مطالعه تغییرات پروتئین گیاه یونجه (Medicago sativa L.) در شرایط نرمال و تحت تنش حاصل از تغذیه سرخرطومی برگ یونجه

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته دوره دکتری اصلاح‌ نباتات، ژنتیک مولکولی، گروه زراعت و اصلاح‌نباتات، دانشگاه بوعلی‌سینا، همدان، ایران

2 دانشیار گروه زراعت و اصلاح‌نباتات، دانشکده کشاورزی دانشگاه بوعلی‌سینا، همدان، ایران

3 استاد مرکز تحقیقات بیولوژی‌ پزشکی، دانشگاه علوم ‌پزشکی کرمانشاه، کرمانشاه، ایران

چکیده

استفاده از ارقام مقاوم از جمله مطمئن‌ترین و سودمندترین روش­های مبارزه با آفات و از جمله سرخرطومی برگ یونجه‌ (Hypera postica Gyll.) می­باشد. پس از بررسی­های مزرعه­ای و گلخانه­ای، در نهایت، ژنوتیپ تفرش42 برای انجام مطالعات مولکولی و با هدف بررسی تفاوت الگوی بیان پروتئین‌ها طی دو مرحله تنش و عدم تنش نسبت به سرخرطومی برگ یونجه، انتخاب گردید و مورد ارزیابی قرار گرفت. تغییرات در بیان پروتئین­ها با استفاده از ژل­های الکتروفورز دوبعدی مطالعه شدند. تجزیه خوشه­ای، تجزیه به مؤلفه اصلی و تجزیه تابع تشخیص مورد بررسی­های آماری قرار گرفتند. نتایج نشان داد که از مجموع 218 نقطه پروتئینی تکرارپذیر، 11 نقطه پروتئینی، تغییر بیان داشتند. بیشترین پروتئین‌های بیان‌ شده با الگوی بیان افزایشی در ژنوتیپ تفرش 42، مربوط به گروه خاصی از پروتئین‌ها بودند که در پاسخ به تنش ایجاد شده توسط آفت، به میزان 46/45% تغییرات داشتند. از نقطه نظر بیان پروتئینی، تجزیه خوشه­ای  سبب تقسیم پروتئین­ها به سه خوشه اصلی شد که بیانگر وجود پروتئین­هایی با بیان مشابه در هر خوشه است. لذا، حضور همه آنها در مسیر بیولوژیکی مشترکی ثابت ­شد. تجزیه تابع تشخیص، نتایج حاصل از خوشه­بندی را 100% تأیید کرد که نشان از انطباق داده­های پروتئینی با شرایط آزمایش بود. نتیجه کلی این که با استفاده از نرم­افزار و تجزیه­های آماری، به سادگی می­توان تغییرات بیان معنی­دار ناشی از خسارت آفت سرخرطومی برگ در یونجه را در سطح پروتئوم مورد ارزیابی قرار داد و شاخص تغییرات را مشخص و متعاقب آن از مهندسی ژنتیک برای افزایش سطح مقاومت گیاه مورد مطالعه بهره­برداری نمود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Study of protein changes in alfalfa (Medicago sativa L.) in normal conditions and under the tension from alfalfa weevil (Hypera postica Gyll.) feeding

نویسندگان [English]

  • Mahdi Kakaei 1
  • Hojatolah Mazaherlaghab 2
  • Ali Mostafae 3
1 Former Ph.D Candidate, Plant Breeding (Molecular Genetics), Department of Agronomy and Plant Breeding Faculty of Agriculture, Bu- Ali Sina University, Hamedan, Iran.
2 Associate Professor of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamedan-Iran.
3 Medical Biology Research Center, University of Medical Sciences, Kermanshah
چکیده [English]

The use of resistant cultivars is one of the safest and most profitable methods of controlling post including alfalfa weevil. After farm and greenhouse evaluating, Tafresh 42 genotype for molecular studies selected and evaluated to examine the pattern of protein expression in stress and non-stress conditions to alfalfa weevil. The Changes in protein expression were investigated using two-dimensional electrophoresis gels. Clustering analysis, principal component analysis and discriminant analysis were used in statistic studies. The results showed that 11 protein spots had expression changes among 218 protein spots. The most expression pattern of proteins with a similar increase in Tafresh 42, was related to a specific group of proteins which had 45.46% variations in the expression response to the stress. From the point of protein expression, cluster analysis caused a dividing of proteins into three main clusters indicating the presence of proteins with a similar performance in each cluster.  Therefore, the presence of these proteins in a common biologic pathway is confirmed. The analysis of discriminant function confirmed 100% the results from clustering that indicated protein conformity with the conditions of the experiment. It is concluded that by using statistical analysis and software, it is possible to evaluate significant expression changes induced damage alfalfa weevil in proteome level and determine the index changes, and after that genetic engineering is utilized for enhancing the level of resistance in the plant under studying.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Alfalfa Weevil
  • Cluster analysis
  • two-dimensional electrophoresis
  • Protein Expression

مطالعه تغییرات پروتئین گیاه یونجه (Medicago sativa L.) در شرایط نرمال و تحت تنش حاصل از تغذیه سرخرطومی برگ یونجه

 

مهدی کاکایی1، حجت الله مظاهری لقب*2، علی مصطفایی3

1دانش آموخته دوره دکتری اصلاح‌ نباتات، ژنتیک مولکولی، گروه زراعت و اصلاح‌نباتات، دانشگاه بوعلی‌سینا، همدان، ایران.

2دانشیار گروه زراعت و اصلاح‌نباتات، دانشکده کشاورزی دانشگاه بوعلی‌سینا، همدان، ایران.

3استاد مرکز تحقیقات بیولوژی‌ پزشکی، دانشگاه علوم ‌پزشکی کرمانشاه، کرمانشاه، ایران.

تاریخ دریافت: 14/07/1395،  تاریخ پذیرش: 14/12/1395

 

چکیده

استفاده از ارقام مقاوم از جمله مطمئن‌ترین و سودمندترین روش­های مبارزه با آفات و از جمله سرخرطومی برگ یونجه‌ (Hypera postica Gyll.) می­باشد. پس از بررسی­های مزرعه­ای و گلخانه­ای، در نهایت، ژنوتیپ تفرش42 برای انجام مطالعات مولکولی و با هدف بررسی تفاوت الگوی بیان پروتئین‌ها طی دو مرحله تنش و عدم تنش نسبت به سرخرطومی برگ یونجه، انتخاب گردید و مورد ارزیابی قرار گرفت. تغییرات در بیان پروتئین­ها با استفاده از ژل­های الکتروفورز دوبعدی مطالعه شدند. تجزیه خوشه­ای، تجزیه به مؤلفه اصلی و تجزیه تابع تشخیص مورد بررسی­های آماری قرار گرفتند. نتایج نشان داد که از مجموع 218 نقطه پروتئینی تکرارپذیر، 11 نقطه پروتئینی، تغییر بیان داشتند. بیشترین پروتئین‌های بیان‌ شده با الگوی بیان افزایشی در ژنوتیپ تفرش 42، مربوط به گروه خاصی از پروتئین‌ها بودند که در پاسخ به تنش ایجاد شده توسط آفت، به میزان 46/45% تغییرات داشتند. از نقطه نظر بیان پروتئینی، تجزیه خوشه­ای  سبب تقسیم پروتئین­ها به سه خوشه اصلی شد که بیانگر وجود پروتئین­هایی با بیان مشابه در هر خوشه است. لذا، حضور همه آنها در مسیر بیولوژیکی مشترکی ثابت ­شد. تجزیه تابع تشخیص، نتایج حاصل از خوشه­بندی را 100% تأیید کرد که نشان از انطباق داده­های پروتئینی با شرایط آزمایش بود. نتیجه کلی این که با استفاده از نرم­افزار و تجزیه­های آماری، به سادگی می­توان تغییرات بیان معنی­دار ناشی از خسارت آفت سرخرطومی برگ در یونجه را در سطح پروتئوم مورد ارزیابی قرار داد و شاخص تغییرات را مشخص و متعاقب آن از مهندسی ژنتیک برای افزایش سطح مقاومت گیاه مورد مطالعه بهره­برداری نمود.

واژگان کلیدی: آفت سرخرطومی برگ یونجه، تجزیه کلاستر، الکتروفورز دو بعدی، بیان پروتئین.

 


مقدمه

آفت سرخرطومی برگ یونجه (Hypera postica Gyll.) از جمله تنش­های محدود کننده در تولید یونجه در شرایط ایران محسوب می­شود (Mazahery-Laghab, 2003). این آفت از طریق تغذیه از شاخه و برگ یونجه، می­تواند چین اول آن را به طور کلی نابود کند و باعث محدودیت تولید علوفه گردد (Karimi, 1989). بنابراین، شناسایی پروتئین­های عامل مقاومت و نیز تشخیص ارقام مقاوم به سرخرطومی برگ یونجه می­تواند در برنامه­های اصلاحی، از جمله روش­های افزایش عملکرد این گیاه به حساب آید (Danilson et al., 1989). امروزه با گسترش تکنیک­هایی چون الکتروفورز دوبعدی امکان تجزیه الگوی بیان ژن­ها در سطح پروتئین میسر گردیده است و در واقع، پروتئومیکس دانشی است که امکان بررسی الگوی بیان کل ژن­های بیان شده درسطح پروتئوم را فراهم می­کند (Gygi et al., 2000). بررسی­های هدفمند با استفاده از آنالیزهای مولکولی توام با بکارگیری تکنیک­های ازمایشگاهی، مخصوصا در تعاملات مقاومت به تنش­های زیستی و شناسایی پروتئین­های مربوطه به عمل آمده است (Khezri, 2013; Saiari et al., 2015). تجزیه داده­های پروتئومیکی با دارا بودن متغیرهای زیاد نیاز به روش­های چند متغیره دارد که امکان تجزیه آماری همزمان چندین متغیر را فراهم می­کنند (Zali et al., 2011). از جمله راهکارهای طبقه­بندی ژرم­پلاسم و تجزیه ­و ­تحلیل روابط ژنتیکی بین افراد استفاده از الگوریتم­های آماری چند متغیره است. در تکنیک­های تجزیه­ و ­تحلیل چند متغیره، از تجزیه هم­زمان چندین متغیر برای بررسی روابط بین افراد استفاده می­شود. این تکنیک­ها امروزه به­طور­ گسترده­ای برای تجزیه ­و­ تحلیل تنوع­ ژنتیکی داده­های مختلف از قبیل داده­های مورفولوژیکی، بیوشیمیایی یا نشانگرهای ملکولی مورد استفاده قرار می­گیرند (Mohammadi and Prasanna, 2003). در این تکنیک­ها، پیرامون میانگین و یا واریانس یک متغیر و یا رابطه دو متغیر بحث نمی­شود بلکه در تجزیه چندمتغیره در ارتباط با روابط هم­زمان متغیرها بحث می­گردد. در واقع، پیرامون کوواریانس­ها و همبستگی­های میان سه متغیر یا بیشتر سخن گفته می­شود. در یک مطالعه (Zali et al., 2011)، تجزیه داده‌های حاصل از ژل‌های الکتروفورز دوبعدی با استفاده از روش‌های آماری چندمتغیره انجام شد که در نتیجه، روش آماری مطلوبی جهت تعیین شاخص تغییرات معرفی گردید. تجزیه به مؤلفه­های اصلی، تجزیه خوشه­ای و تجزیه تابع تشخیص از جمله روش­های آماری چند متغیره­ای هستند که در تجزیه ژل­های دوبعدی استفاده می­شوند. خوشه­بندی، به گروه­بندی پروتئین­ها بر مبنای معیار مورد نظر می­پردازد. نظر به این­که داده­های پروتئومیکی دارای متغیرهای متعددی هستند، استفاده از روش تجزیه آماری چند متغیره که می­تواند هم­زمان همه نقاط پروتئینی موجود را مورد ارزیابی قرار دهد و تفاوت­های کلی بیان ژن را بین گروه­های مختلف درگیر در آنالیز را شناسایی نماید روش مطلوب و مؤثری است (Zali et al., 2011; Pedreschi et al., 2008). روش تجزیه مولفه­های اصلی[1] یکی از الگوهای تشخیص و شناسایی در یک مجموعه اطلاعات می‌باشد. در این روش اطلاعات را بر اساس شباهت‌ها و تفاوت‌های آن‌ها بیان می‌کنند. از آن جا که از اطلاعات در ابعاد بالا، نقشه و طرح خاص در داده‌ها را به سختی می‌توان پیدا کرد، تجزیه به مؤلفه­های اصلی در این زمینه می‌تواند مؤثر باشد. در حقیقت، تجزیه به مؤلفه­های اصلی، ارتباط بین داده‌ها را کشف می­کند و در جایی که نمایش گرافیکی به دلیل حجم بالا و پیچیدگی تصاویر وجود ندارد، تجزیه اجزای اصلی یک ابزار نیرومند برای تجزیه ­و ­تحلیل اطلاعات محسوب می‌شود. در مطالعه نمونه برگ دو رقم گندم تحت تنش کادمیوم و جیوه، مقایسه الگوهای پلی­پپتیدی حاصل از الکتروفورز دوبعدی، تأثیر فلزات کادمیوم و جیوه در سنتز پروتئین­های گیاه تحت تنش گزارش شد (Raeesi Sadati et al., 2016).

در مطالعه حاضر، کاربردهای آماری نرم‌افزارهای آنالیز ژل مورد توجه قرار می‌گیرد. پس از شناخت پروتئین­های پاسخگو و بررسی نقش احتمالی آن­ها، نتایج حاصل از این بررسی در کنار سایر تکنیک­های مولکولی و شناسایی دقیق­تر اثرات تنش سرخرطومی روی گیاه یونجه، می­تواند بستر مناسبی را در جهت بهبود صفت مقاومت به سرخرطومی در یونجه فراهم کند. در واقع، هدف این گزارش مطالعه پروتئین­های ژنوتیپ تفرش42 در نمونه‌های شاهد و آلوده به آفت سرخرطومی برگ یونجه و ارتباط آن‌ها با مقاومت و همچنین، شناسایی لکه‌های پروتئینی با تغییرات بیانی معنی‌دار با کمک تکنیک الکتروفورز دوبعدی می­باشد.

 

مواد و روش­ها

به منظور بررسی ارتباط بیان پروتئین‌ها در شرایط تغذیه و عدم تغذیه سرخرطومی برگ یونجه، ژنوتیپ تفرش42 بر اساس جمع‌بندی نتایج مزرعه‌ای و گلخانه‌ای (کلیه نتایج در اینجا ذکر نشده­اند)، مورد مطالعات الکتروفورز دوبعدی قرار گرفت. نحوه آلوده­سازی این ژنوتیپ به این گونه بود که بذر آن در گلدان­های جداگانه­ی کشت گردید. برخی از گلدان­ها (سه گلدان به مثابه سه تکرار) از آسیب آفت سرخرطومی مصون بودند و سه گلدان (سه تکرار) دیگر با استفاده از لاروهای سن سوم آلوده و مورد تغذیه واقع شدند. بافت سبز قسمت هوایی ژنوتیپ تحت تغذیه و عدم تغذیه سرخرطومی در مرحله قبل از گل­دهی بطور هم‌زمان برداشت و بلافاصله در ازت مایع قرار گرفت و تا زمان انجام تجزیه­های بیوشیمیایی در فریزر 80- درجه سلسیوس نگهداری شدند. سپس 5 گرم از هر نمونه برگی تحت تغذیه آفت سرخرطومی و 5 گرم نیز بدون تغذیه آفت سرخرطومی برگ یونجه، در هاون چینی در حضور نیتروژن مایع، به طور کامل آسیاب و پودر یکنواختی حاصل گردید. استخراج پروتئین از بافت برگ بر اساس روشet al. (1986)  Damervalبا اندکی تغییر انجام شد. مقادیر 200 میلی‌گرم از پودر حاصل از نمونه آلوده و غیرآلوده، به میکروتیوب­های دو میلی­لیتری منتقل شد. پنج برابر حجم نمونه گیاهی محلول استخراج تری کلرواستیک اسید (TCA[2]) ده درصد، در استونی که در فریزر در دمای 20- درجه سلسیوس سرد شده بود، به پودر حاصله اضافه گردید و بافت له شده چندین بار ورتکس گردید. سپس به مدت یک ساعت در 20- درجه سلسیوس قرار گرفت. نمونه­های پروتئینی به سانتریفیوژ یخچال­دار منتقل و در دمای 4 درجه سلسیوس به مدت 15 دقیقه با دور Íg14000 سانتریفیوژ گردید. مایع رویی با دقت دور ریخته شد و به رسوب باقی­مانده در میکروتیوب، محلول شستشو[3] (50 میلی­لیتر Acetone بعلاوه 15/0گرم DTT[4]) اضافه گردید. مواد باقی مانده در میکروتیوب سوسپانسیون شدند. سپس میکروتیوب­های حاوی پروتئین به مدت 20 دقیقه در دمای 20- درجه سلسیوس قرار گرفتند تا پروتئین­های موجود در میکروتیوب (که مجدد سانتریفیوژ شده­اند) به طور کامل رسوب کنند. نهایتاً، نمونه­های پروتئینی در دمای C°4- خشک شد. pH بهینه مورد نیاز در این تحقیق استریپ‌هایی با pH خطی 7-4 بودند. برای متورم نمودن ژل­ها، میزان 360 میکرولیتر از محلول متورم‌سازی[5] (جدول 1) که حاوی 8/0 میلی‌گرم پروتئین (انتخاب محلول متورم‌سازی مطلوب بستگی به میزان محلولیت پروتئین نمونه مورد استفاده دارد) بود به داخل شیار موجود در سینی متورم‌سازی قرار گرفت. IPG Buffer و DTT قبل از استفاده به محلول استوک متورم‌سازی اضافه شدند و ژل نواری[6] روی محلول حاوی پروتئین قرار گرفت. پس از آماده‌شدن دستگاه، ژل متورم‌شده در محل مربوطه در تانک الکتروفورز دستگاه مولتی فورII ساخت شرکت آمرشام بیوساینس[7] قرار گرفت و برنامه آن به صورت گرادینت تنظیم گردید (جدول 2). در این مطالعه، جهت الکتروفورز یک ژل نواری 18 سانتی­متری با دامنه pH 4 تا 7، به­طور متوسط، نیاز به 59 هزار ولت ساعت بود. این انرژی طی شش مرحله  تأمین گردید. در این مرحله پس از اتمام مراحل بعد اول (IEF) و تفکیک پروتئین‌ها بر حسب بار الکتریکی، لازم است تا اثر بار به نوعی خنثی شده و پروتئین‌ها تنها بر حسب وزن ملکولی در بعد دوم الکتروفورز تفکیک شوند.


 

 


جدول 1- مواد لازم جهت تهیه محلول متورم‌سازی با حجم نهایی 30 میلی‌لیتر.

Table 1- The required materials for the preparation swelling agent solution with a final volume of 30 ml.

نوع

Type

مقدار

Amount

اوره    Urea

12 gr

چپس     CHAPS

0.5 gr

آبی برمو فنل بلو

Blue bromophenol

200 µl in Ethanol

آب دیونیزه (دو بار تقطیر)

DH2O

25 ml  

 

جدول 2-برنامه الکتروفورزIEF برگ یونجه.

Table 2- IEF electrophoresis applications alfalfa leaves.

جریان (میلی­آمپر)

Current (mA)

توان (وات)

Power (w)

زمان (ساعت)

Time (h)

ولتاژ (ولت)

Voltage (V)

مراحل

Stage

ردیف

Row

2

5

1

500

Gradient

1

2

5

1

500

Stop

2

2

5

1

300

Gradient

3

2

5

2

300

Stop

4

2

5

4

800

Gradient

5

2

5

3

800

Stop

6

 

 

به همین منظور، نوار IPG بعد اول طی دو مرحله در محلول متعادل کننده SDS-PAGE قرار داده شد. برای هر نوار 10 میلی‌لیتر محلول متعادل سازی از فریزر بیرون آورده شد، و به دمای اتاق رسید. این محلول شامل گلیسرول 30%، اوره 6 مولار، تریس 50 میلی­مولار با 7 pH، SDS 4 %، DTT 1 %، برموفنول­بلو 002/0% بود. سپس به دو قسمت مساوی 5 میلی‌لیتری تقسیم و در لوله آزمایش درپوش‌دار ریخته شد. نوارهای IPG در محلول متعادل­سازی اول که حاوی DTT 1% بود، گذاشته و به مدت 20 دقیقه روی شیکر با دمای 37 درجه سلسیوس قرار گرفت. سپس محلول اول کاملاً دور ریخته شد و نوارها با آب مقطر دوبار تقطیر شسته شدند. سپس نوارها در محلول دوم حاوی یدواستامید 5% وزنی/حجمی به جای DTT، قرار داده شدند و پس از آن، محلول به مدت 20 دقیقه روی شیکر با دمای 37 درجه سلسیوس قرار داده شد. ژل‌ها پس از آماده شدن با دستگاه اسکنر مدل Image Scanner III ساخت شرکت فارماسیا با فرمت  Tiff اسکن و ذخیره شدند. مقایسات برای هر یک از جمعیت­ها تحت تنش زیستی آفت سرخرطومی برگ یونجه و فاقد تنش زیستی انجام گرفت. برای بررسی کمّی و کیفی لکه‌های پروتئینی بیان شده روی ژل‌های دوبعدی اسکن شده، از نرم‌افزارMelanie 6.2 (Gene Bio, Geneva, Switzerland)  استفاده شد. بدین ترتیب که پس از انتخاب لکه‌ها روی ژل‌ها در نرم افزار و ویرایش دستی آن‌ها، لکه‌ها به طور اتوماتیک در ژل‌های مختلف با هم جفت شدند. پس از جفت‌نمودن لکه‌های تیمارهای مختلف، به طور دستی بررسی شدند تا از صحت عمل نرم‌افزار در جفت‌ نمودن لکه‌ها اطمینان حاصل شود. تفاوت‌های بین لکه‌های دو تیمار متفاوت، شناسایی شدند. درصد حجمی توسط نرم‌افزار محاسبه شد. برای شناسایی لکه‌هایی که بین دو تیمار تفاوت معنی‌دار نشان دادند با استفاده از آزمون آماری t-استیودنت تفاوت بین میانگین‌های درصد حجمی دو تیمار مشخص شد. همچنین، به منظور تعیین میزان کاهش و یا افزایش بیان پروتئین­ها در شرایط تغذیه و یا عدم تغذیه سرخرطومی، میانگین درصد حجمی هر لکه در مرحله تنش به میانگین درصد حجمی همان لکه در مرحله عدم تنش تقسیم و به عنوان شاخص تغییرات بیان پروتئین[8] در تعیین میزان کاهش یا افزایش بیان هر لکه پروتئینی مورد استفاده قرار گرفت.

 

نتایج و بحث

در شکل­های 1 و 2 نتایج الگوی الکتروفورزی در ژل دوبعدی آورده شده است. همان طور که مشاهده می­شود وزن مولکولی پروتئین­ها با استفاده از الکتروفورز همزمان نشانگرهای پروتئینی استاندارد[9] مشخص و در نرم­افزار  Melanie 6.2  تخمین زده شد. نقطه ایزوالکتریک نیز برای هر لکه پروتئینی با اندازه­گیری مهاجرت لکه روی نوار 18 سانتی­متری IPG با محدوده  pH 7-4 خطی در نرم­افزار مشخص شد. هر لکه پروتئینی با تغییر بیان معنی­دار، با در دست داشتن وزن مولکولی و نقطه ایزوالکتریک و با جستجو در مقالات مرتبط در این زمینه، بانک‌های اطلاعاتی و سایت Uniprot، مورد شناسایی احتمالی قرار گرفت (جدول 4). روند تغییرات این پروتئین­ها به گونه­ای بوده که در مرحله تحت تغذیه نسبت به مرحله عدم تغذیه سرخرطومی، دچار افزایش بیان شده و اختلاف معنی­داری از خود نشان داده است.

 


 

 

 

شکل 1- الگوی الکتروفورز دوبعدی مرحله تحت تغذیه ژنوتیپ تفرش42 یونجه، روی ژل 5/12 درصد.

Figure 1- Two-dimensional electrophoresis pattern under feeding on genotype Tafresh42, onto the 12/5% gel.

 

 

شکل 2- الگوی الکتروفورز دوبعدی مرحله عدم تغذیه از ژنوتیپ تفرش42 یونجه، روی ژل 5/12 درصد.

Figure 2- Two-dimensional electrophoresis pattern of the non-feeding on Tafresh42 genotype, onto the 12/5% gel.

 

 

هر چقدر نسبت شاخص تغییرات بیان پروتئین بزرگ­تر از یک باشد، نشان­دهنده افزایش بیان آن لکه پروتئینی طی مرحله تغذیه سرخرطومی نسبت به عدم تغذیه توسط آن بوده و هرچه این شاخص کوچک­تر از یک باشد به معنای کاهش بیان لکه مورد نظر است. از بین 11 لکه پروتئینی دارای تغییرات بیانی معنی‌دار (8 لکه با افزایش بیان و 3 لکه با کاهش بیان) در ژنوتیپ تفرش42، بیشترین تعداد آن‌ها یعنی 46/45 درصد در پاسخ به تنش، بیان شده بودند و پس از آن حدود 27/27 درصد از آن‌ها در متابولیسم انرژی نقش ایفا می‌کردند. پروتئین‌های بیان‌شده با عملکرد نامشخص، شرکت‌کننده در متابولیسم و سنتز نیز هرکدام 09/9 درصد از کل پروتئین‌های بیان شده را به خود اختصاص دادند (شکل3). مطالعه سازوکارهای مقاومت به تنش به کمک تلفیق روش­های متنوع ژنومیکس کاربردی نظیر ترانس­کریپتومیکس و پروتئومیکس با مطالعه تنش­ها و همچنین بیوشیمی متابولیت­ها امکان­پذیر خواهد بود و بدین ترتیب فرآیند پیچیده نحوه­ی مقابله گیاهان با تنش­ها مشخص خواهد شد (Salkdeh and Nasrabadi, 2010). شکل 4 تصویر دو و سه‌بعدی لکه‌های پروتئینی با بیان معنی‌دار در ژنوتیپ تفرش 42 را نشان می­دهد.

در آنالیز داده‌های مهم پروتئومیکی با دارا بودن متغیرهای زیاد نیاز به روش‌های چندمتغیره است تا امکان تجزیه آماری همزمان چندین متغیر فراهم شود (Zali et al., 2011). در این مطالعه، کاربردهای آماری نرم‌افزارهای تجزیه ژل مورد توجه قرار گرفت. بررسی نمودارهای تجزیه به مؤلفه‌های اصلی نشان داد که ژل‌های مرتبط با تیمارها دارای تکرارپذیری مطلوب بوده و نیز تیمارهای انتخاب شده، دارای تفاوت معنی‌داری از نظر بیان لکه‌ها می‌باشند. شکل 5 تجزیه خوشه‌ای میانگین حجم لکه‌ها در جمعیت تفرش42 و در شرایط عدم تغذیه سرخرطومی برگ یونجه را بر اساس روش Ward نشان می‌دهد که خط برش در فاصله 4، دندروگرام را در دو گروه خوشه‌بندی نموده است.

بدین صورت که لکه‌های شماره 35 و 87 در خوشه اول (با شماره‌های 3 و 10 در نمودار) و لکه‌های شماره 29، 31، 49، 55، 62، 67، 69، 74 و 89 در خوشه دوم (به شماره 1، 7، 4، 2، 11، 5، 6، 9 و 8 در نمودار) قرار گرفتند. در تحقیقی et al (2011) Zali نیز در مطالعات الکتروفورز دوبعدی از تجزیه خوشه‌ای استفاده کرده و آن را روشی ارزشمند در مطالعات پروتئومی گزارش و بر اساس آن لکه‌ها را دسته‌بندی نمودند.


 

 

 

 

 

شکل 3-نمودار درصد لکه‌های پروتئینی با تغییرات بیانی معنی‌دار در ژنوتیپ تفرش 42 (براساس عملکرد و نقش آن‌ها).

Figure 3- Diagram of a protein spots with significant changes in Tafresh42 genotype (On the base of performance and their functions).

 


تجزیه‌ و تحلیل داده‌های حاصل از ژل‌های دوبعدی با کمک روش‌های آماری چندمتغیره

نتایج گروه‌بندی بر اساس نقاط پروتئینی در ژنوتیپ تفرش42 در شرایط عدم تغذیه مورد تأیید تجزیه تابع تشخیص می‌باشد. شکل 6 بای‌پلات مربوط به پراکنش حجم لکه‌ها در تجزیه به مؤلفه‌های اصلی در جمعیت تفرش42 در شرایط عدم تغذیه سرخرطومی را نشان می‌دهد. با توجه به شکل با‌ی‌پلات، لکه‌هایی که نزدیک به هم قرار دارند، از نظر تجزیه خوشه‌ای در یک گروه قرار دارند. این موضوع نشان می‌دهد که لکه‌هایی در نزدیک هم قرار دارند هم‌خانواده بوده و یا از عملکرد مشابهی برخوردارند.  Castiljo et al (2011)در گیاه نخود علوفه­ای، در مطالعه الکتروفورز دو بعدی با کمک روش‌های آماری چندمتغیره نظیر تجزیه به مؤلفه‌های اصلی، 43 لکه پروتئینی مختلف تحت شرایط آزمایشگاهی شناسایی کرده و استفاده از روش‌های آماری چندمتغیره را در تجزیه­و­تحلیل لکه‌های پروتئینی مطلوب گزارش نمودند.



 

شماره لکه  Number of spot

 

 

29

   

31

   

35

   

49

   

55

   

62

   

67

   

69

   

74

   

87

   

89

   

شکل4-تصویر دو و سه‌بعدی لکه‌های پروتئینی با بیان معنی‌دار در ژنوتیپ تفرش 42.

Figure 4- three-dimensional image of two protein spots with significant expression in Tafresh 42 genotype.


جدول 3- ویژگی لکه­های پروتئینی دارای تغییر بیانی معنی‌دار بین مرحله عدم تغذیه و مرحله تحت تغذیه سرخرطومی در یونجه مورد مطالعه.

Table 3- Features of protein spots with different significant detections between the feeding and non-feeding conditions in alfalfa under study.

نوع بیان

Expression type

Fold change (IF)

T-test

میانگین درصد حجم برای هر لکه پروتئینی در مرحله عدم تغذیه سرخرطومی ± خطای استاندارد

Average volume percent of spots in non-feeding conditions ± standard error

میانگین درصد حجم برای هر لکه پروتئینی در مرحله تغذیه سرخرطومی ± خطای استاندارد

Average volume percent of spots in feeding conditions ± standard error

Match ID

Number (Landmark)

کاهشی

0.6492

0.002

0.37496±0.008

0.24346±0.01

894

29

افزایشی

2.0433

0.007

0.2235±0.003

0.45669±0.04

805

31

کاهشی

0.1904

0.011

0.9455±0.01

0.18007±0.01

866

35

افزایشی

1.8934

0.022

0.23251±0.01

0.44024±0.05

655

49

افزایشی

2.8835

0.007

0.06335±0.01

0.18267±0.02

658

55

افزایشی

4.4887

0.018

0.10230±0.01

0.4592±0.004

800

62

افزایشی

1.4648

0.037

0.17231±0.01

0.25241±0.01

852

67

افزایشی

2.1258

0.020

0.13038±0.02

0.27717±0.03

850

69

افزایشی

2.3528

0.012

0.12664±0.02

0.29796±0.03

810

74

کاهشی

0.2567

0.027

0.6846±0.01

0.17580±0.02

745

87

افزایشی

2.8558

0.047

0.05218±0.01

0.14902±0.02

729

89

 


جدول 4- مشخصات پروتئین­های بیان شده در ژنوتیپ تفرش42 بر اساس گزارشات موجود.

Table 4- Profile proteins expressed in Tafresh 42 genotype based on present reports.

Reference

Function

Organism

MW(kDa)

pI

Name

Landmark

Aranjuelo et al., 2011

Energy

Oryza sativa

30.5

4.20

sedoheptulose-1,7-bisphosphatase precursor

29

Hashimoto and Komatsu, 2007

Stress

O. sativa

48.45

4.47

Putative calreticulin precursor

31

C. Xu et al., 2006

Energy

Pisum sativum

39.23

5.41

Phosphoribulokinase

35

Chen et al., 2009

 

Stress

Medicago sativa

75.40

5.22

Heat Shock protein HSP 70

49

Hashimoto and Komatsu, 2007

Stress

O. sativa

76.02

6.07

Putative phenylalanine ammonia lyase

55

Di Carli et al., 2011

 

Stress

Vitis vinifera

43.16

6.18

Chalcone synthase(CHS)

62

Di Carli et al., 2011

Energy and Carbon Metabolism

V. vinifera

34.73

6.62

Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase

67

Peltier et al., 2002

Unknown Function

Arabidopsis thaliana

36.5

6.2

DegP1

69

Di Carli et al., 2011

Stress

V. vinifera

43.16

6.18

Chalcone synthase(CHS)

74

Chen et. al., 2009

Synthetic

M. sativa

51

5.62

ATP synthase beta subunit

87

Hashimoto and Komatsu, 2007

Metabolism

O. sativa

51.31

5.21

UDP-glucose pyrophosphorylase

89

 



 

شکل 5- تجزیه خوشه‌ای میانگین حجم لکه‌ها در ژنوتیپ تفرش42 در شرایط عدم تغذیه سرخرطومی


بر اساس روش وارد (1963).

Figure 5- Cluster analysis of the average volume of spots in Tafresh42 genotype in non-feeding weevil condition based on input Ward method (1963).

 

 

 

 

جدول 5- نتایج تجزیه تابع تشخیص گروه­بندی بر اساس نقاط پروتئینی ژنوتیپ تفرش 42 در شرایط عدم تغذیه سرخرطومی.

Table 5- Result of discrimination analysis for classification based on Tafresh 42 genotype protein spots in feeding weevil condition.

Groups based on cluster analysis

گروه­های حاصل از تجزیه خوشه‌ای

Predicted Group Membership

گروه­های پیش‌بینی شده بر اساس تجزیه تابع تشخیص

 

Total

مجموع

1

2

3

Number

تعداد

%

درصد

Number

تعداد

%

درصد

Number

تعداد

%

درصد

Number

تعداد

%

درصد

1

2

 100

0

0

0

0

2

100

2

0

0

9

100

0

0

9

100

 


 

 

 

 

شکل 6- بای‌پلات مربوط به پراکنش حجم لکه‌ها در تجزیه به مؤلفه‌های اصلی ژنوتیپ تفرش42 در شرایط عدم تغذیه سرخرطومی.

Figure 6- Biplot related to the distribution of Tafresh 42 genotype spots on principal component analysis in non-feeding weevil condition.

 


شکل 7 تجزیه خوشه‌ای بر اساس میانگین حجم لکه‌ها در ژنوتیپ تفرش42 و در شرایط تغذیه سرخرطومی بر اساس روش Ward را نشان می‌دهد. خط برش در فاصله 4، لکه‌های پروتئینی با تغییرات بیانی معنی‌دار را در سه گروه خوشه‌بندی کرده است. بر این اساس، لکه‌های شماره 31، 49 و 62 در خوشه اول (به ترتیب با شماره‌های 2، 4 و 6 در نمودار)، لکه‌های شماره 29، 67، 69 و 74 (به ترتیب با شماره‌های 3، 5، 10 و 11 در نمودار) در خوشه دوم و لکه‌های شماره 35، 55، 87 و 89 (به ترتیب با شماره‌های 1، 7، 8 و 9) در خوشه سوم قرار گرفتند. جدول 6 نتایج تابع تشخیص برای گروه­بندی بر اساس نقاط پروتئینی در ژنوتیپ تفرش42 در شرایط تغذیه سرخرطومی را نشان می‌دهد و این نتایج بطور 100 درصد مورد تأیید تابع تشخیص می‌باشد. شکل 8 بای‌پلات مربوط به پراکنش حجم لکه‌ها با روش تجزیه به مؤلفه‌های اصلی در ژنوتیپ تفرش42 و در شرایط تغذیه سرخرطومی را نشان می‌‌دهد که بر اساس آن ژنوتیپ‌هایی که نزدیک به هم هستند و در یک خط بسته قرار گرفته‌اند، از نظر تجزیه خوشه‌ای در یک گروه قرار گرفته‌اند. در گیاه گندم Janmohamdi (2009) نیز از تجزیه به مؤلفه‌های اصلی به نحو مطلوبی استفاده کرده و آن را روشی توانا و مناسب در گروه‌بندی تیمارهای مورد مطالعه دانسته‌اند.


 

 

 

 

 

 

شکل 7- تجزیه خوشه‌ای میانگین حجم لکه‌ها در ژنوتیپ تفرش42 و شرایط تغذیه سرخرطومی بر اساس روش وارد (1963).

Figure 7- Cluster analysis Average volume Tafresh 42 Genotype spots in the alfalfa weevil feeding conditions based on input Ward method (1963).

 

 

.

جدول 6- نتایج تابع تشخیص گروه­بندی بر اساس نقاط پروتئینی ژنوتیپ تفرش42 در شرایط تغذیه سرخرطومی.

Table 6- Result of discrimination analysis for Classification based on the protein detection function Alfalfa Weevils Tafresh 42 genotype in the alfalfa weevil feeding condition.

Groups based on cluster analysis

گروه­های حاصل از تجزیه خوشه‌ای

Predicted Group Membership

گروه­های پیش‌بینی‌شده بر اساس تجزیه تابع تشخیص

Total

کل

          1

2

3

Number

تعداد

%

درصد

Number

تعداد

%

درصد

Number

تعداد

%

درصد

Number

تعداد

%

درصد

1

3

100

0

0

0

0

4

100

2

0

0

4

100

0

0

4

100

3

0

0

0

0

4

100

4

100


 

 

شکل 8- بای‌پلات مربوط به پراکنش حجم لکه‌ها در تجزیه به مؤلفه‌های اصلی ژنوتیپ تفرش42 و شرایط تغذیه سرخرطومی.

Figure 8- Biplot related to the distribution of Tafresh 42 genotype spots on principal component analysis and in alfalfa Weevils feeding condition.

 

نتیجه­گیری کلی

 

برای فهم بهتر و عمیق­تر کنترل آفت سرخرطومی برگ یونجه، اثر متقابل و ارتباط بین سازوکارهای سطوح ملکولی ضروری و مورد نیاز است. اخیراً تجزیه پروتئومیکی به یک ابزار مطلوب در تحقیق فرآیندهای پیچیده سلولی نقش ایفا می­کند. این روش در بررسی­های ژنتیکی و شناسایی احتمالی پروتئین­های گیاهی دخیل در تحمل و مقاومت به آفات بسیار موفق بوده است. یکی از موارد اساسی در شناخت سازوکار تحمل و مقاومت گیاهان در پاسخ به تنش­ها، بررسی و شناسایی تغییرات در سطوح پروتئین­های درگیر در این فرآیند می­باشد (Aflatoni, 2010). در این پژوهش، بررسی نمودارهای تجزیه به مؤلفه‌های اصلی نشان داد که ژل‌های مرتبط با تیمارها دارای تکرارپذیری مطلوب بوده و نیز تیمارهای انتخاب شده، دارای تفاوت معنی‌داری از نظر بیان لکه‌ها می‌باشند. نتایج این تحقیق نشان می­دهد که مطالعه میزان تغییرات بیان پروتئین­های منفرد به تنهایی راهگشا نخواهد بود بلکه، شناخت مجموعه پروتئین­های هم بیان و مطالعه الگوی تغییرات جمعی آن­ها در پاسخ به سطوح مختلف تنش مهم است و درک مطلوبتری می­دهد. در بین پروتئین­های شناسایی شده احتمالی، بیشترین تعداد آن‌ها یعنی 46/45 درصد در پاسخ به تنش، بیان شده بودند و پس از آن حدود 27/27 درصد از آن‌ها در متابولیسم انرژی نقش ایفا ‌کردند و در واقع، این نوع پروتئین­ها، انرژی مورد نیاز برای واکنش­های دفاعی در برابر تنش را تأمین می­کنند و پروتئین‌های بیان‌شده با عملکرد نامشخص، شرکت‌کننده در متابولیسم و سنتز نیز هرکدام 09/9 درصد از کل پروتئین‌های بیان شده را به خود اختصاص دادند. در واقع می­توان پیشنهاد نمود که، اگر توالی پروتئین­هایی که در شرایط تنش آفت سرخرطومی، بیان شده بودند مشخص و تعیین گردد، امکان حصول به نتایج مطمئن­تری جهت اهداف مهندسی ژنتیک فراهم خواهد شد.

 

منابع

Aflatoni, MM (2010). Technique and Interpretation of the Electrophoretic Types. Tehran University press.

Castillejo M, Fernandez-Aparicio M, Rubiales D (2011). Proteomic analysis by two-dimensional differential in gel electrophoresis (2D DIGE) of the early response of Pisum sativum to Orobanche crenata. Journal of Experimental Botany 63: 1–13.

Damerval C, de Vienne D, Zivy M, Thiellement H (1986). The technical improvements in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling proteins. Electrophoresis 7: 52-54.

Danilson S (1989). The Alfalfa weevil, Neguide, G73-30-Adiversity among Argentine grapevine (Vitis vinifera L.) varieties using morphological data and AFLP markers. Journal of Biotechnology 6: 241-250.

Gygi SP, Rist B, Aebersold R (2000). Measuring Gene Expression by Quantitative Proteome Analysis. Current Opinion in Biotechnology 11: 396-401.

Janmohamadi M (2009). Study of Changes of Cold-Induced Proteins during Transition of Vegetative to Reproductive Stages in Winter Wheat under Field Conditions. Crop Physiology PhD thesis. College of Agriculture and Natural Resources of Tehran University. 

Karimi H (1989). Agriculture of plant. Tehran Press. No. 387 (In Farsi).

Khezri A (2013). Molecular and chemical analysis of the protein subunits and fractions of sesame meal in comparison to cottonseed meal and soybean meal using SDS-Page electrophoresis and CNCPS methods. Journal of Agricultural Biotechnology 5: 71-81.

Mazahery-Laghab H (2003). Study of the resistance of alfalfa cultivars (Medicago sativa) to alfalfa weevil (Hypera postica Gyll.) attack under water stress conditions. Pajouhesh & Sazandegi 64: 8-15.

Mohammadi SA, Prasanna BM (2003). Analysis of genetic diversity in crop plants: Salient statistical tools and considerations. Crop Science 43: 1235–1248.

Pedreschi R, Hertog ML, Carpentier SC (2008). Treatment of missing values for multivariate statistical analysis of gel-based proteomics data. Proteomics 8: 1371-1383.

Raeesi sadati SE, Gadeh Kahriz SJ, Ebadi A (2016). Expression of proteins in the leaves of two wheat cultivars under stress induced by cadmium and mercury using two-dimensional electrophoresis. Journal of Crop Production and Processing 5: 233-243.

Salekdeh GH, Nasrabadi D (2010). Proteomic Analysis of Root and Leaf in Rice under Salinity Stress. Crop Biotechnology 1: 1-11.

Sayari M, Babaeizad V, Tajick-Ghanbari MA, Rahimian H (2015) Resistance of Two Rice Cultivars to the Sheath Blight Agent Rhizoctonia solani AG1-1A. Journal of Agricultural Biotechnology 7: 97-112.

Zali H, Rezaei Tavirani M, Sayedkhani Nahal A, Shahriari Noor M, Ilghari N (2011). Data Analysis of Two Dimensional Electrophoresis Gels by Multivariate Statistical Methods. Scientific Journal of Ilam University of Medical Sciences 20: 219-231.

 

 

 

Study of protein changes in alfalfa (Medicago sativa L.) in normal conditions and under the tension from alfalfa weevil (Hypera postica Gyll.) feeding

 

Kakaei M.1, Mazahery-Laghab H.*2, Mostafaei A.3 

 

1Former Ph.D Candidate, Plant Breeding (Molecular Genetics), Department of Agronomy and Plant Breeding Faculty of Agriculture, Bu- Ali Sina University, Hamedan, Iran.

2Associate Professor of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamedan-Iran.

3Medical Biology Research Center,  University of Medical Sciences, Kermanshah.

 

Abstract

The use of resistant cultivars is one of the safest and most profitable methods of controlling post including alfalfa weevil. After farm and greenhouse evaluating, Tafresh 42 genotype for molecular studies selected and evaluated to examine the pattern of protein expression in stress and non-stress conditions to alfalfa weevil. The Changes in protein expression were investigated using two-dimensional electrophoresis gels. Clustering analysis, principal component analysis and discriminant analysis were used in statistic studies. The results showed that 11 protein spots had expression changes among 218 protein spots. The most expression pattern of proteins with a similar increase in Tafresh 42, was related to a specific group of proteins which had 45.46% variations in the expression response to the stress. From the point of protein expression, cluster analysis caused a dividing of proteins into three main clusters indicating the presence of proteins with a similar performance in each cluster.  Therefore, the presence of these proteins in a common biologic pathway is confirmed. The analysis of discriminant function confirmed 100% the results from clustering that indicated protein conformity with the conditions of the experiment. It is concluded that by using statistical analysis and software, it is possible to evaluate significant expression changes induced damage alfalfa weevil in proteome level and determine the index changes, and after that genetic engineering is utilized for enhancing the level of resistance in the plant under studying.

Keywords: Alfalfa Weevil, cluster analysis, Two-dimensional electrophoresis, Protein expression.

 

 

 

 

 

 

 



* نویسنده مسئول: حجت‌اله مظاهری لقب                        تلفن:    09183122167               Email: hojat.mazahery@yahoo.co.uk

Principal component analysis -1

[2]- Tricolor Acetic Acid

[3]- Washing Solution

4- Dithio Threitol

[5]- Rehydration

[6]- Immobilized pH gradient Strip

[7]- Amersham Bioscience

[8]- Induction factor

[9]- Amersham Pharmacia Biotech

* Corresponding Author:  Hojatollah Mazahery-Laghab   Tel:09183122167 Email:hojat.mazahery@yahoo.co.uk

Aflatoni, MM (2010). Technique and Interpretation of the Electrophoretic Types. Tehran University press.
Castillejo M, Fernandez-Aparicio M, Rubiales D (2011). Proteomic analysis by two-dimensional differential in gel electrophoresis (2D DIGE) of the early response of Pisum sativum to Orobanche crenata. Journal of Experimental Botany 63: 1–13.
Damerval C, de Vienne D, Zivy M, Thiellement H (1986). The technical improvements in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling proteins. Electrophoresis 7: 52-54.
Danilson S (1989). The Alfalfa weevil, Neguide, G73-30-Adiversity among Argentine grapevine (Vitis vinifera L.) varieties using morphological data and AFLP markers. Journal of Biotechnology 6: 241-250.
Gygi SP, Rist B, Aebersold R (2000). Measuring Gene Expression by Quantitative Proteome Analysis. Current Opinion in Biotechnology 11: 396-401.
Janmohamadi M (2009). Study of Changes of Cold-Induced Proteins during Transition of Vegetative to Reproductive Stages in Winter Wheat under Field Conditions. Crop Physiology PhD thesis. College of Agriculture and Natural Resources of Tehran University. 
Karimi H (1989). Agriculture of plant. Tehran Press. No. 387 (In Farsi).
Khezri A (2013). Molecular and chemical analysis of the protein subunits and fractions of sesame meal in comparison to cottonseed meal and soybean meal using SDS-Page electrophoresis and CNCPS methods. Journal of Agricultural Biotechnology 5: 71-81.
Mazahery-Laghab H (2003). Study of the resistance of alfalfa cultivars (Medicago sativa) to alfalfa weevil (Hypera postica Gyll.) attack under water stress conditions. Pajouhesh & Sazandegi 64: 8-15.
Mohammadi SA, Prasanna BM (2003). Analysis of genetic diversity in crop plants: Salient statistical tools and considerations. Crop Science 43: 1235–1248.
Pedreschi R, Hertog ML, Carpentier SC (2008). Treatment of missing values for multivariate statistical analysis of gel-based proteomics data. Proteomics 8: 1371-1383.
Raeesi sadati SE, Gadeh Kahriz SJ, Ebadi A (2016). Expression of proteins in the leaves of two wheat cultivars under stress induced by cadmium and mercury using two-dimensional electrophoresis. Journal of Crop Production and Processing 5: 233-243.
Salekdeh GH, Nasrabadi D (2010). Proteomic Analysis of Root and Leaf in Rice under Salinity Stress. Crop Biotechnology 1: 1-11.
Sayari M, Babaeizad V, Tajick-Ghanbari MA, Rahimian H (2015) Resistance of Two Rice Cultivars to the Sheath Blight Agent Rhizoctonia solani AG1-1A. Journal of Agricultural Biotechnology 7: 97-112.
Zali H, Rezaei Tavirani M, Sayedkhani Nahal A, Shahriari Noor M, Ilghari N (2011). Data Analysis of Two Dimensional Electrophoresis Gels by Multivariate Statistical Methods. Scientific Journal of Ilam University of Medical Sciences 20: 219-231.