نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه لرستان، خرم‌آباد، ایران.
2 دانشیار، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه لرستان، خرم‌آباد، ایران.
3 مربی، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان لرستان، خرم‌آباد، ایران.
4 استادیار، موسسه تحقیقات کشاورزی دیم کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، گچساران، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Grass pea (Lathyrus sativus L.), as one of the most important forage crop plants, has high content of protein and Laysin. In order to assess the genetic diversity of 33 genotypes of grass pea, 20 semi-random primers were used in the present study. DNA was extracted by CTAB method. The ISJ data were analyzed and 77% of IT bands and 81% of ET bands were polymorphic. The results showed that the average number of polymorphic bands per primer was 3.95 and the highest amount of polymorphic information content and marker index was belonged to ET18-6 primer. According to the Jaccard's similarity coefficient, the range of similarity among studied genotypes was varied from 0.42 to 0.89. Cluster analysis based on UPGMA method divided genotypes to 5 groups at cut of line in 0.71 similarity coefficient. The principle coordinates analysis showed that the first three components explained 74.65% of total variance indicating the restricted distribution of these ISJ markers at the grass pea genome. Present study is the first report on application of ISJ markers in grass pea, as important forage plant, which is hoped to be effective in the development of molecular breeding programs of this plant.
کلیدواژه‌ها [English]
ارزیابی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای خلر با استفاده از نشانگرهای نیمهتصادفی ISJ
محمدامین سهرابی1، احمد اسماعیلی*2، کریم خادمی3، رحمت‌الله کریمی زاده4
1دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه لرستان، خرم‌آباد، ایران.
2دانشیار، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه لرستان، خرم‌آباد، ایران.
3مربی، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان لرستان، خرم‌آباد، ایران.
4استادیار، موسسه تحقیقات کشاورزی دیم کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، گچساران، ایران
تاریخ دریافت: 11/07/1394، تاریخ پذیرش: 21/04/1396
چکیده
خلر (Lathyrus sativus L.)، یکی از مهم‌ترین گیاهان زراعی و علوفهای دنیاست که به علت پروتئین و لایسین بالا گیاهی شناخته شده است. به‌منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی 33 ژنوتیپ خلر، از 20 نشانگر نیمهتصادفی اینترون-اگزونی یا ISJ استفاده شد. استخراج DNA با روش CTAB صورت گرفت. اطلاعات حاصل از آغازگرهای ISJ مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و از مجموع باندها، 77% باندها مربوط به آغازگرهای ET و 81% مربوط به آغازگرهای IT چند شکل بودند. نتایج نشان داد که متوسط تعداد باند چند شکل به ازای هر آغازگر 95/3 عدد بود و بیشترین میزان اطلاعات چند شکلی و شاخص نشانگر را مربوط به آغازگر ET18-6 بود. بر اساس محاسبه ضریب تشابه جاکارد، محدوده تشابه ژنوتیپها از 42/0 تا 89/0 متغیر بود. تجزیه گروهبندی بر اساس روش UPGMA صورت گرفت و براساس دندروگرام بدست آمده و در ضریب تشابه 70/0، ژنوتیپها به پنج گروه اصلی تقسیم شدند. نتایج تجزیه به مختصات اصلی نشان داد که سه مولفه اول در مجموع 65/74 درصد از کل واریانس را توجیه نمودند که بیانگر پراکنش محدود این نشانگرها در سطح ژنوم این گیاه میباشد. این تحقیق اولین گزارش از کاربرد نشانگر ISJ در گیاه علوفهای مهم خلر در دنیا میباشد که امید می‌رود در توسعه اصلاح ملکولی این گیاه مؤثر واقع گردد.
کلمات کلیدی: گروهبندی، خلر، نشانگر ISJ، مختصات اصلی.
مقدمه
در حال حاضر نیاز مبرمی به تحقیقات در زمینه گیاهان علوفهای در کشور احساس میشود و استفاده از روش‌های مولکولی ازجمله نشانگرهای مولکولی به‌عنوان ابزار کارا در جهت اصلاح گیاهان علوفهای حائز اهمیت است (Sandgol, 1996). خلر یا سنگینک با نام علمی Lathyrus sativus L. متعلق به زیر تیره Papilionaceae تیره Leguminosae و خانواده پیچک‌داران است. تمامی گونههای جنس Lathyrus دارای 2n=2x=14 کروموزوم با تعداد کروموزوم پایه n=x=7 می‌باشند. خلر به لحاظ دارا بودن ارزش غذایی زیاد به‌ویژه محتوای پروتئین بالا در دانه (34-18 درصد) و در برگهای بالغ (17 درصد) و نیز محتوای لایسین بالا، گیاهی شناخته شده است (Hanburiy et al., 2000). این گیاه در مقایسه با شبدر، یونجه، اسپرس و سایر گیاهان علوفهای ارزش غذایی یکسانی داشته و پروتئین آنها با توجه به مرحله‌ای از رشد که برداشت می‌شوند بین 12 تا 20 درصد متغیر است. به جهت اهمیتی که این گیاهان در میان گیاهان علوفهای از نظر تغذیه دام، کاشت در اراضی کم بازده، مقاومت به سرما و کم‌آبی و همچنین نقشی که در حاصلخیزی خاک دارند، به‌صورت چند منظوره مورد استفاده قرار می‌گیرند. از این گیاه یک نوع در ایران برای تهیه دانه و علوفه کشت میشود ولی در آمریکا انواع خلر را مخلوط با یولاف برای تهیه علوفه کشت مینمایند (Rastgar, 2013).
در برنامه‌های به‌نژادی و حفظ ذخایر توارثی، اطلاع از سطح تنوع ژنتیکی از اهمیت بسزایی برخوردار است. اطلاعات تنوع ژنتیکی را میتوان از خصوصیات مورفولوژیک، پروتئین، آیزوزایم و نشانگرهای مولکولی به دست آورد (Pejic et al., 1998). استفاده از نشانگرهای مبتنی بر DNA مناسب‌ترین روش برآورد تنوع ژنتیکی به شمار می‌رود (Keshavarz-Khoob et al., 2015; Odonougue et al., 1999). این نشانگرها تحت تأثیر شرایط محیطی نیستند و در هر مرحله از رشد گیاه کاربرد دارند (Manifesto et al., 2001). پیشرفت در ژنتیک سلولی و مولکولی به توسعه نشانگرهای DNA مبتنی بر PCR برای مطالعات ژنتیکی متفاوت در گونههای زراعی منجر شده است (Mohammadi & Prasanna, 2003).
یکی از نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA، نشانگر نیمهتصادفی ISJ (Intron-exon Splice junction) است که توسط Weining & Langridge (1991) ابداع گردید و سپس توسط Rafalski et al. (1997) اطلاعات کامل‌تری از آن به دست آمد. توالی این نشانگرها بر اساس نواحی برش اتصال اینترون-اگزون طراحی‌شده است و دارای توالیهای 9 تا 18 نوکلئوتیدی است. نتایج حاصل از مطالعه Rafalski et al. (19972002;) بیانگر این مطلب بود که نشانگرهای ISJ به علت نیمهتصادفی بودن‌شان نسبت به نشانگر RAPD (Random Amplyfied Polymorphic DNA) پیچیدگی کمتر، تکرارپذیری بالاتر و چندشکلی بیشتری دارند. Przetakiewicz et al. (2002) و Weining & Langridge (1991) بیان نمودند که آغازگرهای ISJ برای ارزیابی تنوع ژنتیکی و جلوگیری از هدف قرار دادن مناطق هتروکروماتینی در ژنوم گیاهان کاربرد دارند. Rafalski et al. (1997) بیان کردند که چندشکلی به‌دست‌آمده از آغازگرهای ISJ ناشی از تفاوت در تکثیر بخش‌هایی از ژنوم گیاه است که مورد رونویسی قرار می‌گیرند. در مطالعهای تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای خلر با استفاده از نشانگرهای RAPD صورت گرفت و نتایج نشان داد که تنوع بالایی در ژنوتیپهای خلر وجود دارد (Chtourou-Ghorbel et al., 2002).Radwan et al. (2013) هجده ژنوتیپ خلر جمع‌آوری‌شده از کشورهای مختلف را برای تغییرات وزن هزار دانه، محتوای پروتئین دانه و الگوهای الکتروفورز کل پروتئین دانه تحت شرایط تنش مورد بررسی قرار دادند. آنها تنوع ژنتیکی مناسبی برای صفات مورد مطالعه میان ژنوتیپهای مورد بررسی نشان دادند و بیان کردند که از طریق انتخاب ساده میتوان این صفات را بهبود بخشید.Shiferaw et al. (2013) با استفاده از نشانگرهای EST-SSR تنوع ژنتیکی تودههای خلر اتیوپی را مورد ارزیابی قراردادند؛ که نتایج منجر به گروهبندی جمعیتهای خلر از سه منطقه جغرافیایی مختلف شد و دیده شد که تنوع زیاد در جمعیتهای دو منطقه از سه منطقه مورد مطالعه وجود دارد.
با توجه به آنچه در بالا در مورد کاربرد نشانگرهای مولکولی در اصلاح گیاهان گفته شد، هدف از این تحقیق بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای گیاه خلر با استفاده از نشانگرهای نیمهتصادفی اگزون-اینترونی بود. قابل‌ذکر است که تاکنون تحقیقی در مورد تنوع ژنتیکی خلر Sativus L. با نشانگر ISJ در داخل و خارج کشور صورت نگرفته است.
مواد و روشها
به‌منظور بررسی تنوع ژنتیکی و شناسایی چندشکلی مولکولی، 33 ژنوتیپ خلر از موسسه تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی لرستان تهیه شد که شرح این ژنوتیپها در جدول 1 ارائه شده است. این آزمایش در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه لرستان انجام گرفت.
استخراج DNA با استفاده از روش CTAB (Doyle and Doyle, 1990) صورت گرفت. سپس کیفیت و کمیت DNA ژنومی با استفاده از ژل آگارز 8/0 درصد و دستگاه بیوفتومتر ارزیابی شد. در این مطالعه از 20 آغازگر ISJ استفاده شد. واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر برای تمامی نمونه‌ها با حداقل دو تکرار بهینه شد. برنامه دستگاه PCR در دو مرحله طبق روش Przetakiewicz et al. (2002) در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. چرخه‌های حرارتی به ترتیب شامل واسرشت شدن اولیه در 94 درجه سلسیوس به مدت پنج دقیقه و سپس 40 چرخه دمایی بود که در هفت‌چرخه اولیه، دمای اتصال آغازگر دو درجه سلسیوس و در 33 چرخه بعدی شش درجه سلسیوس بالاتر از دمای ذوب آغازگر (جهت تکثیر اختصاصی‌تر آغازگرها) در نظر گرفته شد. در تمامی این 40 چرخه، واسرشت شدن به مدت 40 ثانیه و در دمای 94 درجه سلسیوس و اتصال آغازگر به مدت یک دقیقه و مرحله سنتز به مدت دو دقیقه در دمای 72 درجه سلسیوس صورت گرفت. بعد از اتمام 40 چرخه مرحله سنتز نهایی به مدت ده دقیقه در دمای 72 درجه سلسیوس انجام شد. سرانجام جهت تفکیک باندهای DNA، محصولات تکثیرشده PCR بر روی ژل آگارز 1 درصد در بافر TAE 1X و ولتاژ 90 ولت الکتروفورز گردید.
برای تخمین تنوع ژنتیکی، اطلاعات حاصل به‌صورت کد صفر (عدم وجود باند) و کد یک (وجود باند) با استفاده از نرمافزار NTSYS-2.02e مورد تجزیه‌وتحلیل قرار گرفت. از میان 25 آغازگر مورد مطالعه، در نهایت از اطلاعات حاصل از 20 آغازگر چندشکل جهت تشکیل ماتریس تشابه و گروهبندی استفاده شد. در این تحقیق جهت گروهبندی ژنوتیپها از روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه جاکارد استفاده شد. همچنین نمایش گروهبندی ژنوتیپهای مورد مطالعه با استفاده از روش تجزیه به مختصات اصلی (با استفاده از نر‌افزار NTSYS-2.02e) انجام شد.
نتایج و بحث
25 آغازگر نیمهتصادفی درمجموع حدود 100 باند قابل امتیازدهی و تکرارپذیر تولید نمودند که از این میان 79 باند چند شکل (79%) و 21 باند منومرف (21%) است. میانگین تعداد کل باندها و تعداد باندهای چند شکل به ازای هر آغازگر ISJ، به ترتیب 5 و 95/3 باند بود. در بین آغازگرهای تکثیری، بیشترین تعداد قطعات تکثیری مربوط به آغازگر ET18-6 با 8 باند تولیدی و کمترین تعداد قطعات مربوط به تعدادی از آغازگرها (ET 15-35، IT 15-36 و ET 12-29) بود (جدول 2). در تحقیقی توسط Shiferaw et al. (2012)، تعداد آلل در هر لوکوس از 2 تا 7 آلل (و متوسط 4 آلل) برای آغازگرهای EST-SSR گزارش گردید. در بررسی دیگری تنوع ژنتیکی 48 ژنوتیپ خلر با استفاده از 24 نشانگر ISSR بررسی شد و دیده شد که 12 نشانگر چندشکلی دارند (Ambade et al., 2015).
جدول 1- نام و محل جمعآوری ژنوتیپ.
Table 1- Number and location of Latyrus sativus accessions.
|
نام ثبت‌شده ژنوتیپ Genotype registered name |
منشأ جمعآوری Location of collection |
نام ثبت‌شده ژنوتیپ Genotype registered name |
منشأ جمعآوری Location of collection |
|
IF3 |
Turkey |
IF1346 |
ICARDA |
|
IF225 |
Slovakia |
IF1347 |
ICARDA |
|
IF463 |
Ethiopia |
IF1872 |
Bangladesh |
|
IF478 |
Ethiopia |
IF2156 |
Bangladesh |
|
IF587 |
Syria |
IF2177 |
Bangladesh |
|
IF471 |
Ethiopia |
IF2329 |
Bangladesh |
|
IF1306 |
ICARDA |
IF1928 |
Nepal |
|
IF1307 |
ICARDA |
Sel.289 |
ICARDA |
|
IF1309 |
ICARDA |
Sel.290 |
ICARDA |
|
IF1312 |
ICARDA |
Sel.299 |
ICARDA |
|
IF1316 |
ICARDA |
Sel.387 |
ICARDA |
|
IF1322 |
ICARDA |
Sel.449 |
ICARDA |
|
IF1327 |
ICARDA |
Sel.587 |
ICARDA |
|
IF1332 |
ICARDA |
Sel.B111 |
ICARDA |
|
IF1341 |
ICARDA |
Sel.ETH1/299 |
ICARDA |
|
IF1344 |
ICARDA |
Sel.521/B1 |
ICARDA |
|
Sel.B222 |
ICARDA |
|
|
در مطالعهای، Nowosielski et al. (2002) بر روی ارقام ژنتیکی لوبیا با استفاده از آغازگرهای نیمهتصادفی، متوسط تعداد باند به ازای هر ژنوتیپ را 5/11 عدد گزارش کردند. درحالی‌که Rafalski et al. (2002) متوسط تعداد باند تولیدشده به ازای هر یک از ژنوتیپهای چاودار را 9/8 عدد برآورد کردند. نه آغازگر گروه IT، درمجموع 47 باند تولید نمودند که تعداد 38 باند از این تعداد چند شکل (81%) و 9 باند منومرف (19%) بودند. همچنین 11 آغازگر گروه ET درمجموع 53 باند تولید نمودند که 41 باند آنها چند شکل (77%) و 12 باند منومرف (23%) بودند. گروه آغازگرهای IT تعداد 2/4 باند چند شکل به ازای هر آغازگر در مقابل 7/3 باند در گروه ET تولید نمودند (جدول 2). علت پلیمورفیسم پایین این آغازگرها را میتوان ناشی از آن دانست که این آغازگرها از ابتدا برای خانواده غلات و سولاناسه طراحی شدهاند و پیشنهاد میشود در کارهای آینده براساس بانکهای ژنتیکی آغازگرهای جدیدی مبتنی بر توالیهای حفاظتشده مرز اگزون-اینترونی این خانواده بهینهسازی شود.
جدول 2-مشخصات آغازگرها ازنظر چندشکلی و شاخصهای مرتبط.
Table 2- Polymorphysm and related indices of primers.
|
شاخص نشانگر (MI) |
محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) |
درصد تنوع Percent of polymorphism |
باندهای چند شکل Polymorphic bands |
کل باندها Total bands |
نام آغازگر Primer name |
ردیف Row |
|
3 |
0.50 |
100 |
6 |
6 |
IT 10-1 |
1 |
|
3.16 |
0.79 |
66.66 |
4 |
6 |
IT 10-2 |
2 |
|
1.32 |
0.33 |
80 |
4 |
5 |
IT 10-3 |
3 |
|
1.88 |
0.94 |
50 |
2 |
4 |
IT 10-4 |
4 |
|
1.40 |
0.28 |
100 |
5 |
5 |
IT 10-5 |
5 |
|
2.68 |
0.67 |
100 |
4 |
4 |
ET 12-25 |
6 |
|
2.67 |
0.89 |
75 |
3 |
4 |
ET 12-27 |
7 |
|
1.62 |
0.81 |
33.33 |
1 |
3 |
ET 12-29 |
8 |
|
1.47 |
0.49 |
100 |
3 |
4 |
ET 12-30 |
9 |
|
2.16 |
0.36 |
100 |
6 |
6 |
IT 15-31 |
10 |
|
2.3 |
0.46 |
83.33 |
5 |
6 |
IT 15-32 |
11 |
|
2.08 |
0.52 |
66.66 |
4 |
6 |
IT 15-34 |
12 |
|
0.92 |
0.46 |
66.66 |
2 |
3 |
IT 15-36 |
13 |
|
2.04 |
0.51 |
80 |
4 |
5 |
ET 15-32 |
14 |
|
3.36 |
0.56 |
85.72 |
6 |
7 |
ET 15-33 |
15 |
|
1.26 |
0.63 |
66.66 |
2 |
3 |
ET 15-35 |
16 |
|
1.10 |
0.55 |
50 |
2 |
4 |
ET 15-36 |
17 |
|
3.48 |
0.87 |
66.66 |
4 |
6 |
ET 18-1 |
18 |
|
3.60 |
0.72 |
100 |
5 |
5 |
ET 18-2 |
19 |
|
4.90 |
0.70 |
87.5 |
7 |
8 |
ET 18-6 |
20 |
هرچه عدد متوسط باند به ازای هر آغازگر بیشتر باشد کارایی آن نشانگر در گیاه مورد مطالعه بیشتر است. میزان اطلاعات چند شکلی (PIC) برای هر آغازگر محاسبه شد و بیشترین و کمترین PIC به ترتیب مربوط به آغازگر IT10-4 و IT10-5 94/0 و 28/0 بود. محاسبه شاخص نشانگر (MI) برای هرکدام از آغازگرها نشان داد که بیشترین شاخص نشانگر مربوط به آغازگر ET18-6 با مقدار 9/4 و کمترین مقدار آن مربوط به آغازگر ET15-36 با مقدار 92/0 بود. این شاخص پتانسیل هر آغازگر جهت تولید باند بیشتر را نشان میدهد. مجیری و همکاران در مطالعهای روی گیاه آویشن، بیشترین و کمترین میزان اطلاعات چندشکلی را مربوط به آغازگرهای IT15-36 و IT18-2 گزارش کردند (Ismaili & Mojiri, 2013;Mojiri et al., 2013). در مطالعهای توسط Belaid et al. (2006) با استفاده از نشانگرهای ISSR تنوع ژنتیکی درون و بین ژنوتیپهای خلر صورت گرفت، نتایج 60 باند DNA چند شکلی نشان داد که بیانگر پلیمورفیسم بالا در درون و بین ژنوتیپها بود. در مطالعهای روی ژنوتیپهای اتیوپی گیاه علوف‌ای خلر با استفاده از نشانگر EST-SSR مشاهده شد که میانگین شاخص نشانگری برای هر آغازگر 45/0 بدست آمد (Shiferaw et al., 2012).
تصویری از دندروگرام گروهبندی ژنوتیپها با استفاده از نشانگرهای ISJ در شکل 1 نشان داده شده است. در ضریب تشابه 70/0، ژنوتیپهای خلر مطالعه شده به 5 گروه اصلی تقسیم گردید. گروه اول بیست‌وسه ژنوتیپ، گروه دوم شش ژنوتیپ، گروه سوم دو ژنوتیپ و گروه چهارم و پنجم هرکدام یک ژنوتیپ را به خود اختصاص دادند. گروه اول شامل ژنوتیپهایی از ایکاردا و بنگلادش است. قرار گرفتن هر چهار ژنوتیپ بنگلادش در این گروه با منشأ جغرافیایی مطابقت دارد. مبادله و جابجایی بذور را میتوان یک دلیل احتمالی مبنی بر قرار گرفتن این ژنوتیپها در کنار دیگر ژنوتیپهای ایکاردا در یک گروه دانست. ژنوتیپهای 1928 (نپال) و 1327 (ایکاردا) با ضریب تشابه 89/0 بیشترین شباهت ژنتیکی را باهم داشتند. کمترین شباهت ژنتیکی در گروه ژنوتیپهای بنگلادشی با ضریب تشابه 79/0 مربوط به دو نمونه 2329 و 2177 بود. تفاوت در میزان شباهت این ژنوتیپها را میتوان تا حدودی ناشی از منشا هرکدام از این ژنوتیپها دانست. تعدادی از ژنوتیپهای ایکاردا نیز با درصد متفاوت شباهت ژنتیکی در این گروه قرار گرفتند.
در گروه دوم قرار گرفتن ژنوتیپهای از ایکاردا، اسلواکی، اتیوپی و ترکیه در این گروه قابل‌توجه است. در ژنوتیپهای اتیوپی دو ژنوتیپ 463 و 478 با ضریب تشابه 86/0 بیشترین ضریب تشابه را دارا بودند که احتمالا به دلیل منشأ جغرافیایی یکسان است. ژنوتیپ 3 (ترکیه) بالاترین شباهت ژنتیکی را با ژنوتیپ 1928 (نپال) با ضریب تشابه 78/0 داشت. ژنوتیپ اسلواکی بالاترین شباهت ژنتیکی را با ضریب تشابه 78/0 با ژنوتیپ 1327 ایکاردا داشت. گروههای سوم، چهارم همگی ژنوتیپهای ایکاردا هستند که در گروههای مختلف قرار گرفتند. قرار گرفتن این ژنوتیپها در گروههای مختلف را احتمالاً ناشی از آن دانست که منشأ اولیه آنها از مناطق مختلفی است که در این مرکز بینالمللی جمع شدهاند و یا آنکه حاصل تلاقیهایی با والد مشترک باشند. گروه پنجم و آخرین گروه که ژنوتیپی از سوریه است دارای بیشترین اختلاف ژنتیکی با بقیه ژنوتیپها بود.
شکل 1- دندروگرام حاصل از تجزیه خوشهای بر مبنای روش UPGMA.
Figure 1- Dendrogram obtained from cluster analysis based on UPGMA method.
ژنوتیپ IF587 (ایکاردا) بیشترین شباهت ژنتیکی را با ضریب تشابه 67/0 با ژنوتیپ 1347 (ایکاردا) و کمترین شباهت ژنتیکی را با ضریب تشابه 42/0 با ژنوتیپ 1322 (ایکاردا) داشت. در پژوهشی توسط Ambade et al. (2015) روی 48 ژنوتیپ خلر با استفاده از نشانگرهای ISSR دیده شد که ژنوتیپهای مورد مطالعه در ضریب تشابه 61/0 به دو گروه تقسیم شدند و دو ژنوتیپ با RLK-637 و RLK-466 بیشترین شباهت را نشان دادند. تحلیل تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگرهای مولکولی توانست اکسیژن‌های دو گونه Latyrus cicera و Latyrus sativus را از همدیگر تفکیک نماید. همچنین در گونه Latyrus cicera میانگین فاصله ژنتیکی 167/0 و در گونه Latyrus sativus میانگین فاصله ژنتیکی 203/0 برآورد گردید (Almeida et al., 2013). در مطالعهای که توسط Vahabi et al. (2006) بر روی تنوع ژنتیکی تودههای بومی خلر ایران با استفاده از نشانگر تصادفی RAPD صورت گرفت دیده شد که در این تودهها تنوع ژنتیکی بالایی وجود دارد. Rafalski et al. (1997) در مطالعه خود میانگین ضرایب تشابه بین لاینهای اینبرد ذرت را 62/0 گزارش کردند. در مطالعه Przetakiewicz et al. (2002) این مقدار از 19/0 تا 61/0 متغیر بود. Gaweł et al.. (2002) میانگین شباهت بین ارقام گندم و تریتیکاله را با استفاده از آغازگرهای نیمهتصادفی 63/0 گزارش کردند. برای تعیین نحوه پراکنش نشانگرهای ISJ مورد استفاده در سطح ژنوم خلر و همچنین گروهبندی ژنوتیپهای مورد مطالعه ، تجزیه مختصات اصلی انجام گرفت. نتایج به‌دست‌آمده از تجزیه به مختصات اصلی نشان داد که سه مؤلفه اول درمجموع 65/74 درصد از تغییرات را توجیه میکند که سهم مؤلفه اول 81/69، مؤلفه دوم 65/2 و مؤلفه سوم 19/2 درصد تغییرات را به خود اختصاص داده است. نمودار دو بعدی نحوهی پراکندگی ژنوتیپها را در شکل2 به خوبی نشان میدهد. نتایج گروهبندی در نمودار دو بعدی مطابق گروهبندی در تجزیه کلاستر میباشد. سهم مؤلفه اول در توجیه تغییرات برای نشانگرهای ISJ تا حدودی زیاد است؛ این موضوع نشان دهنده این است که عمده این آغازگرها در یک یا چند قسمت محدود از ژنوم (نواحی ژن در ژنوم) تجمع یافته‌اند و در سطح ژنوم پراکنده نیستند (جدول3). در داده‌های مورفولوژیک برعکس داده‌های مولکولی، بهترین حالت زمانی است که بیشترین واریانس توسط تعداد کمی مؤلفه توجیه شود. در داده‌های مولکولی اگر دو یا سه مؤلفه اول حدود 20-10 درصد از تغییرات مربوط به نشانگرها را توجیه کنند، ازنظر آماری ممکن است برای نمایش گرافیکی مناسب نباشد، ولی ازنظر ژنتیکی نشان دهنده نمونه برداری مطلوب نشانگرها و پراکنش آنها در سطح کل ژنوم است. به‌عبارت‌دیگر، زمانی که تعداد صفات یا باندها به تعداد کمی مختصات کاهش یابد، به احتمال قوی مبین آن است که آغازگرهای مورد استفاده به‌طور صحیح انتخاب نشده‌اند و تعداد محدودی از کروموزوم‌ها را تحت پوشش قرار می‌دهند. درنتیجه نمی‌توانند افراد را از همدیگر به‌خوبی جدا کنند؛ اما اگر تعداد مؤلفهها زیاد باشد، آغازگرهای مورد استفاده، کروموزوم‌های بیشتری را تحت پوشش قرار می‌دهند و نشانگر به‌خوبی تنوع ژنتیکی افراد را تعیین میکند (Siahsar et al., 2010).
جدول 3- مقادیر ویژه، نسبت واریانس توجیه شده توسط هر مؤلفه و واریانس تجمعی حاصل از تجزیه به مختصات اصلی بر اساس نشانگرهای نیمهتصادفی.
Table 3- Eigen values, proportion of variance explained by each component and the cumulative variance of principle coordinate analysis based on semi-random markers.
|
واریانس توجیه شده Cumulative variance |
مقادیر ویژه Eigen values |
مؤلفههای اصلی Main components |
|
69.81 |
23.03 |
مؤلفه اول First component |
|
2.65 |
0.87 |
مؤلفه دوم Second component |
|
2.19 |
0.72 |
مؤلفه سوم Third component |
|
74.65 |
|
مجموع Total |
شکل 2- نمودار دو بعدی تجزیه به مختصات اصلی ژنوتیپهای خلر با نشانگرهای ISJ.
Figure 2- Two dimensional diagram for principal coordinate analysis in Lathyrus sativus, using ISJ markers.
این تحقیق اولین کاربرد نشانگرهای نیمه تصادفی اینترون-اگزونی در گیاه علوفهای مهم خلر در دنیا میباشد. درمجموع نتایج این تحقیق نشان داد که 20 آغازگر نیمهتصادفی دارای چندشکلی مورد استفاده در این مطالعه تا حدود قابل توجهی قادر به تمایز ژنوتیپهای خلر و قرار دادن آنها در گروه‌ها و زیرگروه‌های معین بودند؛ بر این اساس میتوان نتیجه گرفت که استفاده از آغازگرهای نیمهتصادفی روش مناسبی در ارزیابی و بررسی درجه شباهت و تفاوت‌های ژنوتیپهای خلر جهت مطالعات کاربردی اصلاح این گیاه در آینده باشد.
منابع
Almeida, NF, Leitao ST, Caminero C, Torres AM, Rubiales D, Patto MCV (2014). Transferability of molecular markers from major legumes to Lathyrus spp. for their application in mapping and diversity studies. Molecular Biology Reports 41: 269-283.
Ambade RL, Verma SK, Nanda HC, Nair SK, Verulkar SB (2015). Genetic diversity based on molecular markers in Grasspea (Lathyrus sativus L). Legume Research-An International Journal 38: 43-46.
Belaid Y, Chtourou-Ghorbel N, Marrakchi M, Trifi-Farah N (2006). Genetic diversity within and between populations of Lathyrus genus (Fabaceae) revealed by ISSR markers. Genetic Resources and Crop Evolution 53: 1413-1418.
Chtourou-Ghorbel N, Lauga B, Ben Brahim N, Combes D, Marrakchi M (2002). Genetic variation analysis in the genus Lathyrus using RAPD markers. Genetic Resources and Crop Evolution 49: 365-372.
Doyle JJ, Doyle GL (1990). Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13-15.
Hanbury C, White C, Mullan B, Siddique K (2000). A review of the potential of Lathyrus sativus L. and L. cicera L. grain for use as animal feed. Animal Feed Science and Technology 87: 1-27.
Hazhbari F, Rozbahan Y, Kafilzadeh F (1999). Chemical compound determination and digestibility of grasspea seeds (Lathyrus sativus L.) with in vivo method in mutton. Journal of Modares Agricultural Sciences and Technology 2: 83-88.
Ismaili A, Mojiri F (2013). Assessment of genetic diversity among Iranian Thymus kotschyanus accessions using semi-random markers. Biotechnology in Agricultural 12: 63-69 (In Farsi).
Keshavarz-Khoob MGh, Gharanjik Sh, Masoumiasl A, Abdollahi-Mandoalkani B (2015). Evaluation of diversity and genetic relationships among some grapevine cultivars using ISSR markers. Journal of Agricultural Biotechnology 7: 129-142 (In Farsi).
Manifesto MM, Schlatter A, Hopp, HE, Suárez EY, Dubcovsky J (2001). Quantitative evaluation of genetic diversity in wheat germplasm using molecular markers. Crop Science 41: 682-690.
Mohammadi S, Prasanna B (2003). Analysis of genetic diversity in crop plants-salient statistical tools and considerations. Crop Science 43: 1235-1248.
Mohammadnezhad A (1990). Grasspea agronomy. Zeitoon Journal 280: 60 (In Farsi).
Mojiri F, Ismaili A, Nazarian F, Madah Arefi H, Ahmadi H (2013). Study of genetic diversity of Iranian Thymus accessions, using ISJ semi-random markers. Journal of Agricultural Biotechnology 6: 147-162 (In Farsi).
Nowosielski J, Podyma W, Nowosielska D (2002). Molecular research on the genetic diversity of Polish varieties and landraces of Phaseolus coccineus L. and Phaseolus vulgaris L. using the RAPD and AFLP methods. Cellular and Molecular Biology Letters 7: 753-762.
Odonougue LS, Souza E, Tanksley SD, Sorrells ME (1999). Relationships among North American oat cultivars based on restriction fragment length polymorphism. Crop Science 34: 1251-1258.
Pejic I, Ajmone-Marsan P, Morgante M, Kozumplick V, Castiglioni P, Taramino G, Motto M (1998). Comparative analysis of genetic similarity among maize inbred lines detected by RFLPs, RAPDs, SSRs, and AFLPs. Theoretical and Applied Genetics 97: 1248-1255.
Przetakiewicz J, Nadolska-Orczyk A, Orczyk W (2002). The use of RAPD and semi-random markers to verify somatic hybrids between diploid lines of Solanum tuberosum L. Cellular and Molecular Biology Letters 7: 671-676.
Radwan SA, El-Koly AS, Sammour RH (2013). Genetic variation among accessions of Lathyrus inconspicuous L. as revealed by SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Acta Agriculturae Slovenica 101: 21-30.
Rafalski A, Gidzinska M, Wisniewska I (1997). PCR-based system for evalution of relationships among maize inbrebs. In: Tsaftaries AS (Eds), Genetics and Biotechnology of Maize and Sorghom. Society of Chemistry, Cambridge, UK, pp. 106-111.
Rastgar MA (2013). Agronomy of forage plants (2nd Eds). Brahmand Publisher, Tehran, Iran, pp. 512.
Sandgol H (1996). Introduction to Plant Breeding forage. Research Institute of Forests and Rangelands, Tehran, Iran, pp. 128.
Shiferaw E (2013). Development and cross-species amplification of grass pea EST-derived markers. African Crop Science Journal 21: 153-160.
Shiferaw E, Pe ME, Porceddu E, Ponnaiah M (2012). Exploring the genetic diversity of Ethiopian grass pea (Lathyrus sativus L.) using EST-SSR markers. Molecular Breeding 30: 789-797.
Siahsar BA, AllahDoo M, Shahsavand Hasani H (2010). Evaluation of Genetic Diversity of Tritipyrum, Triticale and wheat lines through RAPD and ISJ markers. Iran Journal of Field Crop Science 41: 555-568.
Vahabi A, Soloki M, Arzani A, EmamJomeh A (2006). Study of genetic diversity in grass pea (Lathyrus sativus L.) using RAPD markers. Proceeding of 1st National Congress of legums, Nov. 20-21, 2005, Mashhad, Iran. Pp. 602-604 (In Farsi).
Weining S, Langridge P (1991). Identification and mapping of polymorphisms in cereals based on the polymerase chain reaction. Theoretical and Applied Genetics 82: 209-216.
Assessment of genetic diversity among Lathyrus sativus L. genotypes, using semi-random intron-exon splice junction marker
Sohrabi M.A.1, Ismaili A.*2, Khademi K.3, Karimizadeh R.4
1 M.Sc. Student, Faculty of Agriculture, Lorestan University, Iran.
2 Associate Professor, Faculty of Agriculture, Lorestan University, Iran.
3 M.Sc., Agriculture and Natural Resources Research Centre of Lorestan Province, Iran.
4 Assistant professor, Dryland Agricultural Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Gachsaran, Iran.
Abstract
Grass pea (Lathyrus sativus L.), as one of the most important forage crop plants, has high content of protein and Laysin. In order to assess the genetic diversity of 33 genotypes of grass pea, 20 semi-random primers were used in the present study. DNA was extracted by CTAB method. The ISJ data were analyzed and 77% of IT bands and 81% of ET bands were polymorphic. The results showed that the average number of polymorphic bands per primer was 3.95 and the highest amount of polymorphic information content and marker index was belonged to ET18-6 primer. According to the Jaccard's similarity coefficient, the range of similarity among studied genotypes was varied from 0.42 to 0.89. Cluster analysis based on UPGMA method divided genotypes to 5 groups at cut of line in 0.71 similarity coefficient. The principle coordinates analysis showed that the first three components explained 74.65% of total variance indicating the restricted distribution of these ISJ markers at the grass pea genome. Present study is the first report on application of ISJ markers in grass pea, as important forage plant, which is hoped to be effective in the development of molecular breeding programs of this plant.
Keywords: classification, grass pea, markers ISJ, principle coordinates.
* نویسنده مسئول: احمد اسماعیلی تلفن: 06633400012 Email: ahmad_ismaili@yahoo.com
* Corresponding Author: Ismaili A. Tel: 06633400012 Email: ismaili.a@lu.ac.ir
)