نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Fungal diseases are among the most important biotic stresses causing considerable losses in agricultural products. Improving crop plants with broad resistance to fungal diseases is one of the main challenges in agriculture. Classical plant breeding is too timely and has many other limitations, hence using biotechnology for this purpose is inevitable. Expression of a complex of Pathogen Related proteins induces polygenic resistance in plants. This technique leads to a broad and stable resistance to fungal pathogens. Hence, in this study we isolated resistance genes and constructed treble plasmid vectors with multiple genes involving three important families of disease-related proteins namely PR1, PR2, and PR3. For this purpose we isolated two genes of PR1 family with special primer design from tobacco genome, first. After analysis the accuracy of gene isolation using 35S promoter and Nos terminator, they were cloned in binary vector pBI121. Then, we cloned two important antifungal genes including PR2 (glucanase) and PR3 (chitinase) under the control of regulatory independent regions in T-DNA of the above mentioned vector with parallel and antiparallel orientations. These treble vectors have good antibacterial potential too and can be used for resistance to bacteria and other biotic and abiotic stresses. They can be introduced into plants using particle gun or through Agrobacterium mediated transformation.
کلیدواژه‌ها [English]
جداسازی و کلونکردن دو ژن از خانواده PR1 و ساخت پلاسمیدهای سهگانه حاوی سه گروه مختلف از ژنهای PR، به منظور تولید گیاهان تراریخته مقاوم به بیماریهای قارچی
البرز رئوفی1، مسعود توحیدفر*2، محمود سلوکی3، مطهره محسن‌پور4
1 دانشجوی کارشناسی ارشد پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران (ABRII)
2 استادیار، عضو هیئت علمی پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران (ABRII)
3 استادیار دانشکده کشاورزی دانشگاه زابل
4 دکتری اصلاح نباتات - بیوتکنولوژی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران (ABRII)
تاریخ دریافت: 22/03/1390، تاریخ پذیرش: 28/12/1390
چکیده
با توجه به میزان خسارت ناشی از بیماریهای قارچی، استفاده از تکنیک‌های بیوتکنولوژی برای تولید گیاهان مقاوم، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. از آنجایی که بیان ترکیبی از پروتئینهای مربوط به بیماریزایی منجر به مقاومت چندژنی خواهد شد که از یک سو دوام مقاومت را به همراه داشته و از سویی دیگر باعث مقاومت به انواع گسترده‌ای از گونه‌های بیماری‌زا می‌گردد، لذا این پژوهش با هدف جداسازی ژن و ساخت سازه‌های پلاسمیدی چندگانه، حاوی سه گروه مهم از پروتئینهای مربوط به بیماریزایی PR1، PR2 و PR3، انجام گردید. ابتدا دو ژن دارای ویژگی‌های متفاوت از خانواده PR1، با طراحی پرایمرهای اختصاصی، از ژنوم گیاه توتون جداسازی گردیدند و پس از آنالیزهای مربوط به صحت جداسازی ژن، طی مراحلی تحت پیشبر 35S و پایانبر Nos در پلاسمید دوگانة pBI121 کلون‌سازی شدند. در مرحله بعد، کلون‌سازی دو ژن ضدقارچی مهم دیگر، PR2 (β-1و3-گلوکاناز) و PR3 (کیتیناز)، تحت کنترل نواحی تنظیمی مستقل در ناحیة T-DNAی حامل مذکور، به دو صورت همسو و غیرهمسو به همراه PR1، طی چندین مرحله انجام شد. انتظار می رود که حاملهای سهگانه حاصل از این پژوهش، علاوه بر ایجاد مقاومت پایدار به طیف وسیعی از عوامل بیماری‌زای قارچی، دارای پتانسیل ایجاد مقاومت به باکتری و سایر تنشهای زنده و غیرزنده نیز باشند. در نهایت حاملهای مذکور را می توان برای انتقال ژن به گیاهان مختلف با روش اگروباکتریوم و تفنگ ژنی مورد استفاده قرار داد.
واژههای کلیدی:پروتئینهای مربوط به بیماریزایی،کلون‌سازی ژن،کیتیناز،گلوکاناز،PR1.
مقدمه
از آنجا که برنامه‌های اصلاح سنتی جهت تولید گیاهان مقاوم به قارچ براساس فنون زمان بر و طولانی استوار بوده و به ندرت می‌توانند با تکامل سریع عوامل بیماری‌زا کنار بیایند، لذا کشاورزان اغلب ناچار به استفاده از سموم شیمیایی می باشند که پرهزینه بوده، باعث آلودگی محیط زیست شده و بالاخره به دلیل تکامل عوامل بیماری‌زا کم اثرتر می گردند. فن‌آوری‌های جدید نظیر جداسازی ژنهای مقاومت و شیوه‌های انتقال ژن جهت ایجاد گیاهان تراریخته از هر نظر می‌توانند نقایص موجود را برطرف کنند. در حال حاضر اکثر استراتژی‌ها برای تولید گیاهان تراریخته مقاوم به بیماریهای قارچی، روی معرفی ژنهای کدکننده پروتئینهای مربوط به بیماریزایی (PR[1]) متمرکز شده است (Edreva, 2005). ژنهای مربوط به بیماریزایی دسته‌ای از این ژن‌ها می‌باشند که بیان آنها سبب القاء پاسخ فوق حساسیت به بسیاری از آلودگی‌‌های ویروسی، قارچی و باکتریایی می‌گردد. PRها دارای دو نوع بازی و اسیدی می‌باشند، که به ترتیب دارای مکان‌های واکوئولی و آپوپلاستیک هستند. موادشیمیایی مثل سالیسیک، پلیاکریلیک، اسید‌های چرب، نمک‌های معدنی و به همین ترتیب محرک‌های فیزیکی مثل زخم، اشعهUV-B، شوک اسمزی، دمای پایین، کمبود یا زیادی آب سبب القای PRها می‌شوند (Schaller et al., 2000). گروه PR-1، بیشترین میزان را در بین پروتئینهای خانواده PR دارد، که به میزان 10000 برابر در بافت‌های آلوده شده القا می‌شود ومیزان آن به 1تا 2 درصد کل پروتئینهای برگ می‌رسد (Alexander & Goodman, 1993). مشخصه بسیار مهم PRها اثر ضدقارچی آنها می‌باشد. آنزیمهای هیدرولیتیک (مثلβ-1و3-گلوکاناز، کیتیناز و پروتئاز) می‌توانند ابزاری برای سست کردن و از بین بردن دیواره‌های قارچی حاوی گلوکان‌ها، کیتین) قارچ‌هایی از قبیل آسکومیست‌ها، بازیدیومیست‌ها و دئوترومیست‌ها) و پروتئین باشند. همچنین PRها می‌توانند مسیر دفاعی متمایزی شامل تجزیه هیدرولیتیک قطعات گلوکانوکیتین را از دیواره قارچی به کار بیندازند. تأثیر بازدارندگی PR-1 بازی گوجه و لوبیا در برابر پاتوژنهای قارچی به وسیله آزمایش‌های سلولی و اینویترو[2] به اثبات رسیده است (Niderman et al., 1995; Rauscher et al., 1999). به عنوان مثال، خاموشی ژن PR-1b در جو، سبب تسهیل نفوذ پاتوژن قارچی Blumeriagraminis در برگ شد (Schultheiss et al, 2003). بتا-1و3-گلوکان ترکیب اصلی در دیواره‌های سلولی اُاُمایست‌ها می‌باشد (Wessels & Sietsma, 1981). در بسیاری از موارد زمانی که بتا-1 و 3-گلوکوناز و کیتیناز با یکدیگر در گیاه تراریخته بیان می‌شوند، مقاومت بیشتری در گیاه مشاهده می‌شود. گوجه‌های تراریخت که ژن گلوکاناز و کیتیناز کلاس I توتون را بیان می کنند، حساسیت کمتری را در مواجهه با Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici از خود نشان دادند. یونجه‌های بیان کننده تراژن‌های بتا-1و3-گلوکوناز اسیدی یونجه و کیتیناز بازی برنج در آلودگی با pathogen Phytophthora megasperma f. spmedicaginis، که فاقد کیتین در دیواره سلولی خود بود، علائم بیماری اندکی از خود نشان می‌دادند، در حالی که تحت تأثیر چندین قارچ دارای کیتین، در کاهش علائم بیماری در گیاه اثری نبود (Masoud & Zhu 1996). همچنین بیان تراژن‌های نامبرده سبب افزایش چشمگیر مقاومت توتون در برابر قارچ‌های Cercospora nicotianae نسبت به بیان منفرد هر یک از ژنهای نامبرده شد (Zhu 1994). بیان در سطح زیاد PR1 در گیاهان تراریخته ممکن است سایر مکانیسم‌های دفاعی مختص پاتوژنهای اوومیست را فعال کند. از طرفی دیگر کیتین که سوبسترای آنزیم کیتیناز است، یکی از اجزای مهم تشکیل دهندة دیواره سلولی قارچ‌هایی ازقبیل آسکومیست‌ها، بازیدیومیست‌ها و دئوترومیست‌ها است و آنزیم بتا-1و3-گلوکوناز نیز قادر است گلوکان موجود در دیواره سلولی ریسه قارچ را تجزیه کند و موجب تشدید خسارات وارده به قارچ شود. ثابت شده که این آنزیم سبب تشدید فعالیت آنزیم کیتیناز نیز می‌شود. با توجه به مطالعات انجام شده، همچنین به کارگیری همزمان چند ژن با فعالیت مکمل، تولید جدایه‌های قارچی شکنندة مکانیسم‌های مقاومت در گیاهان تراریخته را به تأخیر می‌اندازد. لذا هدف از این پژوهش جداسازی ژن PR1 کد کننده پروتئینهای مربوط به بیماریزایی از ژنوم توتون، ایجاد‌کننده مقاومت به پاتوژنهای قارچی (و بعضی استرس‌های زنده و غیر زنده دیگر)، کلون‌سازی ژن PR1 تحت کنترل پروموتر 35S جهت بیان بالای آن در گیاهان هدف و کلون‌سازی دو نوع مختلف از ژنPR1 (اسیدی و بازی)، تحت پروموتر 35S به همراه سایر پروتئینهای ضد قارچی نظیر کیتیناز و گلوکاناز به طور همزمان، در وکتوری مناسب برای انتقال ژن به گیاهان می‌باشد.
مواد و روش‌ها
در این تحقیق از باکتری E.coli سویه XLI-Blue (Cinna Gen B16-50c) و پلاسمیدهای pGEM®-7Zf(–) و pGEM®-T Easy (Promega)، pBI121(Clontech, Washangton, DC) و نیز پلاسمیدهای نوترکیب (pGEM-Chi (-HindIII و pBI121-ChiGlu (+))) (Mohsenpour, M.,et al, 2008) استفاده گردید. استخراج پلاسمید و واکنش هضم با آنزیمهای نوکلئاز نوع II و تهیه باکتری‌های مستعد، واکنش اتصال[3]و فسفرزدایی طبق دستورالعمل‌های Sambrook و Russel (2000) انجام شد. خالص سازی قطعات DNA از روی ژل آگارز با استفاده از High Pure Pcr Purfication Kit (Roche) انجام شد. در ابتدا طراحی آغازگرهای اختصاصی برای دو ژن از خانواده PR-1a) اسیدی) و PRP-1 (بازی) انجام شد و پس از آن جداسازی این ژن‌ها با استفاده از DNAی ژنومی توتون به عنوان الگو و انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز صورت گرفت. ترادف پرایمرهای طراحی شده برای جداسازی ژن‌ها در جدول 1 نشان داده شده است. صحت جداسازی هر یک از این ژن‌ها با بررسی اندازه قطعات بدست آمده بر روی ژل و نیز با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز داخلی[4] تأیید و سپس در داخل حامل pGEM-Teasy کلون‌سازی شدند. از آنجایی که هدف، قرار دادن هر یک از این ژن‌ها در حاملpBI121 تحت پیشبر[5] 35S و پایانبر[6] Nos بود، ساخت چنین حاملی نیازمند اضافه نمودن جایگاه XbaI در فرادست[7] و SacI در فرودست[8] ژنهای مذکور بود. از سویی دیگر نیاز بود تا جایگاه آنزیمی HindIII که در حامل اولیه pBI121 منحصر به فرد[9] است جهت مراحل بعدی همچنان منفرد باقی بماند. از این رو هر یک از ژنهای PR-1a و PRP-1 پس از خروج از pGEM-T با آنزیم برشی EcoRI، در حامل حد واسط (pGEM-Chi (-HindIII، که قبلاً جایگاه HindIII موجود در MCS آن حذف شده بود (Mohsenpour et al., 2008)، کلون‌سازی شدند و پس از آنالیزهای مربوط به صحت قرارگیری جهت ژن ها توسط آغازگر رو به جلوی M13 و آغازگر رو به عقب اختصاصی ژنهای مذکور، توسط آنزیمهای XbaI و SacI از این حامل خارج شد و با خروج ژن gus در اثر هضم آنزیمی حامل pBI121 با دو آنزیم نامبرده، قطعات مورد نظر تحت پیشبر 35S و پایانبر Nos در این حامل کلون‌سازی مجدد شدند.
جدول 1- ترادف پرایمرهای طراحی شده برای جداسازی ژنهای PR-1a و PRP1.
Table 1- Designed primer for isolation of PR-1a and PRP1
|
توالی |
پرایمر |
|
GTCATGGGATTTGTTCTC |
PR-1a F |
|
TTAGTATGGACTTTCGCC |
PR-1a R |
|
CTCAGCTATATTCTTCCC |
PRP1 F |
|
GCACTCATTAGACATCAG |
PRP1 R |
|
CAAACCACCTGAGTATAG |
PR1 In |
گام بعدی افزودن ژنهای کیتیناز و گلوکوناز به دو حامل حاصل بود که این حامل‌ها به ترتیب pBI-PR-1a و pBI-PRP-1 نامگذاری شدند. بدین منظور ابتدا قطعه گلوکاناز با پایانبر Nos به همراه قطعه کیتیناز تحت پیشبر 35S (Glu-NosT-CaMV35S P-Chi)، از حامل pBI121-ChiGlu توسط آنزیم BamHI خارج و در حامل حدواسط pCaMV کلون‌سازی مجدد گردید. پس از این که صحت کلون‌سازی و جهت ورود قطعات توسط آنزیم EcoRV به اثبات رسید، حامل نوترکیب حاصل موسوم به pCaMV-ChiGlu توسط آنزیم HindIII مورد هضم آنزیمی ناقص قرار گرفت و کاست کامل ژنهای کیتیناز و β-1و3-گلوکوناز با پیشبرهای جداگانه 35S و پایانبر‌های جداگانه Nos با طول 3539 جفت باز از روی ژل آگارز خالص‌سازی و در محل منحصر به فرد آنزیم HindIII در دو حامل pBI-PR-1a و pBI-PRP-1 کلون‌سازی مجدد شد. در نهایت چهار نوع حامل سهگانه مختلف حاصل گردید که سه ژن PR-1a، کیتیناز و بتا 1و3-گلوگوناز را با جهت‌‌های مختلف نسبت به هم و تحت نواحی تنظیمی مستقل در ناحیه T-DNAی حامل pBI121 دارا بودند. حاملهای حاصل به pBI121 PR-1a ChiGlu +، pBI121 PR-1a ChiGlu-، pBI121 PRP-1 ChiGlu +، pBI121 PRP-1 ChiGlu- نامگذاری شدند که مناسب برای انتقال به روش اگروباکتریوم و تفنگ ژنی هستند.
نتایج و بحث
صحت جداسازی ژن‌ها به طور اولیه با مشاهده باندهای 492 و 588 جفت بازی که به ترتیب در مورد ژنهای PR-1a و PRP-1 مورد انتظار بود، مورد تأیید قرار گرفت (شکل1-الف). نتیجه واکنش زنجیره ای پلیمراز داخلی نیز به ترتیب با ظهور باندهای 380 و 415 جفت بازی به ترتیب برای PR-1a و PRP-1 تأیید دیگری بر صحت جداسازی ژنهای مذکور بود (شکل 1-ب). در نهایت توالی‌یابی ژنهای مورد نظر به طور صد در صد صحت ژنهای جداسازی شده را تأیید کرد. توالی‌های حاصل پس از دریافت، از طریق Blast نوکلئوتیدی NCBI مورد آنالیز قرار گرفتند و نتایج، همولوژی صد در صدی ژنهای جداسازی شده در این پژوهش را با ژنهای خانواده PR-1 توتون نشان داد. ورود ژنهای PR-1a و PRP-1 به داخل حاملpGEMTeasy در ابتدا با مشاهده کلونی‌های سفید در محیط حاوی Xgalو IPTG و در نهایت با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز تأیید شد (شکل 2).
جهت صحیح ژن‌ها پس از قرارگیری ژنهای PR-1aوPRP-1 در حامل pGEM7Z(-HindIII) با مشاهده باندهای 583 جفت‌بازی برای PR-1a و 699 جفت بازی برای PRP-1، حاصل از تکثیر با آغازگر رو به جلوی M13 و رو به عقب اختصاصی ژنهای مذکور به اثبات رسید (شکل3).
در نهایت با استفاده از جایگاه‌های برشی XbaIوSacI، ژنهای PR-1a و PRP-1 از حامل pGEM7Z(-HindIII) جداسازی شدند و پس از خالص‌سازی از روی ژل در حامل pBI121 فاقد ژن gus قرار گرفتند. حضور ژنهای مذکور با استفاده از PCR و آغازگرهای اختصاصی دو ژن تأیید شد (شکل 4).
|
|
|
|
|
|
شکل1- انجام PCR برای جداسازی ژن PR1 با استفاده از آغازگرهای اختصاصی. M: نشانگر وزن مولکولی 1kb (Fermentas)، (الف) واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی PR-1a و PRP-1. 1: باند حاصل از تکثیر ژن PR-1a، 2: باند حاصل از تکثیر ژن PRP-1، (ب) واکنش زنجیره ای پلیمراز به منظور تآیید اولیه ژنهای جداسازی شده. 1: PCR آشیانه‌ای برای PR-1a ، 2: PCR آشیانه‌ای برای تکثیر ژن PRP-1.
Figure 1- PCR for isolation of PR1 gene using specific primers. M. DNA Ladder 1Kb (Fermentas), (a) PCR using specific PR-1a and PRP1 primers: 1. PR-1a gene; 2. PRP-1 gene. (b)Verification of isolated gene using PCR: 1. Nested PCR for PR-1a; 2. Nested PCR for PRP-1.
شکل 2- بررسی حضور ژنهای PR-1a و PRP-1در حامل pGEMTeasy با استفاده از PCR و آغازگرهای اختصاصی دو ژن PR-1a و PRP-1. M: نشانگر وزن مولکولی 1kb (Fermentas)، 1و6: کنترل مثبت، 2 تا5: آنالیز کلونی‌ها برای بررسی حضور PR-1a، 6 تا 11: آنالیز کلونی‌ها برای بررسی حضور PRP-1.
Figure 2- PCR for verification of PR-1a and PRP-1 in pGEMTeasy using specific primers.
M. DNA ladder 1Kb (Fermentas), 1 and 6: Positive control, 2-5: Analysis of colony for PR-1a gene, 6-11: Analysis of colony for PRP-1.
|
|
شکل 3- بررسی ژنهای PR-1a (الف) و PRP-1 (ب) با استفاده از آغازگر M13 و آغازگر احتصاصی از ژنهای مذکور. M: نشانگر وزن مولکولی 1kb (Fermentas)، (الف)1 تا 3: کلونی‌های حاوی ژن PR-1a با جهت صحیح، 4 و 5: کلونی‌های حاوی ژن PR-1a با جهت‌گیری عکس. (ب) 1، 3، 4 و 5: کلونی‌های حاوی ژن PRP-1 با جهت‌گیری صحیح، 2: کلونی‌های حاوی ژن PRP-1 با جهت‌گیری عکس.
Figure 3- Analysis for determination of gene orientation (a) PR-1a and (b) PRP-1 using M13 and a gene specific primer. M. DNA ladder 1Kb (Fermentas), (a) 1-3:Colonies containing PR-1a gene with correct orientation; 4 and 5: Colonies containing PR-1a gene with incorrect orientation. (b) 1, 3, 4 and 5: Colonies containing PRP-1 gene with correct orientation; 2. Colony containing PRP-1 gene with incorrect orientation.
|
|
شکل 4- PCR ژنهای PRI-1a (الف) و PRP-1 (ب) در حامل pBI121 با استفاده از آغازگرهای اختصاصی. M: نشانگر وزن مولکولی 1kb (Fermentas)، (الف) 1: کنترل مثبت، 3 و4 و 5: کلونی‌های حاوی حامل نوترکیب pBI121-PR-1a، 2: کلونی‌های حاوی حامل pBI121 فاقد ژن مذکور؛ (ب) 1: کنترل مثبت، 5 و7: کلونی‌های حاوی حامل‌نوترکیب pBI121-PRP-1، 4،3،2 و 6: کلونی‌های‌حاوی حامل pBI121 فاقد ژن مذکور.
Figure 4- PR-1a (A) and PRP-1 (B) Genes in PBI121 using specific primer. M. DNA ladder 1Kb (Fermentas), (a) Positive control; 3, 4 and 5: Colonies containing recombinant pBI121-PR-1a vector, 2: Colonies containing non-recombinant pBI121 vector.
پس از هضم آنزیمی حامل پلاسمیدی pBI121-ChiGlu(Mohsenpour et al., 2008) به وسیله آنزیم BamHI، قطعه 3544 جفت بازی (حاوی کاست ژن بتا 1 و 3-گلوگاناز بدون پیشبر و کاست ژن کیتیناز بدون پایان دهنده) (شکل 5) از روی ژل آگارز خالص سازی گردید.
پس از قرارگیری این قطعه در حامل pCaMV حضور ژنهای مذکور با آغازگرهای اختصاصی ژن کیتیناز مورد بررسی قرار گرفت. پس از تأیید حضور دو ژن مذکور، جهت قرارگیری قطعه در کلونی‌های بدست آمده، با استفاده از آنزیم EcoRV بررسی گردید (شکل 6).
شکل 5- قطعه 3544جفت بازی حاصل از برش حامل پلاسمیدی pBI121-ChiGlu به وسیله آنزیم BamHI .
Figure 5- A 3544bp BamHI fragment resulting pBI121-ChiGlu digestion.
در صورت قرارگیری قطعه با جهت صحیح ظهور باندهای 3793،2340 و 727 جفت بازی مورد انتظار است و در صورت قرارگیری قطعه در جهت عکس باندهایی با اندازه‌های 5459، 727 و 674 جفت باز مشاهده خواهد شد (شکل 6). جداسازی کاست کامل ژنهای کیتیناز و بتا 1 و 3-گلوگاناز از حامل pCaMV-ChiGlu تنها با آنزیم HindIII امکان‌پذیر بود، که با توجه به وجود جایگاه داخلی این آنزیم در وسط این کاست (شکل 7)، از استراتژی هضم ناقص استفاده شد.
با هضم کامل pCaMV-ChiGlu با آنزیم HindIII قطعاتی با طول 2666، 2282و 1912جفت باز مورد انتظار است (شکل 8) که در صورت هضم ناقص، باند مورد نظر با طول 4194 جفت باز نیز ظاهر خواهد شد (شکل 8). این قطعه حاوی کاست کامل دو ژن کیتیناز و گلوکاناز می‌باشد به طوری که ژنهای کیتیناز و گلوکاناز هر یک حاوی یک پیشبر 35s و پایانبر NOS می‌باشند (شکل 9).
|
|
شکل 6- بررسی جهت قطعه ChiGlu در حامل پلاسمیدی pCaMV با استفاده از هضم آنزیمی به وسیله آنزیمEcoRV. M: نشانگر وزن مولکولی 1kb (Fermentas)، 1: پلاسمید pCaMV حاوی قطعه ChiGlu با جهت‌گیری عکس، 2: پلاسمید pCaMV حاوی قطعه ChiGlu با جهت‌گیری صحیح.
Figure 6- Verification of ChiGlu orientation in pCaMV using EcoRV. M. DNA ladder 1Kb (Fermentas), 1: Correct orientation of ChiGlu fragment in pCaMV; 2: Incorrect orientation of ChiGlu fragment in pCaMV.
با هضم کامل pCaMV-ChiGlu با آنزیم HindIII قطعاتی با طول 2666، 2282و 1912جفت باز مورد انتظار است (شکل 8) که در صورت هضم ناقص، باند مورد نظر با طول 4194 جفت باز نیز ظاهر خواهد شد (شکل 8). این قطعه حاوی کاست کامل دو ژن کیتیناز و گلوکاناز می‌باشد به طوری که ژنهای کیتیناز و گلوکاناز هر یک حاوی یک پیشبر 35s و پایانبر NOS می‌باشند (شکل 9).
شکل 7- جایگاه برشی آنزیم HindIII بر روی حامل پلاسمیدی pCaMVcg.
Figure 7- HindIII recognition sites in pCaMVcg vector.
شکل 8.- جداسازی کاست کامل دو ژن کیتیناز و گلوکاناز با استفاده از آنزیم HindIII. M: نشانگر وزن مولکولی 1kb (Fermentas)، 1: قطعات حاصل از هضم ناقص حامل pCaMV-ChiGlu توسط آنزیم HindIII ، 2: هضم کامل حامل pCaMV-ChiGlu توسط آنزیم HindIII.
Figure 8- Isolation of chitinase and glucanase gene cassette using HindIII. M. DNA ladder 1Kb (Fermentas), 1: pCaMV-ChiGlu partial digestion using HindIII. 2: pCaMV-ChiGlu complete digestion using HindIII.
همان طور که در شکل 8 مشاهده می شود، علاوه بر سه باند 2666،2282 و 1912جفت باز حاصل از هضم کامل، در چاهک شماره 1 چندین باند دیگر از جمله سه باند حاصل از عدم هضم حامل، باند 6860 جفت بازی حاصل از برش حامل تنها در یکی از جایگاه‌های برشی و باند 4194 جفت بازی حاصل از برش در جایگاه‌های ابتدای پیشبر 35S گلوکاناز و انتهای پایانبر کیتیناز مشاهده می‌شود. باند مطلوب (قطعه 4194جفت بازی) از روی ژل ریکاوری شد
پس از انجام مراحل فوق حاملهای pBI121PR-1a و pBI121PRP-1 با استفاده از جایگاه برشی HindIII خطی شدند. در نهایت کاست کامل ژنهای کیتیناز و گلوکاناز در فرودست کاست ژنیPR-1a وPRP-1، قرارگرفت. با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن کیتیناز، حضور ژن مذکور و به طبع آن ژن گلوکاناز در حاملهای نهایی به صورت اولیه تأیید شد. سپس به منظور بررسی جهت قرارگیری کاست کیتیناز و گلوکاناز، از آغازگر رو به جلوی کیتیناز و رو به عقب PR-1a و PRP-1 استفاده شد (شکل 10).
شکل9- نقشه فیزیکی کاست‌های کامل دو ژن کیتیناز و گلوکاناز حاصل از هضم ناقص حامل پلاسمیدی pCaMV-ChiGlu با استفاده از آنزیم برشی HindIII .
Figure 9- Physical map of chitinase and glucanase cassettes drived from pCamV-ChiGlu partial HindIII digestion.
و بدین ترتیب حاملهای نوترکیب pBI121PR-1aChiGlu(+) و pBI121PRP-1ChiGlu(+) شناسایی شدند که در آنها مشاهده باند 2703 جفت بازی در حامل pBI121PR-1aChiGlu و باند 2799 جفت بازی در حامل pBI121PRP-1ChiGlu، جهت‌گیری قطعه ChiGlu را به صورت همسو با کاست‌های PR-1a و PRP-1 نشان داد (شکل 11).
|
|
شکل 10- محل آغازگرهای رو به جلوی کیتیناز و رو به عقب ژنهای PR-1a و PRP-1.. (الف): محل و جهت قرارگیری کاست ژنهای کیتیناز و گلوکوناز در فرودست ژن PR-1a، (ب): محل و جهت قرارگیری کاست‌ژن‌های کیتیناز و گلوکوناز در فرودست ژن PRP-1.
Figure 10- Position of specific PR-1a and PRP-1 primers. (a) Position and orientation of chitinase and glucanase cassettes in downstream of PR-1a gene. (b) Position and orientation of chitinase and glucanase cassettes in downstream of PRP-1 gene.
در نهایت پس از بررسی جهت کاست ژنهای کیتیناز و گلوکاناز به وسیله واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، حضور و جهت ژنهای مذکور با استفاده از هضم آنزیمی، مورد تأیید قرار گرفت (شکل 12). بدین منظور با استفاده از آنزیم XhoI، پلاسمید حاصل از کلونی‌های مذکور مورد هضم آنزیمی قرار گرفت. در صورتی که در حامل نوترکیب pBI121PR-1aChiGlu، کاست ژنهای کیتیناز و گلوکاناز به صورت همسو با کاست ژنPR-1a قرار گرفته باشد، هضم آنزیمی باXhoI، منجر به ظهور قطعاتی با طول 15364 و 2282 جفت باز می‌شود و این در حالیست که جهت گیری عکس کاست ژنهای کیتیناز و گلوکاناز نسبت به کاست ژن PR-1a ظهور باندهایی با طول 13988 و 3658 جفت باز را سبب می‌شود. به همین ترتیب در صورتی که در حامل نوترکیب pBI121PRP-1ChiGlu، کاست ژنهای کیتیناز و گلوکاناز به صورت همسو با کاست ژنPRP-1 قرار گرفته باشد، هضم آنزیمی با XhoI، منجر به ظهور قطعاتی با طول 15460 و 2282 جفت باز می‌شود و جهت گیری عکس کاست ژنهای کیتیناز و گلوکاناز نسبت به کاست ژن PR-1a ظهور باندهایی با طول 14084 و 3658 را سبب می‌شود (شکل 12). با توجه به پژوهش‌هایی که در زمینه نوترکیبی‌های همولوگ انجام شده، انتظار می‌رود حاملهای pBI121PR-1aChiGlu(-) و pBI121PRP-1ChiGlu(-) (شکل 13) در طی همانند سازی در سیستم باکتری و نیز در طی نسل‌های بعد گیاهان تراریخت، از پایداری بسیار بیشتری (عدم حذف بخشی از کاست‌های سه ژن) نسبت به حاملهای نوترکیب pBI121PR-1aChiGlu(+) و pBI121PRP-1ChiGlu(+) (شکل 14) از خود نشان دهند.
|
|
شکل11- بررسی جهت قرارگیری کاست ژنهای کیتیناز و گلوکاناز در حاملهای پلاسمیدی pBI121PR-1a و pBI121PR با استفاده از از آغازگر رو به جلوی کیتیناز و رو به عقب PR-1a و PRP-1. M: نشانگر وزن مولکولی 1kb (Fermentas)، (الف): 1،2، 3، 4، 5، 6، 8 و 10: کلونی‌های حاوی حامل پلاسمیدی pBI121PR-1aChiGlu، که جهت‌گیری قطعه ChiGlu درآن به صورت ناهمسو با کاست PR-1a می‌باشد، 7 و 9: کلونی‌های حاوی حامل پلاسمیدی pBI121PR-1aChiGlu، که جهت‌گیری قطعه ChiGlu در آن به صورت همسو با کاست PR-1a می‌باشد (ب): 1، 3، 4، 5، 6 و 7: کلونی‌های حاوی حامل پلاسمیدی pBI121PRP-1ChiGlu، که جهت‌گیری قطعه ChiGlu درآن به صورت ناهمسو با کاستPRP-1 می‌باشد،2: کلونی‌های حاوی حامل پلاسمیدی pBI121PRP-1ChiGlu، که جهت‌گیری قطعه ChiGlu درآن به صورت همسو با کاستPRP-1 می‌باشد.
|
شکل12- بررسی حضور و جهت ژنهای PR-1a و PRP-1. در حاملهای پلاسمیدی ساخته شده با استفاده از هضم آنزیمی توسط آنزیم XhoI. M: نشانگر وزن مولکولی 1 kb Plus DNA Ladder (Fermentas)، 1: حامل پلاسمیدی pBI121PR-1aChiGlu(+) شامل کاست ژنهای کیتیناز و گلوکاناز همسو با کاست ژنPR-1a 2: حامل پلاسمیدی pBI121PR-1aChiGlu(-) شامل ژنهای کیتیناز و گلوکاناز ناهمسو با کاست ژنPR-1a 3: حامل پلاسمیدی pBI121PRP-1ChiGlu(+) شامل کاست ژنهای کیتیناز و گلوکاناز همسو با کاست ژنPRP-1، 4: حامل پلاسمیدی pBI121PRP-1ChiGlu(-) شامل کاست ژنهای کیتیناز و گلوکاناز ناهمسو با کاست ژنPRP-1.
Figure 12- Determination of present and orientation chitinase and glucanase genes in pBI121PR-1a and pBI121PRP-1 using XhoI. M. DNA ladder 1Kb (Fermentas). 1. pBI121PR-1aChiGlu(+) with direct orientation of ChiGlu fragment with PR-1a; 2 pBI121PR-1ChiGlu(-) with indirect orientation of ChiGlu fragment with PR-1a; 3: pBI121PRP-1aChiGlu(+) with direct orientation of ChiGlu fragment with PRP-1; 4: pBI121PRP-1ChiGlu(-) with indirect orientation of ChiGlu fragment with PRP-1.
|
|
شکل13- نقشه فیزیکی دو حامل پلاسمیدی (الف): pBI121PRP-1ChiGlu(-) و (ب): pBI121PR-
1aChiGlu(-).
Figure 13- Physical map of (a) pBI121PRP-1ChiGlu(-) and (b) pBI121PR-1aChiGlu(-).
|
|
شکل14- نقشه فیزیکی دو حامل پلاسمیدی (الف): pBI121PRP-1ChiGlu(+) و (ب): pBI121PR-1aChiGlu(+).
Figure 14- Physical map of (a) pBI121PRP-1ChiGlu(+) and (b) pBI121PR-1aChiGlu(+).
انتظار می‌رود پس از انتقال هر یک از حاملهای نوترکیب حاصل از این پژوهش به گیاه، با توجه به این که سه ژن از خانواده PR را با جهت‌‌های مختلف نسبت به هم دارا هستند اثرات همفزایی مقاومت به طیف وسیعی از پاتوژنهای قارچی ایجاد گردد.
تاکنون تعدادی سازه انتقال ژن به گیاه حاوی ژنهای مربوط به پروتئینهای ضدقارچی در کشور ساخته شده است که تک ژنی یا نهایتاً دو ژنی بوده یعنی یک یا دو ژن رمزکننده پروتئینهای ضد قارچی را حمل می‌کنند (Esfahani et al., 2010; Mohsenpour et al., 2008; Tohidfar et al., 2005). در این پژوهش سازه‌ای حاوی سه نوع مختلف از ژنهای کدکننده پروتئینهای ضدقارچی یعنی گروهای PR1، PR2 و PR3 ساخته شد. از آنجایی که برای تولید گیاهان مقاوم به بیماری با مقاومت پایدار، ضروری است که گیاهان به همه ژنوتیپهای عامل بیماری زا مقاوم باشند. مقاومت تک‌ژنی در گیاهان منجر به نتیجه سریع گزینش در ژنوتیپهای عوامل بیماری‌زا می‌گردد که مقاومت گیاهان را می‌شکند. بنابراین تهیه ناقل پلاسمیدی که دارای چندین ژن کدکننده پروتئینهای ضدقارچی تحت پیشبرهای مستقل قوی باشد، راهکار مناسبی جهت تولید گیاهان تراریخته مقاوم می‌باشد. حاملهای حاصل از این تحقیق علاوه بر پتانسیل ایجاد اثرات همفزایی کیتیناز و بتا 1 و 3-گلوکاناز نگرانی حاصل از احتمال سازگاری عوامل بیماری‌زا و شکستن مقاومت را تا حدود زیادی کاهش می‌دهد. از سوی دیگر بیان خود سرشت PR1 در این حامل که القا کننده سایر ژنهای PR در گیاه است، علاوه بر اثرات مثبت بر روی عملکرد آنزیمهای کیتیناز و بتا 1 و 3-گلوگاناز، سایر ژنهای مربوط به مکانیزم‌‌های دفاعی گیاه را نیز فعال نموده که انتظار می‌رود باعث تولید گیاهانی با مقاومتی بالا نه‌تنها در برابر قارچ‌ها بلکه حتی در برابر باکتری‌ها و دیگر تنشهای زنده و غیر زنده محیطی گردد.
منابع
Alexander D, Goodman RM, Gut-Rella M, Glascock C, Weymann K, Friedrich L, Maddox D, Ahl-Goy P, Luntz T, Ward E, Ryals J (1993). Increased tolerance to 2 oomycete pathogens in transgenic tobacco expressing pathogenesisrelated protein-1a. Proceedings of the National Academy of Sciences. U.S.A. 90: 7327-7329.
Broglie K, Chet I, Holliday M, Cressman R, Biddle P, Knowlton S, Mauvais CJ, Broglie R (1991). Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen, Rhizoctonia solani. Science 254: 1194-1198.
Cornelissen BJC, Horowitz J, Van Kan JAL, Goldberg RB, Bol JF (1987). Structure of tobacco genes encoding pathogenesis-related proteins from the PR-1 group. Nucleic Acids Research 15: 6799-6811.
Datta K, Velazhahan R, Oliva N, Ona I, Mew T, Khush GS, Muthukrishnan S, Datta SK (1999). Over-expression of the cloned rice thaumatin-like protein (PR-5) gene in transgenic rice plants enhances environmental friendly resistance to Rhizoctonia solani causing sheath blight disease. Theoretical and Applied Genetics 98:1138-1145.
Edreva A (2005). Pathogenesis-related proteins: research progress in the last 15 years. Gen. Appl. Plant Physiology 31: 105-124.
Esfahani K, Motallebi M, Zamani M R, Hashemi Sohi H, Jourabchi E (2010). Transformation of potato (Solanum tuberosum cv. Savalan) by chitinase and β-1,3-glucanase genes of mycoparasitic fungi towards improving resistance to Rhizoctonia solani AG-3. Iranian Journal of Biotechnology 8: 73-81.
Jach G, Gornhardt B, Mundy J, Logemann J, Pinsdorf R, Leah R, Schell J, Maas C, (1995). Enhanced quantitative resistance against fungal disease by combinatorial expression of different barley antifungal proteins in transgenic tobacco. Plant Journal 8: 97-106.
Jongedijk E, Tigelaar H, van Roekel JSC, Bres-Vloemans SA, Dekker I, Van den Elzen PJM, Cornelissen BJC, Melchers LS (1995). Synergetic activity of chitinases and β-1,3-glucanases enhances fungal resistance in transgenic tomato plants. Euphytica 85: 173-180.
Lusso M, Kuc J (1966). The effect of sense and antisense expression of the PR-N gene for β-1,3-glucanase on disease resistance of tobacco to fungi and viruses. Physiology Molecular Plant Pathology 49: 267-270.
Masoud SA, Zhu Q, Lamb C, Dixon R A (1996). Constitutive expression of an inducible β-1,3-glucanase in alfalfa reduces disease severity caused by the oomycete pathogen Phytophthora megasperma f. sp medicaginis, but does not reduce disease severity of chitin-containing fungi. Transgenic Research 5:313-318.
Matsuoka M, Yamamoto N, Kano-Murakami Y, Tanaka Y, Ozeki Y, Hirano H, Kagawa H, Oshima M, Ohashi Y (1986). Classification and structural comparison of full-length cDNAs for pathogenesis-related proteins. Plant Physiology 85: 942-950,
Mauch F, Mauch-Mani B, Boller T (1988). Antifungal hydrolases in pea tissue, II: Inhibitation of fungal growth by combination of chitinase and beta-1,3-glucanase. Plant Physiology 88: 936-942.
Mohsenpour M, Babaeian jelodar NA., Tohidfar M, Habashi AA (2008). Design and construction of four recombinant plasmid vectorscontaining chitinase, glucanase and Bt genes,suitable for plant transformation. Journal of Agricultural Sciences and Natural Resources, University of Gorgan 14: 112-124.
Moore AE, Stone BA (1972). Effect of senescence and hormone treatment on the activity of a β-1,3-glucan hydrolase in Nicotiana glutinosa leaves. Planta 104: 93-101.
Payne G, Middlesteadt W, Desai N, Williams S, Dincher S, Carnes J, Ryals J (1989). Isolation and sequence of a genomic clone encoding the basic form of pathogenesis-related protein 1 from Nicotiana tabacum. Plant Molecular Biology 12: 595-603.
Pfitzner AJP, Pfitzner UM, Goodman HM (1990). Nucleotide sequences of two PR-1 pseudogenes from Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38. Nucleic Acids Research 18: 3404-3414.
Pfitzner UM, Goodman HM (1987). Isolation and characterization of cDNA clones encoding pathogenesis-related proteins from tobacco mosaic virus infected tobacco plants. Nucleic Acids Research 15: 4449-4455.
Pfitzner UM, Pfitzner AJP, Goodman HM (2011). DNA sequence analysis of a PR-1a gene from tobacco: molecular relationship of heat shock and pathogen responses in plants. Molecular Gene and Genetic 211: 290-295.
Poupard P, Parisi. L, Campion C, Ziadi S, Simoneau P (2003). A wound- and ethephoninducible PR-10 gene subclass from apple is differentially expressed during infection with a compatible and incompatible race of Venturia inaequalis. Physiological and Molecular Plant Pathology 62: 3-12.
Robert N, Ferran J, Breda C, Coutos-Thevenot P, Boulay M, Buffard D, Esnault R (2001). Molecular characterization of the incompatible interactions of Vitis vinifera leaves with Pseudomonas syringae pv. pisi: expression of genes coding for stilbene synthase and class 10 PR protein. Europen Journal of Plant Pathology 107: 249-261.
Sambrook J, Russel DW (2000). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.
Sarowar S, Jin KY, Nam KE, Kim KD, Hwang BK, Islam R, Shin JSH (2005). Overexpression of a pepper basic pathogenesis-related protein 1 gene in tobacco plants enhances resistance to heavy metal and pathogen stresses. Plant Cell Reports 24: 216–224,
Sarowar SYJ, .Kim E.N, Kim KD, Kim BK, Hwang R, Islam J S, Shin K (2005). Overexpression of a pepper basic pathogenesis-related protein 1 gene in tobacco plants enhances resistance to heavy metal and pathogen stresses. Plant Cell Reports 24: 216-224.
Schaller AP, Roy N, Amrhein H (2000). Salicylic acid-independent induction of pathogenesis-related gene expression by fusicoccin. Planta 210: 599-606.
Schultheiss HLC, Dechert J, Kiraly K,.Fodor KH, Michel R, Kogel H (2003). Functional assessment of the pathogenesis-related protein PR-1b in barley. Plant Science 165: 1275-1280.
Tohidfar M, Ghareyazie B, Mohammadi M (2005). Agrobacterium-mediated transformation of cotton (Gossypium hirsutum) using a heterologous bean chitinase gene, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 83:83–96.
Tonon CG, Guevara C, Oliva G (2002). Isolation of a potato acidic 39 kDa b-1,3- glucanase with antifungal activity against Phytophthora infestans and analysis of its expression in potato cultivars differing in their degrees of field resistance. Journal of Phytopathology 150: 189-195.
Van Loon LC (1985). Pathogenesis-related proteins. Plant Molecular Biology 4: 111-116.
Wessels JGH, Sietsma J H (1981). Fungal cell walls: a survey, in Encyclopedia of Plant Physiology. Plant Carbohydrates II, Vol. 13B, Tanner, W. and Loewus, F. A., Eds., Springer Verlag, Berlin, pp 352.
Wu J H, Dimitman JE (1970). Leaf structure and callose formation as determinants of TMV movement in bean leaves as revealed by UV irradiation experiments. Virology 40: 820-826.
Yoshikawa M, Tsuda M, Takeuchi Y (1993). Resistance to fungal diseases in transgenic tobacco plants expressing the phytoalexin elicitor-releasing factor, β-1,3-endoglucanase, from soybean, Naturwiss 80: 417-423.
Isolation and Cloning of Two Genes from PR1 Family and Construction of Treble Plasmids Containing 3 Groups of Genes for Producing Transformed Plants Resistant to Fungal Diseases
Raufi A.1, Tohidfar M*.2, Soluki M.3, Mohsenpour M.4
1 MSc. Student Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran, Karaj, Iran.
2 Assistant Professor of Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran, Karaj, Iran.
Assistant Professor of Zabol University, Agricultural College, Zabol, Iran.
4 PhD, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran, Karaj, Iran
Abstract
Fungal diseases are among the most important biotic stresses causing considerable losses in agricultural products. Improving crop plants with broad resistance to fungal diseases is one of the main challenges in agriculture. Classical plant breeding is too timely and has many other limitations, hence using biotechnology for this purpose is inevitable. Expression of a complex of Pathogen Related proteins induces polygenic resistance in plants. This technique leads to a broad and stable resistance to fungal pathogens. Hence, in this study we isolated resistance genes and constructed treble plasmid vectors with multiple genes involving three important families of disease-related proteins namely PR1, PR2, and PR3. For this purpose we isolated two genes of PR1 family with special primer design from tobacco genome, first. After analysis the accuracy of gene isolation using 35S promoter and Nos terminator, they were cloned in binary vector pBI121. Then, we cloned two important antifungal genes including PR2 (glucanase) and PR3 (chitinase) under the control of regulatory independent regions in T-DNA of the above mentioned vector with parallel and antiparallel orientations. These treble vectors have good antibacterial potential too and can be used for resistance to bacteria and other biotic and abiotic stresses. They can be introduced into plants using particle gun or through Agrobacterium mediated transformation.
Key words: Gene cloning, Chitinase,Glucanase, Pathogen Related proteins, PR1.
)
