همسانه‌سازی ژن شبه انسولین انسانی در ناقل‌های بیانی گیاهی

همسانه­سازی ژن شبه انسولین انسانی در ناقل­های بیانی گیاهی

سرگل دارابی¹، سونیا رمضانی¹، محمد احمدآبادی²*

 ¹دانشجوی کارشناسی ارشد، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان.

 ²استادیار، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان.

تاریخ دریافت: 29/07/1392، تاریخ پذیرش: 25/07/1394

چکیده

گیاهان تراریخت، بیورآکتورهای مناسبی برای تولید پروتئین­های نوترکیب در سطوح بالا و با کیفیت بهتر می­باشند. همسانه­سازی ژن کدکننده پروتئین هدف در ناقل بیانی مناسب یکی از مراحل مهم در انتقال و بیان موفق پروتئین در گیاه مورد نظر می­باشد. هدف از این تحقیق، همسانه­سازی cDNAی فاکتور رشد شبه انسولین-1 (IGF1) در ناقلهای بیانی مناسب گیاهی بود. برای این منظور، ابتدا با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی، cDNAی ژن IGF1 تکثیر و با استفاده از سایت­های برشی تعبیه شده در ساختار آغازگر در ناقل پایه pMCS5 وارد گردید. با توجه به مزایای غلات بدلیل کشت وسیع، بیوماس بالا، قابلیت ذخیره دانه و قابلیت استفاده خوراکی برای تولید پروتئین­های دارویی، پس از توالی­یابی، cDNA در یک ناقل مناسب برای انتقال و بیان پروتئین در غلات همسانه­سازی گردید. همچنین با توجه به اینکه کلروپلاست­های تراریخت پتانسیل بیشتری برای تولید پروتئین نوترکیب عملکردی در سطوح بالا دارند، cDNAی توالی­یابی شده در دو ناقل اختصاصی برای انتقال و بیان IGF1 در کلروپلاست توتون نیز همسانه­سازی گردید. در یکی از این ناقلها، ژن گزینشگر بوسیله دو توالی مستقیم LoxP احاطه شده تا امکان حذف ژن انتخابگر از طریق سیستم Cre/Lox پس از گزینش گیاهان تراریخت فراهم گردد.

کلمات کلیدی: فاکتور رشد شبه انسولین-1، همسانه­سازی، انتقال ژن، پروتئین نوترکیب، ناقل بیانی.

مقدمه

فاکتور رشد شبه انسولین-1 (IGF1) یک هورمون آنابولیکی کبدی است که رشد و تمایز اکثر سلولها را القا کرده و در ترمیم و بازسازی بافتها نقش اساسی بازی می­کند (Jones & Clemmons, 1995). با توجه به نقش اساسی IGF1 در بدن انسان، افرادی که دچار نقص در تولید این پروتئین هستند، رنج زیادی را تحمل می­کنند (Kim & Lee, 1996). درمان کمبود IGF1 در افراد بیمار نیازمند تزریق روزانه حدود 2-5/1 میلی گرم از آن می­باشد. بنابراین، درمان با IGF1 بدلیل نیاز حدود 600 میلی­گرم در سال برای یک بیمار، بسیار پرهزینه می­باشد. علاوه بر آن، IGF1 در درمان بیماری­های دیگری از قبیل کوتولگی (Laron et al., 1992b)، دیابت (Bach et al., 1993) و پوکی استخوان (Ebeling et al., 1993) نیز کاربرد دارد. در حال حاضر، بیشتر IGF1 مورد نیاز از طریق بیان در باکتری E. coli (Joly et al., 1998a) و یا مخمر (Gill et al., 1999) تامین می­شود. با این حال، این سیستم­ها دارای معایبی از قبیل هزینه بالای ساخت و نگهداری فرمانتورها، عدم انجام تغییرات پس از ترجمه (Philippou et al., 2014) و تشکیل تجمعات پروتئینی[1] در باکتریها و تنوع مشاهده شده در فعالیت بیولوژیکی IGF1 تولید شده در مخمر می­باشند (Daniell et al., 2009a). گیاهان تراریخت، سیستم­های مناسبی برای تولید پروتئین­های نوترکیب در سطوح تجاری و صنعتی فراهم می­کنند. گیاهان دارای مزایای متعددی برای تولید پروتئین­های نوترکیب هستند، از جمله هزینه پایین کشت گیاهان در سطح وسیع، دارا بودن اندام­های طبیعی برای ذخیره پروتئین از قبیل دانه و وجود روش­های توسعه یافته برای برداشت، حمل و نقل، ذخیره و فرآوری آنها (Kusnadi et al., 1997). تخمین زده می­شود که هزینه تولید پروتئین­های نوترکیب در گیاهان حدود 10 تا 50 برابر کمتر از هزینه­های تولید در باکتری باشد (Giddings et al., 2000). تولید IGF1 در گیاهان برای اولین بار در توتون و برنج صورت گرفته است (Panahi et al., 2004). همچنین، تولید IGF1 در کلروپلاست­های تراریخت توتون (Daniell et al., 2009a) و بذر آرابیدوپسیس (Li et al., 2011) نیز گزارش شده است. با این حال تا کنون گزارشی در خصوص همسانه­سازی ژن کد کننده IGF1 و یا بیان این پروتئین در ایران ارائه نشده است. با توجه به اینکه همسانه­سازی بی­نقص ژن کد کننده این پروتئین در ناقل­های بیانی مناسب گیاه از مهمترین مراحل انتقال و بیان موفق آن در گیاه می­باشد، در این تحقیق تلاش گردید تا cDNAی ژن IGF1 از سلولهای انسانی جداسازی و در ناقل­های مناسب برای انتقال و بیان در گیاهان مهم، از قبیل غلاتی مانند ذرت و گندم همسانه­سازی گردد.

مواد و روش­ها

جهت جداسازی cDNAی ژن مربوط به فاکتور رشد شبه انسولین 1 انسانی (IGF1)، ابتدا RNAی کل از سلول­های کشت شده در محیط درون­شیشه­ای جداسازی شد. برای این منظور، ابتدا سلولهای انسانی کشت شده در محیط in vitro (تهیه شده از انستیتو پاستور-استراسبورگ-فرانسه) در ازت مایع کوبیده شد. سپس، RNAی کل با استفاده از روش تریزول استخراج گردید. برای تهیه cDNA، 14 میکرولیتر محلول واکنش حاوی μg 5 از RNAی استخراج شده، 10 پیکومول الیگونوکلوتید پلی T، mM 10 از مخلوط dNTP، در دمای °C 65 قرار داده شد و پس از 5 دقیقه، بلافاصله روی یخ منتقل گردید. پس از یک دقیقه، μl 4 بافر 5 برابر غلظت مخصوص واکنش رونویسی معکوس، 1 میکرولیتر DTT 1/0 مولار، 1 میکرولیتر MgCl₂ 50 میلی­مولار و 5/0 میکرولیتر آنزیم رونویسی معکوس Super Script III ، به محلول واکنش اضافه گردید. سنتز رشته اول به مدت 1 ساعت در دمای °C 50 انجام گرفت. برای تکثیر cDNAی کامل مربوط به ژن IGF1 از جفت آغازگر اختصاصی ژن IGF1 شامل 5'-AAA CAT ATG GGA CCG GAG ACG CTC TG-3' و  5'-GG GGA TCC CTA CAT CCT GTA GTT CTT GTT TCC T-3' که به ترتیب آغازگر روبه جلو و روبه عقب بودند و بر اساس توالی­های موجود در سایت NCBI (کد دسترسی NM-000618) طراحی گردیدند، استفاده شد. همچنانکه مشخص است، در بالادست آغازگر روبه جلو، سایت برشی NdeI و در پایین دست آغازگر روبه عقب، سایت برشی BamHI طراحی گردید. توالی کدون­های آغاز و پایان ژن نیز به ترتیب در ساختار آغازگرهای روبه جلو و روبه عقب با حروف پررنگ مشخص شده­اند. برنامه PCR شامل یک مرحله 4 دقیقه ای در دمای °C 95، 30 چرخه، هر کدام شامل s 45 در  °C 95، s 45 در  °C 55 و s 60 در  °C 72، و در پایان، یک مرحله 10 دقیقه­ای در دمای  °C 72 بود. خالص­سازی قطعات DNA از روی ژل آگارز با استفاده از کیت DNA Ambiclean (شرکت Vivantis-مالزی) و بر اساس دستورالعمل توصیه شده توسط شرکت سازنده انجام گردید. در واکنش­های اتصال[2]، مواد لازم برای 15 میکرولیتر واکنش شامل 300-100 نانوگرم DNAی ناقل برش یافته با آنزیمهای مورد نظر، DNAی الحاقی به نسبت 1 تا 3 برابر ناقل، 5/1 میکرولیتر بافر 10×T4-DNA ligase و 5 واحد آنزیم T4-DNA ligase، در تیوب ریخته شده و در دمای °C16 به مدت یک شب قرار داده شدند. برای استخراج پلاسمید از روش پیشنهاد شده توسط Birnboim و Doly استفاده شد (Birnboim & Doly, 1979). غلظت اسیدهای نوکلئیک از طریق اندازه گیری چگالی نوری و یا الکتروفورز روی ژل آگارز تعیین گردید. از بسته نرم افزاری Lasergene 7 برای طراحی آغازگرها و شبیه­سازی و انتخاب مناسب­ترین راهبرد برای همسانه­سازی استفاده گردید.

نتایج و بحث

پس از تایید کیفیت RNAی استخراجی (شکل 1-الف) و سنتز cDNA، چارچوب ترجمه IGF1 با اندازه bp 336 تکثیر گردید (شکل 1-ب). سپس، قطعه تکثیر شده در ناقل pMCS5 (MoBiTec GmbH) بین سایت­های برشی NdeI و BamHI همسانه­سازی گردید. از انتقال نصف محصول اتصال به باکتری E. coli، حدود ۵۰ کلونی روی محیط گزینشی تشکیل شد. حدود ۱۰ کلونی با PCR بررسی و پس از تایید اولیه، تایید نهایی تعدادی از آنها با هضم آنزیمی انجام گرفت (شکل 1-ج). نتیجه توالی­یابی نشان داد که ۲ کلونی حاوی توالی کاملا مشابه با توالی ثبت شده در NCBI می­باشند. یکی از این پلاسمیدها (که pMCS5-IGF1 نامگذاری گردید، شکل 2-الف)، برای مراحل بعدی همسانه­سازی و تهیه ناقل­های بیانی مورد استفاده قرار گرفت. در مرحله بعد تلاش گردید تا cDNAی همسانه­سازی شده، در ناقل بیانی مناسب برای گیاهان قرار داده شود. برخی ویژگی­های مهم غلات از قبیل دامنه و سطح وسیع کشت، بیوماس بالا و خاصیت انبارداری، غلات را به بیورآکتورهای مناسبی برای تولید و ذخیره واکسن­های انسانی تبدیل کرده است (Hefferon, 2009). بنابراین، طراحی و ساخت یک ناقل بیان مناسب برای انتقال و بیان ژن IGF1 در غلات در دستور کار قرار گرفت. بر اساس مطالعات انجام شده، ریزپرتابی مناسب­ترین روش برای انتقال ژن به غلات می­باشد (Panstruga, 2004). برای این منظور تلاش گردید که ناقل طراحی شده ویژگیهای یک ناقل مناسب برای انتقال ژن به روش ریزپرتابی از قبیل اندازه کوچک و قدرت همانندسازی بیشتر در باکتری E. coli را داشته باشد. یکی از مهمترین ساختارهای ناقل بیانی، تهیه کاست بیانی برای ژن هدف به منظور تضمین بیان مناسب پروتئین هدف می­باشد. برای این منظور ابتدا cDNAی ژن IGF1 با استفاده از سایتهای برشی EcoRV (انتهای صاف) و SphI از ناقل pMCS5-IGF1 جدا و بین سایتهای برشی SmaI (انتهای صاف) و SphI در ناقل pFF19G (اهدائی پروفسور بوک-انستیتو ماکس پلانک آلمان) بجای توالی ژن GUS همسانه­سازی گردید. بنابراین، در ناقل نوترکیب حاصل که pFF19G-IGF1 (شکل 2-ب) نامگذاری گردید، کاست بیان ژن IGF1 تحت کنترل عوامل بیان مربوط به ژن 35S از ویروس CaMV تهیه گردید. برای تکمیل ناقل بیانی، باید کاست بیان یک ژن گزینشگر مناسب نیز در ناقل نوترکیب حاصل وارد می­شد. مطالعات نشان داده­اند که اکثر گیاهان تک­لپه و بویژه غلات برای باززایی گیاه کامل از سلولهای تراریخت به یک دوره جنین­زایی سوماتیکی در تاریکی نیاز دارند (Ahmadabadi et al., 2007).

شکل 1- (الف) تصویر الکتروفورز نمونه RNAی استخراج شده از سلولهای انسانی کشت شده در شرایط درون شیشه­ای. (ب) تصویر الکتروفورز محصول PCR حاصل از تکثیر cDNAی ژن IGF1 (با اندازه bp 336)، با استفاده از جفت آغازگر اختصاصی. (ج) تصویر الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل نوترکیب pMCS5-IGF1 با آنزیمهای برشی NdeI و BamHI. تشکیل باند 336 جفت بازی، همسانه­سازی موفق cDNAی ژن IGF1 در بین سایتهای برشی NdeI و BamHI ناقل پایه pMCS5 را نشان می­دهد. شماره­های 1، 2، 3 و 4، نشان­دهنده چهار کلونی مستقل حاصل از انتقال محصول اتصال به باکتری E. coli می­باشند. M: مارکر (Thermo Scientific O'GeneRuler DNA Ladder Mix).

Figure 1- (A) Agarose gel electrophoresis of RNA extracted from human cells in in vitro culture conditions. (B) PCR products amplified from cDNA of the IGF1 gene (size 336 bp), using specific primers. (C) Gel electrophoresis of enzymatic digestion products of pMCS5-IGF1 recombinant vector cut with the NdeI and BamHI enzymes. Amplification of a 336 bp band shows the successful cloning of the IGF1 cDNA between NdeI and BamHI sites of the pMCS5 basic vector. Numbers 1, 2, 3 and 4 represent four independent colonies obtained from E. coli transformation with ligation product. M: marker (Thermo Scientific O'GeneRuler DNA Ladder Mix).

بنابراین، برای گزینش کارآمد، بهتر است از سیستمی استفاده شود که در تاریکی بیشترین کارآیی را داشته باشد. ژن فسفومانوز ایزومراز (pmi) بعنوان یک ژن گزینشگر مناسب برای غلات بویژه گندم و ذرت معرفی شده است (Ahmadabadi et al., 2007; Wright et al., 2001). این ژن علاوه بر کارآیی بالای گزینش در تاریکی، هیچگونه مقاومتی در برابر آنتی­بیوتیکها و یا داروها ایجاد نمی­کند. لذا از نظر ایمنی-زیستی نیز نسبت به سایر ژنهای گزینشگر دارای مزیت می­باشد. بنابراین، در مرحله بعد، استراتژی مناسب برای جاسازی کاست بیان ژن pmi (که قبلا در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشگاه شهید مدنی آذربایجان از باکتری E. coli جداسازی و همسانه­سازی شده بود) در ناقل pFF19G-IGF1 طراحی گردید. با توجه به محدود بودن سایتهای برشی در پیکره این ناقل به EcoRI و NcoI (شکل 2-ب) که امکان جاسازی کاست ژن pmi را فراهم نمی­کرد، لذا از pMA4 (Ahmadabadi, 2007) بعنوان ناقل واسطه برای تجمیع کاستهای بیان دو ژن IGF1 و pmi استفاده گردید. برای این منظور ابتدا کاست بیان ژن IGF1 با استفاده از سایتهای برشی HindIII و EcoRI در ناقل pMA4 جاسازی گردید تا ناقل نوترکیب pMA4-IGF1 (شکل 2-ج) تشکیل شود. سپس کاست بیان pmi با استفاده از سایتهای برشی SacII و NcoI در ناقل pMA4-IGF1 و در کنار کاست بیان ژن IGF1 همسانه­سازی گردید. وکتور بیانی حاصل که pMA4-IGF1-pmi (شکل 2-د) نامگذاری گردید، برای انتقال پایدار ژن IGF1 به روش ریزپرتابی به غلاتی از قبیل ذرت و گندم که فاقد ژن pmi می­باشند، مناسب می­باشد. لازم به ذکر است که جاسازی ژن در تمام ناقل­های نوترکیب حاصل در هر مرحله توسط PCR و هضم آنزیمی تایید گردید که نتایج تایید بوسیله هضم آنزیمی بدلیل اهمیت در شکل 3 نشان داده شده است.

شکل 2- نقشه ناقلهای pMCS5-IGF1 (الف)، pFF19G-IGF1 (ب)، pMA4-IGF1 (ج) و pMA4-IGF1-pmi (د). سایتهای برشی که برای درج قطعه بین آنها در پیکره ناقل مناسب استفاده شدند، با کادر مشخص شده­اند.

Figure 2- Schematic diagrams of vectors pMCS5-IGF1 (A), pFF19G-IGF1 (B), pMA4-IGF1 (c) and pMA4-IGF1-pmi (d). Restriction sites used for integration of target fragments into suitable vectors are marked with boxes.

شکل 3- (الف) تصویر الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل نوترکیب pFF19G-IGF1 با آنزیمهای برشی PstI و HindIII. تشکیل باند 1200 جفت بازی (شامل توالی IGF1 و توالی­های راه­انداز 35S)، همسانه­سازی موفق cDNAی ژن IGF1 در پایین دست توالی­های راه­انداز 35S در ناقل pFF19G را نشان می­دهد. (ب) تصویر الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل نوترکیب pMA4-IGF1 با آنزیمهای برشی EcoRI و HindIII. تشکیل باند 1400 جفت بازی (شامل توالی IGF1 و توالی­های راه­انداز و ترمیناتور 35S)، همسانه­سازی موفق کاست بیان IGF1 بین سایتهای برشی EcoRI و HindIII در ناقل pMA4 را نشان می­دهد. (ج) تصویر الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل نوترکیب pMA4-IGF1-pmi با آنزیمهای برشی NcoI و SacII. تشکیل باند 2300 جفت­بازی، نشان دهنده همسانه­سازی موفق کاست بیان pmi بین سایت­های برشی NcoI و SacII در ناقل pMA4-IGF1 می­باشد. M: مارکر (الف: Generuler^TM 1 kb DNA Ladder, Fermentas، ب و ج: VC 1kb DNA Ladder, Vivantis).

Figure 3- (A) Gel electrophoresis of enzymatic digestion products of pFF19G-IGF1 recombinant vector cut with the enzymes PstI and HindIII. The 1200 bp band (including IGF1 and the 35S promoter sequences), show successful cloning of IGF1 cDNA downstream of the 35S promoter in vector pFF19G. (B) Electrophoresis of enzymatic digestion products of pMA4-IGF1 recombinant vector cut with the enzymes EcoRI and HindIII. The 1400 bp  band (including the IGF1 and the 35S promoter and terminator sequences), show successful cloning of IGF1 expression cassette between the EcoRI and HindIII sites of the vector pMA4. (C) Electrophoresis of enzymatic digestion products of pMA4-IGF1-pmi recombinant vector cut with the enzymes NcoI and SacII. Observation of the 2300 bp band related to the pmi expression cassette indicate its successful cloning between the NcoI and SacII sites in pMA4-IGF1 vector. M: marker.

همچنان که اشاره گردید، گیاهان تراریخت سیستم­های بیان مناسبی برای تولید پروتئین­های نوترکیب در مقیاس بالا در سطوح صنعتی می­باشند. با این وجود، مشکل عمده در بیان پروتئین­های انسانی از طریق ژنوم هسته، پایین بودن سطح بیان آنها می­باشد که اکثرا کمتر از ١% کل پروتئین­های محلول می­باشد.

برای مثال، سطح بیان ژن IGF1 در هسته توتون و برنج بعد از بهینه کردن شرایط بیان ژن، به حدود ng/mg ١١٣-٢٢ رسیده است (Panahi et al., 2004). مطالعات نشان می­دهند که کلروپلاست­ها اندامکهای مناسب­تری برای بیان پروتئینهای نوترکیب در سطوح بالا می­باشد، بطوریکه گاهی اوقات میزان بیان پروتئین نوترکیب تا حدود 50% از کل پروتئین محلول قابل افزایش است (Daniell et al., 2009a).

علاوه بر آن، انتقال ژن به کلروپلاست دارای مزایای دیگری از قبیل عدم وجود اثر محل ژن[3] (با توجه به انتقال دقیق ژن خارجی در قسمت مشخصی از ژنوم کلروپلاست)، عدم وجود خاموشی ژن، امکان بیان همزمان چندین پروتئین (با توجه به ماهیت پلی­سیسترونیک بودن سیستم بیان ژن در کلروپلاست) و عدم امکان انتقال ژن خارجی به خویشاوندان وحشی (به دلیل توارث مادری کلروپلاستها) می­باشد که باعث شده در سال­های اخیر بیان پروتئین­های نوترکیب و دارویی در کلروپلاست مورد توجه بسیار زیادی قرار گیرد (Daniell et al., 2009b Maliga, 2004; ).

بنابراین، در این مطالعه سعی گردید ناقل­های مناسب برای انتقال و بیان IGF1 در کلروپلاست تهیه شود. با توجه به اینکه در حال حاضر انتقال ژن به کلروپلاست تنها در توتون دارای کارآیی قابل قبول می­باشد (Rigano et al., 2012)، لذا در این تحقیق ناقلهای مناسب برای انتقال و بیان IGF1 در کلروپلاستهای توتون نیز تهیه گردید. برای این منظور از ناقلهای pRB94 (Lutz et al., 2007) و pHK20 (Kuroda & Maliga, 2001) (شکل 4) استفاده گردید.

با توجه به اینکه بیان موفق ژنها در کلروپلاست نیاز به عوامل رونویسی و ترجمه اختصاصی کلروپلاست دارد، لذا در مرحله اول تهیه کاست بیانی مناسب برای بیان ژن IGF1 در کلروپلاست در دستور کار قرار گرفت.

برای این منظور، cDNAی ژن IGF1 با استفاده از آنزیمهای برشی NdeI و XbaI از ناقل pMCS5-IGF1 (شکل 2-الف) جداسازی و در ناقل pHK20 (شکل 4-الف) جایگزین توالی ژن nptII گردید.

بنابراین، در ناقل نوترکیب حاصل که pHK20-IGF1 نامیده شد (شکل 4-ب)، کاست بیان کلروپلاستی IGF1 تحت کنترل راه انداز کلروپلاستی Prrn و ترمیناتور TrbcL توتون تشکیل گردید.

علاوه بر کاست بیان ژن هدف، ناقل بیان کلروپلاستی باید دو ویژگی مهم دیگر را داشته باشد. اول اینکه یک ژن گزینشگر مناسب که بیان آن نیز باید تحت کنترل عوامل بیانی کلروپلاستی باشد، در کنار کاست ژن هدف درج گردد. دوم اینکه با توجه به کارآمد بودن سیستم نوترکیبی هومولوگی در کلروپلاست، با درج ژن هدف بین دو توالی مشابه با قسمتی از ژنوم کلروپلاست، ژن هدف دقیقا در محل مورد نظر در ژنوم کلروپلاست درج می­شود (Maliga, 2004).

بنابراین، لازم بود تا کاست بیان تهیه شده در بین توالیهای هومولوگ تعیین شده همسانه­سازی شود. برای برآورده کردن این دو شرط، از ناقل pRB94 (Lutz et al., 2007) که یک ناقل کلروپلاستی می­باشد، استفاده گردید. در این ناقل، کاست بیانی ژن گزینشگر aadA در بین توالیهای مشابه با قسمتی از ژنوم کلروپلاست توتون (توالی 40210-36840، کد دسترسی NC_001879.2) درج شده است. طراحی چندین سایت برشی واحد نیز درج ژنهای هدف در کنار کاست ژن گزینشگر را امکان پذیر کرده است.

بنابراین، برای تهیه ناقل بیانی کلروپلاستی، کاست بیان کلروپلاستی IGF1 با استفاده از سایتهای برشی SacI و HindIII از ناقل pHK20-IGF1 جداسازی و در ناقل pRB94 با استفاده از همین سایتهای برشی، در کنار کاست بیانی ژن گزینشگر همسانه­سازی گردید. ناقل بیانی حاصل که pRB94-IGF1 نامگذاری گردید (شکل 4-ج) برای انتقال پایدار و بیان IGF1 در کلروپلاست توتون مناسب می­باشد.

با توجه به اینکه ژن گزینشگر aadA موجب ایجاد مقاومت در برابر آنتی بیوتیکهای آمینوگلیکوزیدی از قبیل اسپکتینومایسین و استرپتومایسین می­شود (Maliga, 2004)، و بنابراین، عدم حذف این نوع ژن­ها از محصولات تراریخت مقبولیت زیست-محیطی آنها را کاهش می­دهد،

لذا تلاش گردید تا ناقلی طراحی شود که امکان حذف ژن گزینشگر پس از انتقال موفق و پایدار ژن IGF1 به کلروپلاستهای توتون را فراهم نماید. برای این منظور از ناقل pKP9 (Zhou et al., 2008) (اهدایی پروفسور بوک-انستیتو ماکس پلانک آلمان) استفاده گردید.

شکل 4- نقشه ناقلهای pHK20 (الف)، pHK20-IGF1 (ب)، pRB94-IGF1 (ج) و pKP9-IGF1. سایتهای برشی که برای درج قطعه هدف در پیکره ناقل مربوطه استفاده شدند، با کادر مشخص شده­اند. ناقلهای بیان pRB94-IGF1 و pKP9-IGF1 برای انتقال و بیان IGF1 در کلروپلاست گیاه توتون مناسب می­باشند. تفاوت عمده دو ناقل در جهت ژن گزینشگر aadA و نیز وجود توالی­های تکراری مستقیم LoxP در pKP9-IGF1 می­باشد که این توالی­ها پس از انتقال پایدار IGF1 امکان حذف ژن گزینشگر را با استفاده از سیستم Cre/Lox فراهم می­کنند. SD: توالی شاین دالگارنو.

Figure 4- Schematic picture of vectors pHK20 (b), pHK20-IGF1 (B), pRB94-IGF1 (c) and pKP9-IGF1. The restriction sites used for integration of target fragments into suitable vectors are marked with boxes. pRB94-IGF1 and PKP9-IGF1 expression vectors are suitable for integration and expression of IGF1 gene in chloroplasts of tobacco plants. The main difference between the two vectors is the transcription direction of aadA selectable marker gene and also two directly repeated LoxP sequences flanking this gene in pKP9-IGF1, facilitating the marker gene deletion after stable integration of IGF1, using Cre/Lox system. SD: Shine Dalgarno sequence.

این ناقل کاملا مشابه ناقل pRB94 می­باشد، با این تفاوت که جهت ژن گزینشگر تغییر کرده و 2 توالی تکراری مستقیم LoxP در دو طرف آن تعبیه گردیده است. این توالی بصورت اختصاصی توسط ریکامبیناز Cre قابل شناسایی می­باشد و در حضور این آنزیم، نوترکیبی بین این دو توالی موجب جدا شدن ژن گزینشگر از ژنومهای کلروپلاستهای تراریخت می­شود (Lutz et al., 2006). ناقل نوترکیب حاصل از همسانه­سازی کاست ژن IGF1 داخل این ناقل با استفاده از سایتهای برشی SacI و HindIII، pKP9-IGF1 نامگذاری گردید (شکل 4-د). لازم به ذکر است که در این آزمایشها نیز، تمام ناقل های نوترکیب حاصل در هر مرحله، توسط PCR و هضم آنزیمی تایید گردید که نتایج تایید بوسیله هضم آنزیمی در شکل 5 نشان داده شده است.

شکل 5- (الف) تصویر الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل نوترکیب pHK20-IGF1 با آنزیمهای برشی SacI و XbaI. تشکیل باند 665 جفت بازی (شامل توالی IGF1 و توالی های راه انداز Prrn)، همسانه سازی موفق cDNAی ژن IGF1 در پایین دست توالی­های راه­انداز Prrn در ناقل pHK20 را نشان می­دهد. (ب) تصویر الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل نوترکیب pRB94-IGF1 با آنزیمهای برشی SacI و HindIII. تشکیل باند 833 جفت بازی (شامل توالی IGF1 و توالی های راه­انداز Prrn و ترمیناتور TrbcL)، همسانه­سازی موفق کاست بیان IGF1 بین سایتهای برشی SacI و HindIII در ناقل pRB94 را نشان می­دهد. (ج) تصویر الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل نوترکیب pKP9-IGF1 با آنزیمهای برشی SacI و HindIII. تشکیل باند 833 جفت بازی، همسانه­سازی موفق کاست بیان IGF1 بین سایتهای برشی SacI و HindIII در ناقل pKP9 را نشان می­دهد. M: مارکر (الف: Thermo Scientific O'GeneRuler DNA Ladder Mix، ب و ج: VC 1kb DNA Ladder, Vivantis).

Figure 5- (A) Gel electrophoresis of enzymatic digestion product of pHK20-IGF1 recombinant vector cut with the enzymes SacI and XbaI. The 665 bp band (including the IGF1 and the Prrn promoter sequences), indicates successful cloning of the IGF1 cDNA sequences downstream of the Prrn promoter in the pHK20 vector. (B) Electrophoresis of enzymatic digestion products of pRB94-IGF1 recombinant vector cut with the enzymes SacI and HindIII. The 833 bp band (including the IGF1 cDNA, Prrn promoter and TrbcL terminator sequences), verifies successful cloning of IGF1 expression cassette between the SacI and HindIII sites of the vector pRB94. (C) Gel electrophoresis of enzymatic digestion products of pKP9-IGF1 recombinant vector cut with the enzymes SacI and HindIII. Observation of the 833 bp fragment, demonstrates correctly cloning of IGF1 expression cassette between the SacI and HindIII sites of the vector pKP9. M: marker.

نتیجه­گیری کلی

گسترش روز افزون نیاز به پروتئین­های دارویی در تمام کشورها و به خصوص کشور ما، نیاز به ایجاد سیستم­های کارآمد تولید چنین فرآورده­هایی را دو چندان می­کند. یکی از پروتئین­هایی که در حال حاضر برای درمان دامنه­ی وسیعی از بیماریهای مختلف استفاده می­شود، فاکتور رشد شبه انسولین 1 یا IGF1 است (Castilla-Cortazar et al., 1997; Castilla-Cortazar et al., 2000; Laron et al., 1992a; Thrailkill et al., 1997). تا به حال این فاکتور بیشتر در باکتری E. coli (Joly et al., 1998b) و مخمر S. cerevisiae تولید شده است (Gill et al., 1999)، ولی به علت مشکلات موجود در این ارگانیسم­ها و همچنین مزیت­های عمده­ی سیستم­های بیان گیاهی، در سالهای اخیر تولید این پروتئین در گیاهان مورد توجه قرار گرفته است (Daniell et al., 2009b; Li et al., 2011). یکی از ابزار ضروری برای انتقال و بیان پایدار و کارآمد پروتئین­های خارجی در گیاهان، ساخت ناقل­های بیانی مناسب می­باشد. در این تحقیق ناقل­های بیان مناسب برای انتقال پایدار cDNAی ژن انسانی IGF1 به گیاهان زراعی بویژه غلات تهیه گردید. ناقل نوترکیب حاصل که pMA4-IGF1-pmi (شکل 2-د) نامگذاری گردید، حاوی کاست بیان ژن IGF1 تحت کنترل عوامل تنظیم بیان ژن 35S از ویروس موزائیک گل­کلم و کاست بیان ژن انتخابگر pmi می­باشد. این ژن برای گزینش کالوسهای تراریخت در غلاتی از قبیل ذرت و گندم بسیار مناسب می­باشد (Ahmadabadi et al., 2007 Wright et al., 2001). از آنجاکه این ژن هیچ نوع مقاومتی در برابر آنتی­بیوتیکها و داروها ایجاد نمی­کند، از نظر ایمنی-زیستی نیز مطلوب­تر بوده و نیازی به حذف آن پس از تولید گیاهان تراریخت نمی­باشد. از طرف دیگر، مطالعات نشان داده که خطی کردن ناقل و حذف توالی­های اضافی آن و انتقال قطعه خطی حاوی تنها ژنهای مورد نظر، موجب افزایش احتمال تولید گیاهان تراریخت حاوی تنها یک نسخه از ژن هدف شده و احتمال خاموشی ژن و خطرات ایمنی-زیستی را کاهش می­دهد (Fu et al., 2000). ناقل نوترکیب حاصل به گونه­ای طراحی شده که پس از تکثیر آن، قطعه حاوی ژن هدف و ژن انتخابگر براحتی می­تواند با استفاده از آنزیم­های HindIII و NcoI جداسازی و به روش ریزپرتابی انتقال داده شود. البته لازم به ذکر است که 35S یک راه­انداز عمومی است، و با توجه به اینکه دانه غلات مناسب­ترین بافت برای ذخیره و استفاده مستقیم داروهای خوراکی می­باشد (Chen et al., 2014; Yue et al., 2014)، استفاده از یک راه­انداز اختصاصی دانه می­تواند در افزایش کارآیی تولید و ذخیره پروتئین و نیز کاهش تاثیر بیان پروتئین در مراحل رشد و تکامل گیاه موثر باشد.

بیان ژن خارجی در کلروپلاست می­تواند سطح بیان پروتئین نوترکیب را تا چندین برابر نسبت به بیان آن از طریق هسته افزایش دهد (Daniell et al., 2009b). بنابراین، در این مطالعه، ناقلهای مناسب برای انتقال و بیان IGF1 در کلروپلاست­های گیاه توتون نیز تهیه گردید. ناقلهای نوترکیب حاصل pRB94-IGF1 (شکل 4-ج) و pKP9-IGF1 (شکل 4-د) نامگذاری شدند. در ناقل pKP9-IGF1 ژن انتخابگر aadA توسط دو توالی مستقیم LoxP احاطه شده است که امکان حذف ژن انتخابگر پس از تولید گیاهان تراریخت را فراهم می­کنند. مقایسه­ی توالی قطعه ژنوم کلروپلاست توتون (که در ناقل pRB94 استفاده شده) و گیاه کاهو نشان داد که تشابه بسیار زیادی بین دو گیاه برای این قطعه وجود دارد (حدود90%) (داده­ها نشان داده نشده­اند). بنابراین ناقل­های حاصل علاوه بر این که برای انتقال ژن IGF1 به کلروپلاست گیاه توتون مناسب است، بلکه به احتمال قوی می­تواند برای بیان پروتئین IGF1 در گیاه خوراکی کاهو نیز مورد استفاده قرار گیرد. اضافه می­شود که ناقل pRB94 قبلا نیز بصورت موفقیت­آمیز برای انتقال پایدار ژن به کلروپلاست گیاه گوجه­فرنگی استفاده شده است (Ruf et al., 2001; Zhou et al., 2008). این پژوهش، یکی از ابزارهای لازم برای تولید پروتئین IGF1 در غلات مهمی از قبیل ذرت و گندم و کلروپلاست گیاهانی از قبیل توتون، کاهو و گوجه­فرنگی را فراهم نموده است.

سپاسگزاری

از دانشگاه شهید مدنی آذربایجان و ستاد زیست­فناوری ریاست جمهوری جهت حمایت مالی و معنوی تشکر و قدردانی می­گردد.