مهندسی و تولید پروتئین ریسین نوترکیب با هدف تولید ایمونوتوکسین موثر

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی ، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

2 استاد ژنتیک و اصلاح نباتات گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد

3 دانشیار، گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

4 استاد، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

5 گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد

10.22103/jab.2024.23650.1578

چکیده

متابولیت ریسین یک گلیکوپروتئین سمی است که در آندوسپرم گیاه کرچک یافت می‌شود. این پروتیین شامل دو زنجیره A با 267آمینواسید (32کیلودالتون) و زنجیرهB با 262آمینو اسید (34کیلودالتون) می‌باشد که بوسیله پیوند دی سولفیدی به هم متصل هستند. حساسیت سلول‌های سرطانی به ریسین به دلیل بیان بیشتر گلیکوپروتئین‌های موجود در سطح سلول‌های سرطانی است. سمیت آنزیم ریسین در از بین بردن سلول‌ها سبب شد که این آنزیم به عنوان مهمترین انتخاب در تولید ایمونوتوکسین‌ها بکار گرفته شود. با این‌حال، توانایی پایین ریسین در ورود به سلول هدف با استفاده از مسیر دستگاه گلژی، سبب بالا رفتن سمیت سلولی شده، که این نقص، استفاده از آن را در ایمونوتوکسین‌ها تحت تأثیر قرار داده است. این پژوهش با هدف مهندسی پروتئین ریسین به منظور افزایش بارالکتریکی سطحی پروتئین و تسهیل ورود ریسین به داخل سلول از طریق مسیر اندوزومیک و کاهش اثر سمیت سلولی صورت پذیرفت.
مواد و روش‌ها: وضعیت ساختاری پروتئین ریسین با ایجاد جهش‌های R134A، L214A، R31A ، P250A و در مقایسه با نمونه طبیعی این آنزیم با استفاده از مطالعات ترمودینامیکی مورد بررسی قرار گرفت. سپس توالی ژنی مربوط به نسخه جهش‌یافته، سنتز و با استفاده از وکتور بیانی pET22b(+) در فضای پیروپلاسمی سلولی باکتری اشریشیاکلی BL21(DE3) بیان شد. خالص‌سازی با استفاده از ستون Ni-NTA انجام و سپس عملکرد پروتئین بر رده سلول‌‌های سرطانی پوست A431 با استفاده از آزمون سمیت سلولی مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: جهش‌های ایجاد شده به شکل چشمگیری سبب افزایش بارالکتریکی سطحی پروتئین شده است. مقایسه آنالیز نمودارهای RMSD (انحراف جذر میانگین مربعات)، RMSF (نوسانات جذر میانگین مربعات) و Rg (شعاع ژیراسیون) بین نمونه طبیعی و موتانت مشخص کرد که جهش‌ها هیچ تأثیر معنی‌داری بر ساختار اصلی پروتئین ندارد. تأیید تولید و خالص سازی پروتئین نوترکیب ریسین در دیواره سلولی با وزن مولکولی حدود 33 کیلودالتون با استفاده از ژل SDS-PAGE انجام شد. این فرم نوترکیب نسبت به فرم طبیعی از وزن مولکولی کمتری برخوردار است. نتایج سمیت سلولی نشان داد که پروتئین ریسین موتانت قادر است در غلظت ng/mL 300 سبب مرگ سلولی سلول‌های سرطانی A431 گردد.
نتیجه‌گیری: نتایج In silico و In vitro بدست آمده در این مطالعه بر روی پروتئین ریسین نشان داد که ایجاد جهش‌های هدفمند به منظور افزایش بارالکتریکی سطحی پروتئین‌ می‌تواند به شکل مؤثری سبب بهبود عملکرد پروتئین گردد. از این‌رو، پروتئین ریسین موتانت (R134A، L214A، P250A وR31A) با قابلیت ورود سلولی بیشتر و سمیت کمتر برای سلول‌ها‌ی هدف، قابلیت خوبی به عنوان توکسین در تولید ایمونوتوکسین‌ها دارد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Engineering and production of recombinant ricin protein with the aim of producing effective immunotoxin

نویسندگان [English]

  • Abdolla Rahmani 1
  • Seyed Hasan Marashi 2
  • Nasrin Moshtaghi 3
  • Mohammad Reza Nassiry 4
  • Amin Mirshamsi Kakhki 1
  • Hamid Ariannezhad 5
1 Department of Biotechnology and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad
2 Department of Biotechnology and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
3 Associate Professor, Department of Biotechnology and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
4 Professor, Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
5 Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, P. O. Box: 91775-1163, Iran
چکیده [English]

Aim
Ricin is a globular glycoprotein poison found in the endosperm of the castor plant. This protein consists of two A chains with 267 amino acids (32 kilo Daltons) and a B chain with 262 amino acids (34 kilodaltons), connected by a disulfide bond. The sensitivity of cancer cells to ricin is due to the higher expression of glycoproteins on the surface of cancer cells. The toxicity of the ricin enzyme in destroying cells caused this enzyme to be used as the most important candidate in the production of immunotoxins. However, the low ability of ricin to enter the target cell using the Golgi apparatus has caused increased cytotoxicity, which affected its use as an immunotoxin. This research was carried out with the aim of engineering ricin protein to increase the surface charge of the protein and facilitate the entry of ricin into the cell through the endosomal route and reduce the effect of cytotoxicity.
Methods
Therefore, the structural status of ricin protein with R134A, L214A, R31A, and P250A mutations was investigated using thermodynamic studies. Then, the gene sequence related to the mutant version was synthesized and expressed using the expression vector pET22b(+) in the cell wall of Escherichia coli BL21(DE3). Purification was done using a Ni-NTA column, and then the function of the protein on class A431 cancer epithelial cells was evaluated using a cytotoxicity test.
Results
The obtained results showed that the considered mutations significantly increased the surface charge of the protein. Also, comparing the analysis of Root Mean Square Deviation (RMSD), root-mean-square fluctuations (RMSF) and Radius of gyration (Rg) graphs between the natural sample and the mutant showed that the mutations have no significant effect on the main structure of the protein. Confirmation of the production and purification of recombinant ricin protein in the cell wall with a molecular weight of about 33 kilodaltons was done using SDS-PAGE gel. Cytotoxicity results showed that mutant ricin protein can cause cell death of A431 cancer cells at a concentration of 300 ng/ml.
Conclusion
In silico and In vitro results on ricin protein showed that creating targeted mutations to increase protein surface charge can improve protein performance. Therefore, mutant ricin protein (R134A, L214A, P250A, and R31A) with greater cell penetration and less toxicity for target cells has a high ability to be used as a toxin in the production of immunotoxins.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Ricin
  • cytotoxicity
  • recombinant protein
  • cancer

مراجع

Abraham MJ, Murtola T, Schulz R, et al. (2015) GROMACS: high performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers. Software X 1-2, 19-25.
Aier I, Varadwaj P, Raj U (2016) Structural insights into conformational stability of both wild-type and mutant EZH2 receptor. Sci Rep 6, 34984.
Allahyari H, Heidari S, Ghamgosha M, et al. (2017) Immunotoxin: A new tool for cancer therapy. Tumor Bio 39, e2.
Antignani A, FitzGerald D (2013) Immunotoxins: The Role of the Toxin. Toxins 5(8), 1486-1502.
Azemar M, Djahansouzi S, Jager E, et al. (2003) Regression of cutaneous tumor lesions in patients intratumorally injected with a recombinant single-chain antibody-toxin targeted to ErbB2/HER2. Breast Cancer Res Treat 82, 155–64.
Berendsen HJC, Postma JPM, van Gunsteren WF, et al. (2010) Interaction Models for Water in Relation to Protein Hydration. In: Pullman, B. (eds) Intermolecular Forces. The Jerusalem Symposia on Quantum Chemistry and Biochemistry, 1981; vol 14. Springer, Dordrecht.
Berger EA, Pastan I (2010) Immunotoxin complementation of HAART to deplete persisting HIV-infected cell reservoirs. PLoS Pathog 6, e1000803.
Bortolotti M, Polito L; Bolognesi A (2022) Toxin and Immunotoxin Based Therapeutic Approaches. Toxins 14, e63.
Bradford, M (1976). "A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding". Analytical Biochemistry. 72 (1–2): 248–254.Carrio MM, Cubarsi R, Villaverde A (2000) Fine architecture of bacterial inclusion bodies. FEBS Lett 471, 7–11.
Casellas P, Brown JP, Gros O (1982) Human melanoma cells can be killed in vitro by an immunotoxin specific for melanoma-associated antigen p97. Int J Cancer 30(4), 437–443.
Chen B, Le W, Wang Y, et al. (2016) Targeting Negative Surface Charges of Cancer Cells by Multifunctional Nanoprobes. Theranostics 6(11), 1887-1198.
Chen LC, Chiang WD, Chen WC, et al. (2012) Influence of alanine uptake on Staphylococcus aureus surface charge and its susceptibility to two cationic antibacterial agents, nisin and low molecular weight chitosan. Food Chem 135(4), 2397-2403.
Das U, Shuman S (2014) Mechanism of RNA 2',3'-cyclic phosphate end healing by T4 polynucleotide kinase-phosphatase, Nucleic Acids Res 1, 355-365.
Day PJ, Pinheiro TJ, Roberts LM, et al. (2002) Binding of ricin A-chain to negatively charged phospholipid vesicles leads to protein structural changes and destabilizes the lipid bilayer. Biochemistry 41, 2836-2843.
Dillekås H, Rogers MS, Straume O (2019) Are 90% of deaths from cancer caused by metastases? Cancer Med 8(12), 5574-5576.
Eswar N, Webb B, Marti-Renom MA, et al. (2006) Comparative protein structure modeling using Modeller. Curr Protoc Bioinformatics Chapter 5, Unit 5-6.
Fröhlich E (2012) The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. Int J Nanomedicine 7, 5577-5591.
Gilabert-Oriol R, Weng A, Mallinckrodt B, et al. (1014) Immunotoxins constructed with ribosome-inactivating proteins and their enhancers: a lethal cocktail with tumor specific efficacy. Curr Pharm Des 20(42), 6584-643.
Groth C, van Groningen LFJ, Matos TR, et al. (2019) Phase I/II trial of a combination of anti-CD3/CD7 immunotoxins for steroid-refractory acute graft-versus-host disease. Biol Blood Marrow Transplant 25, 712-219.
Kim Y, Robertus JD (1992) Analysis of several key active site residues of ricin A chain by mutagenesis and X-ray crystallography. Protein Eng 5(8), 775-9.
Kreitman RJ, Wilson WH, White JD, et al. (2000) Phase I trial of recombinant immunotoxin anti-Tac(Fv)-PE38 (LMB-2) in patients with hematologic malignancies. J Clin Oncol 18, 1622-1636.
Krishna BA, Spiess K, Poole EL, et al. (2017) Targeting the latent cytomegalovirus reservoir with an antiviral fusion toxin protein. Nat Commun 8, e14321.
Krolick KA, Uhr JW, Slavin S (1982) In vivo therapy of a murine B cell tumor (BCL1) using antibody-ricin A chain immunotoxins. J Exp Med 155(6), 1797-1809.
Kumar O, Sugendran K, Vijayaraghavan R (2003) Oxidative stress associated hepatic and renal toxicity induced by ricin in mice. Toxicon 41, 333-338.
Lancaster L; Lambert NJ, Maklan EJ, et al. (2008) The sarcin-ricin loop of 23S rRNA is essential for assembly of the functional core of the 50S ribosomal subunit. RNA  14, 1999-2012.
Laskowski RA, MacArthur MW, Moss DS, et al. (1993)  PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J Appl Cryst 26, 283-291.
MacKerell AD, Banavali N, Foloppe N (2001) Development and current status of the CHARMM force field for nucleic acids. Biopolymers 56(4), 257-65.
Moshiri M, Hamid F, Etemad L. (2016) Ricin Toxicity: Clinical and Molecular Aspects. Rep Biochem Mol Biol 4(2), 60-65.
Naemi AA, Salmanian AH, Noormohammadi Z, et al. (2023) A novel EGFR-specific recombinant ricin-panitumumab (scFv) immunotoxin against breast and colorectal cancer cell lines; in silico and in vitro analyses. Eur J Pharmacol 955, e175894.
Park SG, Kim H, Jun H (2022) Directing ricin-based immunotoxins with targeting affibodies and KDEL signal peptide to cancer cells effectively induces apoptosis and tumor suppression. J Nanobiotechnol 20, e387.
Polito L, Bortolotti M, Pedrazzi M, et al. (2011) Immunotoxins and other conjugates containing saporin-s6 for cancer therapy. Toxins (Basel) 3(6), 697-720.
Rust A, Hassan HH, Sedelnikova S, et al. (2015) Two complementary approaches for intracellular delivery of exogenous enzymes. Sci Rep 24(5), e12444.
Sausville EA, Headlee D, Stetler-Stevenson M, et al. (1995) Continuous infusion of the anti-CD22 immunotoxin IgG-RFB4-SMPT-dgA in patients with B-cell lymphoma: a phase I study. Blood 85, 3457-3465.
Shafiee F, Aucoin MG, Jahanian-Najafabadi A (2019) Targeted diphtheria toxin-based therapy: a review article. Front Microbiol 10, e2340.
Shapira A, Benhar I (2010) Toxin-based therapeutic approaches. Toxins 2, 2519-2583.
Singh A, Upadhyay V, Upadhyay AK (2015) Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microb Cell Fact 14, e41.
Słomińska-Wojewódzka M, Sandvig K (2013) Ricin and ricin-containing immunotoxins: Insights into intracellular transport and mechanism of action in vitro. Antibodies 2, 236-269.
Sokołowska I, Wälchli S, Węgrzyn G, et al. (2011) A single point mutation in ricin A-chain increases toxin degradation and inhibits EDEM1-dependent ER retrotranslocation. Biochem J 436(2), 371-385.
Taghizadegan N, Firozrai M, Nassiri M, et al. (2020) Use of molecular dynamic tools in engineering of onconase enzyme to increase cellular uptake and evade RI. Int J Pept Res Ther 26, 737-743.
Thorpe PE, Brown AN, Ross WC (1981) Cytotoxicity acquired by conjugation of an anti-Thy1.1 monoclonal antibody and the ribosome-inactivating protein, gelonin. Eur J Biochem 116(3), 447-454.
Wayne AS, Fitzgerald DJ, Kreitman RJ, et al. (2014) Immunotoxins for leukemia. Blood 123, 2470-2477.
Wilkins DK, Mayer A (2006) Development of antibodies for cancer therapy. Expert Opin Biol Ther 6, 787-796.
Yoshida T, Chen CC, Zhang MS, et al. (1991) Disruption of the Golgi apparatus by brefeldin A inhibits the cytotoxicity of ricn, modeccin, and Pseudomonas toxin. Exp Cell Res 192, 389-395.
Zhao P, Wang P, Dong S, et al. (2019) Depletion of PD-1-positive cells ameliorates autoimmune disease. Nat Biomed Eng 3, 292-305.
Zhu Q, Jiang L, Wang X (2017) The expression of Duffy antigen receptor for chemokines by epithelial ovarian cancer decreases growth potential. Oncol Lett 13(6), 4302-4306.
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی
دوره 16، شماره 4
دی 1403
صفحه 121-138

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار