهیل جذب عناصر غذایی، تثبیت ازت، کاهش پتانسیل غشاء[12] ریشه‌ها، سنتز برخی آنزیم‌هایی (از قبیل ACC deaminase) که سطح هورمون‌های گیاهی را تعدیل می‌کنند (Rodriguez and Fraga, 1999) و همچنین انحلال فسفات معدنی و معدنی کردن فسفات آلی به شکل قابل استفاده برای گیاهان باشد (Rodriguez and Fraga, 1999 Timmusk and Wagner, 1999;). مدارکی مبنی بر نقش ریزسازواره‌های ریزوسفری در انحلال فسفات معدنی در سال 1903 ارائه شده است (Illmer and Schinner, 1992). ریزسازواره‌ها از طریق معدنی کردن فسفر آلی و انحلال فسفات‌های رسوب یافته، فراهم‌سازی فسفر برای گیاهان را افزایش می‌دهند (Chen et al., 2006; Kang et al., 2002; Pradhan and Sukla, 2005). این دسته از ریزسازواره‌ها گرچه فسفر را در ساختار سلولی خود به خدمت می‌گیرند، ولی بخشی از آن که در محیط آزاد شده است در اختیار گیاه قرار می‌گیرد. باکتری‌ها در مقایسه با قارچ‌ها در انحلال فسفات بسیار موثرترند و جمعیت بالایی را به خود اختصاص می‌دهند (Alam et al., 2002)، به طوری کهFallah  (2006) جمعیت باکتری‌های حل‌کننده فسفات را 88 درصد جامعه میکروبی در خاک‌های شمال ایران گزارش کرد. گزارش‌های متفاوتی توانایی گونه‌های مختلف باکتری در انحلال فسفات معدنی نامحلول از قبیل تری‌کلسیم فسفات، دی‌کلسیم فسفات، هیدروکسی آپاتیت و سنگ فسفات را عنوان کردند. در بین باکتری‌هایی با این قابلیت، جنس‌های Pseudomonas، Bacillus،Rhizobium ، Burkholderia، Agrobacterium، Pantoea، Achromobacter و Flavobacterium مشاهده می‌شود. جمعیت‌های قابل توجهی از باکتری‌های حل‌کننده فسفات در خاک و در ریزوسفر گیاه وجود دارد که شامل گونه‌‌های هوازی و بی‌هوازی با غالبیت گونه‌های هوازی است، همچنین جمعیت آنها در ریزوسفر در مقایسه با خاک غیرریزوسفری به مراتب بیشتر بوده است (Rodriguez and Fraga, 1999; Whitelaw, 2000). باکتریهای B. megaterium، B. circulans، B. subtilis، B. polymixa، B. sircalmous، P. striata و Enterobacter می‌توانند به عنوان مهمترین گونه‌های شناخته شده معرفی شوند (Subba Rao, 1988; Kucey et al., 1989). باکتری‌های حل‌کننده فسفات به عنوان کود زیستی[13] از سال 1950 مورد استفاده قرار گرفته‌اند (Kudashev, 1956; Krasilinikov, 1957). رابطه بین گیاهان و باکتری‌های حل‌کننده فسفات به عنوان یک رابطه هم‌افزایی یا تشدید شونده[14] در طبیعت شناخته می‌شود. زیرا از یک سو باکتری فسفات محلول را برای گیاه فراهم می‌کند و از سوی دیگر، گیاه از طریق ترشحات ریشه خود ترکیبات کربنه مورد نیاز (عمدتاً قندها) را برای رشد باکتری آزاد می‌کند (Pérez et al., 2007). استفاده همزمان باکتری‌های حل‌کننده فسفات با سایر میکروفلور مفید ریزوسفری از قبیل قارچ‌های میکوریز و باکتری‌های تثبیت‌کننده ازت رشد گیاهان را در مقایسه با زمانی که آنها به تنهایی استفاده می‌شوند بیشتر تحریک می‌کند (Zaidi et al., 2003; Perveen et al., 2002; Belimov et al., 1995). همکاری ریزسازواره‌های موجود در ریزوسفر گیاهان می‌تواند موجب  بهبود جذب فسفات‌های در دسترس و همچنین فراهم ساختن منابع فسفات تثبیت شده برای گیاه شود. میزان فراهم‌سازی فسفات توسط باکتری­های حل‌کننده فسفات از منابع معدنی و آلی فسفات به ترتیب در محدوده μg ml^-1 42-25 و μg ml^-1 18-8 متغیر بوده است (Tao et al., 2008). Ghaderi et al  (2008) در بررسی اثر حل‌کنندگی و رهاسازی فسفات در سه باکتری P. putida، P. fluorescens Chao وTabriz P. fluorescens مقادیر آزاد شده فسفر را از هیدروکسید آهن (III) 51، 29 و 62 درصد گزارش دادند و بیشترین مقدار فسفر آزاد شده  μg ml^-18/14 بود. این در حالی است که P. striata و B. polymixa به ترتیب μg ml^-1 156 و 116 فسفر را آزاد ساختند (Rodríguez and Fraga, 1999). fluorescens P. از منابع تری‌کلسیم فسفات، فسفات آلومنیم و فسفات آهن به ترتیب مقادیر μg ml^-1 100، 92 و 51 آزاد ساخت (Khan et al., 2009). اخیراً انحلال فسفات به میزان μg ml^-1 120 و 150 برای دو باکتری P. agglomerans P5 و P.putida P13 نیز گزارش شده است (Malboobi et al., 2009a). گر‌چه مقایسه کمّی درستی نمی‌توان از آزمایشات صورت گرفته در منابع مختلف انجام داد، اما اطلاعات نشان می‌دهد که گونه‌های باسیلوس، سودوموناس و ریزوبیوم قویترین حل‌کنندگان فسفات هستند و تری‌کلسیم فسفات و هیدروکسی آپاتیت در مقایسه با سنگ فسفات تجزیه‌پذیرتر می‌باشند (Rodriguez and Fraga, 1999).

3- روش شناسایی و جداسازی باکتری‌های حل‌کننده فسفات

باکتری‌های حل‌کننده فسفات را می‌توان به طریق تهیه سری‌های رقت[15] یا روش‌های کشت‌های غنی شده[16] از نمونه‌های خاک ریزوسفری، غیر ریزوسفری و همچنین از مناطق رسوبات سنگ‌های فسفاته جداسازی نمود (Khan et al., 2009). به خاطر عدم پایداری ویژگی حل‌کنندگی فسفات برخی از باکتری‌ها، دوام و پایداری توان حل‌کنندگی آنها با کشت‌های مجدد مورد آزمایش قرار می‌گیرد (Illmer and Schinner, 1992). معمولاً جداسازی اولیه در محیط جامد انجام گرفته و توانایی آن در انحلال فسفات در محیط مایع آزمایش شده و بعد از انتخاب باکتری حل‌کننده فسفات کارآمد، زادمایه آن تهیه می‌شود و در شرایط آزمایش گلخانه‌ای و مزرعه‌ای آزمایش‌های تکمیلی بر روی آن در حضور گیاهان مختلف انجام می‌گیرد. این مراحل به صورت خلاصه در  شکل 1 آورده شده‌اند.

شکل 1- مراحل نمونه‌برداری و غربالگری باکتری‌های حل‌کننده فسفات به همراه آزمایش‌های تکمیلی جهت انتخاب سویه‌های کارآمد (از بالا به پایین).

Figure 1- The steps of sampling and screening of PSB in order to determine the high efficeint strains.

شکل2- تولید هاله شفاف و کلنی آبی توسط باکتری‌های حل‌کننده فسفات در محیط غربالگری. در شکل سمت راست تولید هاله شفاف توسط باکتری E. coli و تولید هاله شفاف و کلنی رنگی (آبی) در یکی از همسانه‌های مثبت در همین میزبان مشاهده می‌شود. در شکل سمت چپ غربالگری کتابخانه ژنومی سویه‌ای با فعالیت فسفاتازی بالا (P. putida P13) به منظور پایش در حضور سوبسترای رنگی BCIP مشاهده می‌شود، این کتابخانه در سویه میزبان  E. coli DH5αساخته شده است (Sarikhani et al., 2011).

Figure 2- Production of clear zone and blue colony by PSB in the screening medium. The production of clear zone in E. coli and blue phenotype of this bacterium which contatining a phosphatase gene (the right picture). Genomic library screening of a strain with high phosphatase activity (P. putida P13) was shown in presence of chromogenic substarte (BCIP). The library has been constructed in E. coli DH5α (the left picture) (Sarikhani et al., 2011).

با توجه به این که سازوکار انحلال فسفات از طریق تولید اسیدهای آلی و تولید آنزیم‌های فسفاتاز (مانند فیتاز) می‌باشد. محیط اختصاصی برای غربالگری فنوتیپی این باکتری‌ها با استفاده از این سازوکار طراحی شده‌اند به صورتی که با حذف هر گونه منبع فسفات قابل استفاده و محلول در محیط کشت از جایگزین‌های مناسب و نامحلول ترکیبات فسفات معدنی یا آلی (از قبیل تری‌کلسیم فسفات یا فیتات سدیم و فیتات کلسیم) استفاده کرده‌اند. در این رابطه به محیط کشت حداقل مانندSperber  و Pikovskaya می‌توان اشاره داشت (Pikovskaya, 1948).

تشخیص چشمی[17] و حتی برآورد نیمه کمی توانایی انحلال فسفات ریزسازواره‌ها به وسیله غربالگری در پلیت[18]‌ امکان‌پذیر است که در آن تولید منطقه شفاف[19] در اطراف کلنی‌های میکروبی (شکل 2) در محیط کشت حاوی ترکیبات فسفات نامحلول (به عنوان تنها منبع فسفر) مورد بررسی قرار می‌گیرد. این روش به روش هالو[20] نیز معروف است. همچنین روش بهبود یافته‌ای با استفاده از محیط حاوی بروموفنل بلو[21] ارائه شده است که در این محیط، رنگ آبی در اطراف کلنی‌ها به دلیل کاهش pH در نتیجه آزادسازی اسید‌های آلی، بی‌رنگ می‌شود (Rodriguez and Fraga, 1999; Nautiyal 1999; Mehta and Nautiyal 2001; Oliveira et al., 2009). با توجه به ایراداتی که برای روش مشاهده منطقه شفاف در اطراف کلنی در محیط Pikovskaya (PKV) گرفته می‌شود (به عنوان نمونه برخی از باکتریهای فاقد هاله شفاف بعضاً حل‌کنندگان فسفات خوبی در محیط‌های مایع می‌باشند)، Nautiyal (1999) محیط جدیدی را به نام (NBRIP) ارائه داد، وی معتقد است که این روش سه برابر در مقایسه با PKV کارآمدتر است.

از آن جهت که فسفاتازها و فیتازها به عنوان آنزیم‌های درگیر در معدنی کردن فسفات آلی شناخته می‌شوند، یکی از راه‌های جداسازی باکتری‌های حل‌کننده فسفات ارایه روش‌ها و راهکارهایی برای دست یافتن به باکتری‌هایی با فعالیت فسفاتازی و فیتازی بالاست است (Gargova et al., 1997; Shieh and Ware, 1968; Chen, 1998; Bae et al., 1999; Senn and Wolosiuk, 2005). استفاده از روش‌های فوق یا حتی روش‌های تلفیقی از قبیل کشت باکتری در محیط جامد در حضور فسفات معدنی یا آلی نامحلول یا کم محلول و پایش تولید هاله شفاف در اطراف کلنی و همچنین استفاده از سوبستراهای رنگزا[22] از قبیل BCIP (5- برومو 4- کلرو 3- ایندولیل فسفات) و پایش تولید کلنی‌های آبی (شکل 2) به دلیل فعالیت فسفاتازی (Malboobi et al., 2009a; Gibson et al., 1988 ) و در نهایت بررسی توان حل کنندگی فسفات و میزان آزادسازی فسفات توسط باکتری در محیط‌های مایع (Mehta and Nautiyal 2001; Malbooi et al, 2009a; Ghaderi et al, 2008) و انجام آزمایش‌های تکمیلی‌ با گیاه در شرایط گلخانه‌ای و مزرعه‌ای منجر به جداسازی نمونه‌های کارآمدی از این قبیل باکتری‌ها شده است (Malbooi et al, 2009b).  Richardson and Hadobas (1997) در یک مطالعه اقدام به جداسازی باکتری‌های موجود در خاک نمودند که قادر به استفاده از اینوزیتول هگزافسفات [23](IHP) یا فیتات به عنوان یک منبع فسفات آلی بودند. آنالیز 200 نمونه انتخابی‌ِ تصادفی نشان داد که کمتر از 5/0 درصد جمعیت کشت شده از باکتری‌ها قادر به استفاده از IHP به عنوان منبع کربن و فسفر هستند. در ادامه مطالعه آنها منجر به شناسایی 4 ریزسازواره از سودوموناس‌های فلورسنت (P. putida CCAR53 وP. putida CCAR59 ) یا غیر فلورسنت (P. mendocina CCAR60 و P. mendocina CCAR31) شد. سودوموناس‌های فلورسنت فعالیت فیتازی قابل توجهی از خود نشان دادند و بیشتر از 81 درصد فسفات را از IHP در حضور یا عدم حضور آرابینوز به عنوان منبع کربنِ اضافی آزاد ساختند. این در حالی است که سویه‌های غیر فلورسنت تنها در حضور آرابینوز قادر به آزادسازی فسفر از IHP بودند.

بایستی در نظر داشت که حل‌کنندگی فسفات توسط باکتری‌ها به عوامل مختلفی وابسته است مثلاً به نوع منبع نیتروژنی ارتباط دارد و زمانی که در محیط از نمک آمونیم استفاده می‌شود به دلیل تبادل پروتون و کاهش pH محیط در مقایسه با استفاده از نمک نیتراته، فسفر بیشتری آزاد می‌شود (Roos and Luckner, 1984)، در برخی موارد هم خلاف این امر گزارش شده است ( Reyes et al., 1999) در مطالعات جداسازی باکتری حل‌کننده فسفات، مشاهده شده که باکتری در کشت‌های مجددی[24] که از آن تهیه می‌شود، فعالیت حل‌کنندگی فسفات را از دست می‌دهد، بر همین اساس در جداسازی باکتری‌های حل‌کننده فسفات تاکید زیادی بر تکرار آزمایش و مشاهده پایداری رفتار حل‌کنندگی آن می‌شود.

4- سازوکار‌های انحلال فسفات

 4-1- انحلال فسفات معدنی

فعالیت انحلال فسفات معدنی به توانایی ریزسازواره‌ها در آزاد کردن متابولیت‌هایی از قبیل ترشح یون هیدروژن یا پروتون (H⁺) و اسیدهای آلی مربوط می‌شود (Surange et al., 1995; Nahas, 1996; Dutton and Evans, 1996). برخی معتقدند که اسیدهای آلی و معدنی با  گروه‌های کربوکسیل و هیدروکسیل خود کاتیون‌های همراه آنیون فسفات (Al³⁺, Fe³⁺, Ca²⁺) را کلات نموده و به این طریق نیز به انحلال فسفات کمک می‌کنند (Kpomblekou and Tabatabai, 1994; Stevenson, 2005; Omar, 1998) همچنین برخی اعتقاد دارند که انحلال فسفات نتیجه تبادل آنیونی PO₄^3- با آنیون اسید آلی می‌باشد (Omar, 1998).

مطالعه بر روی تولید اسیدهای آلی اغلب در محیط‌های مایع صورت پذیرفته و با روش‌هایی از قبیل کروماتوگرافی کاغذی[25] یا لایه نازک کروماتوگرافی یا به وسیله [26]HPLC و برخی روش‌های آنزیمی مشخص صورت گرفته است (Gyaneshwar et al., 1998). در بین اسیدهای آلی مختلف به نظر می‌رسد اسید گلوکونیک غالب‌ترین و مهمترین اسید تولیدی در باکتری‌های گرم منفی باشد (Goldstein et al., 1993; Kim et al., 1998). تولید این اسید آلی توسط باکتری‌هایی نظیر Pseudomonas sp.، Erwinia herbicola، P. cepacia،Azospirillum spp ، R. leguminosarum، R. meliloti، B. firmus و Burkholderia cepacia گزارش شده است (Rodriguez et al., 2004; Rodriguez and Fraga, 1999). سویه‌هایی از B. liqueniformis و B. amyloliquefaciens یافت شده‌اند که مخلوطی از اسیدهای استیک، لاکتیک، ایزووالریک و ایزوبوتیریک را تولید می‌کنند. دیگر اسیدهای آلی از قبیل اسید سوکسینیک، مالونیک، اکسالیک و گلی‌کولیک همچنین در بین حل‌کنندگان فسفات مشخص شده است (Rodriguez and Fraga, 1999).

احتمال‌های جایگزین به غیر از اسیدهای آلی به منظور انحلال فسفات معدنی با توجه به فقدان رابطه خطی بین pH و مقدار انحلال فسفر پیشنهاد شده است (Subba Rao, 1982). توانایی کلات‌کنندگی اسیدهای آلی مهم می‌باشد، چنان که افزودن 0.05M EDTA به محیط منجر به آزادسازی فسفر در محیط شد (Kucey, 1988). سازوکار‌های دیگری از قبیل تولید مواد کلات‌کننده به وسیله ریزسازواره‌ها، همچنین تولید اسیدهای معدنی از قبیل اسید سولفیدریک، اسید نیتریک، اسید کلریدریک و اسید کربنیک نیز ارائه شده است. به هر حال، تاثیر این فرایندها جای سوال است و به نظر می‌رسد که سهم آنها در آزادسازی فسفرِ خاک قابل صرف نظر کردن باشد (Rodriguez and Fraga, 1999). اسیدهای معدنی مانند اسید کلریدریک در مقایسه با اسید های آلی در pH یکسان کارایی کمتری در انحلال فسفات از خود نشان می دهند (Kim et al., 1998). یکی دیگر از این سازوکارها، پایین آوردن pH ریزوسفر می‌باشد که از راه تولید زیستی پروتون[27]و رهاسازی بیکربنات در تبادل گازی (O₂/CO₂) رخ می‌دهد.

انحلال فسفات معدنی نتیجه اثرات ترکیبی کاهش pH خاک و تولید اسیدهای آلی است (Fankem et al., 2006). ریزسازواره‌های حل‌کننده فسفات از طریق تولید اسیدهای آلی متفاوت همانند اسیدهای کربوکسیلیک[28] (Deubel and Merbach, 2005) و سازوکارهای کاهش pH ریزوسفر (He and Zhu, 1988) فسفات‌های موجود در مواد فسفردار مختلف را آزاد می‌کنند. با این وجود ظرفیت بافری[29] خاک کارایی حل‌کنندگان فسفات را در رهاسازی فسفات از فسفات کلسیم کاهش می‌دهد (Stephen and Jisha, 2009). اسیدهای کربوکسیلیک اساساً فسفات پیوند یافته با آهن و آلومینیم (Al-P و Fe-P) را از طریق تبادل آنیونی[30] یون فسفات با آنیون اسیدی رها می‌سازند یا از طریق کلات[31] نمودن یون‌های آهن و آلومینیم همراه فسفات (Omar, 1998) یا کاهش pH و یا رقابت آنیون اسید آلی با آنیون فسفات در جذب شدن در سطوح جذبی خاک (Nahas, 1996) به انحلال فسفات کمک می‌کنند.

قدرت اسیدهای آلی در کلات کنندگی کاتیون‌های فلزی شدیداً به ساختار مولکولی به ویژه به تعداد  گروه‌های کربوکسیل و هیدروکسیل آن برمی‌گردد. نوع و موقعیت لیگاند[32] علاوه بر قدرت اسید[33] توانایی و کارآیی آن را در فرایند انحلال فسفات تعیین می‌کند (Kpomblekou and Tabatabai, 1994). پتانسیل رهاشدن فسفر از آنیون‌های کربوکسیلیک با کاهش ثابت پایداری کمپلکس آنیون آلی-Al  یا آنیون آلی- Fe به ترتیب زیر کم می‌شود (Ryan et al., 2001).

citrate > oxalate > malonate / malate > tartrate >lactate > gluconate > acetate > formiate

با توجه به این که در انحلال فسفات علاوه بر اسیدهای آلی، آنزیم‌های فسفاتاز و فیتاز نیز دخالت دارند، برای مشخص نمودن عامل انحلال فسفات از تیمار با پپسین (یک نوع پروتئاز می‌باشد) یا استون ( حذف پروتئین‌ یا آنزیم) و باز NaOH (خنثی کننده اسید) استفاده می‌شود. در صورت تیمار با عوامل از بین برنده آنزیم  اگر آزادسازی فسفر تغییری نیابد، نشان می‌دهد که فرایند درگیر در انحلال فسفات غیرآنزیمی بوده و به تولید اسیدهای آلی یا معدنی مربوط می‌شود. اگر انحلال فسفات در صورت تیمار با باز متوقف شود، نشان دهنده آن است که عامل انحلال فسفات، اسید آلی می‌باشد (Rodriguez and Fraga, 1999). براساس این یافته‌ها همسانه‌سازی[34] ژن‌های مرتبط با انحلال فسفات معدنی دنبال شد. Goldstein (1994, 1995) پیشنهاد کرده است که اکسایش گلوگز به اسیدگلوکونیک و اغلب اسید2-کتوگلوکونیک پایه متابولیکی فنوتیپ‌های حل‌کننده فسفات معدنی در برخی از باکتری‌های گِرم منفی می‌باشد.

4-2- معدنی شدن فسفر آلی

ترکیبات فسفر آلی از قبیل اسیدفیتیک ممکن است 80-20 درصد فسفر خاک را به خود اختصاص دهد (Raghothama and Karthikeyan, 2005)، گرچه محدوده تغییر آن بین 90-4 درصد نیز گزارش شده است. تقریباً نیمی از ریزسازواره‌های موجود در خاک و ریشه گیاهان با فعالیت فسفاتازی خود فسفر آلی را معدنی می‌نمایند (Cosgrove, 1967; Tarafdar et al., 1988). فسفاتازهای اسیدی و قلیایی فسفات آلی را به عنوان یک سوبسترا به شکل معدنی تبدیل می‌نمایند(Beech et al., 2001) . گرچه سازوکار اصلی در معدنی شدن فسفات آلی خاک تولید اسید فسفاتازهاست (Rodriguez et al., 2000a). علاوه بر آن، رهاسازی آنیون آلی و تولید سایدروفورها (Yadaf and Tarafdar, 2001) می‌توانند فسفر آلی خاک را هیدرولیز نمایند. تجزیه‌پذیری فسفر آلی اساساً به خصوصیات بیوشیمیایی و فیزیکوشیمیایی مولکول‌ها  وابسته است. به عنوان نمونه، اسیدهای نوکلئیک، فسفولیپیدها و قندهای فسفاته به راحتی تجزیه می‌شوند، در حالی که اسید فیتیک، پلی‌فسفات‌ها به آرامی  تجزیه می‌شوند (Rodriguez and Fraga, 1999). فسفر می‌تواند از ترکیبات آلی موجود در خاک به وسیله 3 گروه آنزیمی آزاد شود. 1- فسفاتازهای غیر اختصاصی، که دِفسفریلاسیون پیوندهای فسفو- استر یا فسفوانیدرید در مواد آلی را دنبال می‌کنند 2- فسفاتازهای اختصاصی مانند فیتازها که باعث آزاد شدن فسفر از فیتات می‌شوند 3- فسفوناتاز[35] و C-P لیازها. گرچه از نظر توالی ژنی و پروتئینی این تقسیم‌بندی صحیح نمی‌باشد، اما در عمل می‌توان گفت که فعالیت اصلی معدنی شدن فسفر آلی بر عهده دو گروه اول می‌باشد (Rodriguez et al., 2006). واکنش‌های دِفسفریله شدن شامل هیدرولیز پیوندهای فسفواستر یا فسفوانیدرید می‌باشد (شکل 3). فسفوهیدرولازها به اسیدی و قلیایی تقسیم‌بندی می‌شوند. فسفوهیدرولازهای اسیدی بر خلاف فسفاتازهای قلیایی، در pHهای اسیدی تا خنثی فعالیت‌های کاتالیتیکی بهینه نشان می‌دهند. بعلاوه، آنها با توجه به اثرگذاری بر روی سوبسترای خاص می‌توانند به اسیدفسفاتازهای ویژه و غیرویژه تقسیم‌بندی شوند. فسفوهیدرولازهای ویژه با فعالیت‌های متفاوت شامل 3َ-نوکلئوتیدازها و 5َ-نوکلئوتیدازها، هگزوزفسفاتازها و فیتازها می‎باشد. یک گروه خاص از آنزیم‌های آزادکننده فسفات آن دسته‌ای هستند که قادر به شکستن پیوندهای C-P از ارگانوفسفات‌ها هستند. علاوه بر فسفاتازهای داخل سلولی، برخی از فسفوهیدرولازها به خارج از غشاء سلول ترشح می‌شوند و برخی هم متصل به غشاء باقی می‌مانند. این موقعیت قرارگیری به آنها اجازه می‌دهد که به عنوان آنزیم‌های پذیرندة فسفواسترهای آلی عمل نمایند که دارای وزن مولکولی بالا بوده (مثلDNA وRNA) و قادر به عبور از غشاء سیتوپلاسم نمی‌باشند. این مواد ابتدا به ترکیبات با وزن مولکولی کم تبدیل می‌شوند و این فرایند ممکن است با تبدیل DNA وRNA به نوکلئوزید مونوفسفاتها به واسطه DNase وRNase همراه با آزاد ساختن فسفر و محصولات جانبی آلی از طریق فسفوهیدرولازها باشد (Rodriguez & Fraga, 1999). هر دو نوع آنزیم فسفاتاز اسیدی (با pH بهینه 5/6-4 برای فعالیت) و فسفاتاز قلیایی (با pH بهینه 10-9 برای فعالیت) در خاک شناسایی شده‌اند. براساس یافته‌ها فسفاتاز اسیدی در خاک‌های اسیدی و فسفاتاز قلیایی در خاک‌های قلیایی غالب است. دمای بهینه در محدودة 60-40 درجه سلسیوس مشخص شده است، اگرچه اغلب اندازه‌گیری‌ها در دمای 37 درجه صورت پذیرفته است (Alef et al., 1995).

فیتازها (myo-inositol hexaphosphate phosphohydrolase) متعلق به گروه خاصی از فسفومونواسترازها هستند که قادر به رهاسازی فسفر از فیتات می‌باشند (Lei and Poress, 2003; Greiner et al., 2002). اسید فیتیک اولین بار در سال 1903 کشف شد و نمک‌های آن به نام فیتات مشهور می‌باشد (Mullaney and Ullah, 2005; Vohra and Satyanarayana, 2003)، فیتات‌ها از جمله اشکال فسفر آلی می‌باشند که در حدود 80-50 درصد فسفر موجود در بقایای گیاهی را به خود اختصاص می‌دهند (Vohra and Satyanarayana, 2003; Haefner et al., 2005). در شکل 4 رهاسازی فسفات از مولکول فیتات توسط آنزیم فیتاز نمایش داده شده است. سازوکارهای درگیر در انحلال فسفات معدنی و معدنی نمودن فسفات آلی در شکل 5 خلاصه شده است.

شکل 3- هیدرولیز سوبسترای فسفردار در حضور آنزیم فسفاتاز.

Figure 3- Hydrolysis of phosphorylated substrate in presence of phosphatase enzyme.

شکل 4- هیدرولیز فیتات در حضور آنزیم فیتاز.

Figure 4- Hydrolysis of phytate in presence of phytase enzyme.

شکل 5- سازوکارهای درگیر در انحلال فسفات معدنی و معدنی شدن فسفات آلی (استنتاج از Roderiquez and Fraga, 1999).

Figure 5- Different mechanisms in solubilizing inorganic phosphate and mineralization of organic phosphate (Roderiquez and Fraga, 1999).

5- ژنتیک باکتری‌های حل‌کننده فسفات

5-1- ژنتیک انحلال فسفات معدنی

پایه ژنتیک انحلال فسفات معدنی به عبارت دیگر فنوتیپ‌های (MPS⁺)[36] به خوبی مشخص نشده است. زیرا تولید اسیدهای آلی سازوکار اصلی برای انحلال فسفات معدنی در نظر گرفته می‌شود، ولی می‌توان فرض نمود هر ژنی که در سنتز اسیدهای آلی درگیر است در این رفتار نقش داشته باشد. برخی از ژن‌های درگیر در گونه‌های مختلف شناسایی شده‌اند که در جدول 1 آورده شده است. اولین بار در سال 1987 ژنی از Erwinia herbicola که در انحلال فسفات معدنی درگیر است به کمک غربالگری نوترکیب های[37] مقاوم به آنتی‌بیوتیک از کتابخانه ژنومی[38] در محیطی حاوی هیدروکسی آپاتیت به عنوان تنها منبع فسفر، همسانه سازی شد. بیان این ژن منجر به تولید اسید گلوکونیک و فعالیت انحلال فسفات معدنی در E. coli HB101 شد. توالی‌یابی این ژن دخیل بودن احتمالی آن را در سنتز PQQ [39] مشخص ساخت که یک فاکتور ضروری برای تشکیل هالوآنزیم[40]  گلوکز دهیدروژناز (GDH) می‌باشد. آنزیم GDH-PQQ تشکیل اسید گلوکونیک از مسیر اکسیداسیون مستقیم گلوکز را کاتالیز می کند.  E. coliقادر به تولید GDH می‌باشد ولی نمی‌تواند PQQ را بسازد، بنابراین اسید گلوکونیک تولید نمی‌شود (Rodriguez and Fraga, 1999; Rodriguez et al., 2006).

با اتخاذ رویکردی مشابه، ژن دیگری در ارتباط با انحلال فسفات معدنی از P. cepacia جداسازی شد. ابراز این ژن gabY که منجر به ایجاد یک فنوتیپ حل‌کننده فسفات معدنی از طریق تولید اسیدگلوکونیک در باکتری E. coli JM109 شد، هیچ‌گونه مشابهت ظاهری با ژن همسانه شدة سنتز کنندة PQQ نداشت. ژن gabY توانست یک نقش جایگزین در بیان و یا تنظیم مسیر اکسیداسیون مستقیم در  P. cepacia بازی کند (Rodriguez and Fraga, 1999). به نظر می‌رسد سایر ژن‌های جداسازی شدة مرتبط با فنوتیپ‌های MPS تنها محدود به pqqDNA و ژن‌‌های سنتز‌کننده gab نباشد. قطعه DNA ژنومی از باکتری Enterobacter agglomerans فعالیت MPS در E. coli JM109 نشان داد، اگر چه pH محیط تغییر نیافت. این نتایج نشان می‌دهد که تولید اسید روش مهمی است اما تنها سازوکار درگیر در انحلال فسفات به وسیله باکتری‌ها نمی‌باشد. جداسازی ژن رمز کننده فسفوانول پیرووات‌کربوکسیلاز pcc موجود در Synechococcus PCC7942، نشان می‌دهد که در MPS دخالت دارد (Rodriguez et al., 2006).

در مطالعه دیگری که توسط Rodriguez et al. در سال 2000 انجام شد، ژن سنتز‌کننده PQQ را که در انحلال فسفات معدنی درگیر است، از باکتری Erwinia herbicola به دو گونه باکتری Burkholderia cepacia IS-16 و Pseudomonas sp. PSS انتقال یافت. در ادامه بیان و ابراز این ژن را در دو باکتری مذکور که به عنوان کودهای زیستی در کشور کوبا مورد استفاده قرار می‌گیرند، مطالعه کرده و ارتباط آنها را با افزایش قابلیت MPS بررسی نمودند (Rodriguez et al., 2000b).

در پژوهشیYong Kim et al.  (1998) موفق به همسانه‌سازی ژن درگیر در انحلال فسفات معدنی از باکتری Rahnella aquatilis شدند. این باکتری از جمله باکتری‌های گِرم منفی بوده و تثبیت‌کنندة ازت می‌باشد و علاوه بر آن دارای توانایی انحلال فسفات معدنی می‌باشد. آنها از طریق تشکیل کتابخانه ژنومی[41] باکتری مذکور در باکتری E. coli HB101 اقدام به همسانه‌سازی ژن درگیر در انحلال فسفات معدنی نمودند. باکتری‌های دریافت کنندة قطعه مذکور دارای قابلیت انحلال فسفات معدنی بالاتری (به میزان دو برابر) از طریق تولید اسید گلوکونیک بودند و دلیل این تفاوت را به سطوح بیان این ژن نسبت دادند، چرا که ژن های mps در پلاسمیدی با تعداد نسخه بالا همسانه‌سازی شده بود.

جدول 1- ژن‌های درگیر در انحلال فسفات معدنی در باکتری‌های مختلف (به نقل از et al., 2006 Rodrıguez).

Table 1- Inorganic phosphate solubilizing genes from different bacteria (Rodrıguez et al., 2006).

این مطالعات بر روی ریزوبیوم‌هایی است که قادر به سنتز PQQ نیستند ولی قادر به تولید آپوانزیم[42] (یعنی GDH) می‌باشند، هدف آن است که ازطریق انتقال کلاستر ژنی (PQQ) به گونه‌های ریزوبیوم، این قابلیت را به ریزوبیوم‌ها انتقال دهند و باکتری توانایی تولید اسید گلوکونیک را بیابد.

 باکتریER2 Serratia marcescens با توجه به فعالیت سطح بالایش در انحلال فسفات معدنی از طریق اکسیداسیون مستقیم و تولید اسید گلوکونیک توسط Krishnaraj and Goldstein (2001) مورد مطالعه و بررسی قرار گرفت. آنها بعد از ساخت کتابخانه ژنومی این باکتری در باکتری E. coli سویه DH5α اقدام به غربالگری همسانه‌های مثبت نمودند. توالی‌یابی DH5α (pKG3791) نشان داد که قطعه DNA همسانه شده هیچ‌گونه تشابهی با ژن‌های شناخته شدة PQQ یا PQQGDH ندارد. در واقع، شناخت خیلی کمی از تنظیم ژنتیکی حاکم بر ویژگی انحلال فسفات معدنی وجود دارد. اطلاعات در مورد ژنتیک و سازوکار بیوشیمیایی درگیر در سنتز هالوآنزیم GDH-PQQ نیز کامل نمی‌باشد و تفاوت‌ها بین فنوتیپ‌های دائمی و القایی در بین چندین گونه باکتریایی مشاهده می‌شود. گلوکز، گلوکونات، مانیتول و گلیسرول از جمله القاگرهای احتمالی فعالیت هالوآنزیم می‌باشند (Rodriguez and Fraga, 1999).

5-2- ژنتیک معدنی شدن فسفات آلی

5-2-1- فسفاتازها

الگوهای متفاوتی از فعالیت فسفاتاز در باکتری‌ها دیده شده است. تولید این آنزیم‌ها اغلب به واسطه سازوکار‌های تنظیمی پیچیده کنترل می‌شود، بنابراین فعالیت آنزیم تنها تحت شرایط محیطی خاص مشخص می‌شود. در واقع، هنوز آگاهی کاملی از خصوصیات، تنظیم، بیان و نقش این آنزیم‌ها وجود ندارد. حتی در مورد E. coli و Salmonella typhimurim که بیشتر مطالعات بر روی آنها صورت گرفته است، تعداد معدودی از ژن‌های فسفاتاز همسانه‌سازی و توالی‌یابی شده‌اند و مطالعات بر روی تنظیم آنها صورت پذیرفته است (Rodriguez and Fraga, 1999). احتمالاً سازوکار اصلی تنظیم بیان فسفاتازها، القاء به واسطه میزان فسفات معدنی (Pi) موجود در محیط است. این سازوکار در مورد فسفاتاز قلیایی (pho A) E. coli مطالعه شده است. زمانی که غلظت Pi به mM 16/0 کاهش می‌یابد، بیان این ژن القاء می‌شود. این سازوکار شامل یک اپرون انتقال Pi[43] به عنوان عنصر تنظیم‌گر، بعلاوه اپرون حسگر و فعال کننده[44] به عنوان حل‌کننده و فعال‌کننده‌ است. ژن‌هایی که به وسیله میزان Pi  کنترل می‌شوند، بیان آنها به وسیله PhoB فعال می‌شود که بخش اصلی رگولون[45] PHO را تشکیل می‌دهد (Rodriguez and Fraga, 1999). گروه‌بندی فسفاتازهای باکتریایی بر اساس خصوصیات بیوشیمیایی و بیوفیزیکی آنزیم از قبیل pH بهینه (اسیدی، خنثی یا بازی)، پروفیل سوبسترایی (اختصاصی یا غیر اختصاصی برای یک سوبسترای خاص) و وزن مولکولی (وزن مولکولی بالا در مقابل پایین) انجام شده است. با توجه به در دست بودن اطلاعات توالی این آنزیم‌ها، همانند بقیه پروتئین‌ها به گروه‌های مولکولی مختلف بر اساس تشابه ساختار اولیه و الگوهای خاص توالی‌های حفظ شده برای هر خانواده، قابل تفکیک و شناسایی‌اند (Rossolini et al., 1998). فسفاتازهای اسیدی غیراختصاصی[46] (NSAP) باکتریایی در سه خانواده به نام گروه مولکولی A، B و C قرار داده می‌شوند (Thaller et al., 1998; Rossolini et al., 1998 ). توجه به گروه A این آنزیم‌ها به منظور زیست پالایی فلزات سنگین در دهه اخیر زیاد شده است. همچنین توجه به NSAPها به منظور انتقال و بیان این ژن‌ها در باکتری‌های PGPR برای رسیدن به سویه‌های حل‌کننده فسفات بهبود یافته با استفاده از فناوری DNA نوترکیب قابل ملاحظه است (Rodriguez et al., 2006). مقایسه توالی‌های اسیدآمینه 6 آنزیم شناخته شده گروه A حضور دومین‌های حفاظت شده[47] را نشان می‌دهد و وجود نگاره[48] GSYPSGH[TA] مشخصه این خانواده می‌باشد (Rossolini et al., 1998). مقایسه توالی‌های اسید آمینه در گروه B، حضور بخش‌های شدیداً حفاظت شده را در آن‌ها نشان می‌دهد. نگاره توالی FDIDDTVLFSSP به عنوان توالی امضاء[49] در این گروه پیشنهاد شده است (به نقل از Rossolini et al.,1998). گرچه گروه C از دو گروه دیگر مجزاست اما در سطح توالی با گروه B اسیدفسفاتازها و برخی اسیدفسفاتازهای گیاهی مشابهت دارد. اولین عضو شناسایی شده این گروه پروتئین OlpA-Cm می‌باشد که ژن رمزکننده آن از باکتری Chryseobacterium meningosepticum جداسازی شده است. مقایسه توالی اسید آمینه‌ای این گروه با سایر پروتئین‌ها این اجازه را داده است تا مناطق حفاظت شده و مشترک بین این توالی‌ها مشخص گردد. یافته‌ها نشان می‌دهد که گروه B و گروه C اسیدفسفاتازها به اتفاق برخی از اسیدفسفاتازهای گیاهی را می توان به خاطر وجود چهار اسید آمینه آسپارتات (D) در مناطق حفاظت شده در یک زیر خانواده به نام "زیرخانواده فسفوهیدرولاز DDDD" جای داد (به نقل از Rossolini et al., 1998). چندین ژن فسفاتاز اسیدی از باکتری‌های گِرم منفی جداسازی و تعیین ویژگی شده‌اند. برای نمونه ژن acp A جداسازی شده از Francisella tularensis رمزکننده فسفاتاز اسیدی با بهینه فعالیت در 6pH: با یک محدوده وسیع از نظر عمل بر سوبستراهای خاص است. همچنین ژن‌های رمزکننده فسفاتاز اسیدی کلاس A (Pho C) و کلاسB (Nap A) از Morganella morganii جداسازی شدند. علاوه بر آن، این آنزیم‌ها از نوع سرکش یا غیر القاپذیر[50] بوده و فعالیت بالا در 6pH: و در دمای 30 درجه سلسیوس و عمل بر سوبسترای مختلف را نشان می‌دهند (Rodriguez et al., 2006). در میان ریزوباکترها ژنی از Burkholderia cepacia جداسازی شده است که فعالیت فسفاتاز را تسهیل می‌کند. این ژن رمزکننده یک پروتئین متصل به غشاء خارجی است که در غیاب فسفر محلول بیان آن بالا می رود و می‌تواند در انتقال فسفر دخیل باشد (Rodriguez et al., 2000a). علاوه بر این، همسانه‌سازی دو ژن فسفاتاز اسیدی پری‌پلاسمیکِ غیر ویژه (nap E وnap D) از Sinorhizobium melilloti به انجام رسیده است. همچنین همسانه سازی و انتقال ژن فسفاتاز nap A از باکتری Morganella morganii به باکتری Burkholderia cepacia IS-16 با استفاده از وکتور pRK293 با دامنه میزبانی بالا[51] انجام شده و افزایش در فعالیت فسفاتاز خارج سلولی سویه نوترکیب گزارش شده است (Rodriguez et al., 2006). همسانه‌سازی و بیان ژن فسفوتری‌استر از (hoc A) از باکتری Pseudomonas montiellii C11 توسط Horn et al. (2002) صورت پذیرفت. دلیل نام‌گذاری آن به خاطر هیدرولیز کراکسن[52] به عنوان یک منبع فسفات آلی می‌باشد. طول این ژنbp  501 بوده و یک پروتئینkD  19 را رمز می‌کند و باکتری مورد نظر را قادر می‌سازد تا از این منبع فسفات آلی به عنوان تنها منبع فسفر موجود در محیط استفاده نماید.

5-2-2- فیتازها

مطالعات ژنتیکی فیتازها در سال 1984 شروع شد و اولین فیتاز تجاری تولید شده به وسیله ریزسازواره‌های مهندسی شده در اواسط سال 1990 با نام Natuphos وارد بازار شد. اغلب مطالعات مهندسی ژنتیک بر تحقیقات فیتاز به منظور بهبود تغذیه حیوانات تک معده‌ای متمرکز شده است. کاربرد دیگر آن در انحلال فیتات خاک می‌باشد، زیرا مایه‌های‌ تلقیح‌ با تولید فیتاز بالا از موارد مورد علاقه برای بهبود تغذیه گیاهان و کاهش آلودگی فسفر در خاک می‌باشد. همچنین ژن‌های فیتاز از قارچ، گیاهان و باکتری‌ها همسانه‌سازی شده‌اند. ژن‌های پایدار در برابر گرما (phy) از Bacillus sp. DS11 و ازB.subtilis VTT E-68013  همسانه‌سازی شده‌اند (Rodriguez et al., 2006; Konietzny and Greiner, 2004 وPandy et al., 2001). تا کنون چهار گروه مجزا بر اساس توالی ژن‌ها و مناطق حفاظت شده آنها، ساختمان سه بعدی، سازوکار‌های واکنش و ویژگی‌های آنزیمی برای فیتازها گزارش شده است که آنها را به اختصار HAP[53] ، PAP[54]، CP[55] وBPP[56] نامگذاری می‌کنند (Mullaney and Ullah, 2005; Tang et al., 2006; Cheng and Lim, 2006; Sarikhani, 2012). فیتازها را بر اساس pH بهینه فعالیت نیز به دو گروه کلی فیتازهای اسیدی و قلیایی تقسیم‌بندی می‌کنند که از گروه اول می‌توان به فیتازهای قارچی و گروه باکتری‌های گِرَم منفی اشاره کرد و باکتری‌های جنس Bacillus از گروه فیتازهای قلیایی‌اند (Vohra and Satyanaryana, 2003; Oh et al., 2004). در یک تقسیم‌بندی دیگر، فیتازها را براساس این که کدام گروه از فسفات ابتدا توسط آنزیم از فیتات برداشته می‌شود نامگذاری می‌کنند. به طور مثال 3- فیتاز یا 6- فیتاز که به ترتیب بیانگر آن است که فسفات شماره 3 و فسفات شماره 6 اولین فسفات‌های برداشته شده از مولکول فیتات می‌باشند. فیتاز E. coli از نوع 6-فیتاز بوده در حالی که فیتازهای قارچی و باسیلوس‌ها از نوع 3-فیتاز می‌باشند (Vohra and Satyanaryana, 2003; Oh et al., 2004; Vats and Banerjee, 2004). فیتازهای طبیعی را از نظر الگوی بیان به فیتازهای دایمی[57] و القایی[58] تفکیک می‌کنند (Vohra and Satyanaryana, 2003). Shieh and Ware  (1968) مشاهده کردند که تولید فیتاز برون سلولی قارچی در غلظت‌های پایین فسفات معدنی[59] در محیط رشد القاء می‌شود، برخلاف فیتاز قارچی، فیتاز B. subtilis در حضور فیتات القاء می‌شود همچنین این آنزیم در حضور عصاره آرد گندم نیز که حاوی فیتات می‌باشد، القا می‌گردد (Kerovuo, 2000). باکتری‌ها و قارچ‌های تولید کننده فیتاز به طور گسترده‌ای مورد مطالعه قرار گرفته‌اند و از جمله باکتری‌های گرم منفی می‌توان به E. coli، Pseudomonas sp.، Klebsiella sp. و از باکتری‌های گرم مثبت به Bacillus sp. اشاره داشت (Oh et al.,2004; Haefner et al., 2005; Konietzny and Greiner, 2004; Pandy et al., 2001; Vats and Banerjee, 2004). همچنین Rodriguez and Fraga (1999) اقدام به همسانه سازی، توالی‌یابی و بیان ژن فسفاتاز اسیدی/ فیتاز (app A2/ app A) از بدن خوک نمودند. دو وظیفه‌ای بودن این آنزیم‌ها آن‌ها را برای انحلال فسفر آلی خاک جذاب نموده است. گرچه قبلاً جداسازی ژن‌های فیتاز از Aspergillus niger، Emericella nidulans و چند گونه دیگر گزارش شده بود. ژن‌های فیتازِ قلیایی تا خنثی نیز از باکتری‌های B. subtilis وB. licheniformis  همسانه‌سازی شده‌اند (Kerovuo, 2000). با توجه به اهمیت آنزیم فیتاز در انحلال فسفات آلی و نیاز حیوانات تک معده‌ای برای استفاده از این منابع غذایی تولید فیتاز و افزودن آن به عنوان یک ماده غذایی اضافه شده به جیره غذایی[60] مورد توجه می‌باشد (Konietzny and Greiner, 2004 Pandy et al., 2001;). با توجه به این مساله Zinin et al. (2004) جداسازی و توالی‌یابی ژن phyA را ازکتابخانه ژنومی Obesumbacterium proteus گزارش کرده و اقدام به همسانه‌سازی و بیان این ژن در باکتری E. coli نمودند و در ادامه مطالعات خود را بر روی خصوصیات و ویژگی آنزیم فیتاز تولیدی تکمیل کردند. Malboobi et al. (2012) موفق به جداسازی دو ژن مرتبط با معدنی نمودن فسفات آلی به نام‌های PPP1 و PPP2 شدند. آن‌ها بعد از تشکیل کتابخانه ژنومی سویه P13 باکتری  P. putida در باکتری E.coli سویه DH5α اقدام به غربالگری در محیط حداقل Sperber در حضور BCIP نمودند. بررسی ویژگی‌های آنزیمی ژن‌های نام برده نشان داد که PPP1 دارای ویژگی بارز فیتازی می‌باشد در حالی که PPP2 بیشتر خاصیت فسفاتاز قندی از خود نشان می‌دهد (Sarikhani et al., 2011; Sarikhani et al., 2012 ).

به منظور جلوگیری از طولانی شدن بحث آنزیم‌های درگیر در انحلال فسفات معدنی و ژن‌های مرتبط با آن‌ها، به جدول 2 که مروری است بر مطالعات انجام یافته بر روی فیتازهای طبیعی یا بومی[61] و بیان فیتازهای نوترکیب[62] در باکتری های میزبان دیگر (اغلب E. coli)، اکتفا می‌شود. مطالعه منبع (Sarikhani and Malboobi, 1389) نیز برای خوانندگان پیشنهاد می‌شود.

به صورت خلاصه می توان تقسیم‌بندی از ژن‌های مرتبط در انحلال فسفات معدنی و معدنی کردن فسفات آلی ارائه نمود که در شکل 6 قابل مشاهده است.

6- روش‌های جداسازی ژن‌های فسفاتاز و فیتاز از باکتری‌های حل‌کننده فسفات

با توجه به اهمیت ژن‌های فسفاتاز و فیتاز در انحلال منابع فسفات آلی و در نظر گرفتن تنوع بسیار بالای توالی آن‌ها، مروری بر روش‌های مختلف جداسازی این ژن‌ها ضروری به نظر می‌رسد.

آنزیم‌های فسفاتاز که فیتازها نیز زیرمجموعه‌ای از آن‌ها را تشکیل می‌دهند، توسط گروه متنوعی از ژن‌ها رمز می‌شوند. به طوری که Thaller et al. (1998) فسفاتازهای پروکاریوتی را بر اساس نگاره توالی حفاظت شده[63] موجود در توالی آنها در 3 گروه مجزای A، B و C قرار دادند. تنوع در بین فسفاتازهای یوکاریوتی بیش از این می‌باشد به طوری که فیضی و ملبوبی (اطلاعات منتشر نشده) فسفاتازهای یوکاریوتی را بر اساس تشابه توالی در 5 گروه مجزا تقسیم‌بندی نمودند. روش‌های مختلفی تا کنون برای همسانه‌سازی این قبیل از ژن‌ها به کار گرفته شده است. برای نمونه PCR و RT-PCR به ترتیب ساده‌ترین روش برای جداسازی و همسانه‌سازی ژن‌ها از ژنوم[64] یا نسخه‌های رونوشت[65] یک موجود بر اساس اطلاعات ژن‌های همسانه‌سازی شده در گذشته می‌باشد. استفاده از RT-PCR در مورد پروکاریوت‌ها به دلیل طول عمر پایین mRNA، فقدان ساختار اینترونی و عدم وجود دنباله [66]A استفاده نشده است (Saleh-Lakha et al., 2005) گرچه استفاده از این روش در مورد فسفاتازهای یوکاریوتی قابل استفاده می‌باشد (Celler et al., 1998; Bei and Xiang-Ning, 2008).

مشکلات روش‌های فوق زمانی بیشتر می‌شود که اطلاعات ژنوم موجودی در دست نباشد و با یک ژن جدید روبرو باشیم. یکی دیگر از روش‌های قابل استفاده در جداسازی این گروه از ژن‌ها، تهیه کتابخانه ژنومی و غربالگری[67] همسانه‌ها با استفاده از هاله شفاف در اطراف همسانه می‌باشد. البته باید در نظر داشت که تولید هاله شفاف می‌تواند ناشی از رهاسازی آنزیم یا اسیدهای آلی باشد (Gargova et al., 1997; Malboobi et al., 2009a; Mehta and Nautiyal, 2001; Bae et al., 1999).

همچنین دست‌یابی به ژن‌های مورد نظر می‌تواند از طریق طراحی آغازگرهای مختلط[68] بر اساس مناطق حفاظت شده (Cho et al., 2005; Huang et al., 2006 ) یا بعد از خالص‌سازی آنزیم و توالی‌یابی قسمتی از توالی اسید آمینه‌ای آن برای رسیدن به ژن رمزکننده در ژنوم موجود هدف (Kerovuo et al., 1998; Cho et al., 2005) امکان‌پذیر باشد. به هر حال رسیدن به ژن رمزکننده از طریق خالص‌سازی آنزیم و طراحی آغازگر برای آن نیاز به داشتن اطلاعات لازم و کافی از رفتار آنزیم در شرایط مختلف دارد که تشخیص و خالص‌سازی آن کار ساده‌ای نمی‌باشد.

در طول زمان برخی از روش‌ها برای جداسازی باکتری‌های حل‌کننده فسفات (Mehta and Nautiyal, 2001; Van Ommen Kloeke et al., 1999) و برخی روش‌ها برای پایش فعالیت فسفاتازی سویه‌ای خاص یا حتی جداسازی ژن استفاده شده است. برای نمونه Gibson et al. (1988) استفاده از BCIP را در مورد قارچ آسپرژیلوس و سوسپانسیون کشت سویا و تشخیص فعالیت فسفاتازی آن گزارش داد. دیگران نیز برای غربالگری فعالیت فسفاتازی همسانه‌های حاصل از تشکیل کتابخانه ژنومی از سوبستراهای رنگزا از قبیل pNPP (Pradel and Boquet, 1988) و فنل فتالئین دی فسفات/ متیل گرین[69] (Riccio et al., 1997) که به ترتیب موجب تشکیل رنگ زرد و سبز همسانه‌های با فعالیت فسفاتازی بالا می‌شود، استفاده کرده‌اند.

علاوه بر آن در زمان‌های مختلف با توجه به اهمیت موضوع کار، ارائه روش‌های کارآمدتر و سریع‌تر در برنامه تحقیقاتی پژوهشگران بوده است. به طور مثال، استفاده از رسوب رنگ فلئورسنت[70] برای تشخیص فعالیت فسفاتازی کلنی باکتری گزارش شده است (Van Ommen Kloeke et al., 1999). همچنینSenn and Wolosiuk  (2005) روشی شیمیایی بر اساس آزاد شدن فسفر به عنوان محصول ناشی از فعالیت فیتازی همسانه‌های حاصل از کتابخانه ژنومی برای غربالگری عرضه کردند.

شکل 6- ژن‌های مرتبط با انحلال فسفات معدنی و آلی (استنتاج از Sarikhani et al. 2010; Roderiquez and Fraga, 1999; Thaller et al. 1998).

Figure 6- Genes related to soilubilization of organic and inorganic phophsate (Sarikhani et al. 2010; Roderiquez and Fraga, 1999; Thaller et al. 1998).

جدول 2- فیتازهای باکتریایی مختلف شناخته شده به همراه ویژگی‌های مهم آنزیمی آنها (Sarikhani and Malboobi, 1389).

Table 2- The known bacterial phyatses and their biochemical characteristics (Sarikhani and Malboobi, 1389).

در پژوهشی Sarikhani et al. (2010) با ارایه روشی برای غربالگری عملکردی[71] کتابخانه ژنومی سویه P13 باکتری P. putida با استفاده از BCIP در محیط حداقل Sperber، جداسازی دو ژن جدید فسفاتازقندی و فیتازی را گزارش دادند. آن‌ها در کار خود با مشاهده رفتار فسفاتازی القایی در محیط Sperber حاوی BCIP اقدام به همسانه‌سازی ژن‌های فوق نمودند (شکل 2). در شکل 7 روش‌های مرسوم برای دست‌یابی به ژن‌های رمزکننده فسفاتاز/ فیتاز و یا ژن‌های درگیر در انحلال فسفات معدنی به شکلی کلی و خلاصه مشخص می‌باشد.

7- گام آخر

بعد از کسب آگاهی نسبت به نقش باکتری‌های حل‌کننده فسفات، نگاهی به استفاده از آنها در دنیا صحبت پایانی خواهد بود. تولید کود زیستی حاوی باکتری‌های حل‌کننده فسفات شامل 3 مرحله می‌باشد. اولین گام: انتخاب و آزمایش سویه‌های حل‌کننده فسفات، دومین گام: تهیه زادمایه که خود شامل انتخاب حامل مناسب و تولید انبوه باکتری حل‌کننده فسفات می‌باشد و سومین گام: روش‌های کنترل کیفی و توزیع کود زیستی. در هندوستان کود زیستی فسفاته با نام IARI microphos که داری دو باکتری به نام‌های P. striata و B. polymyxa و سه گونه قارچی حل‌کننده فسفات به نام‌های  Aspergillus awamori، A. niger و Penicillium digitatum می‌باشد، مورد استفاده قرار می‌گیرد (Khan et al., 2007). در اتحاد جماهیر شوروی سابق اولین کود زیستی فسفاته به نام Phosphobacterin مورد استفاده قرار گرفت که به ترتیب بعداً در کشورهای اروپای شرقی و هند نیز مورد استفاده قرار گرفت، در این کود زیستی از باکتری حل کننده فسفات به نام B. megaterium var. phosphaticum بهره گرفته می‌شد (Khan et al., 2007). دو گونه باکتری Burkholderia cepacia IS-16 و Pseudomonas sp. PSS به عنوان کودهای زیستی حل‌کننده فسفات در کشور کوبا مورد استفاده قرار می‌گیرند (Rodriguez et al., 2000b). کود زیستی بارور2 که شامل دو باکتری P.putida  و Pantoea agglomerans می‌باشد نیز در ایران مورد استفاده قرار گرفته است (Malboobi et al., 2009a,b).

زادمایه باکتری‌های حل‌کننده فسفات می‌تواند به تنهایی و مجزا[72] یا همراه با سایر زادمایه‌ها و مختلط[73] استفاده شود که در این حالت به آن تلقیح همزمان[74] هم اطلاق می‌شود. استفاده به صورت بذرمال، استفاده مستقیم در خاک یا در آب آبیاری از روش‌های پیش‌رو برای استفاده این دسته از کودهای زیستی است که هر کدام با محاسن و معایبی همراه است و تصمیم گیری در مورد نحوه به کارگیری آنها به شرایط حاکم بستگی دارد، به عنوان نمونه زمانی که بذر مورد تیمار یک آفت کش قرار گرفته که با باکتری سازگاری ندارد بایستی از روش بذرمال صرف‌نظر کرد (Khan et al., 2007; Khan et al., 2009).

رقابت باکتری تلقیح شده با سایر باکتری‌های بومی خاک، بقا و تکثیر آن در محیط، موفقیت باکتری در شرایط محیطی جدید را تضمین می‌کند. معمولاً جمعیت و تراکم باکتری تلقیح شده با گیاه یا خاک سریعاً کاهش می‌یابد (Ho and Ko, 1985). بقاء باکتری به عوامل مختلفی از قبیل ترکیب خاک، دما، رطوبت، pH خاک (Van Elsas et al., 1991) و عوامل زیستی از قبیل رقابت، شکار و نوع گیاه و ترشحات ریشه بستگی دارد.

نتیجه‌گیری

با توجه به نیاز ضروری سلول‌های زنده به فسفر، ریزسازواره‌های حل‌کننده فسفات اعم از باکتری‌ها، مخمرها و قارچ‌ها به عنوان یک راهکار برای تامین و فراهمی آن و غلبه بر کمبود آن در چرخه حیات نقش ایفا کرده‌اند. در این میان، توجه بیشتر پژوهشگران به گونه‌های میکروبی فعال در زمینه تولید اسیدهای آلی، تولید کننده فسفاتازها و فیتازها معطوف بوده است که با دست‌یابی به یک گونه مناسب بتوان از آن درحیطه‌هایی چون کودهای زیستی برای گیاهان و پروبیوتیک‌ها برای دام وطیور استفاده نمود. در این میان باکتری‌های حل‌کننده از جنس Pseudomonas،  Bacillusو Enterobacterبرای افزایش فراهمی فسفر مورد نیاز گیاه و همچنین رشد و عملکرد، کارآمدتر به نظر می‌رسند. در مرحله نخست رسیدن به یک ریزسازواره با توان حل‌کنندگی فسفات بالا و در ادامه دستیابی به ژن رمزکننده آن، راه را برای به خدمت گرفتن هر چه بیشتر این توانهای زیستی برای پیشبرد اهداف هموار می‌سازد. نگاهی به پژوهش‌‌های کلاسیک گذشته و استفاده از روش‌های مولکولی نوین، آینده‌ای روشن را پیش روی ما ترسیم می‌نماید تا بتوان با در کنار هم قرار دادن این دو، روشی کارآمد برای غلبه بر مشکل کمبود فسفات محلول در خاک و یا مواد مغذی از یک سو و آلودگی‌های زیست محیطی حاصل از کاربرد کودهای فسفاته شیمیایی از سوی دیگر یافت. برای رسیدن به این مهم تلاش میکروب شناسان، خاکشناسان و زیست‌فناوران ضروری به نظر می‌رسد.

شکل 7- روش‌های مرسوم در جداسازی ژن‌های فسفاتاز و فیتاز (استنتاج از Cho et al. 2005, Sarikhani et al. 2010).

Figure 7- Conventional methods in isolation of phosphatase and phytase genes (Sarikhani et al., 2010; Cho et al., 2005).