شناسایی و اعتبارسنجی نشانگرهای توالی ساده تکراری (SSRs) عقرب آندراکتونوس کراسیکودا (Androctonus crassicauda) با استفاده از داده‏های RNA seq

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری ژنتیک و اصلاح نژاد دام، گروه علوم دامی –دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی -دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان-ملاثانی-ایران

2 دانشیار گروه علوم دامی ، ;دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی -دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان-ملاثانی-ایران

3 گروه علوم دامی –دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی -دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان

4 استادیار سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی شعبه اهواز، گروه جانوران سمی و تولید پادزهر،

چکیده

هدف: نشانگرهای توالی ساده تکراری (SSR) یا ریزماهواره ها به دلیل پوشش مناسب ژنومی و تکرارپذیری بالا یکی از بهترین و کاملترین ابزارهای مولکولی در بررسی تنوع ژنتیکی به شمار می‏آیند. نشانگرهای توالی ساده تکراری برای عقرب آندراکتونوس کراسیکودا تاکنون گزارش نشده اند. لذا این مطالعه با هدف شناسایی و اعتبار سنجی نشانگرهای توالی ساده تکراری مربوط به عقرب اندراکتونوس کراسیکودا با استفاده از داده‌های RNA-Seq انجام شد.
مواد و روش ها: پس از استخراج RNA از غده زهر عقرب، ارزیابی کیفی و کمی انجام گرفت. سپس نمونه ها با پلتفورم Illumina HiSeq 2000 توالی‏یابی شدند. برای ویرایش داده‏های خام و رسیدن به دقت و صحت بالاتر از نرم‏افزارTrimmomatic )نسخه 0.36 ( استفاده شد. بازسازی رونوشت‏ها به روش De novo با استفاده از نرم افزار Trinity انجام شد. در ادامه به منظور شناسایی نشانگرهای SSR جدید، ترانسکریپتوم عقرب آندراکتونوس کراسیکودا با استفاده از نرم افزار FullSSR (نسخه 1.5) مورد انالیز قرار گرفت. به منظور اعتبارسنجی نشانگرهای SSR شناسایی شده، 8 جفت پرایمر توسط نرم افزار PRIMER 3 طراحی و با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز بر روی 60 نمونه DNA استخراج شده از بافت عقرب مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج: سرهم‌بندی رونوشت‌ها توسط برنامه Trinity، در مجموع 744804 ترانسکریپت و 563526 یونی ژن ایجاد کرد. در این مطالعه، بررسی 952725توالی به وسیله نرم‌افزار FullSSR ، منجر به شناسایی تعداد 315395 نشانگر SSR شد. در میان SSRها، تکرارهای دو و سه نوکلئوتیدی به ترتیب با 85/71 درصد و 36/22 درصد بیشترین تعداد تکرار را به خود اختصاص دادند. از 8 جایگاه مورد بررسی 2 جایگاه چندشکلی را نشان داد. هتروزیگوسیتی مورد انتظار و مشاهده شده برای جایگاه RK1354 به ترتیب 765/0 و 683/0 و همچنین برای جایگاه NK1362 به ترتیب 768/0 و 633/0 محاسبه شد. آماره شاخص تثثبیت (Fis) برای هر دو جایگاه تقریبا 1/0 بود که نشاندهنده همخونی کم در جمعیت است. بعلاوه، آزمون کای مربع نشان داد که جمعیت برای هر دو جایگاه در تعادل هاردی-‏وینبرگ قرار ندارد.
نتیجه گیری: نتایج ارزیابی معیار‌های مختلف تنوع ژنتیکی همگی گویای این است که جمعیت از تنوع بالایی برخوردار است اما عواملی در حال کاهش تنوع در بین جمعیت مورد مطالعه هستند. به طوری که جمعیت از تعادل خارج شده است و تعداد هتروزیگوت های مشاهده شده کمتر از هتروزیگوت های مورد انتظار شده است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Identification and validation of simple sequence repeats (SSRs) Markers for Androctonus crassicauda scorpion using RNA-Seq data

نویسندگان [English]

  • Roshan Kaki 1
  • Mahmood Nazari 2
  • Hedaiat allah Rooshanfekr 3
  • Fatemeh Salabi 4
1 Ph. D student in Department of Animal Science, Faculty of Animal science and Food Technology, Agricultural Science and Natural Resources University of Khuzestan, Mollasani, Iran.
2 Department of Animal Science, Faculty of Animal science and Food Technology, Agricultural Science and Natural Resources University of Khuzestan, Mollasani, Iran.
3 Department of Animal Science, Faculty of Animal Science and Food Technology, Agricultural Science and Natural Resources University of Khuzestan
4 Assistant Professor, Department of Venomous Animals and Anti-venom Production, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Ahvaz, Iran.
چکیده [English]

Objective
Simple sequence repeats (SSRs) markers or microsatellites are one of the best and most complete molecular tools in the study of genetic diversity due to the appropriate genomic coverage and high repeatability. Simple sequence repeats markers for the scorpion Andractonus crassicouda have not been reported so far. Therefore, this study was conducted with the aim of identifying and validating simple repeat sequence markers of the scorpion Andractonus crassicouda using RNA-Seq data.
Materials and methods
The samples were evaluated qualitatively and quantitatively after RNA extraction from the scorpion venom gland. Then the samples were sequenced with the Illumina HiSeq 2000 platform. Reconstruction of transcripts was done by De novo assembly method using Trinity software. Next, in order to identify new SSR markers, the transcriptome of the scorpion Andrachtonus crassicouda was analyzed using FullSSR software (version 1.5). To validate the identified SSR markers, 8 pairs of primers were designed by PRIMER 3 software and evaluated by polymerase chain reaction method on 60 DNA samples extracted from scorpion tissue.
Results
Assembling transcripts by the Trinity program generated a total of 744,804 transcripts and 563,526 unigenes. In this study, the examination of 952,725 sequences by FullSSR software led to the identification of 315,395 SSR markers. Among SSRs, two and three nucleotide repeats accounted for the highest number of repetitions with 71.85% and 22.36%, respectively. Among the 8 studied loci, only 2 loci showed polymorphism. The expected and observed heterozygosity for the RK1354 locus was calculated as 0.765 and 0.683 respectively, and for the NK1362 locus as 0.768 and 0.633 respectively. The fixation index statistic (Fis) for both loci was almost 0.1, which indicates low inbreeding in the population. In addition, the chi-square test showed that the population was not in Hardy-Weinberg equilibrium for both loci.
Conclusions
The different criteria of genetic diversity all indicate that the population is highly diverse, but some factors reduce the diversity among the studied population. This means that the population is out of balance and the number of observed heterozygotes is less than the expected heterozygotes. It is necessary to investigate the factors that have led to the reduction of diversity to prevent its further reduction. In general, the results of this research showed that new SSRs can be useful for understanding the population structure and investigating the genetic diversity of the scorpion Andractonus crassicouda.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Andractonus crassicoda
  • Simple sequence repeats
  • Transcriptome

مراجع

شاکری رئوف، جوانمرد آرش، حسن پور کریم، عباسی مختار علی و همکاران (1400) بررسی شاخص‌های تنوع ژنتیکی در یک جمعیت از گاو هلشتاین با استفاده از نشانگرهای متراکم اسنیپ پژوهشهای تولیدات دامی 12(۳۲)، ۱۴۹-۱۴۰.
صباحی راضیه، نظری محمود، بیگی نصیری محمدتقی، قربانی محمدرضا (1399) اثر پودر میوه گیاه پنج‌انگشت بر بیان ژن GnRH هیپوتالاموس مرغان تخمگذار. پژوهشهای تولیدات دامی ۱۱(۳۰) ،۱۰۰-۹۲.
کوه گیوی کی‌آرام، روشنفکر هدایت الله، نظری محمود، طاطار احمد (1398) تاثیر جایگزینی -DL متیونین با -L متیونین و سطوح مختلف پروتئین جیره بر بیان ژن میوستاتین در بلدرچین ژاپنی. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 11(2)، 36-23.  1
ربیعه مولود، روشنفکر هدایت‌الله، نظری محمود، قربانی محمدرضا (1400) بررسی بیان ژن آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در جوجه‌های گوشتی تغذیه شده با ویتامین E، عصاره‌ی گیاه خرفه و پسته‌ی وحشی تحت استرس گرمایی. نشریه دامپزشکی ایران 17(2)، 60-51.
روحی‌پور مرضیه، نظری محمود، بیگی نصیری محمدتقی (1398) آنالیز ژنتیکی و فیلوژنیک جمعیت بز عدنی بر اساس سیتوکروم B. پژوهشهای تولیدات دامی 10(26)، 89-84.
روحی‌پور مرضیه، نظری محمود، بیگی نصیری محمدتقی (1399) تعیین ساختار، روابط فیلوژنتیک و تنوع ژنتیکی ناحیه کنترل میتوکندریایی بز عدنی. مجله ژنتیک نوین 15(4)، 304-297 .
محمدی اهوازی غزال، بیگی نصیری محمدتقی، نظری محمود، صدر آیه سادات (1403) شناسایی و اعتبارسنجی نشانگرهای توالی ساده تکراری (SSR) برای ماهی گطان (Luciobarbus xanthopterus) بر پایه داده‌های .RNA-Seq مجله علمی شیلات ایران ۳۳ (۱)، 27-15.
محمدی اهوازی غزال، نظری محمود، محمدآبادی محمدرضا، حیدری راضیه (1398) آنالیز ژنتیکی و فیلوژنتیکی ناحیه HVR1 میتوکندری در سه نژاد گوسفند ایرانی. مجله ژنتیک نوین 14(3)، 219-211.
محمدآبادی محمدرضا، قاسمی میمندی مهرداد، منتظری مهدیه (1400) بررسی تنوع ژنتیکی شترهای بومی شمال استان کرمان با استفاده از آماره‌های F. مجله اصلاح و به‌نژادی دام 1(2)، 17-5.
محمدآبادی محمدرضا، کرد محبوبه، نظری محمود (1397) مطالعه بیان ژن لپتین در بافت‌های مختلف گوسفند کرمانی با استفاده از. Real Time PCR مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 10(3)، 123-111
نعمتی ایمان، صدقی محمد، حسینی سالکده قاسم، توکل افشاری رضا، تقوی محمدرضا (1398) توالی‌یابی de novo ترانسکریپتوم و آنالیز عملکردی ژن‌های با بیان متفاوت بذرهای بزرگ و کوچک گیاه توق خاردار (Xanthium strumarium L.) در دوره نمو. علوم و فناوری بذر ایران 8(2)، 227-211.
 
Alavi, M., Mozafari, M.R., Ghaemi, S., Ashengroph M., Hasanzadeh Davarani, F., & Mohammadabadi, M. (2022). Interaction of Epigallocatechin Gallate and Quercetin with Spike Glycoprotein (S-Glycoprotein) of SARS-CoV-2: In Silico Study. Biomedicines, 10(12), e3074. https://doi.org/10.3390/biomedicines10123074.
Amiri Roudbar, M., Mohammadabadi, M.R., Ayatollahi Mehrgardi, A., Rostami, A. A. Momen, M., Morota, G., Brito Lopes, F., Gianola, D., & Rosa, G. (2020). Integration of single nucleotide variants and whole-genome DNA methylation profiles for classification of rheumatoid arthritis cases from controls. Heredity, 124, 658-674. https://doi.org/10.1038/s41437-020-0301-4.
Barazandeh, A., Mohammadabadi, M.R., Ghaderi-Zefrehei M., & Nezamabadi-Pour, H. (2016). Genome-wide analysis of CpG islands in some livestock genomes and their relationship with genomic features. Czech Journal of Animal Science, 61(11), 487–495. https://doi.org/10.17221/78/2015-CJAS
Bordbar, F., Mohammadabadi, M., Jensen, J., Xu, L., Li, J., & Zhang, L. (2022). Identification of candidate genes regulating carcass depth and hind leg circumference in simmental beef cattle using Illumina Bovine Beadchip and next-generation sequencing. Animals, 12(9), e1103. https://doi.org/10.3390/ani12091103.
Contente, A., Dittmer, A., Koch, M.C., Roth, J., & Dobbelstein, M. A. (2002). A polymorphic microsatellite that mediates induction of PIG3 by p53. Nature Genetics, 30(3), 315–320. https://doi.org/10.1038/ng836.
Corney, D.C., & Basturea, G.N. (2016). RNA-seq using next generation sequencing. Materials and Methods, 3, 203. https://doi.org/10.13070/mm.en.3.203
Dehghani, R., Djadid, N.D., Shahbazzadeh, D., & Bigdelli, S. (2009). Introducing Compsobuthus matthiesseni (Birula, 1905) scorpion as one of the major stinging scorpions in Khuzestan, Iran. Toxicon, 54 (3), 272-5. https://doi.org/10.1016/j.toxicon.2009.04.011.
Dehghani, R., Ghorbani, A., Varzandeh, M., & Karami-Robati, F. (2023). Toxicity Mechanism of Dangerous Scorpion Stings in Iran. Journal of Arthropod-Borne Disease, 17(2), 105-119. https://doi.org/10.18502/jad.v17i2.13616
Dehghani, R., Khobdel, M., & Sabati, H. (2018). Control of scorpions in military environments: a review study. Journal of Military Medicine, 20(1), 3-13. http://eprints.bmsu.ac.ir/id/eprint/703
Dunlop, J.A. (2010). Geological history and phylogeny of Chelicerata. Arthropod Structure & Development, 39, 124–142. https://doi.org/10.1016/j.asd.2010.01.003
Ebrahimi, M., Azizi, K., Moemenbellah-Fard, M.D., Fakoorziba, M.R., & Soltani, A. (2015). Morphometry Indices of the Black Fat-tailed Scorpion Androctonus crassicauda (Scorpiones Buthidae), from Fars Province, Southern Iran. Journal of Entomology, 12(1), 39-47. https://doi.org/10.3923/je.2015.39.47
Ellegren, H. (2004). Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nature Reviews Genetics, 5, 435–445. https://doi.org/10.1038/nrg1348
Ghorbani, A., Mansouri, B., & Baradaran, M. (2021). Effects of climate variables on the incidence of scorpion stings in Iran for five years. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, 27, e20200110. https://doi.org/10.1590/1678-9199-JVATITD-2020-0110.
Haas, B.J., Papanicolaou, A., Yassour, M, Grabherr, M., Blood, P.D., Bowden, J., Couger, M.B., Eccles, D., Li, B., Lieber, M. MacManes, M.D. Ott, M.m Orvis, J., & Pochet, N. (2013). De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature protocols, 8, 1494-1512. https://doi.org/10.1038/nprot.2013.084
Hefferon, T.W., Groman, J.D., Yurk, C.E., & Cutting, G.R. (2004). A variable dinucleotide repeat in the CFTR gene contributes to phenotype diversity by forming RNA secondary structures that alter splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 101(10), 3504–35. https://doi.org/10.1073/pnas.0400182101.
Howard, R.J., Edgecombe, G.D., Legg, D.A., Pisani, D., & Lozano-Fernandez, J. (2019) Exploring the evolution and terrestrialization of scorpions (Arachnida: Scorpiones) with rocks and clocks. Organisms Diversity Evolution, 19, 71–86. https://doi.org/10.1007/s13127-019-00390-7
Koohgivi, K. A., Rooshanfekr, H. A., Nazari, M., & Tatar, A. (2019). Effect of DL- Methionine Replacement with L- Methionine and Different Dietary Protein Levels on Myostatin Gene Expression in Japanese Quails. Agricultural Biotechnology Journal, 11(2), 23-36. (In Persian). https://doi.org/10.22103/jab.2019.13274.1099
Li, Y.C., Korol, A.B., Fahima, T., & Nevo, E. (2004). Microsatellites within genes: structure, function, and evolution. Molecular Biology and Evolution, 21(6), 991–1007. https://doi.org/10.1093/molbev/msh073
Luca, M., Danilo, B., Giorgia, G., Adriana, C., & Oliana, C. (2021). De novo transcriptome assembly, functional annotation and characterization of the Atlantic bluefin tuna (Thunnus thynnus) larval stage. Marine Genomics, 58, 100834. https://doi.org/10.1016/j.margen.2020.100834
Mirkin, S. (2007). Expandable DNA repeats and human disease. Nature, 447, 932–940. https://doi.org/10.1038/nature05977
Mohamadi Ahvazi, G., Beigi Nassiri, M.T., Nazari, M., & Sadr. A.S. (2024). Identification and validation of simple sequence repeats (SSR) markers for yellowfin barbel (Luciobarbus xanthopterus) using RNA-Seq data. Iranian Scientific Fisheries Journal, 33 (1), 15-27 (In Persian). https://doi.org/10.22092/ISFJ.2024.131190
Mohamadi ahvazi, G., Nazari, M., Mohamadabadi, M.R., & Heidari R. (2019). Genetic and phylogenetic analysis of mitochondrial HVR1 region in three breeds of Iranian sheep. Modern Genetic Journal, 14(3), 211-219 (In Persian). http://mg.genetics.ir/article-1-110-en.html
Mohammadabadi, M., Babenko Ivanivna, O., Borshch, O., Kalashnyk, O., Ievstafiieva, Y., & Buchkovska, V. (2024). Measuring the relative expression pattern of the UCP2 gene in different tissues of the Raini Cashmere goat. Agricultural Biotechnology Journal, 16(3), 317-332. https://doi.org/10.22103/jab.2024.24337.1627
Mohammadabadi, M., Kord, M., & Nazari, M. (2018). Studying expression of leptin gene in different tissues of Kermani Sheep using Real Time PCR. Agricultural Biotechnology Journal, 10(3), 111-123 (In Persian). https://jab.uk.ac.ir/article_2211.html?lang=en
Mohammadabadi, M., Ghasemi Meymandi, M., & Montazeri, M. (2021). The Study of genetic diversity of camels in north of Kerman province using F statistics. Breeding and Improvement of Livestock, 1(2), 5-17 (In Persian). https://doi.org/10.22034/bilj.2021.144024
Nemati, I., Sedghi, M., Hoseini Salekdeh, G., Tavakkol afshari, R., & Naghavi, M. (2020). De novo tanscriptome sequencing and functional annotation of differentially expressed genes in large and small seeds of common cocklebur (Xanthium strumarium L.) during seed development. Iranian Journal of Seed Science and Technology, 8(2), 211-227 (In Persian). https://doi.org/10.22034/ijsst.2019.122712.1220
Ozkan, O., Ahmet, C., & Zafer, K. (2010). A study on the genetic diversity of Androctonus Crassicauda from Turkey. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, 16(4), 599-606. https://doi.org/10.1590/S1678-91992010000400010 
Li, Q., Su, X., Ma, H., Du, K., Yang, M., Chen, B., Fu, S., Fu, T., Xiang C., Zhao, Q., & Xu, L. (2021). Development of genic SSR marker resources from RNA‑seq data in Camellia japonica and their application in the genus Camellia. Scientific Reports, 11, 9919. https://doi.org/10.1038/s41598-021-89350-w
Rabieh, M.H., Rooshanfekr, M., Nazari, M., & Ghorbani, M.R. (2020). Gene expression of antioxidant enzymes fed wild pistachio (Pistachio atlantica), purslane (portulaca oleracea) extract and vitamin E under in broiler chickens under heat stress condition. Iranian Veterinary Journal, 17(2), 51-60 (In Persian). https://doi.org/10.22055/IVJ.2019.154392.2084
Rohipoor, M., Nazari, M., & Beigi Nassiri, M.T. (2019). Genetic and Phylogenetic Analysis of Adani Goat Population Based on Cytochrome B Gene. Research on animal production, 10(26), 84-89 (In Persian). https://doi.org/10.29252/rap.10.26.84
Rohipoor, M., Nazari, M., & Beigi Nassiri, M.T. (2021). Population structure, Genetic diversity and phylogenetic analysis of control region of mtDNA in Adani goat breed. Modern Genetic Journal, 15(4), 297-304 (In Persian). http://mg.genetics.ir/article-1-94-en.html
Sabahi, R., Nazari, M., Beigi Nassiri, M.T., & ghorbani, M.R. (2020). The Effect of Vitex Agnuse Castus Fruit Powder on Hypothalamic GnRH Gene Expression in Laying Hens. Research on Animal Production, 11(30), 92-100 (In Persian). https://doi.org/10.52547/rap.11.30.92
Safaei, S.M.H., Dadpasand, M., Mohammadabadi, M., Atashi, H., Stavetska, R., Klopenko, N., & Kalashnyk, O. (2022). An origanum majorana leaf diet influences myogenin gene expression, performance, and carcass characteristics in Lambs. Animals (Basel), 13(1), 14. https://doi.org/10.3390/ani13010014
Salabi, F., Nemati, M., & Lari Baghal, M. (2024). Fractionation and enzymes activity measurement of the scorpion Androctinus crassicoda (Scorpionida: Buthidae) venom. Iranian Veterinary Journal, 20(1), 109-120. https://doi.org/10.22055/IVJ.2023.422895.2646
Shakeri, R., Javanmard, A., Hasanpur, K., Abbasi, M., Mazlom, S.M., Khansefid, M., & Rahimi Varposhti, M. (2021). Assessment of genetic diversity within Holstein population using bovine SNP chip data. Research on Animal Production, 12(32), 140-149 (In Persian). https://doi.org/10.52547/rap.12.32.140
Toth, G., Gaspari, Z., & Jurka, J. (2000). Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Research, 10(7), 967–981. https://doi.org/10.1101/gr.10.7.967.
Trifonov, E.N. (2004). Tuning function of tandemly repeating sequences: A molecular device for fast adaptation. Springer Nature, Netherlands, pp 115-138.
Wang, C., Du, L.M., Li, P., Yang, M., Li, W., & Shen, Y. (2015). Distribution patterns of microsatellites in the genome of the german cockroach (Blattella germanica). Acta Entomologica Sinica, 58(10), 1037–1045.
Wang, C., Kubiak, L., Du, L., Li, W., Jian, Z., Tang, C., Fan, Z., Zhang, X., & Yue, B. (2016). Comparison of microsatellite distribution in genomes of Centruroides exilicauda and Mesobuthus martensii. Gene, 594(1), 41-46. https://doi.org/10.1016/j.gene.2016.08.047
Wen, S., Li, P., Wang, F., Li, J., Liu, H., & Li, N. (2020). De novo assembly and microsatellite marker development of the transcriptome of the endangered Brachymystax lenok tsinlingensis. Genes & Genomics, 42(7), 727-734. https://doi.org/10.1007/s13258-020-00939-3.
Ji, Y.J., Leng, L., Shi, C.M., Hua, Y.P., & Zhang, D.X. (2008). Eight polymorphic microsatellite markers developed in the Chinese scorpion, Mesobuthus martensii (Scorpiones: Buthidae). Molecular Ecology Resources, 8(6), 1454–1456. https://doi.org/10.1111/j.1755-0998.2008.02215.x
Zane, L., Bargelloni, L., & Patarnello, T. (2002). Strategies for microsatellite isolation. Molecular Ecology, 11(1), 1–16. https://doi.org/10.1046/j.0962-1083.2001.01418.x.
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی
دوره 17، شماره 2
اردیبهشت 1404
صفحه 31-54

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار