تجزیه و تحلیل تنوع و جایگاه ژنتیکی قوچ و میش‌های پناهگاه حیات‌وحش بوروئیه با کمک ژن سیتوکروم ب (Cytochrome b)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

چکیده

قوچ و میش از خانواده گاوها (Bovidae) و جنس قوچ (Ovis) است، که در بیشتر مناطق ایران زیست می­کند. به لحاظ تعیین طبقه­بندی این گونه همواره چالش­های زیادی در بین محققین وجود داشته است. هدف از این مطالعه، بررسی ژنتیکی و فیلوژنتیکی توالی نوکلئوتیدی ناحیه سیتوکروم b از DNA میتوکندری قوچ و میش­های پناهگاه حیات وحش بوروئیه به منظور تعیین طبقه­بندی صحیح این گونه است. در این پژوهش، تعداد 17 نمونه سرگین و بافت از قوچ و میش­های پناهگاه حیات ­وحش بوروئیه شهرستان خاتم جمع­آوری شد. پس از استخراج DNA، تکثیر قطعات 1140، 741 و 765 جفت بازی از ناحیه سیتوکروم b میتوکندری با استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز و پرایمرهای (Cytb F-  (Cytb Rو Cytb F-Cytbin R)، Cytb R-Cytbin F) انجام گردید. توالی­یابی ناحیه تکثیر شده با استفاده از دستگاه خودکار ABI 3130 به روش اتوماتیک سانگر صورت گرفت و به منظور تعیین فاصله ژنتیکی با توالی­های حاصل از مطالعات دیگر، مقایسه شد. نتایج نشان داد که در بین توالی­های نوکلئوتیدی نمونه­های مورد مطالعه، تفاوت هاپلوتایپی وجود نداشت. نتایج آزمون فیلوژنتیکی با استفاده از روشNeighbor-Joining  نشان داد، قوچ و میش­های پناهگاه حیات ­وحش بوروئیه در شاخه قوچ و میش ارمنی (Ovis orientalis) قرار می­گیرند و از لحاظ هاپلوتایپی با جمعیت­های قوچ و میش ارمنی در دیگر مناطق ایران متفاوت هستند. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که قوچ و میش­های پناهگاه حیات ­وحش بوروئیه در حال حاضر تنوع ژنتیکی پایینی دارند، که در کارهای مدیریتی دراز مدت در آینده باید به طور جدی به آن توجه شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Genetic and Phylogenetic Analysis of Cytochrome b region in Wild Sheep of Buruieh Wildlife Refuge

نویسندگان [English]

  • Seyyed Majid Hosseini
  • Hamid Reza Rezaei
  • Hossein Varasteh
  • Saeid Naderi
  • Fatemeh Nikouy
چکیده [English]

Wild sheep is belonging to Bovidae family and genus ovis which living in the most regions of Iran. There are many challenges between researchers about Wild Sheep species taxonomy. This study aims to investigate genetic and phylogenetic analysis of cytochrome b region of ovis orientalis's mtDNA in the Buruieh wildlife refuge in order to determine the correct taxonomy. With this regard, 17 samples of ovis orientalis stool and tissue were collected from Buruieh Wildlife Refuge in Khatam Township. After DNA extraction 1140, 741, 765 bp fragment of the mitochondrial cytochrome b was amplified with primers Cytb F-Cytb R, Cytb F- Cytbin R and Cytb R-Cytbin F under polymerase chain reaction .Amplified fragments were sequenced by ABI 3130 automated device with Sanger method. The results were compared with sequences from other studies to determine the genetic distances. Hoplotype variations were not observed in the nucleotide sequences obtained in this study. Using the Neighbor-Joining phylogenetic test results showed that the Buruieh Wildlife Refuge wild sheep is placed in the group of ovis orientalis and is different from other ovis orientalis populations all around Iran in the terms of Hoplotype. Our results demonstrated that the Buruieh Refuge Wildlife Sheeps have low genetic diversity which should be considered at the long-time managment activities in the future.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Wild Sheep
  • Buruieh Wildlife Refuge
  • Phylogeny
  • Cytochrome b

تجزیه و تحلیل تنوع و جایگاه ژنتیکی قوچ و میش­های پناهگاه حیات­وحش بوروئیه با کمک ژن سیتوکروم ب (Cytochrome b)

 

سید مجید حسینی*1، حمیدرضا رضایی2 ، حسین وارسته3 ، سعید نادری4، فاطمه نیکوی1

1دانش­آموخته کارشناسی ارشد محیط­زیست، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان.

2استادیار، دانشکده شیلات و محیط­زیست، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان.

3استادیار، دانشکده شیلات و محیط­زیست، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان.

4استادیار، گروه محیط­زیست، دانشگاه گیلان.

تاریخ دریافت: 28/09/1392، تاریخ پذیرش: 10/10/1393

چکیده

قوچ و میش از خانواده گاوها (Bovidae) و جنس قوچ (Ovis) است، که در بیشتر مناطق ایران زیست می­کند. به لحاظ تعیین طبقه­بندی این گونه همواره چالش­های زیادی در بین محققین وجود داشته است. هدف از این مطالعه، بررسی ژنتیکی و فیلوژنتیکی توالی نوکلئوتیدی ناحیه سیتوکروم b از DNA میتوکندری قوچ و میش­های پناهگاه حیات وحش بوروئیه به منظور تعیین طبقه­بندی صحیح این گونه است. در این پژوهش، تعداد 17 نمونه سرگین و بافت از قوچ و میش­های پناهگاه حیات ­وحش بوروئیه شهرستان خاتم جمع­آوری شد. پس از استخراج DNA، تکثیر قطعات 1140، 741 و 765 جفت بازی از ناحیه سیتوکروم b میتوکندری با استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز و پرایمرهای (Cytb F-  (Cytb Rو Cytb F-Cytbin R)، Cytb R-Cytbin F) انجام گردید. توالی­یابی ناحیه تکثیر شده با استفاده از دستگاه خودکار ABI 3130 به روش اتوماتیک سانگر صورت گرفت و به منظور تعیین فاصله ژنتیکی با توالی­های حاصل از مطالعات دیگر، مقایسه شد. نتایج نشان داد که در بین توالی­های نوکلئوتیدی نمونه­های مورد مطالعه، تفاوت هاپلوتایپی وجود نداشت. نتایج آزمون فیلوژنتیکی با استفاده از روشNeighbor-Joining  نشان داد، قوچ و میش­های پناهگاه حیات ­وحش بوروئیه در شاخه قوچ و میش ارمنی (Ovis orientalis) قرار می­گیرند و از لحاظ هاپلوتایپی با جمعیت­های قوچ و میش ارمنی در دیگر مناطق ایران متفاوت هستند. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که قوچ و میش­های پناهگاه حیات ­وحش بوروئیه در حال حاضر تنوع ژنتیکی پایینی دارند، که در کارهای مدیریتی دراز مدت در آینده باید به طور جدی به آن توجه شود.

کلمات کلیدی: قوچ و میش، پناهگاه حیا­ت ­­وحش بوروئیه، فیلوژنی، سیتوکروم b.



مقدمه  

قوچ و میش یا همان گوسفند وحشی از جنس قوچ (Ovis) پراکنش وسیعی در نیم­کره شمالی کره زمین دارند. پراکنش آن‌ها از آمریکا و کانادا تا مناطق وسیعی از آسیا و بخشی از اروپا را شامل می­شود. در مطالعاتی که روی قوچ و میش در جهان صورت گرفته است، آن‌ها را بین یک تا 7 گونه تقسیم نموده­اند (Nadler et al.,1973). در مطالعات انجام شده مشخص شده است که قوچ و میش­های جهان از لحاظ رده­بندی یکی از جنس­های پیچیده در جهان هستند. اکثر مطالعات انجام گرفته در ایران بر روی این گونه بر اساس خصوصیات مورفولوژی صورت گرفته و تنها مطالعات محدودی در زمینه سیتولوژی و ژنتیک انجام شده است. روش­های مولکولی مانند توالی­یابی ژنوم میتوکندری یکی از کاربردی­ترین روش­ها برای تعیین رابطه فیلوژنتیکی بین جمعیت­ها و گونه­های نزدیک به هم محسوب می­شود (Bruford et al., 2003). امروزه ژنوم میتوکندری به دلیل اندازه کوچک و آسان بودن استخراج آن و این که از طریق مادر به ارث می‌رسد، به طور متداول برای مطالعات فیلوژنتیکی و تکاملی مورد استفاده قرار می‌گیرد (Lansman et al., 1983). DNA میتوکندری (mtDNA) در تشخیص گونه­ها و ترسیم رابطه فیلوژنتیکی دارای مزایایی از جمله تعداد زیاد نسخه به ازای هر سلول، اندازه کوچک­تر آن از DNA ژنومی، وراثت­پذیری مادری، هاپلوئید بودن، عدم وجود نوترکیبی در آن­ها و وجود نواحی حفاظت­شده می­باشد (Bellagamba et al., 2001). همچنین DNA میتوکندریایی دارای محدودیت­های خاصی نیز است (Funk & Omland, 2003). اندامک میتوکندری تقریباً در همه یوکاریوت‌ها یافت می‌شود، تعدادشان بسته به نوع ارگانیسم و نوع بافت متفاوت است. بسیاری از سلول‌ها تنها یک میتوکندری دارند در حالی که سلول‌های دیگر می‌توانند شامل چندین هزار میتوکندری باشند (Johanson et al., 2001). تصور می‌شود که DNA  میتوکندری و هسته منشأ تکاملی مجزایی داشته باشند، به طوری که DNA میتوکندری از ژنوم‌های حلقوی باکتری‌ها مشتق شده است (Wiesner et al., 1992). ژنوم میتوکندری پستاندارانDNA  حلقوی دو رشته‌ای به طول 17-16 کیلوباز، با وزن مولکولی کم، ساختار ساده، سرعت تکاملی بالا و وراثت مادری است. این DNA فاقد اینترون بوده و بر خلاف DNA هسته فاقد حدود 7% توالی‌های غیر کد کننده است. DNA میتوکندری 37 ژن را کد می‌کند که 13 ژن آن کد کننده پروتئین هستند (شکل 1). درون این 37 ژن 22 ژن tRNA وجود دارد. دو ژن آخر هم ژن‌های  rRNA می‌باشند و بالاخره D-loop یا ناحیه کنترل که ناحیه غیر کد کننده است (Schlick et al., 2006). به دلیل این که تمام DNA میتوکندریایی به صورت یک واحد خاص یا هاپلوتایپ به ارث می‌رسد خویشاوندی‌های بین DNA میتوکندری افراد متفاوت را می‌تواند به صورت یک درخت ژنی نشان داد. الگوهای این درخت‌های ژنی برای پی بردن به تاریخچه تکاملی جمعیت‌ها استفاده می‌شود (Cann et al., 1987; Torroni et al., 2006). ژن‌های میتوکندری ابزاری مهم در مطالعات مختلف در زمینه‌های تکامل جانوران، فیلوجغرافیایی و فیلوژنتیک می‌باشند (Rokas et al., 2003). تنوع ژنتیکی و مدیریت منابع ژنتیکی به عنوان یکی از اجزای مهم پروژه­های اصلاحی می­باشند. چرا که یک گونه بدون تنوع ژنتیکی کافی قادر به سازگاری با تغییرات محیطی و مبارزه با انگل­ها و رقیب­ها نیست (Askari et al., 2011). حفاظت باید بر اساس دانش عمیقی از منابع ژنتیکی نژادهای خاص باشد، لذا تلاش برای شناسایی و تعیین خصوصیات ژنتیکی نژادهای بومی و محلی بسیار اهمیت دارد (Shojaei et al., 2010).

 

 

شکل 1- ساختار حلقوی DNA میتوکندری.

Figure 1- Structure of circular mitochondrial DNA.

 

 

ژن سیتوکروم b[1]، ژن میتوکندری کدینه است که تاکنون برای تاکسون‌های گوناگون تعیین توالی شده است و اطلاعات کاملی در مورد این ژن در دسترس است (Aliabadian et al., 2009). این ژن نشانگری مناسب در سطح جنس و گونه است و تغییرات درون و بین گونه­ای را نشان می‌دهد (Wink et al., 2000 ) و فاقد تغییرات حذف، الحاق و واژگونی است. این ژن توانایی نشان دادن واگرایی‌های قدیمی­تر از 20 میلیون سال را ندارد (Konig et al., 2008). دیدگاه­های جدیدی برای تکامل گوسفند وحشی توسط تکامل نژادی مولکولی با استفاده از روش­های صرفه­جویی حداکثر[2]، بیزین[3]، تشابه حداکثر[4] و اتصال همسایگی[5] به دست آمده است (Rezaei et al., 2010).  بر اساس آخرین رده­بندی، قوچ و میش­های جهان را شش گونه معرفی کرده­اند که دو گونه از این قوچ و میش­ها در ایران یافت می­شود. قوچ و میش اوریال (Ovis vignei) که بیشتر در شمال شرقی، شرق و جنوب شرقی ایران و ارمنی (Ovis orientalisکه محدوده پراکنش آن بیشتر در شمال غربی، غرب و جنوب غرب ایران است (شکل 2). در برخورد این دو گونه با هم در مرکز ایران و مناطق مجاور هم در یک منطقه، احتمال حضور دو گونه افزایش می­یابد (Rezaei et al., 2010). هشت جمعیت­ قوچ و میش در سراسر ایران بر اساس الگوی کروموزوم، شکل شاخ، ویژگی­های پوست و نرخ جنین آنالیز شدند و بر اساس تعداد کروموزوم تقسیم بندی شده­اند (Valdez et al.,1978). قوچ و میش لارستان در جنوب ایران به عنوان زیرگونه­ای از موفلون آسیایی (O. Orientalis laristanica) مطرح و اشاره شده است که موفلون­های آسیایی اجداد گوسفندان اهلی هستند (Corbet and Hill, 1991). قوچ و میش­های ایران جزء گونه­هایی هستند که با توجه به هیبرید بین آن‌ها نیاز به مطالعات ژنتیکی و مولکولی گسترده­ای دارند (Hosseini et al., 2013). قوچ و میش­های استان یزد در منطقه آمیزشی بین دو گونه قوچ و میش اوریال و ارمنی قرار دارند. پناهگاه حیات­ وحش بوروئیه در جنوبی­ترین قسمت استان یزد از جمله مناطقی است که ­می­تواند قوچ و میش­های متفاوتی از لحاظ ژنتیکی، با توجه به همسایگی این شهرستان با استان­های فارس و کرمان نسبت به دیگر مناطق این استان داشته باشد. هدف از این پژوهش تجزیه و تحلیل ژنتیکی ناحیه Cyt-b از ژنوم میتوکندریایی در قوچ و میش­های پناهگاه حیات وحش بوروئیه و تعیین جایگاه قوچ و میش­های پناهگاه حیات­وحش بوروئیه در بین قوچ و میش­های ایران و استان یزد است.

مواد و روش­ها

قوچ و میش[6] از خانواده گاوسانان[7] و از راسته زوج سمان[8] است. زیستگاه آن‌ها بیشتر در تپه و ماهورها و دامنه کوهستان­های مرتفع در مناطق استپی است. بیشتر روزگرد است و به صورت اجتماعی زندگی می­کنند. از علوفه، بوته­ها و برگ درختان تغذیه می­کنند. دشمن طبیعی این گونه گرگ، پلنگ، یوز و سگ­های اهلی هستند. در سال­های اخیر به دلیل اشغال زیستگاه و آبشخورها، شکار بی­رویه و گرفتن بره­ها، نسل آن­ها به شدت رو به کاهش نهاده و در بعضی از مناطق به کلی نابود شده­اند Ziaie, 2008)).

 


 

 

شکل 2- توزیع جغرافیایی گونه­های قوچ وحشی (Rezaei et al., 2010).

Figure 2- Phylogeography of the wild Ovis species (Rezaei et al., 2010).

 

 

پناهگاه حیات­وحش بوروئیه در جنوب استان یزد، در شهرستان خاتم واقع شده است. این محدوده در حد فاصل 54 درجه و 12 دقیقه تا 54 درجه و 59 دقیقه طول شرقی و 30 درجه و 2 دقیقه تا 30 درجه و 11 دقیقه عرض شمالی قرار گرفته است. این منطقه با مساحت حدود 78590 هکتار در تاریخ 21 خرداد 1381 با مصوبه­ شورای عالی حفاظت محیط زیست، به مناطق چهارگانه­ محیط زیست پیوست. بخش عمده­ پناهگاه را ارتفاعات تشکیل می­دهد. دامنه­ ارتفاعی منطقه بین 1600 تا 2800 متر متغیر است. عمده­ترین تعارضات پناهگاه، چرای دام و معدودی مزرعه است. بر اساس طبقه­بندی اقلیمی دومارتن، اقلیم پناهگاه خشک و نیمه خشک است. میانگین سالانه­ دما بین 10 تا 18 سانتی‌گراد و میزان بارندگی بین 200 تا 330 میلی­لیتر در بخش­های مختلف منطقه در نوسان است (Entekhabi, 2009).

برای انجام این مطالعه به دو شیوه مختلف نمونه­برداری انجام شد. این نمونه­ها شامل نمونه­های سرگین و بافت بود. نمونه­های سرگین در فصل پاییز سال 1391 از پناهگاه حیات­وحش بوروئیه جمع­آوری شد. 15 نمونه سرگین از این منطقه جمع­آوری شد. جمع­آوری نمونه­های سرگین به صورت تصادفی صورت گرفت. نمونه­ها در الکل 96 درصد و در تیوب­های نمونه­برداری بی‌رنگ 15 میلی­لیتری نگهداری شدند. موقعیت جغرافیایی کلیه نمونه­ها توسط GPS ثبت شد. شیوه دوم نمونه­برداری از بافت بود که در این شیوه از نمونه­هایی که در طبیعت تلف شده بود یا به صورت قانونی برای آن‌ها پروانه شکار صادر شده بود و همچنین نمونه­هایی که از متخلفین بدست آمده بود، در اداره کل محیط زیست استان یزد وجود داشت تهیه شد. در کل دو نمونه بافت از این منطقه توانستیم جمع­آوری کنیم. این نمونه­ها نیز پس از ثبت موقعیت جغرافیایی و تعیین جمعیت در الکل 96 درصد نگهداری شد.

 استخراج DNA از نمونه­ها با استفاده از کیت مخصوص استخراج DNA از سرگین و بافت توسط کیت شرکت بیونیر بر اساس پروتکل انجام شد. برای انجام PCR در این تحقیق از سه جفت پرایمر استفاده شد (Pedrosa et al., 2005; Rezaei et al., 2010). ابتدا نمونه­ها توسط پرایمری که 1140 جفت باز به عنوان نتیجه در اختیار ما قرار می­دهد، تکثیر شد و داده­های آن مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و چون تعداد کمی از نمونه­ها با این جفت پرایمر جواب دادند و بقیه باند واضح و خوبی نشان ندادند. از دو جفت پرایمر دیگر با طول قطعه 741 و 765 جفت بازی استفاده شد (جدول 1).

واکنش زنجیره­ای پلیمراز توسط دستگاه ترموسایکلر در 35 سیکل انجام شد. حجم واکنش 25 میکرولیتر و اجزای آن شامل 11 میکرولیتر Master KIT، 8 میکرولیتر آب، 2 میکرولیتر پرایمر رفت[9]، 2 میکرولتیر پرایمر برگشت[10] و 2 میکرولیتر DNA بود. برنامه حرارتی واکنش PCR به شرح جدول (2) می­باشد (Bunch et al., 2006).

به منظور تأیید تکثیر ناحیه مورد نظر، طی واکنش­های PCR الکتروفورز محصولات PCR روی ژل آگارز 2 درصد صورت گرفت. از روی شدت وضوح باندها می­توان به کیفیت و تا حدودی کمیت DNA پی برد. مقدار 20 میکرو لیتر از محصولات  PCRخالص­سازی شد و به همراه 100 میکرولیتر از هر یک آغازگرهای رفت و برگشت با غلظت 10 پیکومول به منظور تعیین توالی به شرکتBioneer  کره جنوبی ارسال شدند. این نمونه‌ها با استفاده از دستگاه ABI 3130 به روش اتوماتیک سانگر توالی­یابی گردید.

برای تجزیه و تحلیل نتایج از ابزار BLAST و رویه BLASTN در پایگاه [11]NCBI جهت تعیین همولوژی توالی­ها استفاده گردید. از نرم­افزار Seqscape به منظور اصلاح نوکلئوتیدی توالی­ها استفاده شد. برای بررسی جایگاه قوچ و میش در بین سایر قوچ و میش­های ایران و بررسی ارتباطات بین آن­ها از توالی ناحیه سیتوکروم b ثبت شده سایر قوچ و میش در ژن بانک (NCBI) بدست آمدند و ردیف آرایی توالی­ها در نرم افزار MEGA.5 صورت گرفت. در نهایت درخت فیلوژنی بر اساس روش اتصال مجاور با استفاده از نرم افزار MEGA.5  ترسیم گردید   .(Fadakar, 2012)


 

 

 

جدول 1- پرایمرهای استفاده شده برای PCR و توالی­یابی.

Table 1- Primers used for PCR and sequencing.

لوکوس

Locus

نام پرایمر

Primer name

توالی پرایمر

Primer sequence (5-3)

طول قطعه

Fragment L

درجه حرارت

Tm (̊C)

cytochrome b (part 1)

CYTB_F

CYTB_R

CCCCACAAAACCTATCACAAA

AGGGAGGTTGGTTGTTCTCC

1140

55̊ C

cytochrome b (part 2)

CYTB_F

CYTB_IN_R

CCCCACAAAACCTATCACAAA

CCTGTTTCGTGGAGGAAGAG

741

55̊ C

cytochrome b (part 3)

CYTB_IN_F

CYTB_R

ACCTCCTTTCAGCAATTCCA

AGGGAGGTTGGTTGTTCTCC

765

60̊ C

           

 

جدول 2- برنامه حرارتی برای چرخه PCR.

Table 2- Thermal program for cycle PCR.

مرحله

Stage

زمان (ثانیه)

Time (Second)

درجه حرارت

Tm (̊0C)

مراحل PCR

PCR Stage

1

600

95

واسرشته­سازی اولیه Predenature

2

30

95

واسرشته­سازی Denature

3

bp  1140، 741

45

55

اتصال آغازگرها Annealing

765  bp

45

60

اتصال آغازگرها Annealing

4

60

72

Extension  تکثیر

5

540

72

تکثیر نهایی Final extension

6

4

نگهداری Retention

*مراحل دو تا چهار 35 بار تکرار می­گردد.

 



نتایج

نتایج طیف­سنجی نشان داد که DNA استخراج شده از دو نمونه بافت موجود و 5 نمونه سرگین از کیفیت مناسبی برای PCR برخوردار است و بقیه نمونه­ها فاقد DNA بودند. این نمونه­ها (2 نمونه بافت و 5 نمونه سرگین) با استفاده از یک جفت پرایمر (Cytb F, Cytb R) در دمای اتصال 55 درجه سانتی‌گراد در دستگاه PCR تکثیر شد. الکتروفورز محصولات PCR روی ژل آگارز 2% نشان داد که قطعه اختصاصی برای سیتوکروم b  به طول 1140 جفت باز به خوبی برای نمونه­های بافت تکثیر شده است. اما، نمونه­های سرگین PCR شده داری کیفیت خوبی برای فرستادن به توالی­یابی نبودند. برای تکثیر بهتر DNA  نمونه­های سرگین  از دو جفت پرایمر Cytb F-Cytbin R) ،(Cytb R-Cytbin F  استفاده شد. الکتروفورز محصولات PCR شده نشان داد که پنج نمونه سرگین که با این دو جفت پرایمر آزمایش شدند داری باند خوب و واضحی برای فرستادن به توالی­یابی بودند (شکل 4(.


 

شکل 4- الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره ای پلیمراز به طول 741 جفت باز روی ژل آگارز 2%.

Figure 4-  Electrophoresis of 741bp PCR products on 2% agarose gel.

 

 

نتایج حاصل از توالی­یابی برای همه نمونه­ها با توجه به کیفیت خوب آن‌ها مورد آنالیز قرار گرفت. با استفاده از ابزار BLAST تعیین همولوژی توالی­ نمونه­های پناهگاه حیات ­وحش بوروئیه با توالی­های گرفته شده از GenBank که شامل قوچ و میش­های اوریال و ارمنی بود  صورت پذیرفت. حدود 21 توالی از این دو گونه   و 7 نمونه از منطقه مورد مطالعه مورد استفاده قرار گرفت. در ترسیم درخت فیلوژنی از توالی کل و بز (aegagrus Capra) ثبت شده در ژن بانک به عنوان گروه خارجیاستفاده شد. (جدول 3).


 


جدول 3- تعداد توالی­های مورد استفاده برای رسم درخت فیلوژنتیک.

Table 3- The number of sequence used to draw phylogenetic tree.

تعداد توالی No. sequence

گونه  Species

7

پناهگاه حیات­وحش بوروئیه

4

قوچ اوریال Ovis vignei

5

قوچ ارمنی Ovis orientalis

3

قوچ منطقه البرز مرکزی Ovis orientalis* vignei

3

قوچ منطقه اصفهان Isphahanica Ovis orientalis

3

قوچ منطقه لارستان Ovis orientalis laristanica

3

قوچ منطقه کرمان Ovis orientalis laristanica* cycleceros

 

 

مقایسه بین هفت توالی قوچ و میش­های پناهگاه حیات وحش بوروئیه با استفاده از ابزار Disparity Index Analysis ، در نرم­افزار MEGA، نشان دهنده عدم وجود اختلاف بین آنها بود. در نتیجه می­توان گفت جمعیت مورد مطالعه فاقد تنوع هاپلوتیپی بود.

نتایج حاصل از آزمون فیلوژنتیکی بر اساس Neighbor-Joining به صورت درخت رسم شد (شکل 4). ترسیم درخت فیلوژنتیک برای قوچ و میش­های پناهگاه حیات وحش بوروئیه با استفاده از توالی­های سیتوکرومی ثبت شده در Gen Bank تشابه قوچ و میش­های این منطقه را با قوچ و میش ارمنی تأیید می­نماید. با مقایسه توالی­های مورد مطالعه با توالی­های برگرفته از GenBank مشخص شد که قوچ و میش­های پناهگاه حیات وحش بوروئیه فاصله ژنتیکی چندانی با قوچ و میش­های منطقه اصفهان و لارستان ندارند. فراوانی هر یک از نوکلئوتیدها در نرم­افزار MEGA.5 محاسبه شد (Tamura et al., 2007). باز آدنین بیشترین فراوانی و باز گوانین کم‌ترین فراوانی را داشت (جدول 4).

میزان جانشینی نوع اول (جانشینی بازهای پورین A-G با یکدیگر و جانشینی بازهای پیریمیدین C-T با یکدیگر) و جانشینی نوع دوم (جانشینی بازهای پورین و پریمیدین با یکدیگر) در نمونه­های پناهگاه حیات ­وحش بوروئیه محاسبه شده است (جدول 5). در این جدول اعدادی که به صورت پررنگ نشان داده شده­اند نرخ جانشینی نوع اول را بیان می­کنند و سایر اعداد نشان­دهنده نرخ جانشینی نوع دوم هستند. الگوهای جانشینی و نرخ­ها بر اساس مدل تامورا-نئی در نرم­افزار مگا برآورد شده است (Tamura and Nei, 1993).


 

 


 

شکل 4-  درخت فیلوژنتیک  قوچ و میش بر اساس توالی­های سیتوکروم b.

  Figure 4- Phylogram of the Ovis based on cytochrome b sequences.

 

جدول 4- فراوانی نوکلئوتیدها حاصل از توالی­های قوچ و میش پناهگاه حیات­ وحش بوورئیه.

Table 4- Nucleotide abundance of wild sheep of Buruieh Wildlife Refuge sequences.

G

C

T/U

A

نوکلئوتید  nucleotide

12.98

28.68

26.93

31.40

فراوانی     abundance

 

جدول 5- تخمین الگوهای جانشینی نوکلئوتیدی.

Tabale 5- Estimate of substitution pattern nucleotide.

نوکلئوتید  nucleotide

A

T/U

C

G

A

-

8.98

9.56

4.32

T/U

10.47

-

9.56

4.33

C

10.47

8.97

-

4.33

G

10.46

8.98

9.56

-

 


 

 

ماتریس فواصل ژنتیکی بین گونه­ها بر اساس مقایسه توالی­های هر گروه با بقیه گروه­ها به صورت دو به دو و با استفاده از مدل حداکثر درست­نمایی ترکیبی (Tamura et al., 2004) به دست آمده است. از آنجا که اعداد حاصله نمایان­گر میزان جانشینی نوکلئوتیدها بین توالی­های گونه­های مورد بررسی می­باشند، فاصله ژنتیکی بین دو گونه مرتبط با همبستگی فیلوژنتیکی بین آن­ گونه­ها خواهد بود. در نتیجه از این شاخص می­توان برای مشخص کردن دوری یا نزدیکی گونه­ها از هم استفاده نمود. محاسبه ماتریس فواصل ژنتیکی بین توالی­های پناهگاه حیات وحش بوروئیه (هفت نمونه یک هاپلوتیپ مشترک)، یک توالی از­ منطقه حفاظت­شده کوه بافق حاصل از مطالعه .Rezaei et al (2010) و دو توالی از قوچ و میش­های اوریال و ارمنی نشان­دهنده تعلق گونه مورد مطالعه، به گونه قوچ ارمنی Ovis orientalis می­باشد. همان‌طور که مشاهده می­شود کم‌ترین فاصله ژنتیکی گونه مورد مطالعه با گونه قوچ ارمنی می­باشد که معادل 0009/0 است. ترسیم درخت فیلوژنتیک نیز صحت این گفته­ها را تأیید می­کند (جدول 6).


 

جدول 6- فواصل ژنتیکی بین توالی­ها.

Table 6- Genetic distances between sequences.

4

3

2

1

 

 

 

 

 

1. IR281.Bafgh PA

 

 

 

0.0240

2.OV9.Buruieh WR

 

 

0.0009

0.0250

3.OOS1.O Orientalis

 

0.0260

0.0250

0.0045

4.OVNo4.O Vignei

 


بحث و نتیجه­گیری

نمونه­های سرگین با توجه به اینکه دارای DNA کمی در خود هستند و یا اینکه DNA آن‌ها می­تواند در منطقه در مجاورت عوامل محیطی تخریب یا از بین برود داری باند ضعیف­تر یا فاقد باند به نسبت بافت هستند، بنابراین برای تکثیر بهتر DNA نمونه­های سرگین از همان ابتدا پیشنهاد می­شود از دو جفت پرایمر Cytb F-Cytbin R) ،(Cytb R-Cytbin F  استفاده شود و نمونه­های بافت که DNA کافی را دارا هستند برای تکثیر DNA آن­ها از یک جفت پرایمر Cytb F) ،(Cytb R استفاده کرد. قوچ و میش­های شمال شرق و جنوب شرق ایران قوچ و میش اوریال هستند. قوچ و میش­های شمال­غرب ایران، اصفهان، لارستان قوچ و میش ارمنی هستند (Valdez et al., 1978 Nadler et al., 1971). حتی مناطقی مانند پارک ملی خبر، بمو، خجیر و شهر بابک دارای دو گونه قوچ و میش اوریال و ارمنی هستند (rezaei et al., 2010)، که نشان­دهنده پیچیدگی ژنتیکی و هیبرید بین قوچ و میش­های مناطق مختلف ایران است. قوچ و میش­های منطقه بوروئیه از لحاظ ژنتیکی قرابت زیادی با گونه قوچ و میش ارمنی دارند و می­توان آن را قوچ و میش ارمنی نامید. قوچ و میش­های منطقه مورد مطالعه با قوچ و میش­های ارمنی، اصفهان و لارستان در یک شاخه از درخت فیلوژنتیک قرار گرفتند. قوچ و میش­های اوریال منطقه کرمان در شاخه دیگر قرار گرفتند.

به طور کلی به جز در مناطق شرق ایران که قوچ­های اوریال خالص و غرب ایران که قوچ­های ارمنی خالص زندگی می­کنند، در بسیاری از دیگر مناطق کشور، قوچ و میش­ها از نظر فرم شاخ، اندازه جثه، رنگ و حتی تعداد کروموزوم­ها با یکدیگر متفاوت هستند (Ziaie, 2008). از لحاظ طبقه­بندی مشکل اساسی در مناطق مرکزی ایران وجود دارد که هر یک از جمعیت­ها از لحاظ خصوصیات ظاهری و ژنتیکی با جمعیت دیگر کاملاً متفاوت می­باشند که وابسته به میزان آمیزش دو گونه شرقی و غربی در آن زیستگاه است. در مناطق مرکزی ایران و محل تلاقی دو گونه قوچ اوریال و قوچ ارمنی امکان تولید مثل بین این دو گونه وجود دارد و افراد این جمعیت­ها می­توانند دارای 54 الی 58 کروموزم باشند (Valdez et al.,1978). نتایج این پژوهش با نتایجZiaie  (2008) که قوچ­های ایران را یک گونه با اسم علمی Ovis orientalis می­نامید و قوچ و میش­های مناطق مختلف ایران را به عنوان زیرگونه­ای از این گونه نام می­برد کاملاً متفاوت بود. در آخرین پژوهشی که بر اساس مطالعات مولکولی در سطح جهان انجام شد، قوچ و میش‌های ایران به دو گونه اوریال و ارمنی تقسیم می­شوند و همه قوچ و میش­هایی که در تحقیقات قبلی به عنوان زیرگونه در ایران مطرح بودند، به عنوان قوچ اوریال یا ارمنی نام‌گذاری شده­اند (Rezaei et al., 2010)، در این مطالعه که بیشتر مناطق ایران را پوشش داده بود، قوچ و میش­های منطقه حفاظت­شده کوه بافق استان یزد نیز در این پژوهش مورد بررسی قرار گرفته بودند و نتایج به دست آمده نشان داده بود که قوچ و میش­های کوه بافق، در رده­بندی قوچ و میش­های ایران جز قوچ و میش اوریال است و گونه­ای متفاوت از پناهگاه حیات ­وحش بوروئیه در استان یزد است که تحقیقات ما نشان داد. درخت فیلوژنتیکی حاصل از رسم توالی­ قوچ و میش­های پناهگاه حیات وحش بوروئیه با توالی­­های منطقه حفاظت­شده کوه بافق، جدایی این قوچ­ها را از نظر گونه نشان می­دهد (شکل 5).

 

 

 

 

شکل 5- درخت فیلوژنتیک قوچ بر اساس توالی­های سیتوکروم b.

  Figure 5- Phylogram of the Ovis based on cytochrome b sequences.

 

 

درخت فیلوژنتیکی حاصل از قوچ و میش­های پناهگاه حیات وحش بوروئیه و نقاط دیگر نشان می­دهد که قوچ و میش­های منطقه بوروئیه از لحاظ ژنتیکی تفاوت کمی با قوچ و میش­های ارمنی دارند. قوچ و میش­های پناهگاه حیات­ وحش بوروئیه را نمی­­توان به عنوان زیرگونه­ای از قوچ ارمنی معرفی کرد، بلکه باید آن را به عنوان قوچ ارمنی نام‌گذاری کرد. نتایج ما با نتایج .Nadler et al  (1971)و در آخرین مطالعه­ای که .Rezaei et al (2010) که قوچ و میش­های جهان را طبقه­بندی کردند همخوانی دارد و نشان می­دهد که قوچ و میش­های ایران را اوریال و ارمنی تشکیل می­دهند و هیبریدهایی از این دو گونه در مناطق مختلف کشور وجود دارد. تحقیقات Rezaei et al. (2010) نشان داد که در یک منطقه حفاظتی از هر دو گونه قوچ و میش اوریال و ارمنی می­توانند حضور داشته باشد که در مطالعات قبلی به اشتباه زیرگونه در نظر گرفته می­شدند، مناطقی مانند پارک ملی خبر، بمو، خجیر و شهر بابک دارای دو گونه قوچ و میش اوریال و ارمنی بودند.

نتیجه­گیری کلی

قوچ و میش­های منطقه بوروئیه که در جنوبی­ترین قسمت استان یزد قرار دارند جزء قوچ و میش­های ارمنی (Ovis orientalis) هستند و از لحاظ ژنتیکی تفاوت کمی با قوچ و میش­های ارمنی دارند و با قوچ و میش­های اوریال کاملا متفاوت­اند. این قوچ و میش­ها دارای یک هاپلوتایپ مشترک هستند، این مسئله تنوع ژنتیکی پایینی را در این منطقه نشان می­دهد، که در کارهای مدیریتی دراز مدت در آینده باید به طور جدی به آن توجه شود. تعداد نمونه پایین و همچنین عدم استفاده از چند جایگاه می­تواند محدودیت­هایی باشد که با مرتفع نمودن آن­ها در مطالعات بعدی می­توان با یقین بیشتری در این مورد سخن گفت. انتقال قوچ و میش­های ارمنی از دیگر نقاط کشور به این منطقه یکی از راهکارهایی است که برای افزایش تنوع ژنتیکی این منطقه پیشنهاد می­شود که این انتقال نیاز به مطالعات فراوان دارد.

 


تقدیر و تشکر

بدین­ وسیله از مساعدت­های اداره کل محیط­زیست استان یزد به خصوص جناب آقای دکتر حسن اکبری معاون محیط طبیعی اداره کل محیط زیست استان یزد و آقای مهندس حیدری رئیس اداره محیط زیست شهرستان خاتم سپاس­گزاری می­شود. از محیط­بان تلاش­گر و علاقه­مند پناهگاه حیات ­وحش بوروئیه جناب آقای مهندس حجت تیموری که در مطالعات میدانی و جمع­آوری نمونه­ها همکاری نمودند تقدیر و تشکر می­شود. 

 

 

منابع

Aliabadian M, Kaboli, M, Nijman V, Vences M (2009). Molecular Identification of Birds: Performance of Distance-Based DNA Barcoding in Three Genes to Delimit Parapatric Species. Plos One 4:4119.

Askari N, Abadi MM, Baghizadeh A (2011). ISSR markers for assessing DNA polymorphism and genetic characterization of cattle, goat and sheep populations. Iranian Journal of Biotechnology 9: 222-9.

Bellagamba F, Moretti VM, Comincini S, Valfare F (2001). Identification of species in animal feedstuffs by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism analysis of mitochondrial DNA. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49:75-81.

Bruford M, Bradley D, Luikart G (2003). DNA markers reveal the complexity of livestock domestication. Nature Reviews Genetics 3:900-910.

Bunch TD, Wu C, Zhang YP, Wang S (2006). Phylogenetic analysis of snow sheep (Ovis nivicola) and closely related taxa. Journal of Heredity 97:21–30.

Cann RL, Stoneking M, Wilson AC (1987). Mitochondrial DNA and human evolution. Nature 325:31–36.

Corbet GB, and Hill JE (1991). A world list of mammalian species. 3rd ed. Brithish museum (Natural History); London. 243 pp.

Entekhabi H (2009). Yazd Province Atlas of Natural Features. edn 1. NAQSH-E MANA Press Pp:181.

Fadakar D (2013) Genetic diversity of gazzela in central part of Iran using cytochrome b equencing. M.Sc. thesis. Environmental Sciences, College of Fisheries and Environmental Sciences, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources. Gorgan. Iran.

Funk DJ, Omland KE (2003). Species-level Paraphyly and Polyphyly: Frequency,Causes, and Consequences, with Insights from Animal Mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 34:397-423.

Hosseini SM, Rezaei HR, Varasteh H, Naderi S (2013). The importance of Molecular studies in Taxonomy and Phylogeny of Wild Sheep in the world and Iran. First National Conference on Environmental Protection and Planning.

Johanson KP, De Kort S, Dinwoodey K, Mateman AC, Ten Cate C,  Lessells CM, Clayton DH (2001). A molecular phylogeny of the Dove genera Streptopelia and Columba. The Auk 118:874-887.

König C, Weick F, Becking JH (2008). Owls of the World, 2nd edition. Christopher Helm.

Lonsman RA, Avise JC, Aquadro CF, Shapira JF (1983). Extensive genetic variation in mitochondrial DNAs among geographic populations of the deer mouse (Perromyscus maniculatus). Evolution 37:1-16.

Nadler CF, Hoffmann RS, Woolf A (1973). G-band patterns as chromosomal markers, and the interpretation of chromosomal evolution in wild sheep (Ovis). Experientia 29:117–119.

Nadler CF, Lay DM, Hassinger JD (1971). Cytogenetic analyses of wild sheep populations in northern Iran. Cytogenetics 10, 137–152.

Pedrosa S, Uzun M, Arranz JJ, Gutierrez-Gil B, San Primitivo F, Bayon Y (2005). Evidence of three maternal lineages in Near Eastern sheep supporting multiple domestication events. Proceeding of the Royal Society of London Serie BBiological Sciences 272:2211–2217.

Rezaei HR, Naderi S, Chintauan-Marquier IC, Taberlet P, Virk AT, Naghash HR,  Rioux D, Kaboli M, Pompanon F (2010). Evolution and taxonomy of the wild species of the genus Ovis (Mammalia, Artiodactyla, Bovidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 54:315–326.                                         

Rokas A, Ladoukakis E, Zouros E (2003). Animal mitochondrial DNA recombination revisited. Trends in Ecology and Evolution 18:411- 417.

Schlick N, Jensen-Seaman M, Orlebeke K, Kwitek A, Jacob H, Lazar J (2006). Sequence analysis of the complete mitochondrial DNA in 10 commonly used inbred rat strains. American Journal of Physiology-Cell Physiology 291:1183-1192.

Shojaei M, Mohammad Abadi M, Asadi Fozi M, Dayani O, Khezri A, Akhondi M (2010). Association of growth trait and Leptin gene polymorphism in Kermani sheep. Journal of Cell and Molecular Research 2: 67-73.

Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S (2007). MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599.

Tamura K, Nei M (1993). Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution 10:512-526.

Tamura K, Nei M, Kumar S (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

Torroni A, Achilli A, Macaulay V, Richards M, Bandelt HJ (2006). Harvesting the fruit of the human mtDNA tree. Trends Gene 22:339–345.

Valdez R, Nadler CF, Bunch TD (1978). Evolution of wild sheep in Iran. Evolution 32:56–72.                                                                                                                                          

Wiesner RJ, Ruegg JC, Morano I (1992). Counting target molecules by exponential polymerase chain reaction, copy number of mitochondrial DNA in rat tissues. Biochemical and Biophysical Resaerch Communication 183:553–559.

Wink M, Heidrich P (2000). Molecular systematic of owls based on DNA sequences of mitochondrial cytochrome b gene. Proceedings of the World Conference on Birds of Prey and Owls 819-828.

Ziaie H (2008). A field guide to the mammals of Iran, 2 edn. Iran wildlife center.

 


Genetic and Phylogenetic Analysis of Cytochrome b region in Wild Sheep of Buruieh Wildlife Refuge

 

 

Hosseini S.M.* 1, Rezaei H.R.2, Varasteh H.3, Naderi S.4, Nikooy F.1

 

1MSc, Environmental Sciences Department, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, I.R. Iran.

2Assist Prof., College of Fisheries and Environmental Sciences, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, I.R. Iran.

3Assist Prof., College of Fisheries and Environmental Sciences, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, I.R. Iran.

4Assist Prof., College of Environmental Sciences, Guilan University, I.R. Iran.

 

 

Abstract     

Wild sheep is belonging to Bovidae family and genus ovis which living in the most regions of Iran. There are many challenges between researchers about Wild Sheep species taxonomy. This study aims to investigate genetic and phylogenetic analysis of cytochrome b region of ovis orientalis's mtDNA in the Buruieh wildlife refuge in order to determine the correct taxonomy. With this regard, 17 samples of ovis orientalis stool and tissue were collected from Buruieh Wildlife Refuge in Khatam Township. After DNA extraction 1140, 741, 765 bp fragment of the mitochondrial cytochrome b was amplified with primers Cytb F-Cytb R, Cytb F- Cytbin R and Cytb R-Cytbin F under polymerase chain reaction .Amplified fragments were sequenced by ABI 3130 automated device with Sanger method. The results were compared with sequences from other studies to determine the genetic distances. Hoplotype variations were not observed in the nucleotide sequences obtained in this study. Using the Neighbor-Joining phylogenetic test results showed that the Buruieh Wildlife Refuge wild sheep is placed in the group of ovis orientalis and is different from other ovis orientalis populations all around Iran in the terms of Hoplotype. Our results demonstrated that the Buruieh Refuge Wildlife Sheeps have low genetic diversity which should be considered at the long-time managment activities in the future.

 

Keywords: Wild Sheep, Buruieh Wildlife Refuge, Phylogeny, Cytochrome b.



*  نویسنده مسئول: سید مجید حسینی                تلفن: 09189168387                            Email: majid.hosseini93@yahoo.com

[1] cytochrome b

[2] Maximum parsimony        

[3] Bayesian

[4] Maximum likelihood        

[5] Neighbor-Joining  

[6] Wild Sheep

[7] Bovidae

[8] Artiodactyla

[9] Forward  Primer

[10] Reverse Primer

[11] National Center for Biotechnology Information

* Corresponding Author: Hosseini S.M.      Tel: 09189168387              Email: majid.hosseini93@yahoo.com

 
Aliabadian M, Kaboli, M, Nijman V, Vences M (2009). Molecular Identification of Birds: Performance of Distance-Based DNA Barcoding in Three Genes to Delimit Parapatric Species. Plos One 4:4119.
Askari N, Abadi MM, Baghizadeh A (2011). ISSR markers for assessing DNA polymorphism and genetic characterization of cattle, goat and sheep populations. Iranian Journal of Biotechnology 9: 222-9.
Bellagamba F, Moretti VM, Comincini S, Valfare F (2001). Identification of species in animal feedstuffs by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism analysis of mitochondrial DNA. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49:75-81.
Bruford M, Bradley D, Luikart G (2003). DNA markers reveal the complexity of livestock domestication. Nature Reviews Genetics 3:900-910.
Bunch TD, Wu C, Zhang YP, Wang S (2006). Phylogenetic analysis of snow sheep (Ovis nivicola) and closely related taxa. Journal of Heredity 97:21–30.
Cann RL, Stoneking M, Wilson AC (1987). Mitochondrial DNA and human evolution. Nature 325:31–36.
Corbet GB, and Hill JE (1991). A world list of mammalian species. 3rd ed. Brithish museum (Natural History); London. 243 pp.
Entekhabi H (2009). Yazd Province Atlas of Natural Features. edn 1. NAQSH-E MANA Press Pp:181.
Fadakar D (2013) Genetic diversity of gazzela in central part of Iran using cytochrome b equencing. M.Sc. thesis. Environmental Sciences, College of Fisheries and Environmental Sciences, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources. Gorgan. Iran.
Funk DJ, Omland KE (2003). Species-level Paraphyly and Polyphyly: Frequency,Causes, and Consequences, with Insights from Animal Mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 34:397-423.
Hosseini SM, Rezaei HR, Varasteh H, Naderi S (2013). The importance of Molecular studies in Taxonomy and Phylogeny of Wild Sheep in the world and Iran. First National Conference on Environmental Protection and Planning.
Johanson KP, De Kort S, Dinwoodey K, Mateman AC, Ten Cate C,  Lessells CM, Clayton DH (2001). A molecular phylogeny of the Dove genera Streptopelia and Columba. The Auk 118:874-887.
König C, Weick F, Becking JH (2008). Owls of the World, 2nd edition. Christopher Helm.
Lonsman RA, Avise JC, Aquadro CF, Shapira JF (1983). Extensive genetic variation in mitochondrial DNAs among geographic populations of the deer mouse (Perromyscus maniculatus). Evolution 37:1-16.
Nadler CF, Hoffmann RS, Woolf A (1973). G-band patterns as chromosomal markers, and the interpretation of chromosomal evolution in wild sheep (Ovis). Experientia 29:117–119.
Nadler CF, Lay DM, Hassinger JD (1971). Cytogenetic analyses of wild sheep populations in northern Iran. Cytogenetics 10, 137–152.
Pedrosa S, Uzun M, Arranz JJ, Gutierrez-Gil B, San Primitivo F, Bayon Y (2005). Evidence of three maternal lineages in Near Eastern sheep supporting multiple domestication events. Proceeding of the Royal Society of London Serie BBiological Sciences 272:2211–2217.
Rezaei HR, Naderi S, Chintauan-Marquier IC, Taberlet P, Virk AT, Naghash HR,  Rioux D, Kaboli M, Pompanon F (2010). Evolution and taxonomy of the wild species of the genus Ovis (Mammalia, Artiodactyla, Bovidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 54:315–326.                                         
Rokas A, Ladoukakis E, Zouros E (2003). Animal mitochondrial DNA recombination revisited. Trends in Ecology and Evolution 18:411- 417.
Schlick N, Jensen-Seaman M, Orlebeke K, Kwitek A, Jacob H, Lazar J (2006). Sequence analysis of the complete mitochondrial DNA in 10 commonly used inbred rat strains. American Journal of Physiology-Cell Physiology 291:1183-1192.
Shojaei M, Mohammad Abadi M, Asadi Fozi M, Dayani O, Khezri A, Akhondi M (2010). Association of growth trait and Leptin gene polymorphism in Kermani sheep. Journal of Cell and Molecular Research 2: 67-73.
Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S (2007). MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599.
Tamura K, Nei M (1993). Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution 10:512-526.
Tamura K, Nei M, Kumar S (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.
Torroni A, Achilli A, Macaulay V, Richards M, Bandelt HJ (2006). Harvesting the fruit of the human mtDNA tree. Trends Gene 22:339–345.
Valdez R, Nadler CF, Bunch TD (1978). Evolution of wild sheep in Iran. Evolution 32:56–72.                                                                                                                                          
Wiesner RJ, Ruegg JC, Morano I (1992). Counting target molecules by exponential polymerase chain reaction, copy number of mitochondrial DNA in rat tissues. Biochemical and Biophysical Resaerch Communication 183:553–559.
Wink M, Heidrich P (2000). Molecular systematic of owls based on DNA sequences of mitochondrial cytochrome b gene. Proceedings of the World Conference on Birds of Prey and Owls 819-828.
Ziaie H (2008). A field guide to the mammals of Iran, 2 edn. Iran wildlife center.