شناسایی باکتری‌های اندوفیت گیاه برنج رقم چمپا و بررسی تاثیر آن‌ها بر خصوصیات رشد گیاه میزبان

شناسایی باکتری­های اندوفیت گیاه برنج رقم چمپا و بررسی تاثیر آن­ها بر خصوصیات رشد گیاه میزبان

سیدمنصور سیدنژاد¹*، حسین معتمدی^2،3، آسیه سلیمانی⁴

¹ استاد بخش فیزیولوژی گیاهی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران.

² استاد بخش میکروبیولوژی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران.

³ مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و علوم زیستی ،دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران.

⁴ دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران.

تاریخ دریافت: 21/09/1392، تاریخ پذیرش: 29/04/1394

چکیده

اندوفیت­های آپوپلاست یا سیم­پلاست گیاهان موجب تحریک رشد گیاه، افزایش مقاومت به آفات و تنش­ها و بهبود شرایط رشدی گیاه می­شوند. هدف از مطالعه حاضر شناسایی اندوفیت­های موجود در شش رقم برنج استان خوزستان و بررسی تاثیر آن­ها در خصوصیات رشد گیاه میزبان می­باشد. برای این منظور سوسپانسیونی از بذرهای استریل شده تهیه و با تلقیح به محیط LB اندوفیت­های موجود در آن­ها جداسازی و تعیین هویت شدند. توانایی این جدایه­ها در تثبیت ازت، تولید اکسین و حل کردن فسفات سنجیده شد. اثر تیمار بذرهای رقم چمپا با اندوفیت­های جداسازی شده از آن بر شاخص­های مورفولوژیک و فیزیولوژیک ارزیابی شد. در نتیجه این تحقیق هفت اندوفیت از جنس­های باسیلوس، استافیلوکوکوس و اروینیا از شش رقم برنج جداسازی شد. باکتری اروینیا قادر به تثبیت نیتروژن و انحلال فسفات و بیشترین تولید اکسین بود. تیمار گیاه با اروینیا به طور معنی­داری موجب افزایش وزن تر و خشک اندام هوایی و ریشه، طول اندام هوایی و افزایش تراکم تارهای کشنده گردید. همچنین میزان اکسین اختلاف معنی­داری را با گروه شاهد نشان داد. تفاوت معنی­داری بین تیمارهای مختلف در میزان کلروفیل a و همچنین کلروفیل b  مشاهده نشد و تیمار فاقد اندوفیت میزان کلروفیل a و کلروفیل b بیشتری نسبت به تیمارهای دارای اندوفیت تولید کرده بودند. در حالی­که تیمار فاقد اندوفیت بیشترین میزان کاروتنوئید را نسبت به سایر تیمارها تولید کرد. در نهایت می­توان بر اساس نتایج این تحقیق پیشنهاد داد که باکتری اروینیا به عنوان یک اندوفیت تاثیر قابل توجهی در افزایش عملکرد گیاه برنج رقم چمپا دارد و باعث بهبود خصوصیات اساسی این گیاه می­شود.

واژه های کلیدی: اندوفیت، اکسین، برنج چمپا، پروتئین، رنگدانه، کربوهیدرات.

مقدمه  

باکتری­های محرک رشد گیاه(Plant growth promoting bacteria: PGFR) گروه وسیعی از باکتری­هایی هستند که در ریزوسفر گیاهان حضور دارند و از راه­های مختلف سبب افزایش و تحریک رشد گیاه می­شوند. گروهی از این­ها به نام اندوفیت­ها وارد گیاه می­شوند (Rosenblueth and Martinez- Romero, 2006). این میکروارگانیسم­ها بدون ایجاد آسیب­های ظاهری و آشکار، در فضای آپوپلاست یا سیم پلاست گیاهان رشد می­کنند (Gimenz et al., 2007). باکتری­های همزیست فوق فواید مختلفی از قبیل افزایش مقاومت به تنش­ها و بهبود شرایط رشدی گیاه را بوجود می­آورند (Hallmann et al., 1997). این رابطه زندگی متعادلی را بین گیاه و اندوفیت فراهم می­کند ولی اگر شرایط محیطی به گونه­ای به نفع اندوفیت تغییر کند، اندوفیت حالت پاتوژن به خود گرفته و وضعیت تعادل به هم می خورد (Aly et al., 2010). باکتری­های اندوفیت بر خلاف باکتری­های موجود در ریزوسفر به دلیل سکونت در بافت گیاه میزبان در برابر عوامل تنش­زای زیستی و غیر زیستی مورد حمایت قرار می گیرند (Rosenblueth and Martinez- Romero, 2006). البته تنوع باکتری­های اندوفیت بسیار کمتر از باکتری­های ریزوسفر می­باشد (Mano and Morisaki, 2008). اندوفیت­ها به واسطه تولید ترکیبات آلکالوئیدی و نیز ترکیبات ضدباکتریایی می­توانند موجب تحریک رشد گیاه و افزایش میزان محصول (Gao et al., 2010، Gimenz et al., 2007 ; Rosenblueth and Martinez- Romero, 2006)، افزایش مقاومت گیاه در برابر تنش­ها به دلیل مواد طبیعی تولیدی توسط اندوفیت­ها (Rasmussen et al., 2008; Varma et al., 2003) مقابله با عوامل بیماری­زا و آفات گیاه (Hinsvark et al., 1953; Gao et al., 2010) شوند. قابلیت تحریک رشد گیاه میزبان از دو طریق توسط اندوفیت­ها امکان­پذیر است. این باکتری­ها از طریق افزایش قابلیت دسترسی گیاه میزبان به منابع  غذایی(Gao et al., 2010)، تثبیت نیتروژن، انحلال برخی عناصر ضروری غیرقابل دسترس برای میزبان مثل فسفات (Rosenblueth and Martinez- Romero, 2006) و یا تولید سیدروفورها به منظور بالاتر بردن جذب آهن عمل می­کنند. از سوی دیگر قادر به تولید برخی فیتوهورمون­ها به ویژه اکسین هستند (Rodrigues et al., 2000) و به این صورت موجب تحریک رشد گیاه همزیست می­شوند. اندوفیت­های تثبیت کننده نیتروژن بخش کوچکی از کل جمعیت اندوفیت­ها را تشکیل می­دهند و افزایش جمعیت آن­ها در گیاهان جهت تثبیت نیتروژن مورد توجه قرار گرفته است. در گیاه برنج اندوفیت­های تثبیت کننده نیتروژن در بذر، ساقه و ریشه برخی از ارقام برنج یافت شده است (Mano and Morisaki, 2008). باکتری­های حل کننده فسفات از طریق تولید اسیدهای آلی گوناگون فسفات غیر محلول را به شکل محلول تبدیل می­کنند (Kim et al., 1998)؛ به همین دلیل از این باکتری­ها به عنوان کودهای زیستی استفاده می­شود (Mehta and Nautiyal, 2001). تحقیقات نشان داده است که تلقیح بذرهای برنج با باکتری­های حل کننده فسفات سبب افزایش غلظت فسفات، طول ریشه و وزن خشک اندام هوایی این گیاه شده است (Amou Aghaee  and Mostaajeran, 2007).

اندوفیت ها با تولید هورمون­های گیاهی محرک رشد مثل ایندول استیک اسید و یا ممانعت از تولید هورمون­های گیاهی ممانعت کننده از رشد مثل اتیلن موجب رشد گیاه میزبان می­شوند (Vessey, 2003). اثبات شده است که باکتری­های ریزوسفر و همزیست با گیاهان نسبت به سایر باکتری­ها تمایل بیشتری برای تولید اکسین نشان می­دهند که علت عمده­ی آن ترشح سوبسترای مناسب این هورمون­ها از ریشه گیاه میزبان می­باشد (Shahab et al., 2009). حتی برخی از باکتری­ها قادر به تولید چندین نوع هورمون در گیاه میزبان هستند (Feng et al., 2006). در مطالعات نشان داده شده است که اندوفیت­ها اثرات مستقیمی بر خصوصیات مورفولوژیک گیاه میزبان دارند؛ از جمله موجب افزایش وزن ریشه، طول ریشه، میزان تار کشنده، توسعه و رشد ساقه (Vessey, 2003)، اشغال نیج اکولوژیکی، برقراری رابطه فوق انگلی و مقاومت گیاه در برابر پاتوژن­ها به طور مستقیم (با تولید آنتی بیوتیک­ها، ترپنوئیدها، آلکالوئیدها، ترکیبات آروماتیک، پلی پپتیدی و تولید آنزیم­های لیزکننده پاتوژن­ها) و غیر مستقیم (از طریق تحریک گیاه برای سنتز متابولیت­های دارای خاصیت ضد پاتوژنی) می­شوند (Gao et al., 2010). تاکنون اکثر مطالعات روی اندوفیت­ها بیشتر بر روی گیاهان مناطق معتدل متمرکز شده است. مطالعاتی که روی گیاهان گرمسیری انجام شده نشان­داده است که اندوفیت­های این گیاهان نسبت به مناطق معتدل غنی­تر هستند اما نسبت به میزبان خود کمتر اختصاصی عمل می­کنند (Gimenez et al., 2007). در حال حاضر محققین در تلاش هستند اندوفیت­هایی را شناسایی کنند که علاوه بر سازگار بودن با گیاه مورد نظر بتوانند برتری­های زیستی نظیر مقاومت به پاتوژنها یا افزایش قابلیت جذب نیتروژن و فسفر را باعث شوند. به این ترتیب میزان استفاده از سموم و کودهای شیمیایی که مصرف آن­ها با اشکالاتی همراه است کاهش خواهد یافت. استان خوزستان یکی از مناطق گرمسیری است که رقم­های مختلف برنج در آن کشت می­شود. هدف از مطالعه حاضر شناسایی اندوفیت­های موجود در شش رقم برنج استان خوزستان و بررسی تاثیر آن­ها در خصوصیات رشد برنج رقم چمپا می­باشد. رقم چمپا از ارقام کیفی استان خوزستان می باشد و عمدتا در نواحی کوهستانی و شمال شرقی استان به روش کشت نشایی کشت می­شود. این رقم از نظر مورفولوژیکی از ارقام پا بلند و کم سنبله می باشد و از کودپذیری کم برخوردار است و از نظر طول دانه جزء ارقام دانه متوسط می باشد و هر ساله در سطح 8000- 7500 هکتار کشت می­شود.

مواد و روش ها

شش رقم برنج موجود در خوزستان شامل چمپا، عنبوری قرمز، دانیال، هویزه، حمر و گرده رامهرمز از بخش تحقیقات برنج مرکز تحقیقات کشاورزی استان خوزستان تهیه و. سلامت بذرها توسط مرکز فوق تایید شد. به منظور جداسازی اندوفیت­ها ابتدا استریلیزاسیون سطح بذرها به روش زیر انجام شد. شلتوک برنج به گونه­ای که به جنین آن آسیبی نرسد جداسازی شد. پس بذرها 30 ثانیه در اتانول 70 درصد قرار داده و چند مرتبه با آب مقطر استریل شستشو و در مرحله بعد بذرها 10 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 5 درصد غوطه­ور شدند. سه مرتبه شستشوی بذرها با آب مقطر استریل انجام و آب حاصل از شستشوی سوم جمع آوری شد. بذرها داخل هاون چینی استریل خرد شده (Bric et al., 1991; Rasmussen et al., 2008) و در محیط کشت مایع لوریا برتانی (LB) تلقیح شد. همزمان از آب حاصل از مرحله سوم شستشو نیز روی محیط LB آگار کشت تهیه شد. هر دو محیط کشت پنج شبانه روز در انکوباتور 37 درجه سانتی­گراد قرار داده شد. پس از انکوباسیون و منفی شدن رشد باکتری در محیط کشت جامد، از باکتری­های رشد کرده در محیط مایع LB روی محیط جامد نوترنیت آگار کشت انجام شد و مجددا انکوباسیون صورت گرفت (Feng et al., 2006). باکتری­های رشد کرده روی محیط نوتریت آگار خالص سازی شدند و با استفاده از رنگ­آمیزی گرم، رنگ­آمیزی اسپور، شکل کلنی، رنگ کلنی، خصوصیات سطحی کلنی، تست کاتالاز، تست اکسیداز، تست اسنات، واکنش های بیوشیمیایی شامل تست O/F، تست اوره­آز، تست سیترات، احیاء نیترات، تست TSI، تولید اندول، حرکت، هیدرولیز ژلاتین، تولید اسید از قندها، رشد در دمای 50 درجه سانتی­گراد، رشد در نمک NaCl 10 درصد ، همولیز و رشد در محیط مک­کانکی آگار و طبق جداول استاندارد ارائه شده در کتاب طبقه­بندی باکتری­های برجی شناسایی و تعیین هویت گردیدند. به منظور بررسی توانمندی باکتری­های اندوفیت جداسازی شده تست­های زیر انجام شد ( Garrity et al., 2005).

الف- تثبیت ازت: برای این منظور از روش تغییر داده شده Dobereiner et al. (1972) و محیط کشت فاقد نیتروژن Dobereiner استفاده شد. اندوفیت­های خالص شده در این محیط تلقیح و به مدت 48-24 ساعت در 37 درجه سانتی­گراد انکوبه شدند. در صورت رشد باکتری­ها در این محیط و داشتن فعالیت اسیدی، رنگ محیط از سبز به زرد تغییر خواهد کرد.

ب- تولید هورمون اکسین: برای این منظور از روشBric et al., 1991 و معرف سالکوفکی استفاده شد. باکتری­ها در محیط LBT (L-tryptophan Luria –Beetani) کشت داده شدند (Bric et al., 1991)؛ به این صورت که پس از رشد باکتری در محیط LB مایع و رسیدن به غلظت ^CFU/_ml 10⁸ ×5، پنج میکرولیتر از محیط کشت در مرکز پلیت LBT قرار داده شد و کاغذ نیتروسلولز استریل بر آن قرار داده شد. پلیت­ها تا رسیدن قطر کلنی­ها به 2 میلی­متر انکوبه شدند. سپس کاغذ نیتروسلولز برداشته و با معرف سالکوفسکی آغشته شد. ایجاد هاله صورتی نشان­دهنده تولید اکسین است که شدت رنگ با میزان تولید ارتباط مستقیم دارد (Rajaee et al., 2007). سنجش کمی اکسین نیز با استفاده از واکنش یک میلی لیتر مایع رویی کشت 144 ساعته باکتری در محیط LBT با 2 میلی لیتر معرف سالکوفسکی و اندازه گیری جذب آن در 530 نانومتر انجام شد (Bric et al., 1991).

ج- حل کردن فسفات: از محیط کشت Seperb با 2/7 = pH که دارای فسفات کلسیم به عنوان منبع فسفات معدنی غیر محلول است برای این تست استفاده شد. توانایی رشد باکتری و ایجاد هاله شفاف در اطراف کلنی نشان­دهنده توانایی انحلال فسفات کلسیم توسط باکتری است (Teimouri et al., 2004). پس از شناسایی باکتری­های اندوفیت و بررسی توانمندی­های آن­ها، با توجه به نتایج بدست آمده برنج رقم چمپا که دارای دو نوع اندوفیت توانمند بود جهت بررسی تاثیر اندوفیت­ها بر بذرها و خصوصیات رشدی آن انتخاب شد. برای این هدف مراحل زیر انجام شد:

الف- آماده­سازی بذر برنج چمپا با باکتری­های اندوفیت. در ابتدا استریلیزاسیون کامل بذرها با روش تغییر یافته­ای از روش­های ارائه شده توسط Feng et al. (2006) و Varma et al.,  (2003) انجام شد. شلتوک برنج بدون آسیب رساندن به جنین پوست کنی شد و بذرها 48 ساعت در آب دیونیزه قرار  گرفتند و  سپس 5 دقیقه در اتانول 75 درصد و 10 دقیقه در محلول 2/0 درصد HgCl₂ تیمار شدند. در ادامه بذرها 5 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 5 درصد قرار گرفتند و نهایتا با آب دیونیزه استریل شش مرتبه شستشو انجام شد (Varma et al., 2003; Feng et al., 2006).

ب-تیمار بذرهای استریل با اندوفیت ها‌. سه ارلن حاوی محیط مایع LB آماده شد و هر کدام از دو اندوفیت جدا شده از برنج رقم چمپا در ارلن­های مجزا و در ارلن سوم به صورت مخلوط تلقیح شدند. محیط­های کشت در انکوباتور شیکردار 37 درجه سانتی­گراد تا رسیدن به غلظت^CFU/_ml 10⁷× 5/1 انکوبه شدند. بذرهای استریل شده چهار قسمت شدند و در هر کدام از ارلن­ها یک قسمت تلقیح شد. در یک ارلن هم بذرهای رقم چمپا بدون حضور باکتری تلقیح شد.

ج- کشت بذرها. بذرهای تیمار شده در محیط کشت گیاهی استریل RCV کشت داده شدند. این محیط در لوله های 250× 200 میلی­متری به میزان 30 میلی­لیتر توزیع و اتوکلاو شد. بذرهای تیمار شده در مرحله قبل به این لوله­ها تلقیح شد. تعداد بذر در هر لوله و نیز تعداد تکرار کشت در هر بخش بسته به مدت زمان کشت و میزان نمونه مورد نیاز انتخاب شد (Feng et al., 2006).

د- بررسی خصوصیات رشد گیاه. صفات مورفووژیکی و فیزیولوژی گیاه برنج چمپا پس از کشت بذرها در لوله آزمایش به شرح زیر اندازه گیری شد: برای تعیین وزن خشک و تر اندام هوایی و زمینی بیست عدد گیاهچه­ 21 روزه استفاده و جهت خشک کردن اندام­های هوایی و زمینی نمونه­ها 3-2 روز در دمای 50 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند. به منظور اندازه­گیری طول اندام هوایی و ریشه از 20 نهال 21 روزه در این مرحله استفاده شد و میانگین طول اندام هوایی و ریشه این نمونه­ها ثبت شد. نمونه­های گیاهی در 4 تیمار به مدت 6 روز در 34-32 درجه سانتی­گراد کشت داده شدند. پس  از این زمان 1 گرم از نمونه تر انتخاب و 15 میلی لیتر دی­اتیل اتر به آن اضافه شد. نمونه­ها در ظرف شیشه­ای کاملا استریل و در دمای 2 درجه سانتی­گراد به مدت 4 روز نگهداری شدند. سپس نمونه­ها با استفاده از کاغذ صافی از محلول جداسازی شدند و جهت استخراج کامل اکسین، نمونه­های باقی مانده روی کاغذ صافی با دو مرتبه تکرار با 5 میلی­لیتر دی­اتیل اتر شستشو و مایع حاصل از فیلتراسیون قبلی اضافه شد. مایع حاصل از فیلتراسیون جهت تبخیر دی­اتیل اتر مدت کوتاهی در بن ماری قرار داده شد تا حجم محلول­ها به یک میلی­لیتر رسید. پس به نسبت 1 به 2 با معرف سالکوفسکی مخلوط، 20 دقیقه در 50-40 درجه سانتی­گراد انکوبه و میزان اکسین با استفاده از قرائت جذب در 530 نانومتر با استفاده از معادله استاندارد اکسین محاسبه شد (Thimann and Skoog, 1940; Abrishamchi, 2007).

اندازه گیری میزان پروتئین های کل سیتوپلاسمی

برگ­های فریز شده به نسبت 1/0 گرم با 2 میلی­لیتر بافر فسفات پتاسیم 1/0 مولار (4/7 = pH) در هاون چینی همگن شدند. پس از سانتریفیوژ (rpm 1500، C° 4) محلول شفاف رویی جهت سنجش پروتئین برداشت شد. سنجش پروتئین با استفاده از روش تغییر یافته لوری انجام شد (Lowry et al., 1951). به دلیل این­که میزان پروتئین سنتز شده در گیاه رشد کرده در شرایط آزمایشگاه نسبت به نمونه­های مزرعه کمتر است، از عصاره بدست آمده در مرحله قبل بدون رقیق­سازی جهت سنجش پروتئین استفاده شد. نمونه­ها در 3 تکرار اندازه­گیری شدند.

اندازه گیری میزان کل قند محلول در بافت گیاه

میزان 1/0 گرم برگ خشک برنج با 10 میلی­لیتر اتانول 80% مخلوط و به مدت 50 ثانیه ورتکس شد. سپس در rpm 3000 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد و مایع رویی به منظور سنجش میزان قند برداشت گردید. این فرآیند سه بار تکرار شد. سنجش میزان قند محلول با استفاده از روش فنل – اسید سولفوریک انجام شد. در این روش به دو میلی­لیتر عصاره بدست آمده 1 یک میلی لیتر فنل 5 درصد افزوده شد و سپس 5 میلی­لیتر اسیدسولفوریک غلیظ اضافه گردید. پس از 30 دقیقه جذب نمونه در طول موج 485 نانو قرائت گردید (Helle Bust & Graigie, 1978).

اندازه گیری رنگیزه­های اصلی (کلروفیل­a) و کمکی (کلروفیلb و کاروتنوئید)

            از روشArnon  (1949) جهت سنجش رنگیزه­ها استفاده شد. نمونه­های تازه نهال 15 روزه، به وزن 200 میلی­گرم در هاون چینی با افزودن 5 میلی­لیتر استون 80 درصد کاملا سائیده شدند تا مخلوط یکنواختی بدست آید. عصاره با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره یک صاف شد. نمونه موجود در روی کاغذ صافی مجددا با 5 میلی­لیتر استون 80 درصد شستشو داده شد و به محلول قبلی اضافه گردید. حجم کل محلول با استفاده از استون 80 درصد به 15 میلی­لیتر رسانده شد. تمامی مراحل در تاریکی انجام گرفت. غلظت کلروفیل a، b و کاروتنوئید به ترتیب با قرائت جذب در طول  موج­های 2/633، 8/646، 470 و 570 نانومتر و با استفاده از فرمول مرتبط محاسبه گردید.

نتایج

از شش رقم برنج خوزستان که در این بررسی استفاده شد، هفت باکتری اندوفیت بدست آمد. از برنج رقم چمپا دو نوع اندوفیت و از بقیه یک نوع اندوفیت جداسازی شد. بر اساس نتایج بدست آمده از تست­های تشخیصی، باکتری­های اندوفیت جداسازی شده از ارقام حمر، دانیال، عنبوری قرمز، هویزه و گرده رامهرمز، متعلق به جنس باسیلوس، اندوفیت شماره یک برنج رقم چمپا متعلق به جنس اروینیا و اندوفیت شماره دو متعلق به جنس استافیلوکوکوس تشخیص داده شد. از کشت مایع حاصل از شستشوی مرحله سوم بذرهایی که سطح آن­ها استریل شده بود هیچ­گونه باکتری جداسازی نشد. نتیجه بررسی تثبیت نیتروژن، انحلال فسفات و تولید اکسین توسط جدایه­ها در جدول 1 آمده است. از بین هفت اندوفیت جداسازی شده فقط اندوفیت شماره یک چمپا قادر به تثبیت نیتروژن و انحلال فسفات بود و بیشترین میزان اکسین را نیز تولید کرد.

جدول 1- مقایسه میانگین تولید اکسین در اندوفیت­های جدا شده از شش رقم برنج بومی خوزستان  با استفاده از حداقل میانگین معنی دار (LSD).

Table 1- Comparison of auxin production between endophytes isolated from 6 native rice cultivars in Khouzestan.

با توجه به نتایج بدست آمده در ادامه تحقیق برنج رقم چمپا انتخاب شد و مطابق روش ذکر شده در قسمت روش کار، تیمار آن با دو اندوفیت جدا شده از این رقم انجام شد و خصوصیات رشدی و فیزیولوژیک گیاه تیمار شده بررسی گردید. جدول 2، نتیجه تغییرات رشدی برنج در اثر تیمار با اندوفیت­های خالص و مخلوط را نشان می­دهد. بر اساس نتایج بدست آمده میانگین وزن خشک اندام هوایی بذرهای تیمار شده با دو اندوفیت نسبت به سایر تیمارها دارای اختلاف معنی دار است (001/0 >P). همچنین این شاخص بین بذر تیمار شده با باکتری Erwinia sp. نسبت به نمونه شاهد دارای اختلاف معنی دار است(01/0 >P). وزن خشک اندام هوایی بذر تیمار شده با دو اندوفیت نیز با سایر تیمارها تفاوت معنی­دار نشان داد (001/0 >P). این فاکتور در نمونه تیمار شده با Erwinia sp.  نیز با گروه شاهد تفاوت معنی­دار نشان داد. وزن خشک و تر اندام هوایی در تیمار انجام شده با باکتری Staphylococcus sp. تفاوت معنی داری با سایر گروه ها نشان نداد. تفاوت معنی­داری در وزن خشک و تر ریشه گیاهان تیمار شده با هر دو اندوفیت نسبت به گروه شاهد مشاهده شد (05/0>P).

جدول 2- نتایج اندازه­گیری شاخص­های رشدی گیاه برنج چمپا تیمار شده با باکتری­های Erwinia sp. و Staphylococcus sp..

Table 2- Growth parameters of Champa rice treated with Erwinia sp. and Staphylococcus sp.

   همچنین گیاه تیمار شده با باکتری Erwinia sp.تفاوت معنی­داری را در وزن تر ریشه (05/0>P) و وزن خشک ریشه (01/0 >P) با گروه شاهد نشان داد. وزن تر و خشک ریشه در تیمار با Staphylococcus sp. تفاوت معنی­داری با گروه شاهد نداشت. در بررسی طول اندام هوایی، گروه های تیمار شده با هر دو باکتری و باکتری Erwinia sp. به تنهایی اختلاف معنی­داری را در متوسط طول اندام هوایی نسبت به گروه شاهد نشان دادند (01/0 >P). متوسط طول ریشه در تیمار با باکتری Staphylococcus sp. اختلاف معنی­داری را با سایر تیمارها نشان داد؛ ولی سایر تیمارها اختلاف معنی­داری را از این نظر نشان ندادند. با این­که طول ریشه در گروه تیمار شده با Staphylococcus sp. بیشتر بود ولی تعداد ریشه­های فرعی و تارهای کشنده در گروه تیمار شده با Erwinia sp. بیشتر بود و بیشترین تراکم تارهای کشنده در این گروه مشاهده شد و در مرتبه بعدی در گروه تیمار شده با دو باکتری اندوفیت بیشترین تراکم ریشه مشاهده شد (نتایج در اینجا ارائه نشده است). در بررسی خصوصیات فیزیولوژیک گیاه تیمار شده محتوی اکسین، مقدار پروتئین کل، کربوهیدرات­های محلول و مقدار رنگیزه­های اصلی گیاه مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج ارزیابی اکسین تفاوت معنی­دار در میزان اکسین استخراج شده از گیاه تیمار شده با Erwinia sp. در مقایسه با گروه شاهد را نشان داد (05/0>P). بیشترین میزان اکسین استخراج شده مربوط به گروه تیمار شده با دو باکتری اندوفیت بود (جدول 3).

جدول 3- نتایج تغییرات برخی شاخص­های فیزیولوژیک گیاه برنج رقم چمپای تیمار شده با باکتری­های اندوفیت.

Table 3- Physiologic parameters of endophyte treated Champa cultivar.

مطابق با جدول 3، با این­که بیشترین میزان پروتئین کل مربوط به گیاه تیمار شده با اندوفیت Erwinia sp. بود ولی از این نظر بین تیمارهای مختلف تفاوت معنی­داری وجود نداشت(05/0 >P). میزان کربوهیدرات محلول کل در گروه تیمار شده با  دو اندوفیت Erwinia sp. و Staphylococcus sp. تفاوت معنی­داری را با سایر تیمارها نشان داد (05/0 >P). در بررسی رنگیزه های گیاه مشاهده شد که تفاوت معنی­داری بین تیمارهای مختلف در میزان کلروفیل a و همچنین کلروفیل b وجود ندارد (05/0 >P) و  تیمار فاقد اندوفیت میزان کلروفیل a و کلروفیل b بیشتری نسبت به تیمارهای دارای اندوفیت تولید کرده بودند. پس تغییرات میانگین کلروفیل کل در بین تیمارها معنی­دار نبود (05/0 >P)؛ در حالی که میزان کاروتنوئید در سه تیمار تفاوت معنی داری با تیمار فاقد اندوفیت نشان داد (01/0 >P) به طوری­که تیمار فاقد اندوفیت بیشترین میزان کاروتنوئید را نسبت به سایر تیمارها تولید کرد.

بحث   

اندوفیت های گیاهی با توجه به اثراتی که در تحریک رشد گیاه، فراهم کردن عناصر ضروری آن­ها و حذف پاتوژن­های گیاهی دارند می­توانند به عنوان عوامل محرک رشد گیاه و عوامل بیوکنترل استفاده شوند. از  این رو تحقیق و شناسایی این باکتری­ها در مورد ارقام برنج هر منطقه ضروری به نظر می­رسد. از این رو محققین در نقاط مختلف دنیا اقدام به شناسایی این باکتری­ها کرده­اند. از این جمله می­توان به Stoltzfus et al.  (1997)، An et al.  (1999) و  Shen et al.  (2000) اشاره کرد.

در این مطالعه برای اولین بار اندوفیت­های شش رقم برنج موجود در خوزستان مورد بررسی قرار گرفت که در نتیجه­ی آن هفت باکتری اندوفیت متعلق به جنس­های Bacillus، Erwinia و Staphylococcus جداسازی شد. از بین این جدایه ها فقط Erwinia sp. قادر به تثبیت نیتروژن بود و بیشترین میزان اکسین را نیز تولید ­نمود. در تحقیق Hung & Annapurna (2004) نیز از بین 65 اندوفیت جدا شده فقط 15 جدایه قادر به تولید اکسین بودند که بیشترین میزان تولید آن  ^µg/_ml25 بوده است.Feng et al., (2006)، تولید ^mg/_L 243 اکسین و Yasmin et al., (2004) بیشترین میزان تولید اکسین را  ^mg/_L8/90 گزارش کرده اند.  در مقایسه با نتایج ذکر شده Erwinia sp. جدا شده از رقم برنج چمپا در این تحقیق میزان بالایی از اکسین را تولید کرد. این جدایه قادر به انحلال فسفات نیز بود. این باکتری در مطالعات دیگران نیز در کنار باکتری­های جنس باسیلوس، ازوتوباکتر، سودوموناس و آزوسپیریلیوم به عنوان حل کننده فسفات گزارش شده است (Hung & Annapurna, 2004; Rokhzadi et al., 2008).

با توجه به ویژگی­های فوق تاثیر اندوفیت­های گیاه چمپا بر برخی خصوصیات رشدی و فیزیولوژیک این گیاه بررسی شد. لازم به ذکر است که تاکنون در تحقیقات اندکی به این موضوع پرداخته شده است. همان­گونه که در نتایج مشاهده شد باکتری Erwinia sp. تاثیر معنی­داری در افزایش طول اندام هوایی در مقایسه با سایر تیمارها نشان داد و باکتری ٍStaphylococcus sp. با اختلاف معنی داری باعث افزایش طول ریشه در مقایسه با سایر تیمارها شد. تاثیر اندوفیت­ها بر مورفولوژی ساقه به واسطه تولید هورمون­هایی نظیر اکسین، ژیبرلین و غیره می باشد (Shahab et al. 2009). برخی از فیتوهورمون­­هایی که توسط اندوفیت­ها تولید و ترشح می­شوند باعث تغییر در مورفولوژی ریشه می­گردد. بعنوان مثال اکسین باعث افزایش طول سلول­ها، تحریک ریشه­دهی و تحریک تقسیم سلول­ها می­شود. در پژوهشی Fallik et al.,  (1994) نشان دادند که تلقیح ذرت با باکتری آزواسپریلیوم برزیلینس باعث افزایش قابل توجه در تارهای کشنده ذرت می­گردد. در مطالعه Shahb et al.,  (2009) نیز افزایش معنی­داری در طول ریشه و ساقه گیاه تیمار شده با اندوفیت مشاهده شد.

در پژوهشی دیگر Thimann  (1997) نشان داد که اکسین محرک ایجاد ریشه جانبی در اطراف ریشه اصلی می­شود و همچنین از طویل شدن ریشه ممانعت بعمل می­آورد. این نتیجه با نتیجه بدست آمده در این تحقیق که باکتریErwinia sp.  با وجود تولید اکسین بیشتر نسبت به باکتری Staphylococcus sp. طول ریشه کمتری را در گیاه چمپا تیمار شده ایجاد کرد ولی تراکم ریشه­های تولید شده بیشتر بود مطابقت داشت.

پژوهشگران دیگر Mano & Morisaki, (2008) وet al.,  Glick (1986) نیز در تیمار گیاه با باکتری­های اندوفیت افزایش طول ریشه و نیز تعداد تارهای کشنده را گزارش کرده­اند. وزن خشک و تر گیاه تیمار شده با هر دو اندوفیت به صورت مخلوط یا باکتریErwinia sp.  به تنهایی بیش از سایر تیمارها و با اختلاف معنی­دار بدست آمد. همچنینBarea & Brown (1974) در گیاه گوجه فرنگی و Mrkovacki & Milic  (2001) در گیاهان گوجه فرنگی و خیار نشان دادند که تلقیح بذر گیاه با اندوفیت­ها موجب افزایش وزن خشک ریشه و برگ­ها می شود. البته Gholami et al.  (2009) افزایش وزن خشک ساقه، ریشه و محصول را در گیاه ذرت تیمار شده با اندوفیت­ها نشان دادند.

با توجه به نتایج این مطالعه و مطالعات سایر محققین می­توان بیان داشت که  احتمالا حضور اکسین بالا در باکتری Erwinia sp. سبب افزایش قابل توجه در وزن خشک و تر ریشه و اندام های هوایی برنج شده است.

رنگیزه­های برنج چمپا تیمار شده با اندوفیت­ها نسبت به گروه شاهد کاهش پیدا کرده بود که این کاهش در مورد کاروتنوئید معنی­دار بود. Rodrigues Costapinto et al., (2000) متوجه شدند که میزان کلروفیل گیاه ذرت تیمار شده با اندوفیت 50 درصد کمتر از گیاه تیمار نشده است؛ در حالی­که همین محققین در موز تفاوت چندانی را در میزان کلروفیل b مشاهده نکردند.

تیمار برنج چمپا با باکتری باعث افزایش معنی­دار میزان کربوهیدرات کل محلول در گیاه شد. در پژوهشی  Rasmussen et al.  (2008) افزایش کربوهیدرات­های محلول در آب، لیپیدها و برخی از اسیدهای آلی را در گیاه Lolium perenne تیمار شده با اندوفیت مشاهده کردند. احتمالا افزایش میزان کربوهیدرات در گیاه آلوده به اندوفیت به این دلیل است که گیاه کمتر از اسکلت کربنی برای سنتز آمینواسیدها استفاده می­کند و سنتز پروتئین کاهش پیدا خواهد کرد. از طرف دیگر در مطالعه Rasmussen et al.,  (2008) میزان فیبر گیاه آلوده به اندوفیت کاهش یافت. پس اسکلت­های کربن موجود در گیاه وارد ساختمان دیواره شده است و به صورت کربوهیدرات­های محلول در آب درآمده است.

در تحقیق حاضر میزان کربوهیدرات گیاه تیمار شده با دو اندوفیت به صورت همزمان کاهش پیدا کرد. این امر می­تواند به دلیل انحراف بیش از حد کربوهیدرات از گیاه میزبان به سمت باکتری های همزیست باشد. بعلاوه در این تیمار به دلیل تجمع دو اندوفیت به طور همزمان در گیاه احتمالا غلظت اکسین بیش از حد بهینه بوده است که موجب کاهش تراکم تارهای کشنده و کاهش سطح جذب ترکیبات توسط ریشه گیاه و در نتیجه کاهش کربوهیدرات کل شده است.

در مورد میزان پروتئین کل گیاه، گیاه تیمار شده باErwinia sp.  بیشترین میزان پروتئین را نسبت به سایر تیمارها نشان داد. البته این تغییر معنی­دار نبود که احتمالا می­تواند به دلیل کافی نبودن دوره رشد نهال­های مورد آزمایش، عدم دسترسی گیاه به نیتروژن تثبیت شده توسط باکتری، بهینه نبودن شرایط تلقیح و یا کشت گیاه و ورود آمینو­اسیدهای سنتز شده یا پیش­سازهای آن به مسیرهای متابولیکی دیگر باشد (Rasmussen et al. 20008 Feng et al., 2005; James, 2000 Hurek & Hurek 1998;). میزان اکسین در اندام هوایی نهال­های تیمار شده به طور همزمان با دو اندوفیت بیش از سایر تیمارها بود که این افزایش احتمالا به سنتز اکسین توسط اندوفیت­ها مربوط است. با توجه به نتایج بدست آمده در این تحقیق می­توان بیان کرد که باکتری­های اندوفیت با چند مکانیسم به گیاه میزبان خود کمک می­کنند و چندین نقش را در ارتباط با گیاه به­عهده دارد. نتایج مطالعات Bashan & Holguin  (1998) و  Rokhzadi et al. (2008) نیز تایید کننده این یافته است. در نهایت می­توان بر اساس نتایج این تحقیق پیشنهاد داد که باکتری Erwinia sp. به عنوان یک اندوفیت تاثیر قابل توجهی در افزایش برخی ویژگی­های مرتبط با عملکرد گیاه برنج رقم چمپا دارد و باعث بهبود خصوصیات اساسی این گیاه می­شود. بر این اساس تحقیق در مورد اندوفیت­های سایر ارقام برنج خوزستان و تاثیر آن­ها بر رشد و عملکرد این ارقام و نیز ارقام برنج سایر نواحی برنج خیز کشور توصیه می­شود.

تقدیر و تشکر

بدینوسیله نویسندگان مراتب تشکر و قدردانی خود را از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز به لحاظ تامین هزینه­های پژوهشی این تحقیق اعلام می­دارند. بعلاوه از آقای دکتر گیلانی به لحاظ فراهم کردن ارقام برنج مورد تحقیق تشکر و قدردانی می شود.