جداسازی، همسانه‌سازی و توالی‌یابی ژن aiiA از باکتری Paenibacillus polymyxa

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه بیماری ‌شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی‌ آذربایجان، تبریز، ایران.

2 دانشیار، گروه بیوتکنولوژی و اصلاح‌نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی‌ آذربایجان، تبریز، ایران.

3 دانشیار، گروه بیماری ‌شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران

چکیده

هدف: ژن aiiA کدکننده متالوآنزیمی به نام لاکتوناز است که با هیدرولیز اسیل هموسرین لاکتون، منجر به مهار سیستم کروم سنسینگ در باکتری‌های گرم‌منفی می‌شود؛ سیستمی که نقش کلیدی در بیماری‌زایی این باکتری‌ها ایفا می‌کند. انواع مختلفی از این آنزیم در باکتری‌های گوناگون شناسایی شده است. نوعی از این آنزیم دارای موتیف محافظت‌شده‌ای است که در اتصال یون‌های فلزی و فعالیت آنزیمی نقش دارد. نمونه‌ای از این آنزیم در جنس Bacillus مشاهده شده است که ژن مربوط به آن با ۷۵۰ جفت باز، پروتئینی با ۲۵۰ اسیدآمینه را کد می‌کند. باکتری Paenibacillus که پیش‌تر در جنس Bacillus طبقه‌بندی می‌شد، به‌عنوان یک باکتری محرک رشد با فعالیت آنتاگونیستی مؤثر علیه بیمارگرهای گیاهی، از پتانسیل بالای بیوتکنولوژیکی برخوردار است.
مواد و روش‌ها: در این پژوهش، جهت بررسی حضور ژن aiiA در یک جدایه باکتری با ویژگی‌های مرتبط با جنس Paenibacillus، آغازگرهای اختصاصی این ژن طراحی شدند و پس از تکثیر، محصول PCR با استفاده از آنزیم‌های برشی SmaI و BamHI در پلاسمید pBluescript II KS (+) همسانه‌سازی شد. پس از تأیید صحت پلاسمید نوترکیب و وجود ژن، با استفاده از PCR و آنزیم برشی، نمونه جهت توالی‌یابی ارسال گردید.
نتایج: بر اساس نتایج توالی‌یابی، طول ژن aiiA در این جدایه معادل ۷۵۶ جفت باز بود. نتایج Blast نشان داد که این توالی شباهتی بیش از ۹۹ درصد با توالی‌های شماره‌ی دسترسی NZ_CP009909.1 و NZ_CP025957.1 در پایگاه‌ داده NCBI دارد که نشان‌دهنده نزدیکی این جدایه به گونه P. polymyxa می‌باشد. نتایج محاسبه ضریب فاصله و ترسیم درخت فیلوژنتیکی براساس توالی این ژن نیز این قرابت را تأیید کرد. علاوه‌بر این شناسایی دامنه متعلق به خانواده β-Lactamase در موتیف پیشنهادی ژن مذکور، نشان‌دهنده نقش این ژن به‌عنوان یک آنزیم لاکتوناز و توانایی آن در مهار سیگنال‌دهی سیستم کروم سنسینگ می‌باشد. تحلیل ساختار پیشنهادی پروتئین کدشده توسط این ژن نیز نتایج مذکور را تأیید می‌کند.
نتیجه‌گیری: نتایج این پژوهش، ضمن انتقال و همسانه‌سازی موفق ژن aiiA به‌منظور استفاده در تولید گیاهان مقاوم به باکتری‌های بیماری‌زا، امکان شناسایی مولکولی دقیق جدایه مورد بررسی را نیز فراهم کرد. شناسایی این جدایه به‌عنوان باکتری نزدیک به گونه P. polymyxa، بیانگر پتانسیل بالای آن در کنترل زیستی بیماری‌های گیاهی است. بر این اساس، این جدایه می‌تواند به‌عنوان یک عامل زیستی مؤثر در راهکارهای پایدار مدیریت بیماری‌های باکتریایی گیاهان مورد بهره‌برداری قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Isolation, Cloning, and Sequencing of the aiiA Gene from Paenibacillus polymyxa

نویسندگان [English]

  • Faezeh Khoshbakhtlou 1
  • Maghsoud Pazhouhandeh 2
  • Akbar Shirzad 3
1 M.Sc. Student, Department of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz, Iran.
2 Assistant Professor, Department of Biotechnology and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz, Iran.
3 Assistant Professor, Department of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz, Iran.
چکیده [English]

Objective:
The aiiA gene encodes a metalloenzyme known as lactonase, which hydrolyzes acyl-homoserine lactone (AHL) molecules and thereby inhibits the quorum sensing (QS) system in Gram-negative bacteria—a system that plays a central role in their pathogenicity. Various forms of this enzyme have been identified across multiple bacterial genera. The enzyme features a conserved motif essential for metal ion binding and enzymatic activity. A well-characterized example exists in the Bacillus genus, where the gene is 750 base pairs long and encodes a 250-amino acid protein. Paenibacillus, formerly classified within Bacillus, is recognized as a plant growth-promoting bacterium with potent antagonistic activity against plant pathogens, making it a valuable candidate for biotechnological applications.
Materials and Methods:
In this study, specific primers were designed to detect the presence of the aiiA gene in a bacterial isolate exhibiting traits associated with the Paenibacillus genus. The gene was amplified via PCR and subsequently cloned into the pBluescript II KS (+) plasmid using the restriction enzymes SmaI and BamHI. The recombinant plasmid was confirmed through PCR and enzymatic digestion, after which the construct was submitted for sequencing.
Results:
Sequencing analysis revealed that the cloned aiiA gene was 756 base pairs in length. BLAST results indicated over 99% similarity with the aiiA sequences found under NCBI accession numbers NZ_CP009909.1 and NZ_CP025957.1, confirming a close relationship between the isolate and Paenibacillus polymyxa. Distance-based analysis and phylogenetic tree construction based on the gene sequence further supported this classification. Moreover, the presence of a conserved domain related to the β-lactamase protein family within the predicted motif of the gene provided additional evidence of its functional role as a lactonase capable of disrupting quorum sensing signals. Structural analysis of the predicted protein reinforced these findings.
Conclusion:
This study successfully cloned the aiiA gene, highlighting its potential application in developing transgenic plants resistant to bacterial pathogens. Additionally, the sequencing and phylogenetic analyses enabled precise molecular identification of the isolate, which was closely related to P. polymyxa. The isolate’s high potential as a biocontrol agent suggests it could play a key role in sustainable management strategies for bacterial diseases in plants.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Antagonist
  • Antibiotic resistance
  • Biocontrol
  • Lactonase
  • Quorum quenching

مراجع

محمودی اسماعیل، جعفری صمد (2018) تأثیر بیان ژن aiiA بر تحرک و آنزیم‌های بیماری‌زایی باکتری Pectobacterium carotovorum عامل پوسیدگی نرم باکتریایی. کنترل بیولوژیک آفات و بیماری های گیاهی 7، 93-103https://doi.org/10.22059/jbioc.2019.276448.261.
Akbari Kiarood, S. L., Rahnama, K., Golmohammadi, M., & Nasrollanejad, S. (2020). Quorum‑quenching endophytic bacteria inhibit disease caused by Pseudomonas syringae pv. syringae in Citrus cultivars. Journal of Basic Microbiology, 60(9), 746-757. https://doi.org/10.1002/jobm.202000038
Anandan, K., & Vittal, R. R. (2019). Quorum quenching activity of AiiA lactonase (KMMI17) from endophytic Bacillus thuringiensis KMCL07 on AHL‑mediated pathogenic phenotype in Pseudomonas aeruginosa. Microbial Pathogenesis, 132, 230-242. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2019.05.015
Ayyappan, S. V., & Bhaskaran, K. (2022). Extracellular lactonase‑mediated quorum quenching by a novel Bacillus velezensis. FEMS Microbiology Letters, 369(1). https://doi.org/10.1093/femsle/fnac095
Badarau, A., & Page, M. I. (2006). The variation of catalytic efficiency of Bacillus cereus metallo‑β‑lactamase with different active site metal ions. Biochemistry, 45(35), 10654-10666. https://doi.org/10.1021/bi060934l
Baltenneck, J., Reverchon, S., & Hommais, F. (2021). Quorum sensing regulation in phytopathogenic bacteria. Microorganisms, 9(2). https://doi.org/10.3390/microorganisms9020239
Bergonzi, C., Schwab, M., Naik, T., Daudé, D., Chabrière, E., & Elias, M. (2018). Structural and biochemical characterization of AaL, a quorum quenching lactonase with unusual kinetic properties. Scientific Reports, 8(1), 11262. https://doi.org/10.1038/s41598-018-28988-5
Chen, J., Liu, X., Min, Y., & Yang, Z. (2018). Construction of gene engineering bacteria of Paenibacillus polymyxa NR1 and functional analysis for aiiA gene expression. Chinese Journal of Biological Control, 34(3), 398. https://doi.org/10.16409/j.cnki.2095-039x
Churchill, M. E. A., & Chen, L. (2011). Structural basis of acyl‑homoserine lactone‑dependent signaling. Chemical Reviews, 111(1), 68-85. https://doi.org/10.1021/cr1000817
Dong, Y. H., Wang, L. H., Xu, J. L., Zhang, H. B., Zhang, X. F., & Zhang, L. H. (2001). Quenching quorum‑sensing‑dependent bacterial infection by an N‑acyl homoserine lactonase. Nature, 411(6839), 813-817. https://doi.org/10.1038/35081101
Dong, Y. H., Xu, J. L., Li, X. Z., & Zhang, L. H. (2000). AiiA, an enzyme that inactivates the acyl‑homoserine lactone quorum‑sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97(7), 3526-3531. https://doi.org/10.1073/pnas.97.7.3526
Dong, Y.-H., Gusti, A. R., Zhang, Q., Xu, J.-L., & Zhang, L.-H. (2002). Identification of quorum‑quenching N‑acyl homoserine lactonases from Bacillus species. Applied and Environmental Microbiology, 68(4), 1754-1759. https://doi.org/10.1128/AEM.68.4.1754-1759.2002
Eberl, L. (1999). N‑acyl homoserine‑lactone‑mediated gene regulation in gram‑negative bacteria. Systematic and Applied Microbiology, 22(4), 493-506. https://doi.org/10.1016/S0723-2020(99)80001-0
Fuqua, C., & Greenberg, E. P. (1998). Self perception in bacteria: quorum sensing with acylated homoserine lactones. Current Opinion in Microbiology, 1(2), 183-189. https://doi.org/10.1016/S1369-5274(98)80009-X
Garge, S. S., & Nerurkar, A. S. (2016). Attenuation of quorum sensing regulated virulence of Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum through an AHL lactonase produced by Lysinibacillus sp. Gs50. PLOS ONE, 11(12), e0167344. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0167344
Grady, E. N., MacDonald, J., Liu, L., Richman, A., & Yuan, Z.-C. (2016). Current knowledge and perspectives of Paenibacillus: a review. Microbial Cell Factories, 15(1), 203. https://doi.org/10.1186/S12934-016-0603-7
Helman, Y., & Chernin, L. (2015). Silencing the mob: disrupting quorum sensing as a means to fight plant disease. Molecular Plant Pathology, 16(3), 316-329. https://doi.org/10.1111/MPP.12180
Kachhadia, R., Kapadia, C., Datta, R., Jajda, H., Danish, S., & Glick, B. R. (2022). Cloning and characterization of AiiA, an acyl‑homoserine lactonase from Bacillus cereus RC1 to control soft rot causing pathogen Lelliottia amnigena RCE. Archives of Microbiology, 204(11), 665. https://doi.org/10.1007/S00203-022-03271-4
Langendries, S., & Goormachtig, S. (2021). Paenibacillus polymyxa, a Jack of all trades. Environmental Microbiology, 23(10), 5659-5669. https://doi.org/10.1111/1462-2920.15450
Leadbetter, J. R., & Greenberg, E. P. (2000). Metabolism of acyl‑homoserine lactone quorum‑sensing signals by Variovorax paradoxus. Journal of Bacteriology, 182(24), 6921-6926. https://doi.org/10.1128/JB.182.24.6921-6926.2000
Lee, S. J., Park, S.-Y., Lee, J.-J., Yum, D.-Y., Koo, B.-T., & Lee, J.-K. (2002). Genes encoding the N‑acyl homoserine lacton‑degrading enzyme are widespread in many subspecies of Bacillus thuringiensis. Applied and Environmental Microbiology, 68(8), 3919-3924. https://doi.org/10.1128/AEM.68.8.3919-3924.2002
Lei, M., Lu, P., Jin, L., Wang, Y., Qin, J., Xu, X., Zhang, L., & Wang, Y. (2015). Complete genome sequence of Paenibacillus polymyxa CF05, a strain of plant growth‑promoting rhizobacterium with elicitation of induced systemic resistance. Genome Announcements, 3(2). https://doi.org/10.1128/genomeA.00198-15
Luo, Y., Cheng, Y., Yi, J., Zhang, Z., Luo, Q., Zhang, D., & Li, Y. (2018). Complete genome sequence of industrial biocontrol strain Paenibacillus polymyxa HY96‑2 and further analysis of its biocontrol mechanism. Frontiers in Microbiology, 9, 1520. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.01520
Mahmoudi, E., Jafari, S. (2018). The effect of aiiA gene on the motility and enzymatic properties of Pectobacterium carotovorum, the causal agent of bacterial soft rot. Journal of Biological control of pests and plant diseases, 7, 93-103. https://doi.org/10.22059/jbioc.2019.276448.261. (In Persian)
Martinez, J. L., Fajardo, A., Garmendia, L., Hernandez, A., Linares, J. F., Martínez‑Solano, L., & Sánchez, M. B. (2009). A global view of antibiotic resistance. FEMS Microbiology Reviews, 33(1), 44-65. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2008.00142.x
Molina, L., Rezzonico, F., Défago, G., & Duffy, B. (2005). Autoinduction in Erwinia amylovora: evidence of an acyl‑homoserine lactone signal in the fire blight pathogen. Journal of Bacteriology, 187(9), 3206-3213. https://doi.org/10.1128/JB.187.9.3206-3213.2005
Momb, J., Wang, C., Liu, D., Thomas, P. W., Petsko, G. A., Guo, H., Ringe, D., & Fast, W. (2008). Mechanism of the quorum‑quenching lactonase (AiiA) from Bacillus thuringiensis. 2. Substrate modeling and active site mutations. Biochemistry, 47(29), 7715-7725. https://doi.org/10.1021/bi8003704
Na, H., Namgung, B., Song, W. S., & Yoon, S. (2019). Structural and biochemical analyses of the metallo‑β‑lactamase fold protein YhfI from Bacillus subtilis. Biochemical and Biophysical Research Communications, 519(1), 35-40. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2019.08.106
Nealson, K. H., Platt, T., & Hastings, J. W. (1970). Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system. Journal of Bacteriology, 104(1), 313-322. https://doi.org/10.1128/JB.104.1.313‑322.1970
Ouyang, L. J., & Li, L. M. (2016). Effects of an inducible aiiA gene on disease resistance in Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis. Transgenic Research, 25(4), 441-452. https://doi.org/10.1007/S11248-016-9940-X
Pan, J., Huang, T., Yao, F., Huang, Z., Powell, C. A., Qiu, S., & Guan, X. (2008). Expression and characterization of aiiA gene from Bacillus subtilis BS‑1. Microbiological Research, 163(6), 711-716. https://doi.org/10.1016/j.micres.2007.12.002
Papenfort, K., & Bassler, B. L. (2016). Quorum sensing signal‑response systems in Gram‑negative bacteria. Nature Reviews Microbiology, 14(9), 576-588. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2016.89
Rasmussen, T. B., & Givskov, M. (2006). Quorum‑sensing inhibitors as anti‑pathogenic drugs. International Journal of Medical Microbiology, 296(2-3), 149-161. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2006.02.005
Schaad, N. W., Jones, J. B., & Chun, W. (2001). Laboratory guide for the identification of plant pathogenic bacteria (3rd ed.). American Phytopathological Society.
Sifri, C. D. (2008). Healthcare epidemiology: quorum sensing: bacteria talk sense. Clinical Infectious Diseases, 47(8), 1070-1076. https://doi.org/10.1086/592072
Sundin, G. W., Castiblanco, L. F., Yuan, X., Zeng, Q., & Yang, C.-H. (2016). Bacterial disease management: challenges, experience, innovation and future prospects: Challenges in bacterial molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology, 17(9), 1506-1518. https://doi.org/10.1111/MPP.12436
Ulrich, R. L. (2004). Quorum quenching: enzymatic disruption of N‑acyl‑homoserine lactone‑mediated bacterial communication in Burkholderia thailandensis. Applied and Environmental Microbiology, 70(10), 6173-6180. https://doi.org/10.1128/AEM.70.10.6173-6180.2004
Vos, P., Garrity, G., Jones, D., Krieg, N. R., Ludwig, W., Rainey, F. A., Schleifer, K.-H., & Whitman, W. B. (2011). Bergey’s manual of systematic bacteriology: Volume 3: The Firmicutes (Vol. 3). Springer Science & Business Media. https://doi.org/10.1007/978-0-387-68489-5
Wilson, K. (2001). Preparation of genomic DNA from bacteria. Current Protocols in Molecular Biology, 56(1), 2-4. https://doi.org/10.1002/0471142727.mb0204s56
Zhu, C.-G., Sun, M., & Yu, Z.-N. (2003). Expression of gene aiiA carrying the promoter of gene cry3Aa in Bacillus thuringiensis. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao = Chinese Journal of Biotechnology, 19(4), 397-401. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15969053/
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی
دوره 17، شماره 4
آبان 1404
صفحه 1-26

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار