بیان اختصاصی ژن اکسندین-4 متصل به زیرواحد B سم وبا (CTB) در ریشه هویج ( Daucus carota L.) تحت تنظیم راه انداز MLL

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشیار بیوتکنولوژی گیاهی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران

2 کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی گیاهی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران

3 دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی گیاهی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران

10.22103/jab.2023.21290.1473

چکیده

هدف: اکسندین-4 (Ex4) یک پپتید 39 اسید آمینه‌ایی است که از ترشحات بزاق مارمولک هلودرما سوسپتوم جدا شده و دارای عملکرد زیستی مشابه با گیرنده شبه‌گلوکان (GLP-1) می‌باشد. مهمترین نقش فیزیولوژیکیGLP-1 تنظیم متابولیسم گلوکز از طریق کاهش ورود گلوکز به سلول‌ها است. اتصال Ex4 به زیر واحد B سم وبا (CTB) باعث افزایش کارایی آن از طریق اتصال به پذیرنده سلول‌های اپیتلیال روده می‌شود. گیاهان تراریخت می‌توانند به‌عنوان کارخانه‌های تولید پروتئین‌های نوترکیب به‌کار روند، برای به حداکثر رساندن کارآیی گیاهان تراریخت می‌توان بیان ژن‌های خارجی را از نظر زمانی و مکانی تحت تنظیم راه‌اندازهای مختلف تنظیم نمود. به‌منظور بیان اختصاصی ژن CTBEx4 در بافت ریشه هویج، راه‌انداز (MLL) Major Latex-Likeمربوط به بیان اختصاصی در ریشه غده‌ایی چغندر قند جایگزین راه‌انداز CaMV35S در سازه pBI121 شد و برای تراریختی ریز‌نمونه‌های گیاه هویج به‌کار گرفته شد.
مواد و روش‌ها: با استفاده از روش CTAB از برگ‌های گیاه چغندر قند DNA استخراج شد سپس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی راه‌انداز MLL واکنش PCR انجام گرفت. قطعه به‌دست آمده با استفاده از آنزیم‌های برشی جایگزین راه‌انداز CaMV35S در سازه pBI121 شد. از دو سازه pBI121-Mll-CTBEx4 و pBI121-CamV35S-CTBEx4، با استفاده از باکتری Agrobacterium tumefaciens برای تراریخت کردن ریزنمونه‌های هویج استفاده شد. ریز‌نمونه‌های تراریخت شده در محیط کشت MS درون شیشه از طریق باززایی غیرمستقیم به گیاه کامل باززا شدند و سپس به محیط گلدان انتقال یافتند. در نهایت بیان ژن CTBEx4 در گیاهان تراریخت شده در سطح mRNA و پروتئین با استفاده از آزمون‌های RT-PCR و ELISA اندازه‌گیری شد.
نتایج: نتایج بررسی بیان ژن با روش‌های RT-PCR و ELISA حاکی از بیان ژن CTBEx4 در بافت ریشه هویج تحت تنظیم راه-انداز MLL بود در حالیکه هیچ بیانی در بافت برگ مشاهده نشد. همچنین نتایج نشان داد که ژن CTBEx4 تحت تنظیم راه‌انداز CaMV35S در هر دو بافت ریشه و برگ بیان شد اما بیان آن در ریشه نسبت به بیان تحت تنظیم راه‌انداز MLL کمتر بود (30%). نتایج به‌دست آمده حاکی از توانایی راه‌انداز MLL برای بیان اختصاصی ژن CTBEx4 در ریشه گیاه هویج بود.
نتیجه گیری: راه‌انداز MLL قادر به بیان ژن CTBEx4 در ریشه گیاه هویج در سطح mRNA و پروتئین بود، همچنین پروتئین CTBEx4 تحت تنظیم راه‌انداز MLL در مقایسه با راه‌انداز CaMV35S دارای مقدار بیان بیشتری بود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Specific expression of exendin-4 gene in carrot root (Daucus carota L.) under regulation of MLL promoter

نویسندگان [English]

  • Bahman Bahramnejad 1
  • Neda Zandinava 2
  • Hemn Salehi 3
1 Associate professor in Plant Biotechnology, Department of Plant Production and Genetics, Faculty of Agriculture, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran
2 Department of Plant Production and Genetics, Faculty of Agriculture, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran.
3 Department of Plant Production and Genetics, Faculty of Agriculture, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran.
چکیده [English]

Abstract
Objective
Exendin-4 (Ex4) is a 39-amino acid peptide isolated from the salivary secretions of the lizard Heloderma susceptum and it has similar biological function as glucan-like peptide (GLP-1) receptor. The most important physiological role of GLP-1 is to regulate the amount of glucose metabolism by reducing the entry of glucose into the cells. Transgenic plants can be used as factories for the production of recombinant proteins. In order to maximize the efficiency of transgenic plants, the expression of foreign genes can be regulated in terms of time and place under the regulation of different promoters. Considering the nutritional value of carrot tuber and its fresh consumption, in this study, CTBEx4 gene was expressed in carrot plant using a root-specific promoter. In this study, in order to specifically express the CTBEx4 gene in carrot root, the Major Latex-Like promoter (MLL) related to the specific expression in sugar beet storage root tissue was replaced by the CaMV35S promoter in the pBI121 construct and were used for the transformation of carrot explants.
Materials and methods
Using the CTAB method, DNA was extracted from the leaves of the sugar beet plant, then the PCR reaction was performed using specific MLL primers. The obtained fragment was replaced by the CaMV35S promoter in the pBI121 construct using restriction enzymes. Both pBI121-Mll-CTBEx4 and pBI121-CamV35S-CTBEx4 constructs were used to transform carrot leaf explants using Agrobacterium tumefaciens bacteria. Transgenic explants were indirectly regenerated into plants in MS culture media in vitro and then transferred to pot. Finally, the CTBEx4 gene expression of the transgenic plants was analyzed at mRNA and protein levels using RT-PCR and ELISA.
Results
The results of the expression analysis using RT-PCR and ELISA methods indicated that the expression of CTBEx4 gene in carrot root tissue was regulated by MLL promoter, while no expression was observed in leaf tissue. Also, the results showed that the CTBEx4 gene was expressed under CaMV35S promoter regulation in both root and leaf tissues, but its expression in roots was lower (30%) than that under MLL promoter regulation. The obtained results indicated the ability of the MLL promoter to specific expression the CTBEx4 gene in the roots of carrot plants.
Conclusions
The MLL promoter was able to express the CTBEx4 gene in the root tissue of carrot plants at the mRNA and protein level, Also, CTBEx4 protein under MLL promoter had higher expression level compared to CaMV35S promoter.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Exendin-4
  • constant expression
  • MLL promoter
  • CTB
جعفری احمدآبادی سید علی اصغر، عسکری‌همت حشمت‌اله، محمدآبادی محمدرضا (1402) تاثیر شاهدانه بر بیان ژن DLK1 در بافت‌ قلب بره‌های کرمانی. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی، 15(1)، 234-217.
شکری سمیرا، خضری امین، محمدآبادی محمدرضا، خیرالدین حمید (1402) بررسی بیان ژن MYH7  در بافت‌های ران، دست و راسته بره‌های پرواری نژاد کرمانی. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی، 15(2)، 236-217.
References
Amack SC, Antunes MS (2020) CaMV35S promoter–A plant biology and biotechnology workhorse in the era of synthetic biology. Curr Plant Biol 1, e100179.
Androutsellis-Theotokis A, Walbridge S, Park DM et al. (2010) Cholera toxin regulates a signaling pathway critical for the expansion of neural stem cell cultures from the fetal and adult rodent brains. PLoS One 26, e10841.
Baranski R (2008) Genetic transformation of carrot (Daucus carota) and other Apiaceae species. Transgenic Plant J 2, 18-31.
Barazandeh A, Mohammadabadi MR, Ghaderi-Zefrehei M, Nezamabadi-Pour H (2016) Genome-wide analysis of CpG islands in some livestock genomes and their relationship with genomic features. Czech J Anim Sci 17, 487-495.
Bordbar F, Mohammadabadi M, Jensen et al. (2022) Identification of candidate genes regulating carcass depth and hind leg circumference in simmental beef cattle using Illumina Bovine Beadchip and next-generation sequencing analyses. Animals 25, 1103.
Chen L, Jiang B, Wu C et al. (2014) GmPRP2 promoter drives root-preferential expression in transgenic Arabidopsis and soybean hairy roots. BMC Plant Biol 14, 1-13.
Ekam VS, Udosen EO, Chigbu AE (2006) Comparative effect of carotenoid complex from Golden Neo-Life Dynamite (GNLD) and carrot extracted carotenoids on immune parameters in albino Wistar rats. Niger J Physiol Sci 21, 1-4.
Escalada FJ (2014) The physiology of glucagon-like peptide-1 and its role in the pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. Med Clin 143, 2–7. 
Fang RX, Nagy F, Sivasuramaniam S, Chua NH (1989) Multiple cis-regulatory elements for maximal expression of the Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter in transgenic plants.  Plant Cell 1, 141–150.
Furtado A, Henry RJ, Takaiwa F (2008) Comparison of promoters in transgenic rice. Plant Biotechnol J 6, 679-693.
Ghawana S, Paul A, Kumar H et al. (2011) An RNA isolation system for plant tissues rich in secondary metabolites. BMC Res Notes 4, 1-5.
Höfgen R, Lothar W (1988) Storage of competent cells for Agrobacterium transformation. Nucleic Acid Res 16, e9877.
Iorizzo M, Curaba J, Pottorff M et al. (2020) Carrot anthocyanins genetics and genomics: Status and perspectives to improve its application for the food colorant industry. Genes 7, e906.
Jafari Ahmadabadi SAA, Askari-Hemmat H, Mohammadabadi M (2023) The effect of Cannabis seed on DLK1 gene expression in heart tissue of Kermani lambs. Agric Biotechnol J 15, 217-234 (In Persian).
Jiang JX, Chen ZX, Zhou XP (2003) Production of a monoclonal antibody to sugarcane mosaic virus and its application for virus detection in China. J Phytopathol 151, 361-364.
Joung YH, Kamo K (2006) Expression of a polyubiquitin promoter isolated from Gladiolus. Plant Cell Rep 25, 1081-1088.
Kamo K, Blowers A, Smith F et al. (1995) Stable transformation of Gladiolus using suspension cells and callus. J Am Soc Hortic Sci 12, 347-352.
Kim ST, Cho KS, Jang YS, Kang KY (2001) Two‐dimensional electrophoretic analysis of rice proteins by polyethylene glycol fractionation for protein arrays. Electrophoresis 22, 2103-2109.
Kloos DU, Oltmanns H, Dock C et al. (2002) Isolation and molecular analysis of six taproot expressed genes from sugar beet. J Exp Bot 53, 1533–1534.
Kokei S, Bahramnejad B (2020) Transient Expression of CTB-Exendin Fused Genes in Nicotiana tabacum via Agrobacterium tumefaciens. J Agric Sci Technol 22, 1603-1612.
Kwon KC, Nityanandam R, New JS, Daniell H (2013) Oral delivery of bioencapsulated exendin‐4 expressed in chloroplasts lowers blood glucose level in mice and stimulates insulin secretion in beta‐TC 6 cells. Plant Biotechnol J 11, 77-86.
Li Y, Sun Y, Yang Q (2012) Cloning and function analysis of an alfalfa (Medicago sativa L.) zinc finger protein promoter MsZPP. Mol Biol Rep 39, 8559–8569.
Lindh I, Wallin A, Kalbina I et al. (2009) Production of the p24 capsid protein from HIV-1 subtype C in Arabidopsis thaliana and Daucus carota using an endoplasmic reticulum-directing SEKDEL sequence in protein expression constructs. Protein Expr Purif 66, 46-51.
Luchakivskaya Y, Kishchenko O, Gerasymenko I (2011) High-level expression of human interferon alpha-2b in transgenic carrot (Daucus carota L.) plants. Plant Cell Rep 30, 407-415.
Maestro MA, Molnar F, Carlberg C (2019) Vitamin D and its synthetic analogs. J Med Chem 27, 6854-6875.
Masoudzadeh SH, Mohammadabadi MR, Khezri A et al. (2020) Dlk1 gene expression in different Tissues of lamb. Iran J Appl Anim Sci 10, 669-677.
Merlin M, Gecchele E, Capaldi S (2014) Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective. BioMed Res Int 2014, 1-14
Mohammadabadi M, Masoudzadeh SH, Khezri A et al. (2021) Fennel (Foeniculum vulgare) seed powder increases Delta-Like Non-Canonical Notch Ligand 1 gene expression in testis, liver, and humeral muscle tissues of growing lambs. Heliyon 7, e08542
Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15, 473-497.
Nityanandam R (2011) Expression and functional evaluation of exendin 4 fused to cholera toxin B subunit in tobacco chloroplast to treat type 2 diabetes. McS thesis, University of Central Florida. 19-29.
Oltmanns H, Kloos DU, Brie W, et al. (2006) Taproot promoters cause tissue specific gene expression within the storage root of sugar beet. Planta 224, 485-495.
Sambrook J, Russell DW (2006) Transformation of E. coli by electroporation. Cold Spring Harb Protoc 2006, 3933.
Shokri S, Khezri A, Mohammadabadi M, Kheyrodin H (2023). The expression of MYH7 gene in femur, humeral muscle and back muscle tissues of fattening lambs of the Kermani breed. Agric Biotechnol J 15, 217-236 (In Persian).
Song HC, Yang YX, Lan QG, Cong W (2023) Immunological effects of recombinant Lactobacillus casei expressing pilin MshB fused with cholera toxin B subunit adjuvant as an oral vaccine against Aeromonas veronii infection in crucian carp. Fish Shellfish Immunol 139, 108934.