تجزیه و تحلیل مولکولی جمعیتی از مرغ بومی مازندران با استفاده از توالی ناحیه HVR-I ژنوم میتوکندری

تجزیه و تحلیل مولکولی جمعیتی از مرغ بومی مازندران با استفاده از توالی ناحیه HVR-I ژنوم میتوکندری

نصرالله پیرانی^١*، آرزو محمدهاشمی²، صادق علیجانی¹، رامین رضازاده گلی¹، صابر قنبری ³

^١ گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز

^٢گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه مشهد

³ دانشگاه گوتنینگن آلمان

چکیده

حفظ تنوع ژنتیکی در جمعیت­های بومی مرغ در نقاط مختلف ایران به دلیل اندازه کم جمعیت آنان برای انجام برنامه­های اصلاح نژادی و افزایش تولید ضروری است. اولین گام در این راه تعیین تنوع ژنتیکی در این جمعیت­ها است. بررسی توالی ناحیه HVR-I ژنوم میوکندری می­تواند شاخصی مناسبی از میزان تنوع موجود در جمعیت­های مورد بررسی ارائه دهد. هدف از این تحقیق تعیین توالی ناحیه HVR-I از ژنوم میتوکندری جمعیتی از مرغ مازندرانی ایران، تعیین میزان تنوع موجود در این جمعیت و ترسیم رابطه فیلوژنی آن با سایر نژادهای مرغ بود. به این منظور از تعداد 20 قطعه مرغ مازندرانی به طور تصادفی خون­گیری انجام شد. پس از استخراج DNA از خون کامل، ناحیه HVR-I با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تکثیر و قطعات تکثیر شده پس خالص سازی توالی یابی شدند. در کل 19 توالی با کیفیت مناسب بدست آمد. پس از اخذ توالی­های مشابه ژنوم میتوکندری دیگر نژادهای موجود در بانک جهانی ژن و مرغ مرندی ایران درخت فیلوژنی با استفاده از آنها ترسیم شد. نتایج فیلوژنی مشخص کرد که مرغ بومی مازندرانی ایران با مرغ مرندی ایران، بومی کشور آذربایجان، لگهورن سفید، پلیموتراک پر خط­دار، مرغ ابریشمی و جنگلی خاکستری (سونراتی) در یک دسته قرار دارند. بنابراین، می­توان نتیجه­گیری کرد که مرغ مازندرانی احتمالا" واجد برخی شباهت­های ژنتیکی با این نژادها می­باشد.

واژه­های کلیدی: تعیین توالی، ژنوم میتوکندری، فیلوژنی، مرغ بومی مازندرانی، ناحیه بسیار متغیر 1.

مقدمه

وجود بیش از یکصد توده ژنتیکی بومی دام و طیور در ایران که با شرایط محل زندگــی خود به خوبی سازگــار شده و نسبت به بیماری های منطقه ای مقاومت نسبی پیدا کرده اند، از سرمایه­های مهم و ملی کشور به­شمار می آیند (Tavakolian, 1999). پرورش مرغ بومی از دیرباز در نقاط مختلف روستایی و حتی شهری، بخصوص در مناطق شمالی ایران رایج بوده و پرورش دهندگان علاوه بر نیازهای خود، مازاد تولیدات را به فروش می رسانند. از این رو ضمن ایجاد اشتغال، کمک به اقتصاد خانوارهای روستایی و در تولید بخشی از منابع غذایی نقش مهمی ایفا می کنند. بنابراین، استفاده از طیور بومی به عنوان جمعیت مولد ژنتیکی پایه در برنامه­های اصلاح نژادی طیور کشور دارای مزایای بسیاری است و شناخت دقیق تر و کسب اطلاعات بیشتر در مورد آنها جهت حفظ این ذخایر ژنتیکی ضروری به­نظر می رسد. یکی از راههای شناسایی این نژادها استفاده از تکنیکهای مولکولی بخصوص استفاده از ژنوم میتوکندری (mtDNA) است. میتوکندری اندامکی سیتوپلاسمی است که در بیشتر سلول­های بدن وجود دارند. این اندامک که قادر به تولید انرژی برای سلول است دارای DNA حلقوی اختصاصی و مستقل از DNA هسته ای است و در گونه­های جانوری 37 ژن را کد می­کند که شامل 13 ژن کد کننده زنجیره تنفسی، 22 ژن کد کننده tRNA و 2 ژن کد کننده rRNA است و طول تقریبی آن در طیور 16 کیلو جفت باز می باشد (Wallce, 1992). ژنوم میتوکندری دارای ناحیه­ای به نام D-loop یا ناحیه کنترل[1] است که فاقد هر گونه ژن رمز کننده­ای بوده و بنابراین وقوع هر نوع جهش می­تواند در آنجا تثبیت شود و میزان جهش نوکلئوتیدها در این منطقه حدود 10 برابر DNA هسته­ای است (Anderson et al., 1981). میزان بالای جهش و وجود تفاوت در افراد مختلف در این ناحیه سبب شده تا توالی­یابی بخش­های مختلف این ناحیه از ژنوم میتوکندری جهت تعیین تنوع ژنتیکی و شناسایی منشأ نژادهای مختلف مورد توجه قرار گیرد. ناحیه D-loop به سه ناحیه کنترلی کاملاً مشخص تقسیم می­شود. قطعه آغازین یا ناحیه کنترل^[2] I (HVR-I) در انتهای′3، قطعه انتهایی یا ناحیه کنترل  III(HVR-III) در انتهای ′5 و قطعه میانی یا ناحیه کنترل II در بین دو ناحیه فوق قرار دارد. نواحی کنترل I و III دارای بالاترین میزان تغییرات نوکلئوتیدی در افراد مختلف هستند و به خاطر تکامل سریع، مطالعه توالی این نواحی در بررسی تنوع ژنتیکی و ارزیابی روابط میان گونه­ها بسیار ارزشمند است، اما ناحیه کنترل II اغلب توالی حفاظت شده­ای دارد و دارای کمترین میزان تغییرات نوکلئوتیدی است (Sultana & Mannen, 2004). از کاربردهای ژنوم میتوکندری می­توان به تشخیص همزمان گوشت گونه های مختلف مثل گاو، گاو میش، گوسفند و بز در مخلوط گوشت (Pirany & Elyasi Zarrin Ghobai, 2009 )، تشخیص وجود بقایای طیور و نشخوارکنندگان در نمونه هایی از پودر ماهی (Heravy et al., 2007)، تشخیص هویت (Lutz et al., 1998) و تشخیص تنوع ژنتیکی و تعیین رابطه فیلوژنتیکی بین جمعیت­ها و گونه­های نزدیک به هم (Hiendleder et al., 1998) اشاره نمود. اولین توالی کامل ژنوم میتوکندری مرغ به طول 16775 جفت باز و همچنین طول ژن­های مختلف واقع بر آن و ناحیه D-loop به طول 1227 با کد دسترسی X52392 گزارش شده است (Desjardins & Morais, 1990). استفاده از نواحی کنترلی میتوکندری در آنالیز­های مولکولی اولین بار با مطالعه ناحیه کنترل غیر کد کننده mtDNA پرندگان مختلف به روش RFLP صورت گرفت و زیر گونه مرغ جنگلی قرمز (گالوس گالوس) به عنوان جد مادری تمام نژادهای اهلی معرفی شد (Fumihito et al., 1994). از آن زمان تا کنون مطالعات بر پایه توالی ژنوم میتوکندری سرعت یافته است. در مطالعه دیگری توالی ناحیه D-Loop میتوکندری به طول 1232-1231 جفت باز در 20 نژاد مرغ بومی ژاپنی و همچنین لگهورن سفید، ردآیلندرد و مرغهای بومی اندونزیایی بررسی و روابط فیلوژنتیک و مسیر و منشأ مادریشان مورد بررسی قرار گرفتند. در مطالعه فوق 42 هاپلوتیپ و 7 هاپلوگروه (A تا G) مشخص شد (Oka et al., 2007). در مطالعه دیگری که روی ژنوم میتوکندری 140 پرنده از زیر گونه­های مرغ جنگلی لافایتی، سبز و قرمز انجام گرفت، 44 عدد SNP از 42 هاپلوتیپ از 6 گروه هاپلوئیدی شناسایی شد (Silva et al., 2008). همچنین در تحقیقی که بر روی مرغ مرندی ایران انجام گرفته است پس از توالی یابی و بررسی تنوع در قطعه HVR-I تعداد 5 هاپلوتیپ مشاهده شد (Mohammadi Pestehbig, 2009). هدف از این تحقیق تعیین و بررسی توالی نوکلئوتیدهای بخش HVR-I از ناحیه D-loop ژنوم میتوکندری مرغ بومی مازندران ایران بود تا اطلاعاتی از وضعیت توالی این ناحیه از ژنوم میتوکندری این نژاد بدست آورده و ضمن مقایسه با سایر نژادها توالی بدست آمده برای این توده بومی در بانک جهانی ژن ثبت شود.

مواد و روش ها

نمونه ها و استخراج DNA

برای اجرای این پژوهش نمونه های خون به طور تصادفی از تعداد 20 قطعه مرغ (10 مرغ و 10 خروس) غیرخویشاوند مازندرانی گرفته شد. نمونه های خون مورد استفاده در این پژوهش از جوجه­های مازاد مرکز اصلاح نژاد مرغ بومی مازندران اخذ شد (شکل 1).

استخراج DNA توسط یک روش بهینه یافته انجام شد (Bailes et al., 2007). کمیت DNA استخراج شده با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر و کیفیت آن با الکتروفورز روی ژل آگارز 8/0 درصد تعیین شد.

شکل1- گله مرغ مازندرانی.

Figure 1- Mazandrani chicken flock.

انتخاب آغازگرها و واکنش زنجیره ای پلیمراز

در این پژوهش از دو آغازگر اختصاصی رفت و برگشت ناحیه (قسمت اول ناحیه D-loop) ژنوم میتوکندری گونه مرغ که 20 نوکلئوتید طول داشتند استفاده شد. آغازگر رفت در فاصله 16775-16756 بازی و آغازگر برگشت هم در فاصله 668-649 بازی از ژنوم کامل میتوکندری مرغ اهلی با شماره دسترسی X52392)) متصل می شدند (Desjardins & Morais, 1990). توالی دو آغازگر به شرح زیر است (شرکت MWG آلمان).

F (5’-GGCTTGAAAAGCCATTGTTG-3’)

 R (5’-CCCCAAAAAGAGAAGGAACC-3’)

دو آغازگر M13-F (5'-GTAAAACGACGCCAG-3') و M13-R- (CAGGAAACAGCTAGGAC-3') به انتهای 5َ هر کدام از آغازگرهای تکثیر کننده ناحیه HVR-I متصل شدند. این توالی­های جهانی جهت ایجاد نقاط هدف برای آغازگرهای تعیین توالی بعد از تولید محصولات واکنش زنجیره ای مورد استفاده قرار گرفتند. واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از مخلوط Taq شروع گرم[3] (شرکت کیاژن آلمان) در حجم نهایی 20 میکرولیتر شامل 50 نانوگرم DNA ژنومی و 6 پیکومول از هر آغازگر انجام گرفت. برنامه حرارتی شامل دمای واسرشته شدن اولیه 94 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه، 30 چرخه دمایی با دمای واسرشت 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، دمای اتصال 55 درجه سانتیگراد مدت 45 ثانیه، دمای تکثیر 72 درجه سانتیگراد به مدت 90 ثانیه و دمای تکثیر نهایی 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه انجام شد. برای اطمینان از تکثیر قطعه مورد نظر، نمونه ها و DNA اندازه روی ژل آگارز (شرکت مرک آلمان) با غلظت 5/1 % الکتروفورز شدند (شکل 2).

تعیین توالی محصولات تکثیر شده

محصولات تکثیر شده با استفاده از کیت ExoSAP-IT (شرکت USB آلمان) تخلیص شده و سپس با استفاده از آغازگرهای فلورسنس دار مکمل با آغازگرهای متصل شده (M13-F و M13-R) و با استفاده از کیت توالی­یابی[4] (شرکت USB آلمان) توالی یابی شدند. بدین منظور محصولات آماده شده روی ژل پلی­آکریلامید 6 درصد دستگاه LICOR اجرا شدند. توالی های رفت و برگشت با استفاده از نرم افزار دستگاه فوق (شرکت LICOR آلمان) هم ردیف و توالی نهایی مشخص شد. پس از بررسی اولیه توالی­های حاصله از آنجا که مشخص شد تمامی تغییرات نوکلئوتیدی در فاصله 455 جفت بازی قرار دارند بنابراین همین اندازه مبنای مقایسه برای تمامی توالی های­ بدست آمده قرار گرفت.

تجزیه و تحلیل توالی ها

تجزیه و تحلیل توالی ها توسط برنامه های نرم افزاری مختلفی انجام گرفت. کلیه توالی­های مربوط به مرغ مازندرانی توسط نرم افزار MEGA 4 (Tamura et al., 2007) در یک فایل ادغام و پس از همردیف کردن توالی­های به دست آمده، نوکلئوتیدهای جایگزین، حذف و یا اضافه شده تعیین و هاپلوتیپ­ها نیز مشخص شدند. فاصله درون هاپلوتیپی، تنوع هاپلوتیپی (هتروزیگوسیتی) و تنوع نوکلئوتیدی (π) توسط نرم افزار Arlequin 3.5 (Excoffier et al., 2005) محاسبه شد. درخت فیلوژنی برای تعیین نزدیکی هاپلوتیپ­های این نژاد و نژاد مرندی پس از هم ردیف شدن توالی­های هر دو، توسط رویه NJ^[5] بر پایه ML^[6] به کمک نرم­افزار MEGA 4 رسم گردید. توالی کلی (جامع)[7] مرغ مازندرانی با توالی این ناحیه در نژاد و سویه­های مختلف مرغ اهلی اخذ شده از بانک ژن (NCBI, 2010) به همان طریق در ابتدا همردیف و سپس درخت فیلوژنی مربوطه ترسیم شد.

نتایج و بحث

کیفیت و اندازه تقریبی محصولات واکنش زنجیره ای پلی مراز در شکل 2 آورده شده است. با توجه به شکل فوق ضمن قابل قبول بودن کیفیت محصولات تکثیر شده اندازه آنها نیز در حد قابل انتظار بود.

شکل 2- الکتروفورز محصولات PCR. قطعات تکثیر شده در محدود باندهای 600 تا 700 قرار دارند (L: DNA اندازه 100 جفت بازی).

Figure 2- Electrophoresis of PCR products. The sizes of products are in the range of 600-700 bps (L: 100 bp DNA ladder).

توالی یابی در 19 نمونه به خوبی انجام گرفت و فقط در یک نمونه کیفیت خوبی نداشت که از مجموعه داده کنار گذاشته شد. به طور متوسط در تمام نمونه ها، تعداد 455 نوکلئوتید مورد استفاده قرار گرفتند که بیشترین تغییرات نوکلئوتیدی در آن ناحیه قرار داشتند. تعداد 6 هاپلوتیپ از بین توالی­های مورد بررسی تعیین شدند که دارای 10 جایگاه چند شکل (SNP) بودند. از جایگاههای چند شکل حاصله تعداد 9 عدد حاصل از تغییرات درون بازهای پورینی و یا پیریمیدینی[8] و یکی هم (جایگاه شماره 198) حاصل تبدیل به هر نوکلئوتید[9] دیگر بود. این تغییرات به طور عمده از نوکلئوتید شماره 198 تا 446 مشاهده شدند. ویژگی­های نمونه­های مورد بررسی در جدول 1 آورده شده است. نتایج جایگزینی نوکلئوتیدها در این تحقیق از نسبت جهش­ها­ در میان 4 نوکلئوتید موجود در ساختمان DNA که توسط سایرین (Li et al., 1984) گزارش شده پیروی می کند. به عنوام مثال در گزارش فوق سرعت جهش نسبی تبدیل نوکلئوتید تیپ وحشی C به A حدود 5/6 ذکر شده که این حالت هم در این تحقیق فقط در یک جایگاه (شماره 198) رخ داده است. بیشترین فراوانی نسبی هاپلوئیدی مربوط به نوع چهارم است که در حدود 4/47 درصد از موارد را شامل می­شود. بیشترین فاصله درون هاپلوتیپی بین ها­پلوتیپپ 4 با هاپلوتیپ­های 3 و 5 به ترتیب با 8 و 7 نوکلئوتید و کمترین نیز بین هاپلوتیپ­های 3 و5 و همچنین هاپلوتیپ 1 با هاپلوتیپ های 2 و 6 (با 1 نوکلئوتید) مشاهده شد.

تعدادی از جایگاههای چند شکل مشاهده شده در این تحقیق هم از نظر محل و هم از نظر نوع جایگزینی نوکلئوتیدی مطابق با تعدادی از گزارشات در رابطه با مرغ اهلی بود. به عنوان مثال 6 عدد از این چندشکلی­ها با آنچه برای مرغان اندونزیایی (Sulandari et al., 2008) و اقیانوسیه (Dancause et al., 2011) و 4 عدد نیز مشابه با مرغان ویتنامی (Cuc et al., 2011) بود. این مشابهت می­تواند دلیلی بر صحت توالی­های بدست آمده و همچنین وجود جد و یا اجداد مشترک بین جمعیت­های مورد بررسی باشد.

جدول1- SNP های به دست آمده برای هاپلوتیپ­های مرغ مازندرانی.

Table 1- SNP positions of Mazandrani chicken haplotypes.

از آنجا که تعداد جایگاههای چند شکل به تعداد نمونه وابسته می­باشد لذا از پارامتر دیگر یعنی تنوع نوکلئوتیدی (π) یا هتروزیگوسیتی در سطح نوکلئوتید استفاده شد که به طول DNA و اندازه نمونه بستگی ندارد و عبارت از متوسط تفاوت نوکلئوتیدی بین دو توالی در هر جایگاه می باشد (Nei, 1987). تنوع نوکلئوتیدی (π±SD) در جمعیت مرغ مازندرانی 0032/0±  0051/0 تخمین زده­ شد. مقدار تنوع نوکلئوتیدی در مطالعه حاضر در محدوده مقداری است (019/0- 002/0) که برای موجودات یوکاریوت ذکر شده است (Nei, 1987). متوسط تنوع نوکلئوتیدی برای 15 جمعیت از مرغان اندونزیایی 00994/0 گزارش شده است (Sulandari et al., 2008) که اندکی بیشتر از مقدار برآورد شده برای مرغ مازندرانی است. مقدار تنوع هاپلوتیپی (هتروزیگوسیتی یا تنوع ژنی) در جمعیت حاضر 00852/ ± 7424/0 برآورد شد. این مقدار در محدوده گزارش شده (78/0 – 29/0) برای مرغان آسیای جنوب شرقی، مرغان زیمبابویه­ای با منشأ هندی و برخی لاینهای تخمگذار و گوشتی تجارتی و خیلی نزدیک به مقدار گزارش شده برای لاینهای گوشتی تجارتی است (Muchadeyi et al., 2008). در صورتی که این مقدار برای برخی از جمعیتهای مرغ ویتنامی خیلی زیاد (94/0) گزارش شده است (Cuc et al., 2011) که نشان دهنده تنوع متوسط و پایین در این جمعیت می­باشد. فراوانی نسبی نوکلوتیدها در توالی تک رشته ناحیه HVR-I توالی کلی مرغ مازندرانی به طول 455 نوکلئوتید با توالی ناحیه مشابه در مرغ مرندی به عنوان تنها نژاد ایرانی با توالی ثبت­ شده با کدهای دسترسی GU481096-105 در جدول 2 آورده شده است که تفاوت بسیار اندکی در آنها مشاهده می­شود. با این وجود تنوع نوکلئوتیدی و هاپلوتیپی در مرغ نژاد مرندی بیشتر است که بیانگر وجود تنوع بیشتر در این جمعیت می­باشد.

جدول 2- تعداد هاپلوتیپ، درصد فراوانی نسبی نوکلئوتیدها، تنوع نوکلئوتیدی و هاپلوئیدی ناحیه HVR-I مرغ مازندرانی و مرندی.

Table 2- Number of haplotypes, nucleotides relative frequency percentage, nucleotide and haplotype diversities of Mazandrani and Marandi chickens HVR-I.

همچنین جهت تعیین میزان شباهت هاپلوتیپ­های موجود در این دو نژاد، نمودار فیلوژنی با توالی هاپلوتیپ های ناحیه HVR-I از قسمت D-loop مرغ مازندرانی (MAZ) و مرندی ( (MAR ترسیم شد. همانطور که در شکل 3 مشاهده می­شود توالی این ناحیه در برخی از هاپلوتیپ های مرغ مازندرانی با مرندی بسیار نزدیک است و با مقایسه تک تک نوکلئوتید­ها در هاپلوتیپ­های این دو نژاد مشاده شد که هاپلوتیپ­های شماره های 2 و 4 در هر دو نژاد دقیقاً مشابه می­باشند که می­تواند هم به دلیل نزدیکی جغرافیایی و هم تفرق این دو جمعیت در فاصله زمانی کمی باشد.

برای تعیین موقعیت این نژاد در بین برخی نژادها نمودار فیلوژنی با توالی کلی بخش HVR-I ازناحیه D-loop مرغ مازندرانی و 14 نژاد مرغ موجود در بانک جهانی ژن رسم شد. همانطور که در شکل 4 مشاهده می­شود، توالی این ناحیه در مرغ مازندرانی با مرغ مرندی ایران، بومی آذربایجان، لگهورن سفید، پلیموتراک پر خط دار، مرغ ابریشمی و جنگلی خاکستری (سونراتی) نزدیکی بیشتری دارد که این نزدیکی ممکن است به علت تشابه ژنتیکی مرغ مازندرانی ایران از طریق مشابهت اجدادی به این نژادها باشد. در پژوهشهای سایر محققین نیز چنین تشابهاتی وجود دارد، مثلاً در مطالعه­ای که به روش RFLP روی ناحیه کنترل غیر کد کننده mtDNA پرندگان مختلف انجام شده است، زیر گونه مرغ جنگلی قرمز (گالوس گالوس) به عنوان جد مادری تمام نژادهای اهلی مرغ معرفی شده است (Fumihito et al., 1994). در مطالعه دیگری که به منظور بررسی منشأ مادری و تعیین روابط فیلوژنتیک 20 نژاد بومی ژاپنی و مرغهای بومی اندونزیایی انجام گرفته است نتیجه گرفته شده است که بعضی نژادهای منتسب به ژاپن از داخل ژاپن نشأت نگرفته­اند و نژادهای سایر کشورها پایه مرغهای بومی ژاپنی را تشکیل داده اند (Oka et al., 2007).

نتیجه گیری کلی

نتایج این پژوهش نشان داد که تنوع ژنتیکی متوسط تا پایینی در این جمعیت وجود دارد. مشابهت تعدادی از جایگاههای چند شکل نشان دهنده نزدیکی ژنتیکی این جمعیت با نژادهای مرغ سایر کشورهاست. ورود مرغ­های اصلاح شده خارجی به کشور موجب بی توجهی به ظرفیت تولیدی مرغ های بومی شده­است. با توجه به سازگاری نژاد های مرغ بومی نسبت به شرایط محل زندگــی خود و مقاومت نسبی آنها به بیماری­های موجود در منطقه، به کمک شیوه های اصلاح نژادی امکان افزایش ظرفیت تولیدی آنها وجود دارد. به کمک توالی یابی ناحیه HVR-I ژنوم میتوکندری با توجه به طول کوتاه و آسان بودن روش و آنالیز داده­ها و مقایسه آن با برخی از نژادهای پرتولید تجارتی می­توان دریافت که این نژادها در برخی موارد شباهتهایی با نژادهای پرتولید دارند که بیانگر توانایی و قابلیت تولیدی این نژادها می باشد. همچنین با استفاده از توالی های فوق و ثبت آنها در بانک جهانی ژن به نام کشورمان می تواند به عنوان شاخص مناسبی جهت شناسایی نژادهای مرغ بومی مورد استفاده قرار گیرد.

سپاسگزاری

بدینوسیله از مسئولین و دست اندرکاران مرکز اصلاح نژاد مرغ مازندرانی بخاطر تلاش در جهت حفظ و افزایش توانایی تولید این نژاد و همچنین از آزمایشگاه آقای S. Weigend (Institute of Farm Animal Genetics, Mariensee, Germany) بخاطر کمکهای ارزنده­شان در تعیین توالی نمونه­ها تشکر و قدردانی می­شود.