اثرات پارامترهای مختلف بر روی کیفیت نتایج حاصل از تکنیک cDNA-AFLP در مطالعه ترانسکریپتوم سیب زمینی

اثرات پارامترهای مختلف بر روی کیفیت نتایج حاصل از تکنیک cDNA-AFLP در مطالعه

ترانسکریپتوم سیب زمینی

کبری مسلم خانی*¹، جواد مظفری²

¹ استادیار موسسه تحقیقات ثبت و گواهی بذرو نهال

² دانشیار موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر

تاریخ دریافت: 16/07/1390، تاریخ پذیرش: 31/02/1392

چکیده

آنالیز­های ترانسکریپتوم در ایجاد اطلاعات و درک کافی از سیستم های واکنشی گیاهان در برابر عوامل زیستی و غیر زیستی بسیار کارآمد هستند. cDNA-AFLP به عنوان روشی مناسب علاوه بر تکرار پذیری بالا، نیاز به اطلاعات اولیه در مورد توالی ژن ها ندارد. البته عوامل متعددی در حساسیت، دقت و تکرار پذیری آن موثر هستند که توجه به این عوامل می تواند باعث افزایش کیفیت ارزیابی­ها و دستیابی به اطلاعات صحیح گردد. در تحقیق حاضر cDNA-AFLP برای آنالیز واکنش گیاه سیب زمینی در برابر استرس ناشی از باکتری بیماریزای Ralstonia solanacearum در شرایط in vitro بهینه سازی گردید. در این راستا پارامترهای مختلف و اثر تعامل آنها با یکدیگر در افزایش حساسیت و تکرار پذیری این روش بررسی شد. نتایج نشان داد روش استخراج RNA و استفاده از mRNA  از فاکتور های تاثیر گذار در موفقیت آزمون cDNA-AFLP است به طوری که RNA های استخراج شده با استفاده از روش مبتنی بر ستون از یکنواختی و کیفیت بالاتری برخوردار هستند و استخراج mRNA علاوه بر حذف RNA های ریبوزومی، در کاهش ممانعت کننده ها و اجرای صحیح سایر مراحل آزمون تاثیر گذار است. همچنین بهینه سازی فاکتورهایی از قبیل رقت مناسب محصول پیش تکثیر که به عنوان الگو در مرحله تکثیر انتخابی استفاده می­شود، تعداد سیکل PCR در مرحله پیش تکثیر، غلظت مناسب MgCl₂ و Taq DNA Polymerase در مراحل پیش تکثیر و تکثیر انتخابی، نقش تعیین کننده ای بر روی تعداد و غلظت قطعات cDNA تکثیر شده و وضوح آن بر روی ژل دارد.

کلمات کلیدی: بیان ژن، ترانسکریپتوم، سیب زمینی،  cDNA-AFLP

مقدمه

برای درک بهتر مکانیسم های مولکولی مختلف در واکنش موجودات به ویژه گیاهان در برابر عوامل زیستی و غیر زیستی، آنالیز همزمان و وسیع ژن های دخیل در واکنش گیاه و ترانسکریپتوم موجود از اهمیت زیادی برخوردار است. آنالیز ترانسکریپتوم علاوه بر جنبه های مختلف دفاع و مقابله گیاه در برابر انواع تنش های زنده و غیر زنده، باعث شناخت ژن های جدید دفاعی و فرآیند های جدید فیزیولوژیکی می گردد. این امر می تواند برای القاء عکس العمل های دفاعی گیاه در سیستم های تولید دارای تنش، استفاده گردد.  این نوع تجزیه و تحلیل­ها، همپوشانی فرایند­های پیام رسانی ناشی از دفاع در پاتوسیستم­های مختلف و همچنین فرایند­های پیام رسانی ناشی از هورمونها را مشخص می کند ( Schenk et al., 2000). تا کنون روش­های مولکولی متفاوتی برای بررسی بیان متفاوت ژنها معرفی شده است که می توان به روشهای
 RNA fingerprinting arbitrary primer PCR (Welsh et al., 1992) و Differential display RT-PCR (DD-RT-PCR) (Liang and Pardee, 1992)، cDNA-amplified fragment length polymorphism (cDNA-AFLP)  (Bachem et al., 1998) وSuppression Subtractive Hybridization (SSH)  (Diatchenko et al., 1996) اشاره نمود. هر یک از روش­های ذکر شده مزایا و معایبی دارند و بر اساس هدف، میزان اطلاعات اولیه در مورد توالی ژن­ها و توالی­های موجود و نیز امکانات مالی، مورد استفاده قرار می­گیرند. روشهای مبتنی بر هیبریداسیون مانند Microarray با وجود کارایی بالا در ارزیابی بیان هزاران ژن در یک آزمون، به دلیل نیاز به اطلاعات اولیه در رابطه با توالی ژنهای موجود هدف و نیز هزینه بر بودن و عدم توانایی ردیابی ترانسکریپتوم در غلظت پایین، در ارتباط با برخی ارگانیسم ها و در تعداد زیادی از آزمایشگاه های تحقیقاتی به ویژه در کشورهایی با توان اقتصادی پایین، قابل اجرا نمی باشد (Kivioja et al., 2005). علاوه بر این، روش هایی مانند DD-RT-PCR با وجود آنکه از سرعت و حساسیت در تعیین تغییرات بیان ژن برخوردار است و نیاز به اطلاعات اولیه در زمینه توالی ژنها ندارد اما به دلیل اشکالاتی نظیر تکرار پذیری پایین، واکنش مثبت دروغین مورد توجه قرار نگرفته و روش cDNA-AFLP به عنوان تکنیکی برای بررسی وسیع بیان ژنومی، جایگزین آن شده است (Bachem et al., 1998, Fukumura et al., 2003). روش cDNA-AFLP از توسعه DD-RT-PCR حاصل شده است و میزان اندک RNA مورد نیاز برای شروع آزمون، حساسیت بالا، سادگی، تکرارپذیری و عدم نیاز به اطلاعات اولیه ژنوم و امکان اتوماسیون با استفاده از رنگ­های فلورسانت از مزایای آن به شمار می روند (Cho et al., 2001; Breyne & Zabeau, 2001) . همین امر باعث تمایل روزافزون استفاده از این روش در درک و شناسایی سیستم دفاعی گیاهان علیه بسیاری از تنش­های زنده و غیر زنده می باشد (Ekkehard, 2001, Petters et al., 2002; Kemp et al., 2005; Samuelian et al., 2004; Esposito et al., 2008; Durrant et al., 2000; Neveu et al., 2003). با استفاده از این روش امکان بررسی بیان تعداد زیادی ژن بصورت همزمان وجود دارد. در واقع روش cDNA-AFLP روشی برای انگشت نگاری   RNA است که از AFLP (Vos et al., 1995) روش انگشت نگاری DNA منتج شده است  (Ekkehard, 2001).

با وجود اینکه به واسطه اتصال مولکول­های آداپتور به cDNA تعداد واکنش­های مثبت دروغین  به صورت چشمگیری در این روش کاهش­می یابد (Cho et al., 2001) اما نحوه استخراج RNA و کیفیت آن و نحوه تهیه cDNA با کیفیت و کمیت مناسب و نیز بهینه سازی آزمون PCR در صحت قطعات تکثیر شده و تعداد، شدت و وضوح قطعات حقیقی می تواند بسیارتاثیر گذار باشد. در این تحقیق علاوه بر مقایسه دو روش استخراج RNA مبتنی بر استفاده از ستون و روش معمول استخراج کلرید لیتیم (Mekuria et al, 2003) ، تاثیر استخراج mRNA در مقایسه با استفاده از RNA تیمار شده با آنزیم DNase و نیز فاکتور­های مختلفی که باعث افزایش کیفیت محصول cDNA-AFLP، تکرار پذیری بالای آن و ظهور کامل بندها  می شود، بحث شده است.

مواد و روشها

نمونه گیاهی

غده های بذری طبقه سوپرالیت رقم مارفونا از مرکز تحقیقات کشاورزی اردبیل تهیه شد. از گیاهان سیب زمینی کاشته شده در گلخانه ریزنمونه هایی برداشت شد و پس از شستشوی سطحی با آب روان، نمونه ها در شرایط استریل ضد عفونی و سپس به محیط کشت MS (Murashing & Skoog, 1962) منتقل شدند. نمونه های کشت شده در دمای 22 تا 25 درجه سانتی گراد و فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی انکوبه شدند. پس از رشد کافی هر ماه عمل تکثیر و واکشت جوانه ها انجام شد.

آلوده سازی گیاهچه ها

جدایه  SH₁₂ باکتری Ralstonia solanacearum که از گیاه سیب زمینی در خوزستان جداسازی شده بود از دانشگاه صنعتی اصفهان دریافت گردید و پس از انجام آزمون بیماریزایی روی رقم حساس و اطمینان از قدرت بالای بیماریزایی آن در انجام این تحقیق مورد استفاده قرار گرفت.

رقم حساس مارفونا پس از استقرار و تکثیر در شرایط درون شیشه ای برای آلوده سازی توسط باکتری با استفاده از روش غوطه ور نمودن گیاهچه ها با ریشه های بریده در سوسپانسیون باکتری مورد استفاده قرار گرفت  (.(Fock et al., 2000; Moslemkhani et al., 2011  سی گیاهچه هم اندازه و هم شکل که کاملا ریشه دار بوده و رشد رویشی مناسبی داشتند انتخاب گردید. شش گیاهچه به عنوان شاهد بدون هر گونه تیمار، شش گیاهچه دیگر به عنوان نمونه شاهد منفی که تنها با آب تیمار شدند در نظر گرفته شد و 18 گیاهچه با باکتری تیمار شدند. شش گیاهچه، دو روز پس از آلودگی، شش گیاهچه، چهار روز پس از آلودگی و شش گیاهچه، هفت روز پس از آلودگی برداشت و پس از پودر شدن در ازت مایع در 80- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

استخراج RNA

به منظور انتخاب روش مناسب برای استخراج RNA و تهیه RNA با کیفیت بالا و یکنواخت، از دو روش استخراج کلرید لیتیم (Mekuria et al, 2003) و روش استخراج مبتنی بر ستون ( کیت کیاژن طبق دستورالعمل شرکت تولید کننده) استفاده شد. سپس در total RNA بدست آمده از روش کلرید لیتیم، واکنش حذف DNA با استفاده از آنزیم DNase انجام شد. برای این منظور حدود 10 میکروگرم
 total RNA، 10 میکرولیتر 10X Reaction buffer ، 55 میکرولیتر آب، 10 میکرولیتر آنزیم DNase(1u/µ) و یک میکرولیتر آنزیم Ribonuclease inhibitor با هم ترکیب و به مدت نیم ساعت در 37 درجه سلسیوس نگهداری شد. سپس ترکیب حاصل به مدت 10 دقیقه در 65 درجه سلسیوس قرار گرفت. پس از انجام واکنش، آنزیم ها با استفاده از فنل –کلروفرم –ایزوآمیل الکل (1:24:25) حذف شدند و با انجام سانتریفوژ به مدت دو دقیقه در 14000 دور در دقیقه رسوب داده شدند. فاز رویی به ویال جدید منتقل و یک دهم حجم آن استات سدیم سه مولار (با  اسیدیته پنج و دو دهم) و سه برابر حجم اتانول 95 درصد افزوده گردید ترکیب حاصله به مدت 15 دقیقه روی یخ قرار گرفت و سپس به مدت 30 دقیقه در 15000  دور در دقیقه سانتریفوژ شد پس از حذف فاز رویی رسوب با اتانول 70 درصد شستشو داده شد. در نهایت بعد از خشک شدن رسوب (به مدت نیم ساعت در 37 درجه ) در 15 میکرولیتر آب فاقد RNase حل گردید.

محلول total RNA استخراج شده از طریق ستون، طبق دستورالعمل کیت استخراج mRNA کیاژن مجددا از ستون، جهت خالص سازی mRNA عبور داده شد تا حتی الامکان، DNA و RNA های ریبوزومی حذف گردند.

تهیه  cDNAدو رشته ای

در مرحله بعد با استفاده از کیت سنتز First strand cDNA بر اساس دستورالعمل شرکت فرمنتاس نمونه cDNA تک رشته ای تهیه شد و از محصول آن جهت تهیه Second strand cDNA بصورت زیر استفاده شد:

مقدار 20 میکرولیتر محصول First strand به همراه 5/7 میکرولیتر 10xcDNA buffer ، 5/2میکرولیتر DNA polymeraseI (10u/µ)  (شرکت Promega) و 5/1 میکرولیتر RNaseH (1/5u/µ)  (شرکت Promega)، 25/1 میکرولیتر dNTP (10mM) و 5/46 میکرولیتر آب ترکیب شده و به مدت دو ساعت در 16 درجه سانتی گراد قرار داده شد. قسمتی از محصول cDNA به منظور بررسی کمی و کیفی روی ژل آگاروز یک درصد الکتروفورز شد و سپس بقیه محصول به منظور حذف آنزیمها تحت تیمار فنل – کلرفرم قرار گرفت. برای این کار حجم ترکیب، به وسیله آب مقطر استریل به 100 میکرولیتر رسانیده و به میزان هم حجم فنل- کلرفرم - ایزوآمیل الکل (1:24:25) اضافه گردید. پس از مخلوط نمودن کامل به مدت پنج دقیقه در 13000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید. فاز رویی جدا شده و 45 میکرولیتر استات آمونیوم 5/7 مولار و 500 میکرولیتر اتانول مطلق سرد به آن اضافه شد. ترکیب به مدت 15 دقیقه روی یخ نگهداری و در 15000 دور به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ شد تا cDNA رسوب نماید. رسوب حاصله پس از شستشو با اتانول سرد 70 درصد، به مدت نیم ساعت در 37 درجه سانتی گراد قرار داده شده تا خشک شود سپس در 20 میکرولیتر آب مقطر استریل حل شد.

هضم و اتصال

برای انجام واکنش هضم، 20 میکرولیتر از محصول cDNA با چهار میکرولیتر بافر x10 Tango، نیم میکرولیتر آنزیم EcoRI و نیم میکرولیتر آنزیم MseI و 15 میکرولیتر آب ترکیب شده و به مدت یک شب در 37 درجه سانتی گراد قرار داده شد، سپس با قرار دادن به مدت دو ساعت در دمای 65 درجه سانتی گراد فعالیت آنزیمی متوقف گردید.

قبل از انجام اتصال Mµ50 از آداپتورهای MseI و EcoRI در یک چرخه حرارتی شامل: پنج دقیقه در 94 درجه سانتی گراد 10 دقیقه در 65 درجه سانتی گراد و 10 دقیقه در 37 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. برای انجام واکنش اتصال 20 میکرولیتر از محصول  هضم با 5/3 میکرولیتر بافر اتصال، 35/0 میکرولیتر آنزیم (u/µ 3) T4/DNA ligase ( شرکت Promega ) ، یک میکرولیتر آداپتور  µM) EcoRI (5 و یک میکرولیتر آداپتور MseI (50 µM)  ترکیب شده و به مدت سه ساعت در دمای اتاق نگهداری شد. از محصول این مرحله به عنوان الگو در مرحله پیش تکثیر در روش cDNA-AFLP استفاده شد.

بهینه سازی مرحله پیش تکثیر و تکثیر انتخابی تکنیک cDNA-AFLP

تعداد سیکل در مرحله پیش تکثیر، میزان رقیق سازی محصول پیش تکثیر برای استفاده در مرحله تکثیر انتخابی، غلظت MgCl₂ و غلظت Taq DNA Polymerase برای بهینه سازی نتیجه در محصول نهایی cDNA-AFLP حاصل از RNA بدست آمده از دو روش مختلف بررسی گردید.

پیش تکثیر و تکثیر انتخابی

محصول مرحله اتصال با استفاده از آغازگرهایی که توالی آداپتور را شناسایی می نمایند در واکنش PCR مرحله پیش تکثیر قرار گرفت. واکنش در حجم 25 میکرولیتر، حاوی 3 میکرولیتر از محصول مرحله اتصال با 5/2 میکرولیتر 10xPCR buffer ، 5/1 میکرولیتر MgCl₂ (25mM)  ، 5/2 میکرولیتر dNTP(2mM) ، 1 میکرولیتر آغازگر  EcoRI (µM10)و یک میکرولیتر آغازگر MseI (µM10) (جدول 1)، 2/0 میکرولیترµ) Taq DNA polymerase(5u/ و 3/13 میکرولیتر آب تشکیل شد سپس واکنش تحت سیکلهای دمایی 30 ثانیه در 94 درجه سانتی گراد ، 60 ثانیه در 56 درجه سانتی گراد و 60 ثانیه در 72 درجه سانتی گراد به تعداد 15، 20 و 25 چرخه انجام گرفت. محصول واکنش PCR پیش تکثیر در روی ژل آگاروز یک درصد بررسی شد.

محصول مرحله پیش تکثیر به نسبت 1:1، 1:5، 1:10، 1:20، 1:50 و 1:200 رقیق شد. 3 میکرولیتر از هریک از آن ها با 2 میکرولیتر 10xPCR buffer، 2 میکرولیتر dNTP(2mM)، 8/0 میکرولیتر آغازگر
 NN EcoRI + (µM10) و 8/0 میکرولیتر آغازگر  +NN MseI  (µM10) و 2/9 میکرولیتر آب مقطر استریل در واکنش PCR مورد تکثیر قرار گرفت. برای بهینه سازی واکنش، غلظت های مختلفی (4/0، 2/0 و 1/0 میکرولیتر) µl) Taq DNA polymerase(5u/ و 1، 2 و 3 میلی مولار MgCl₂  استفاده شد و ترکیب های مختلف تحت چرخه­های دمایی ذیل قرار گرفتند.

یک چرخه شامل 30 ثانیه در 94 درجه سانتی گراد، 30 ثانیه در 65 درجه سانتی گراد، 60 ثانیه در 72 درجه سانتی گراد، 12 چرخه شامل  30 ثانیه در 94 درجه، 30 ثانیه در 65 درجه که در هر چرخه 7/0 درجه سانتی گراد دما کاسته می شود و 60 ثانیه در 72 درجه سانتی گراد و در نهایت 23 چرخه شامل 30 ثانیه در 94 درجه، 30 ثانیه در 56 درجه و 60 ثانیه در 72 درجه سانتی گراد.

به منظور اطمینان از اینکه واکنش با موفقیت صورت گرفته، نمونه ها ابتدا در روی  ژل آگاروز 3%  الکتروفورز شدند و پس از کسب اطمینان از صحت انجام واکنش، نمونه ها در روی ژل اکریل آمید شش درصد الکتروفورز گردیدند تا تفکیک قطعات DNA محصول PCR با دقت و وضوح بیشتری صورت گیرد.

جدول 1- آغازگر های مورد استفاده در مرحله پیش تکثیر و تکثیر انتخابی در تجزیه cDNA-AFLP واکنش سیب زمینی رقم مارفونا در برابر Ralstonia solanacearum.

Table 1- The primers used in the pre and selective amplification in cDNA-AFLP analysis of potato plant (cv. Marfona) against Ralstonia solanacearum.

الکتروفورز محصول cDNA-AFLP روی ژل اکریل آمید شش درصد

به منظور تهیه ژل پلی اکریل آمید،70 میلی لیتر اکریل آمید شش درصد هواگیری شده و 80 میکرولیتر تمد (TEMED) و 70 میکرولیتر APS 25% آن افزوده شد. قبل از تزریق ژل، شیشه های دستگاه الکتروفورز عمودی (Biorad) تیمار شدند، بدین صورت که ابتدا هر دو شیشه با آب و صابون و سپس با الکل به خوبی و با دقت شسته شد و با استفاده از دستمال یا کاغذ صافی واتمن هر شیشه بطور کاملا جداگانه خشک و تمیز شد. سپس شیشه بوسیله 300 میکرولیتر Repel تیمار گردید و جهت اتصال کامل ژل به شیشه ساده این شیشه بوسیله دو میلی لیتر ترکیب Bind-salin که حاوی 90 میکرولیتر آب، 10 میکرولیتر اسید استیک، 10 میکرولیتر Bind-salin و 1900 میکرولیتر اتانول مطلق است تیمار گردید. پس از گذشت 10 دقیقه که شیشه ها خشک شدند با گذاشتن Spacer ها شیشه ها روی هم قرار داده شد. پس از بستن دستگاه، ژل بین دو شیشه تزریق گردید. پس از یک ساعت که ژل بسته شد نمونه ها الکتروفورز شدند. قبل از الکتروفورز در نمونه های 5 میکرولیتری محصول PCR، دو میکرولیتر DNA sequencing stop solution ( حاوی سه میکرولیتر   NaOH پنج مولار، 1439 میکرولیتر فرمامید 99 درصد، 5/1 میلی گرم بروموفنل بلو، 5/1 میلی گرم زایلن سیانول و 61 میکرولیتر آب ) اضافه شد. سپس نمونه ها به منظور Denature شدن به مدت چهار دقیقه در 94 درجه سانتی گراد قرار گرفته و سریعا به یخ منتقل و در 80 وات و دمای 55 درجه سانتی گراد در بافر TBE1x به مدت دو ساعت الکتروفورز شدند.

پس از اتمام زمان مذکور، دو شیشه از هم باز شده و شیشه حاوی ژل به مدت 10 دقیقه در محلول فیکس (یک لیتر حاوی 100 میلی لیتر اتانول و 10 میلی لیتر اسید استیک) قرار گرفت پس از یک دقیقه شستشو به مدت سه دقیقه در محلول پیش تیمار (یک لیتر حاوی 15 میلی لیتر اسید نیتریک) قرار گرفت. پس از یک دقیقه شستشو، شیشه حاوی ژل، 20 دقیقه در محلول نیترات نقره 2/0 % قرار گرفت و سپس دو بار به مدت 30 ثانیه با آب مقطر شستشو شد. سپس ژل دو بار هر بار به مدت 10 دقیقه در محلول ظهور (یک لیتر حاوی 30 گرم کربنات سدیم و 540 میکرولیتر فرمالدئید) قرار گرفت. پس از ظهور کامل بند های DNA، ژل به مدت پنج دقیقه در محلول Stop (یک لیتر حاوی 50 میلی لیتر اسید استیک) قرار گرفت(Abrinbana et al., 2010) . پس از خشک شدن ژل و تهیه عکس، تعداد بند های ظاهر شده و شدت وضوح آنها در شرایط مختلف آزمون بررسی و مقایسه شد.

نتایج و بحث

پارامتر های متعددی در بهبود نتایج cDNA-AFLP تاثیر گذار است. استخراج RNA با کیفیت بالا به عنوان اولین گام در اجرای صحیح این آزمون مطرح است. در بررسی صورت گرفته مشخص شد محصول RNA به دست آمده از روش استخراج مبتنی بر ستون نسبت به محصول روش کلرید لیتیم از کیفیت و یکنواختی بالاتری برخوردار است (شکل 1). روش مبتنی بر استفاده از ستون علاوه بر سرعت بالا، در حذف ممانعت کننده هایی نظیر پلی ساکاریدها، پلی فنل ها و سایر متابولیت های ثانویه که باعث کاهش کیفیت RNA می گردد (Loulakakis et al., 1996)  و می تواند در نسخه برداری معکوس و تهیه cDNA مشکلاتی جدی به همراه داشته باشد (Salzman et al.,  1999)  موفق عمل نمود. در تمامی نمونه های استخراج شده به وسیله روش مبتنی بر ستون، RNA های ریبوزومی به صورت نوارهای بسیار مشخصی مشاهده می شوند که حاکی از سلامت و عدم خرد شدن نمونه های RNA است در حالیکه در برخی تکرارهای روش کلرید لیتیم، RNA از کیفیت لازم برای ساخت cDNA برخوردار نبود.  در این صورت به دلیل خرد شدن زیاد RNA امکان از بین رفتن بعضی از توالی های سایت برشی و ایجاد خطا در آزمایشات به میزان زیادی افزایش می یابد (Tattersall et al., 2005). استخراج total RNA با کیفیت بالا در موفقیت روشهای مولکولی مطالعه پروفایل بیان ژنها از اهمیت بسیار زیادی برخوردار است. بنابراین ایجاد تمهیدات لازم برای مقابله با تجزیه سریع RNA بوسیله ریبونوکلئازها گام مهم و ضروری است. تسریع در مراحل استخراج به میزان زیادی مانع از خرد شدن RNA می شود (Sambrook et al., 1989).

DNA موجود در total RNA باعث ایجاد باند های کاذب در پروفایل بیان ژنها می گردد برای حذف آن ها به دو طریق تیمار total RNA با آنزیم DNase و استخراج mRNA از total RNA  عمل شد. در روش دوم علاوه بر حذف DNA، تاحد زیادی RNA های ریبوزومی نیز حذف شدند و نتایج نهایی cDNA-AFLP نشان داد که در روش اول یعنی استخراج total RNA با کلرید لیتیم و تیمار DNase تعداد کل بندهای مشاهده شده در پروفایل ژنهای بیان شده نسبت به زمانی که از روش استخراج بر پایه ستون و در پی آن استخراج mRNA استفاده شده کمتر می باشد. علاوه بر آن برخی بندهای جدید نیز مشاهده می گردد که ممکن است مربوط به RNA ریبوزومی باشد (شکل 2) احتمالا دلیل اصلی کاهش بندها، از دست رفتن برخی RNA ها در مراحل متعدد این روش خصوصا در مرحله تیمار با فنل- کلروفرم می باشد. علاوه بر این حجم بالای ممانعت کننده ها در نمونه RNA با استفاده از روش کلرید لیتیم اشکالاتی در سنتز cDNA و PCR ایجاد می نماید (Salzman et al., 1999; Tattersall et al., 2005 ). استخراج mRNA تهیه cDNA از آن باعث کاهش حجم ممانعت کننده ها و عدم ایجاد اختلال در مراحل بعدی آزمایش و اجتناب از هضم غیر اختصاصی cDNA می گردد (Bachem et al., 1998) و در نهایت موجب می شود که نتایج cDNA-AFLP از صحت بالاتری برخوردار باشند.

به منظور بررسی اولیه نتایج تکثیر انتخابی قبل از انتقال آنها به روی ژل پلی اکریل آمید، محصولات روی ژل آگاروز سه درصد الکتروفورز شدند قبل از بهینه سازی تکنیک، محصول cDNA-AFLP  بصورت اسمیر از داخل چاهک مشاهده گردید. با انتقال این نمونه ها به روی ژل پلی اکریل آمید همچنان اسمیر با حداقل میزان بند DNA و یا بدون وجود بند DNA خاص مشاهده شد (شکل 3).

پس از اطمینان از صحت اجرای مراحل استخراج RNA، سنتز cDNA و هضم و اتصال، بهینه سازی دو مرحله پیش تکثیر و تکثیر انتخابی از طریق انتخاب سطح بهینه فاکتور های متعددی از جمله غلظت ترکیبات موجود در واکنش PCR ، تعداد سیکلهای PCR و غلظت الگوی مرحله تکثیر انتخابی انجام شد. نتایج نشان داد زمانیکه محصول مرحله اتصال رقیق نشود می توان تعداد سیکلهای PCR را به 15 سیکل و میزان رقت محصول مرحله پیش تکثیر را به یک پنجاهم کاهش داد. با استفاده از این محصول پیش تکثیر بعنوان الگو در مرحله تکثیر انتخابی و غلظت  mM2 MgCl₂، اسمیر به میزان زیادی حذف و  بندهای cDNA ظاهر شدند (شکل 3).

در واکنش PCR مرحله تکثیر انتخابی فاکتورهای متعددی از جمله کیفیت و میزان الگو مورد استفاده، ترکیبات آغازگری، کنترل ممانعت کننده ها و اجتناب از آلودگیهای محیط کار و همچنین بهینه سازی غلظت و کیفیت ترکیبات PCR ، تعداد و نوع سیکلهای دمایی در بهبود حساسیت و دقت نتایج این روش تاثیر گذار است (Kennedy & Oswald, 2011, Bachem et al., 1998) .

در مجموع cDNA-AFLP به عنوان روش مناسبی برای بررسی وسیع تغییرات بیان ژن ها در سطح ترانسکریپتوم در تعامل سیب زمینی با باکتری R. solanacearum معرفی می شود و نتایج حاصل از آن اطلاعات زیادی در ارتباط با مکانیسم های مولکولی در شرایط حساسیت و مقاومت فراهم می نماید. در این تحقیق با مطالعه بیان افتراقی ژن های سیستم دفاعی، الگو های متفاوتی از cDNA-AFLP در تعامل سیب زمینی با باکتری R. solanacearum  مشاهده شد. البته در صحت و دقت نتایج حاصل از این تکنیک فاکتورهای متعددی از جمله کیفیت و کمیت RNA و cDNA مورد استفاده و همچنین شرایط آزمون های PCR دخالت دارند که در صورت عدم توجه، نتایج بدست آمده با اشکالات متعددی همراه خواهد بود.