بررسی اثر عصاره الکلی برگ پونه کوهی بر روی مرحله پروماستیگوت لیشمانیا ماژور با روش رنگ‌سنجی در مدل برون‌تنی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش‌آموخته کارشناسی ارشد، گروه باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه هرمزگان، هرمزگان، ایران و دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران.

2 گروه مهندسی بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

3 هیات‌علمی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی کرمان، کرمان، ایران

چکیده

هدف: لیشمانیوز یکی از بیماری‌های انگلی است که به‌طور گسترده در جهان توسط تک یاخته‌ای از جنس لیشمانیا ایجاد شده‌است. در حال حاضر جهت درمان لیشمانیوز جلدی از ترکیبات پنج ظرفیتی آنتیموان نظیر گلوکانتیم و آمفوتریسین B استفاده می شود. داروهای گیاهی در بسیاری از موارد فاقد هرگونه عارضه هستند و از طرفی در‌دسترس و ارزان می‌باشند. از این رو پیدا کردن یک داروی گیاهی برای درمان لیشمانیوز یکی از اهداف جهانی است. این مطالعه به‌منظور ارزیابی فعالیت ضد لیشمانیایی عصاره الکلی برگ‌های گیاه دارویی پونه، روی مرحله پروماستیگوت لیشمانیا ماژور با روش رنگ سنجی در شرایط آزمایشگاهی انجام شد.
مواد و روش‌ها: پروماستیگوت های لیشمانیا ماژور در محیط کشت RPMI-1640 به همراه 10 درصد FBS کشت داده شدند. برای تعیین سمیت عصاره بر سلول‌های ماکروفاژ از روش MTT و خوانش با الایزا و برای تعیین اثر آنتی پروماستیگوتی عصاره از روش بررسی آپوپتوز با فلوسایتومتری استفاده‌‌ شد. میزان CC50 و IC50 از طریق نتایج این دو تست محاسبه شدند و در هر دو تست از آمفوتریسین به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. برای این منظور، پروماستیگوت‌ها به همراه غلظت‌های مختلف عصاره برگ گیاه دارویی پونه و آمفوتریسین B بر روی پلیت 96 خانه اضافه و به مدت 72 ساعت انکوبه شدند و سپس ارزیابی‌ها براساس آزمون‌های فوق صورت پذیرفت. داده‌های آماری با استفاده از روش دانکن، ANOVA و نرم افزار SAS در سطح احتمال (05/0≥(P آنالیز شدند.
نتایج: بیشترین مقدار آپوپتوز مربوط به تیمار800 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر که به‌ترتیب در آمفوتریسین B 35/97 درصد و در عصاره الکلی برگ گیاه دارویی پونه 42/47 درصد بود. غلظتی از دارو که از رشد %50 سلول‌ها جلوگیری می‌کند (CC50)، برای آمفوتریسین B 6/129 و برای عصاره گیاه دارویی پونه 162 میکروگرم بر میلی‌لیتر بود. میزان IC50 پروماستیگوت در آمفوتریسین و عصاره گیاه دارویی پونه به‌ترتیب به‌طور میانگین 5/18 و 01/111 ± 5/2989 میکروگرم بر میلی‌لیتر می‌باشد.
نتیجه‌گیری: عصاره الکلی برگ گیاه پونه با افزایش غلظت از رشد پروماستیگوت‌ها جلوگیری کرده و در بعضی از غلظت‌ها با یکدیگر و با داروی آمفوتریسین B تفاوت معنی‌داری داشتند. بر‌اساس نتایج فلوسایتومتری، افزایش آپوپتوزیس وابسته به دوز دیده‌شد. با توجه به نتایج CC50 عصاره الکلی برگ گیاه پونه، اثر بخشی بالایی نشان‌داد. لذا مطالعات بیشتر برای ارزیابی تاثیر آن بر روی انگل لیشمانیا در شرایط بالینی بسیار مطلوب است.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Evaluation of the in vitro effect of alcoholic extract of Nepeta ispahanica L. leaves on Leishmania major promastigote stage by colorimetric assay

نویسندگان [English]

  • Iman Nik Aein 1
  • Gholam Reza Sharifi 2
  • Iraj Sharifi 3
1 M. Sc. Student, College of Agriculture and Natural Resources, University of Hormozgan, Bandar Abbas, and Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.
2 Department of Agricultural Biotechnology Engineering, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.
3 Leishmaniasis Research Center, Kerman University of Medical Sciences, Kerman, Iran.
چکیده [English]

Objective
Leishmaniasis is one of the most prevalent parasitic unicellular diseases worldwide, which is caused by the Leishmania genus. Currently, pentavalent antimony compounds such as Glucantime and amphotericin B are used to treat cutaneous leishmaniasis. In many cases, herbal remedies have no adverse effects and are both affordable. Therefore, finding an herbal medicine to treat leishmaniasis is one of the global objectives. This study aimed to evaluate the anti-leishmanial activity of Nepeta ispahanica L. leaves alcoholic extract on promastigote stage of Leishmania major by in vitro colorimetric method.
 
Materials and methods
Different concentrations of Nepeta ispahanica L. leaf extract were used against L. major promastigotes compared to amphotericin B. L. major promastigotes were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10 Percent FBS. Optical absorption (OD) was measured by the ELISA method to determine the 50 Percent inhibitory concentration (IC50) of drugs. Promastigotes were added to the 96-well plate and incubated for 72 h with different concentrations of bay laurel leaf extract and amphotericin B (800, 600, 400, 200, 50, 25, and 10 μg mL-1). Flow cytometry was used to evaluate apoptosis. All concentrations were incubated in the MTT assay for 3 min and the flow cytometric assay for 2 h. Statistical data were analyzed by Duncan, ANOVA, and SAS software at P≤0.05.
 
Results
In N. ispahanica L. leaf extract treatments, the greatest amount of apoptosis (42.47 Percent) was related to treatment of 800 μg mL-1 concentration. Maximum amount of apoptosis (97.35 Percent) in amphotericin B treatments as positive control was related to treatment 800 μg mL-1 concentration.  CC50 of Amphotericin B and leaf extract of bay laurel treatments was obtained in 129.6 and 162 μg mL-1 concentrations, respectively. Inhibitory concentration (IC50) of amphotericin B and N. ispahanica L. leaf extract treatments were 18.5 and 2989.5 μg mL-1 on L. major promastigotes.
 
Conclusions
The results showed an increase in dose-dependent apoptosis based on flow cytometric analysis.  Also, the proximity of N. ispahanica L. leaf extract and amphotericin B treatments in apoptosis-like cell death, which increases with increasing drug concentration. According to the IC50 results of N. ispahanica L. leaf extract and its high apoptotic efficiency, further studies are needed to evaluate of N. ispahanica L. leaf extract on Leishmania parasite and also, to design a clinical setting for this herbal drug.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Amphotericin B
  • Apoptosis
  • Colorimetric method
  • Leishmania major
  • Nepeta ispahanica
الله‌دین سودابه، خادم‌وطن شهرام، هاشمی‌تبار محمود، اسکندری البرز (1393) بررسی تاثیر عصاره گیاه کاملیا ساینسیس بر پروماستیگوت انگل‌های لیشمانیا ماژور و لیشمانیا اینفانتوم با روش رنگ سنجی MTT. مجله مطالعات علوم پزشکی ارومیه 25(10)، 893-900.
براتی محمد، شریفی یاور، شریفی فر فاطمه (1388) بررسی اثرات ضد لیشمانیایی عصاره‌های آویشن شیرازی، اسپند و مورد با روش رنگ‌سنجی به صورت برون‌تنی. مجله دانشگاه علوم پزشکی کرمان 17، 41-32.
بنیادیان مچتبی، حجازی حسین، عزیزی حمیدرضا و دیگران (1394) اثر ضد لیشمانیایی اسانس گیاه اسطوخودوس علیه لیشمانیا ماژور در شرایط آزمایشگاهی. مجله دانشگاه علوم پزشکی شهر کرد 17، 101-93.
دلیمی عبدالحسین، اربابی محسن، ناصری فر راضی (1392) بررسی تاثیر عصاره آبی دو گیاه Artemisia sieberi Besser وScrophularia striata Boiss  بر رشد لیشمانیا ماژور در شرایط In vitro. فصلنامه علمی- پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران 29، 237-246.  https://doi.org/10.22092/ijmapr.2013.2904
صدوقی مرتضی (1395) ارزیابی فعالیت ضد لیشمانیایی عصاره چای سبز بر روی پروماستیگوت و آماستیگوت لیشمانیا تروپیکا در شرایط برون‌تنی. پایان نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه علوم پزشکی کرمان، ص. 120-1.
محمودی رزاق، احسانی پهرآباد علی، تاچیک حسین و همکاران (1389) اثر ضد میکروبی اسانس پونه کوهی و لاکتوباسیلوس کازئی بر استافیلوکوکوس اورئوس در پنیر سفید ایرانی. مجله پژوهش های صنایع غذایی20 ، 161-147.
محمودی رزاق، تاچیک حسین، فرشید امیر عباس و همکاران (1390) تعیین ترکیبات شیمیایی و اثرات ضد میکروبی اسانس پونه کوهی علیه باکتری استافیلو کوکوس اورئوس. ارمغان دانش، مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی یاسوج 16، 412-400.
میثاقی علی، سعیدی معصومه، نوری نگین، رضایی گلستانی محمدرضا (1397) مطالعه تاثیر اسانس پونه کوهی و عصاره اتانولی بره موم بر ویژگی های ضد باکتریایی و برخی ویژگی های فیزیکی فیلم های زیست تخریب پذیر پلی لاکتیک اسید. مجله سلامت و محیط زیست، فصلنامه علمی پژوهشی انجمن علمی بهداشت محیط ایران11، 122-111.
نیک آیین ایمان، شریفی سیرچی غلامرضا، شریفی ایرچ (1400) بررسی اثر عصاره الکلی برگ گیاه برگ‌بو بر پروماستیگوتهای لیشمانیا ماژور از طریق روش رنگ سنجی در مدل برون‌تنی. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 13(1)، 92-75. https://doi.org/10.22103/jab.2021.16918.1282
یزدانی مرتضی، جوکار کاشی فرشته، طلوعی زینب، رحیمی مقدم اکرم (1399) ارزیابی فیتوشیمیایی سمیت سلولی، آنتیاکسیدانی و ضدباکتریایی اسانس گیاه دارویی Melissa officinalis L. در منطقه مریوان. فصلنامه اکوفیتوشیمی گیاهان دارویی  29، 16-30.
Allahdin, S., Khademvatan, S., Hashemitabar, M., & Eskandari, A. (2014). In vitro activity of Camellia sinensis extracts against L. major and L. infantum promastigotes using the Colorometric MTT Assay. Journal of Medical Science Studies, 25(10), 893-900 (In Persian). https://umj.umsu.ac.ir/browse.php?a_id=2546&sid=1&slc_lang=en
Barati, M., Sharifi, I., & Sharififar, F. (2010). In vitro evaluation of anti-leishmanial activities of Zataria multiflora boiss, Peganum harmala and Myrtus communis by colorimetric assay. Journal of Kerman University of Medical Sciences, 17, 32 - 41 (In Persian). https://www.sid.ir/paper/146/en
Barati, M., Sharifi, I., Sharififar, F. Hakimi Parizi, M., & Shokri, A. (2014). Antileishmanial Activity of Gossypium hirsutum L., Ferula assa-foetida L. and Artemisia aucheri Boiss. Extracts by Colorimetric Assay. Anti-infective Agents, 12, 159-164. https://doi.org/10.2174/22113525113119990005.
Bonyadian, M., Hejazi, H., Azizi, H., Habibian, S., & Sayahi, A. (2015). Antileishmania activity of Levandula officinalis essence against Leishmania major in in vitro media. Journal of Shahrekord University of Medical Sciences, 17, 93- 101 (In Persian).
Bouvier, J., Etges, R., & Bordier, C. (1987). Identification of the promastigote surface protease in seven species of leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology, 24, 9-73. https://doi.org/10.1016/0166-6851(87)90117-4.
Chen, X., Lan, W., & Xie, J. (2024). Natural phenolic compounds: Antimicrobial properties, antimicrobial mechanisms, and potential utilization in the preservation of aquatic products. Food Chemistry, 440, 138-198. https://doi.org/10.1016/j.food chem.2023.138198
Dalimi, A., Arbabi, M., & Naserifar, R. (2013). The effect of aqueous extraction of Artemisia sieberi Besser and Scrophularia striata Boiss. On leishmania major under in vitro conditions. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants Research, 29, 237-246 (In Persian). https://doi.org/10.22092/ijmapr.2013.2904.
Desjeux, P. (2001). The increase in risk factors for leishmaniasis worldwide. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 95, 239-243. DOI: 10.1016/s0035-9203(01)90223-8.
Desjeux, P. (2004). Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases, 27, 305-318.
http://dx.doi.org/10.1016/j.cimid.2004.03.004.
Fard, M. D, Kalantari, M., Rassi, Y., & Javadian, E. (2003). The PCR- based detection of Leishmania major infection in Meriones libycus (Rodentia: Muridae) from southern Iran. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 97, 811-816. https://doi.org/10.1179/000349803225002651.
Jamshidi, M., Shabani, E., Hashemi, Z., & Ebrahimzadeh, M. (2014). Evaluation of three methods for the extraction of antioxidants from leaf and aerial parts of Lythrum salicaria L. (Lythraceae). International Food Research Journal, 21(2), 783 -788. https://www.cabidigitallibrary.org/doi/full/10.5555/20143367152
Khademvatan, S, Saki, J., Gharavi, M.J., & Rahim, F. (2011). Allium sativum extract induces apoptosis in Leishmania major (MRHO/IR/75/ER) promastigotes. Journal of Medicinal Plant Research, 5(16), 3725-32.
Kyriazis, J., Aligiannis, N., Polychronopoulos, P., Skaltsounis, A. L., & Dotsika, E. (2013). Leishmanicidal activity assessment of Olive tree extracts. Phytomedicine, 20, 275-281. https://doi.org/10.1016/j.phymed.2012.11.013.
Lamidi, M., DiGiorgio, C., Delmas, F., Favel, A., Eyele Mve-Mba, C., Rondi, M. L., Ollivier, E., Nze-Ekekang, L., & Balansard, G. (2005). In vitro cytotoxic, antileishmanial and antifungal activities of ethnopharmacologically selected Gabonese plants. Journal of Ethnopharmacology, 102, 90- 185. https://doi.org/10.1016/j.jep.2005.06.011.
Mahmoudi, R., Ehsani, A., Tajik., H., & Akhondzade Bast, A. (2010). Antimicrobial effects of Mentha longifolia L. essential oil and Lactobacillus casei against Staphylococcus aureus in Iranian white cheese. Journal of Medicinal Plants, 20, 147-161 (In Persian).
Mahmoudi, R., Tajik, H., Farshid, A. A., Ehsani, A., Zaree, P., & Moradi, m. (2011). Phytochemical properties of Mentha longifolia L. essential oil and its antimicrobial effects on Staphylococcus aureus. Armaghan-e-Danesh, 16, 400-412 (In Persian). http://armaghanj.yums.ac.ir/article-1-307-en.html.
Markell, E. K., Voge, M. A., & John, D.T. (2006). Medical parasitology (7th ed.) W. B. Saunders Company Philadelphia, 148-159.
Misaghi, A., Saeedi, M., Noori, N., & Rezaeigolestani, M. (2018). Study of effect of oregano essential oil and ethanolic extract of propolis on antibacterial properties and some physical characteristics of biodegradable poly-lactic acid films. Iranian Journal of Health and Environment, 11, 111-122 (In Persian).
Mishra, B. B., Singh, R.K., Srivastava., A., Tripathi, V. J., & Tiwari, V. K. (2009). Fighting against leishmaniasis: search of alkaloids as future true potential anti-Leishmanial agents. Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 9, 107123. https://doi.org/10.2174/138955709787001758
Mohebali, M., Taran, M., & Zarei, Z. (2004). Rapid detection of leishmania infantum infection dogs: Comparative study using an immune chromatographic dipstick rk39 test and direct agglutination. Veterinary Parasitology, 121, 239-245. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2004.02.014.
Nik Aien, I., Sharifi-Sirchi, G. h., & Sharifi, I. (2020). The in vitro effect of alcohlic extract of Laurus nobilis leaves on Leishmania major promastigote stage by colorimetric assay. Agricultural Biotechnology Journal, 13(1), 75-92 (In Persian). https://doi.org/10.22103/JAB.2021.16918.1282.
Nosratabadi, S.J., Sharifi, I., Sharififar, F., Bamorovat, M., Daneshvar, H., & Mirzaie, M. (2015). In vitro antileishmanial activity of methanolic and aqueous extracts of Eucalyptus camaldulensis against leishmania major. Journal of Parasitic Diseases, 39, 18-21. https://doi.org/10.1007/s12639-013-0377-3.
Sadughi, M. (2018). Evaluation Leishnrunicidal activity of Green Tea extract (Epigullocatechin 3- O - Gallotel on Leishmonia tropica promastigote and antastigote in vitro. MSc thesis, Kerman Universitv of Medical Sciences, pp. 1-120.
Takó M, Kerekes EB, Zambrano C Kotogán, A., Papp, T., Krisch, J., & Vágvölgyi, C. (2020). Plant phenolics and phenolic-enriched extracts as antimicrobial agents against food-contaminating microorganisms. Antioxidants (Basel), 18, 9(2),165-186. https://doi.org/10.3390/antiox9020165.
Weigle, K.A., Valderrama, L., Arias, A. L., Santrich, C., & Saravia N. G. (1991). Leishmanin skin test standardization and evaluation of safety, dose, storage, longevity of reaction and sensitization. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 44, 260-271. https://doi.org/10.4269/ajtmh.1991.44.260.
Yazdani, M., Jookar Kashi, F., Toluei, Z., & Rahimi-Moghaddam, A. (2020). Evaluation of phytochemical, cytotoxic, antioxidant and antibacterial activity of Melissa officinalis L. from Marivan region. Ecophytochemistry journal of Medicinal Plants, 29, 16-30 (In Persian).
Yousefi, E., Eskandari, A., Gharavi, M. J., & Khademvatan, S. (2014). In vitro activity and cytotoxicity of Crocus sativus extract against leihmania major (MRHO/IR/75/ER). Infectious Disorders Drug Targets, 14(1), 56-60.  https://doi.org/10.2174/1871526514666140827101901.