فاکتورهای تاثیرگذار بر کارایی روش آگرواینجکشن برای بیان سیستمیک ژن خارجی در گیاه ذرت به‌واسطه ویروس موزائیک نیشکر

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه زابل

2 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زابل

3 دانشیار، گروه مهندسی بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان

4 دانشیار دانشکده کشاورزی دانشگاه زابل

5 Boyce Thompson Institute for Plant Research

چکیده

هدف: ذرت (Zea mays L.) یکی از مهمترین گیاهان زراعی در سراسر دنیا و از گیاهان مدل خانواده غلات است. استقرار و بهینه‌سازی یک سیستم بیان موقت ژن موفق در ذرت علاوه بر قابلیت استفاده در پروژه‌های خاموشی ژن یا تولید پروتئین‌های نوترکیب، می‌تواند موجب تسهیل مطالعات عملکرد ژن در این گیاه شود. پژوهش حاضر با هدف بهینه‌سازی سیستم بیان سیستمیک ژن به‌واسطه آگروباکتریوم در گیاه ذرت با استفاده از یک ناقل مبتنی بر ویروس موزائیک نیشکر انجام پذیرفت.
مواد و روش‌ها: برای این منظور از ژنوم ویروسی نوترکیب که در آن توالی رمزکننده پروتئین فلورسنت سبز (GFP)، در امتداد چهارچوب قرائت آزاد ویروس و در ناحیه بین توالی P1 و HC-Pro ویروس درج شده بود، استفاده شد. برای انتقال ژنوم ویروسی نوترکیب به گیاهان ذرت، از روش تزریق مستقیم آگروباکتریومی (آگرواینجکشن) به نواحی مریستمی گره کولئوپتیلی گیاهچه استفاده شد. کارایی دو سویه EHA105 و GV3101 باکتری Agrobacterium tumefaciens در انتقال ژنوم نوترکیب ویروس به سه واریته ذرت Iochief، Golden Bantam (ذرت شیرین) و B73 (ذرت دندان اسبی) در دو مرحله رشدی (گیاهچه‌های سه و هفت روزه) مورد مقایسه قرار گرفت. پس از ظهور علائم موزائیک ویروسی در گیاهان تلقیح شده، بیان ژن خارجی GFP با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت کانفوکال و همچنین RT-PCR در این گیاهان در مقایسه با گیاهان شاهد ارزیابی شد.
نتایج: ‏ نتایج حاصل از RT-PCR و میکروسکوپ فلورسنت کانفوکال، نشان داد که سویه GV3101 در مقایسه با سویه EHA105 به لحاظ آماری عملکرد بالاتری در انتقال ناقل نوترکیب به گیاهان ذرت دارد. همچنین در مقایسه واریته‌های مختلف ذرت، این روش در بیان پروتئین فلورسنت سبز در ذرت واریته گلدن‌بانتام به‌طور بسیار معنی‌داری موفق عمل نمود. اگرچه در مورد سویه EHA105 درصد گیاهچه‌های سه روزه ذرت شیرین گلدن‌بانتام که به‌طور موفق ناقل محتوی ژن خارجی‌ را دریافت و بیان نمودند بالاتر بود، اما در مورد سویه GV3101 تفاوت معنی‌داری میان گیاهچه‌های سه و هفت روزه مشاهده نشد.
نتیجه‌گیری: ذرت رقم گلدن‌بانتام و آگروباکتریوم سویه GV3101 در مراحل پیش از دوبرگی به‌عنوان یک سیستم مدل بهینه، سریع و کارآمد برای پروژه‌های تحقیقاتی بررسی عملکرد ژن و حوزه‌های پژوهشی مرتبط پیشنهاد می‌گردد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Factors influencing the efficiency of an agroinjection-mediated SCMV-based systemic heterologous gene expression system in maize

نویسندگان [English]

  • Mahdieh Sadeghian 1
  • Mahmood Solouki 2
  • jafar zolala 3
  • abbasali emamjomeh 4
  • Georg Jander 5
1 University of Zabol
2 Department of Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Zabol
3 Associate professor, Department of Biotechnology, Faculty of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
4 Associate professor, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Zabol, Zabol, Iran.
5 Boyce Thompson Institute for Plant Research
چکیده [English]

Objective
Maize (Zea mays L.) is a key cereal crop throughout the world and important model for plant genetics and biology. Establishment of an efficient transient gene expression system in maize facilitates plant functional genomics projects using gene silencing or heterologous protein overexpression strategies. The present study was aimed at optimizing an Agroinjection-mediated SCMV-based systemic heterologous gene expression system in maize.
Materials and methods
Recombinant DNA encoding sugarcane mosaic virus (SCMV) containing the coding sequence of green fluorescent protein between the protein 1 (P1) and helper component‐proteinase (HC‐Pro) cistrons, in‐frame with the viral open reading frame, was introduced into the meristematic tissue, above the coleoptilar node, of maize seedlings via a direct Agroinoculation procedure. The efficiency of Agrobacterium tumefaciens strains EHA105 and GV3101 in delivering the recombinant vector into three and seven-day old seedlings of three maize varieties, including sweet corn (Iochief and Golden Bantam varieties) and dent corn (inbred line B73), was examined. Expression of GFP transgene in symptomatic Agroinoculated plants was assessed by confocal fluorescent microscopy and RT-PCR in comparison with controls.
Results
Results of RT-PCR and confocal fluorescent microscopy revealed that: 1) A. tumefaciens GV3101 is significantly more successful in delivering the recombinant SCMV-based vector into maize plants than EHA105, 2) the percentage of GFP-expressing Golden Bantam plants is significantly higher than two other maize varieties, and 3) The effectiveness of growth stage of maize seedlings on the percentage of GFP expressing Agroinjected plants depends upon the interactions between Agrobacterium strain and maize genotype.
Conclusions
In conclusion, a combination of the Golden Bantam maize variety and A. tumefaciens strain GV3101 for direct Agroinjection of the SCMV-based vector into seedlings at the early two-leaf stage could be a fast and efficient system for investigating gene functions in maize.

کلیدواژه‌ها [English]

  • : Green Fluorescent Protein
  • Agroinjection
  • In-planta expression system
  • Viral vectors
Afzal S, Saleem M, Yasmin R et al. (2010) Pre and post cloning characterization of a beta-1, 4-endoglucanase from Bacillus sp. Mol Bio Res 37, 23–1717.
Akyol I, Comlekcioglu U, Kar B et al. (2009) Cloning of a xylanase gene xyn2A from rumen fungus Neocallimastix sp. GMLF2 in Escherichia coli and its partial characterization. Biologia 64, 664–670.
Beernink BM, Holan KL, Lappe RR, Whitham SA (2021) Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones. J Vis Exp 168, e62277.
Bhardwaj N, Kumar B, Verma P (2019) A detailed overview of xylanases: an emerging biomolecule for current and future prospective. Bioresour Bioprocess 6, 40.
Bilgin S, Ulusu Y, Kudug H, Gokce I (2018) Cloning, Expression and Characterization of Xylanase (xyn-akky1) from Bacillus subtilis in Escherichia coli. Sakarya Uni J Sci 22, 1508–1517.
Dhiman SS, Sharma J, Battan B (2008) Industrial applications and future prospects of microbial xylanases. Bio Resource 3, 1377–1402.
Engberg M, Hedemann S, Steenfeldt S, Jensen B (2004) Influence of whole wheat and xylanase on broiler performance and microbial composition and activity in the digestive tract. Poult Sci 83, 925–938.
Fajardo P, Pastrana L, Endez J et al. (2012) Effects of Feeding of Two Potentially Probiotic Preparations from Lactic Acid Bacteria on the Performance and Faecal Microflora of Broiler Chickens. The Sci World J 23, 1–9.
Glickman JF, Schmid A (2007) Farnesyl pyrophosphate synthase: real-time kinetics and inhibition by nitrogen-containing bisphosphonates in a scintillation assay. Assay Drug Dev Technol 5, 205–214.
Hristov AN, Oh J, Lee C et al. (2013) Mitigation of greenhouse gas emissions. In Gerber, PJ, Henderson, B and Makkar, HPS. Eds. Livestock production–a review of technical options for non-CO2 emissions. FAO Anim Prod Health Paper 177.
Jie H, Li Z, Wang P et al. (2017) A simple method based on Sanger sequencing and MS Word wildcard searching to identify Cas9-induced frameshift mutations. Lab Invest 97, 1500–1507.
Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680–685.
Laura R, Jarboe AB, Ping LB et al. (2012) Optimization of enzyme parameters for fermentative production of biorenewable fuels and chemicals. Comput Struct Biotechnol J 3, e10005.
Ma L, Aizhan R, Wang X et al. (2020) Cloning and characterization of low‑temperature adapted GH5‑CBM3 endo‑cellulase from Bacillus subtilis 1AJ3 and their application in the saccharification of switchgrass and coffee grounds. AMB Expr 10, 42.
Mao S, Lu Z, Zhang CH et al. (2013) Purification, characterization, and heterologous expression of a thermostable β-1, 3-1, 4-glucanase from Bacillus altitudinis YC-9. Appl Biochem Biotechnol 169, 960–975.
McCleary BV (2001) Analysis of feed enzymes. In: Enzymes in Farm Animal Nutrition, M.R. Bedford and G.G. Partridge (Eds.). CAB International, 406.
Miller GL (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal Chem 31, 426–428.
Moazeni S, Mohammadabadi MR, Sadeghi M et al. (2016) Association between UCP Gene Polymorphisms and Growth, Brreeding Value of Growth and Reproductive Traits in Mazandaran Indigenous Chicken. Open J Anim Sci 6, 1-8.
Mohammadifar A, Faghih Imani SA, Mohammadabadi MR, Soflaei M (2014) The effect of TGFb3 gene on phenotypic and breeding values of body weight traits in Fars native fowls. Agric Biotech J 5, 125-136 (In Persian).
Mohammadifar A, Mohammadabadi MR (2018) Melanocortin-3 receptor (mc3r) gene association with growth and egg production traits in Fars indigenous chicken. Malay Appl Biol 47, 85–90.
Mohammadifar A, Mohammadabadi MR (2017) The Effect of Uncoupling Protein Polymorphisms on Growth, Breeding Value of Growth and Reproductive Traits in the Fars Indigenous Chicken. Iran J Appl Anim Sci 7, 679-685.
Ndazigaruye G, Kim DH, Kang CH et al. (2019) Effects of Low-Protein Diets and Exogenous Protease on Growth Performance, Carcass Traits, Intestinal Morphology, Cecal Volatile Fatty Acids and Serum Parameters in Broilers. Anim 9, 226.
Osek M, Milczarek A, Janocha A, Świnarska R (2010) Effect of triticale as a partial or complete wheat and maize substitute in broiler chicken diets on growth performance, slaughter value and meat quality. Ann Anim Sci 10, 275–283.
Pastor FIJ, Gallardo O, Sanz-Aparicio J (2007) Xylanases: molecular properties and applications. In: Polaina J, MacCabe AP (eds) Industrial enzymes. Springer, 65–82.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Vasudevan R, Gale GAR, Schiavon AA et al. (2019) CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiol, 01401.
Wang J, Zhang H, Wu M, Tang C (2011) Cloning and sequence analysis of a novel xylanase gene, Auxyn10A, from Aspergillus usamii. Biotechnol Lett 33, 1029–1038.
Wang W, Yan-long J, Yi-chun L et al. (2018) Impact of different promoters, promoter mutation, and an enhancer on recombinant protein expression in CHO cells. Sci Report 7, 10416.
Yadav P, Maharjan J, Korpole S et al. (2018) Production, Purification, and Characterization of Thermostable Alkaline Xylanase From Anoxybacillus kamchatkensis NASTPD13. Bioeng Biotechnol 6, 65.