ردیابی ژن عامل طول دانه برنج (GS3) در جمعیتهای تلاقی مرکب با استفاده از نشانگرهای مولکولی

ردیابی ژن عامل طول دانه برنج (GS3) در جمعیتهای تلاقی مرکب با استفاده از نشانگرهای مولکولی

کاملیا کتالانی*¹، قربانعلی نعمت زاده²، غفار کیانی³، سید حمید رضا هاشمی⁴

1- کارشناسی ارشد رشته بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

2- استاد و محقق ارشد پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

3- استادیار دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی ساری

4- دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی، پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

تاریخ دریافت 7/9/90، تاریخ پذیرش 05/02/1391

چکیده

کیفیت ظاهری دانه برنج عمدتا شامل طول دانه و نسبت طول به عرض می­باشد و سهم به سزایی در بازارپسندی محصول دارد. با توجه به اینکه تعیین فنوتیپ شکل دانه در مراحل اولیه رشد گیاه میسر نمی­باشد انتخاب به کمک نشانگرهای مولکولی گامی اساسی در جهت بهبود صفات کمی و کیفی برنج می­باشد. در این تحقیق به منظور ترمیم صفات کمی و کیفی رقم جدید قائم، از دو رقم محلی شصتک و دمسیاه و دو رقم اصلاح شده فجر و نعمت به عنوان والد در تلاقی­ها استفاده گردید. جهت اجرای MAS در لاین­های حاصل از تلاقی­های مرکب، ابتدا کارایی نشانگر GS3 به کمک مطالعات بیوانفورماتیکی (In silico) و بررسی همبستگی الگوی باندی با فنوتیپ والدین تایید گردید. بدین نحو که رقم شصتک با خصوصیات دانه گرد، نسبت به سایر والدین الگوی باندی منحصر به فردی ایجاد نمود. از الگوی باندی نشانگر GS3 در تلاقی­های مرکب شماره 1 (فجر / قائم// شصتک / قائم)، تلاقی شماره 3 (نعمت / قائم// شصتک / قائم) و تلاقی شماره 4 (شصتک / قائم // دمسیاه/ قائم) جهت تمایز بوته­های هتروزیگوس دارای آلل شصتک (نامطلوب) از سایر بوته­ها (دانه کشیده) استفاده گردید. شایان ذکر است برای دستیابی به لاین­های خالص، بوته­های دانه بلند انتخابی می­بایست در نسل­های پیشرفته­تر مورد بررسی قرار گیرند. نتایج این تحقیق نشان می­دهد که از نشانگر مکان ژنی  GS3 می­توان به عنوان روشی سریع و کم هزینه جهت بهبود کیفیت طول دانه استفاده نمود.

کلمات کلیدی: طول دانه، برنج، تلاقی مرکب، انتخاب به کمک نشانگرهای مولکولی (MAS).

مقدمه

طول دانه یکی از صفات مهم کیفی برنج می­باشد که بر وزن دانه و عملکرد محصول تاثیرگذار است (Liu et al.., 2004). طول دانه و شکل آن یکی از عوامل اصلی بازارپسندی برنج بوده و تاثیر به سزایی بر روی پخت و فرآیند تبدیل برنج دارد (Fan et al., 2009). دانه های برنج سفید از نظر طول (میلی­متر) به دانه های خیلی بلند (بیش از 5/7)، بلند (5/7-61/6)، متوسط (6/6-5/5) و کوتاه (5/5 و یا کمتر) تقسیم می­شوند(Dela Cruz et al., 2000). طول دانه صفتی کمی است. یک QTL اصلی برای طول دانه در اطراف ناحیه پری سانترومریک کروموزوم 3 به نام GS3  شناسایی شده که 80- 90 درصد تنوع طول دانه را به خود اختصاص داده است و تاثیر منفی بر روی طول دانه دارد (Fan et al.,2006). مقایسه توالی ژنوتیپ­های دانه بلند و دانه کوتاه نشان داده است که اگزون شماره 2 لوکوسGS3  یک چند شکلی تک نوکلئوتیدی[1] دارد که شکل دانه به واسطه آن تغییر می­کند. این SNP در سطح پروتئین کدون سیستئین را (TGC) به کدون پایان (TGA) تغییر می­دهد. آلل غالب C، پروتئینی 232 آمینو اسیدی را رمز می­کند که باعث ایجاد دانه کوتاه شده و آلل A که مغلوب بوده، پروتئینی با 178 آمینو اسید و بدون ویژگی های عملکردی را رمز کرده و سبب ایجاد دانه بلند می­شود (Fan et al., 2006).

با توجه به اینکه تعیین شکل دانه در مراحل اولیه رشد گیاه امکان پذیر نمی­باشد، همچنین اهمیت شکل دانه برای مصرف کنندگان، محققان را به این امر واداشت تا نشانگرهایی که با ژن مورد نظر پیوسته هستند، به منظور تعیین طول دانه در مراحل اولیه رشد برنج طراحی نموده و به کار گیرند. اولین نشانگرهای RFLP پیوسته با ژن طول دانه (RZ562 و RZ323)، به علت فاصله زیاد از ژن مورد نظر در برنامه های انتخاب به کمک نشانگرهای مولکولی MAS[2])) کاربردی نبودند (Ahn et al., 1993). نشانگرهای SSR نیز از قابلیت چندانی در تشخیص این صفت برخوردار نبودند (Biswas et al., 2004). پس از آن نشانگرهایی دقیق تر بر مبنای جهش تک نوکلئوتید مورد بررسی قرار گرفتند. با کمک نشانگرهای حاصل از مکان های چند شکلی تک نوکلئوتیدی(SNP) می­توان بر مشکل نوترکیبی و پیوستگی که در مورد نشانگرهای حاصل از QTL وجود دارد، فائق آمد (Fan et al., 2009). در پژوهشی Fan et al. (2009) یک نشانگر [3]CAPS، بر مبنای جهش تک نوکلئوتیدی در اگزون دوم این ژن طراحی کردند، اما این نشانگر به علت هضم بعد از PCR و استفاده از ژل اکریل آمید و رنگ آمیزی نقره، در MAS هزینه بالا و وقت زیادی را به خود اختصاص می­داد. در همین راستا محققان دیگری نیز از نشانگرهای مربوط به این ژن در برنامه های اصلاحی استفاده کردند (Yan et al., 2009)، از جمله  Ramkumar et al(2010) نشانگری جدید را برای ژن GS3 بر مبنای SNP معرفی کردند که قادر به تفکیک در ژل آگارز بوده و ازاین رو در برنامه­های MAS قابل استفاده می­باشد. محققان زیادی بر اساس داده­های حاصل از نشانگرهای مولکولی کیفیت ارقام زراعی را بهبود بخشیده و موفق به ترکیب این ویژگی­ها در یک رقم شده اند (Jairin et al., 2009; Jin et al., 2010; Yan et al., 2009). هدف از این تحقیق مطالعه ردیابی ژن طول دانه (GS3) در جوامع حاصل از تلاقی های مرکب، و ردیابی آن با استفاده از نشانگرهای مولکولی بوده است.

مواد و روش ها

مواد گیاهی

در این تحقیق از چهار رقم مختلف برنج از جمله ارقام محلی دمسیاه و شصتک و ارقام اصلاح شده پرمحصول فجر و نعمت بعنوان پایه­های پدری، و رقم قائم بعنوان پایه ثابت مادری استفاده گردید. کلیه تلاقی­های ممکن یک­طرفه در سال 1387 به صورت دستی انجام و بذور F₁ که شامل تلاقی­های فجر/ قائم ، دمسیاه / قائم ، شصتک / قائم و نعمت / قائم بودند در سال 1388 کشت شدند. در سال زراعی 1388 تلاقی­های بین F₁ ها انجام (جدول 1) و بذور تلاقی­ها­ی مرکب جمع آوری و در سال زراعی 1389 در مزرعه پژوهشی پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری طبرستان کشت شدند. مطالعات بیوانفورماتیکی ژن طول دانه

به منظور بررسی بیوانفورماتیکی ژن طول دانه و در نتیجه انتخاب نشانگر مناسب در این تحقیق، از پایگاه­های اطلاعاتی و نرم افزارهای مربوطه استفاده گردید، که از جمله می­توان به BLAST و Clustal W  اشاره نمود.

نمونه­های برگی 43 بوته انتخابی از مجموع 190 بوته تلاقی­های مرکب (با توجه به خصوصیات مورفولوژیکی و تیپ مناسب بوته) برداشت و استخراج DNA آنها به روش دلاپورتا و همکاران (1983) انجام شد. نشانگرهای همبسته با صفت مورد نظر طبق جدول 2 انتخاب و به کار گرفته شدند (جدول 2). شرایط PCR برای ژن مورد مطالعه بر اساس استاندارد متداول شرایط PCR برای نشانگرهای SSR بوده است فرآورده­های PCR به وسیله الکتروفورز ژل آگارز 5/2-2 درصد جداسازی و در اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی شدند.

جدول 1-  ارقام والدینی مورد استفاده و تلاقی های انجام شده برای تولید جمعیت های مرکب.

Table 1- Parental varieties and crosses that were used for the production of composite populations.

جدول 2- نشانگرهای مولکولی همبسته با شکل دانه برنج که در این تحقیق استفاده شده­اند.

Table 2- Molecular markers linked to the rice grain length used in this research.

نتایج

مطالعات بیوانفورماتیکی

با توجه به مطالعات گسترده­ای که در زمینه شناسایی ژن­های دخیل در طول دانه برنج صورت گرفته، شناسایی یک نشانگر مولکولی ایده­آل جهت استفاده در برنامه انتخاب به کمک نشانگر (MAS) ضروری بنظر می­رسد. از اینرو جهت انتخاب یک نشانگر کارا، ژن­های کاندید دخیل در شکل دانه شامل gl-3، GS3, GW2, qSW5و GW5 (Wan et al.., 2006, Fan et al.., 2006, Song et al.., 2007, Shomura et al.., 2008, Weng et al.., 2008) در پایگاه های BLAST و Clustal W مورد بررسی قرار گرفتند. از این میان بلوک ژنی GS3 بشماره ژن بانک DQ355996 انتخاب گردید. در این بررسی با استفاده از نرم افزار BLAST و Clustal w  و مقایسه توالی­های موجود در بانک­های اطلاعاتی، کلون BAC[4] به شماره ژن بانک AC13486.5 به عنوان کلونی حاوی ژن GS3 مشخص و مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به نتایج حاصل از ترادف و همردیفی نرم افزاری، نشانگر GS09 در فاصله 5/37 کیلو جفت باز یا 145/0 سانتی مورگان (با فرض هر سانتی مورگان در برنج معادل حدودی 5/258 کیلو جفت باز (Semang et al.,2006) از ژن طول دانه، قرارگرفته است (شکل1). نشانگر GS09 به دلیل وجود توالی تکراری _n(ATT) از اندازه باندی متفاوتی در ژنوتیپ­های مختلف برخوردار می­باشد. که با توجه به فاصله نزدیک آن با اگزون شماره 2 ژن GS3، مکان ژنی GS09 جهت ردیابی تغییرات ایندل مورد استفاده قرار گرفت.

آنالیز مولکولی و ارزیابی جمعیت تلاقی مرکب

نتایج آزمایش نشان داده است که نشانگر ریز ماهواره RM411 علی­رغم فاصله 5 سانتی مورگان با ژن مورد نظر (GS3) قادر به تفکیک طول دانه در این تحقیق نبود، در حالی که نشانگر GS09 از این قابلیت برخوردار بوده و به خوبی توانست شصتک را که رقمی با شکل دانه کوتاه بطول 60/8 میلی متر می­باشد (شکل 2) از سایر ارقام والدینی (فجر:86/10، قائم: 07/11، نعمت: 97/11 و دمسیاه: 03/11) متمایز نماید (شکل3). باند تکثیری حاصل از این نشانگر به وزن 156 جفت باز در رقم شصتک (شکل 3) و مطابقت با باند مورد انتظار حاصل از مطالعات بیوانفورماتیکی (شکل 1)، نشان­دهنده صحت استفاده از این نشانگر در بررسی های MAS می­باشد. علاوه بر این نتایج حاصل از نشانگر SNP رامکومار و همکاران (2010) نیز رقم شصتک را از سایر ارقام متمایز نموده است. همچنین چندشکلی حاصل از این نشانگر نشان دهنده پیوستگی بین طول دانه کوتاه و ژن GS3 می­باشد (شکل 4). آزمون این نشانگر در نسل در حال تفکیک فجر / قائم // شصتک / قائم(تلاقی1) نشان داده است که از تعداد 11 بوته،2 بوته هموزیگوت غالب (دانه کوتاه) و الگوی باندی شصتک را داشته و 6 بوته هتروزیگوت (با یک باند شصتک)، و مابقی بوته­ها الگوی باندی مشابه با والدین دانه بلند خود داشتند، به علت تفاوت در اندازه باندی والد دمسیاه نسبت به سایر ارقام در تلاقی نعمت / قائم // دمسیاه / قائم (تلاقی2)، از تعداد 10 بوته 5 بوته هتروزیگوت (با یک باند دمسیاه) و مابقی باند هموزیگوس مغلوب (دانه بلند) داشتند.

شکل 1- نمای شماتیکی از ژن GS3 و موقعیت نسبی نشانگر GS09 از این ژن و قطعه تکثیر شده توسط این نشانگر. بلوک های سیاه :نواحی کد کننده، بلوک های خاکستری 3'  و 5' UTR ، کدون شروع (ATG)، کدون پایان (TGA) و جهش تک نوکلئوتیدی (C/A) در دومین اگزون نشان داده شده است.

Figure 1- Organization of GS3 gene and relative position of GS09 primer for amplifying a segment of 156 bp in PCR. The position of coding regions (black boxes), 5' and 3' UTR (ashen boxes), translation start codon (ATG) , translation stop codon (TGA) and the SNP (C/A) in the second exon are indicated.

شکل 2- اندازه دانه ارقام والدینی به میلی متر. شصتک، کوتاهترین طول  (60/9 میلی متر) را در بین ارقام دیگر دارد.

Figure 2- Grain size of parent cultivars to mm, Shastak is shorter than others.

در تلاقی نعمت / قائم // شصتک / قائم (تلاقی3)، 2 بوته هتروزیگوت مربوط به شصتک، 1 بوته هموزیگوت غالب و 2 بوته هموزیگوت مغلوب بودند. در تلاقی شصتک/قائم// دمسیاه/ قائم(تلاقی4)، 1 بوته هتروزیگوت شصتک و 1 بوته هتروزیگوت با یک باند دمسیاه و 5 بوته هموزیگوت مغلوب بوده و در تلاقی فجر / قائم // نعمت / قائم (تلاقی5)، هر 5 بوته هموزیگوت مغلوب بودند. از تعداد 5 بوته تلاقی فجر / قائم // دمسیاه / قائم (تلاقی6)، نیز 4 بوته هتروزیگوت و 1 بوته هموزیگوت مغلوب بوده است.

شکل 3- نشانگر GS09، چندشکلی حاصل در والدین و جمعیت حاصل از تلاقی مرکب : فجر قائم//شصتک/ قائم (1). نعمت / قائم // دمسیاه / قائم (2). نعمت / قائم // شصتک / قائم (3). شصتک / قائم // دمسیاه/ قائم (4). فجر / قائم // نعمت / قائم(5). فجر / قائم // دمسیاه / قائم(6)، و ارقام والدینی شامل: P₁ ; فجر، P₂ ; قائم ، P₃ :شصتک ; P₄ : دمسیاه ; P₅ : نعمت.

Figure 3- GS09 primer, Polymorphism in parent and population from composite cross: Fajr / Ghaem // Shastak / Ghaem (1). Nemat / Ghaem // Domsia / Ghaem (2). Nemat / Ghaem // Shastak / Ghaem (3). Shastak / Ghaem // Domsia / Ghaem (4). Fajr / Ghaem // Domsia / Ghaem (5). Fajr / Ghaem // Domsia / Ghaem (6). Parents including: P₁: Fajr, P₂: Ghaem, P₃: Shastak, P₄: Domsia. P₅: Nemat.

جدول 3- نمایی از قطعه های تکثیر شده توسط نشانگرGS09 که در شکل 3 نشان داده شده است.

Table 3- Imagery of amplified segments by GS09 primer which was shown in figure 3.

شکل4- چند شکلی حاصل ازنشانگر SNP رامکومار و همکاران. ارقام والدینی شامل: P₁: فجر، P₂ : قائم، P₃ : شصتک ، P₄ : دمسیاه ، P₅ : نعمت.

Figure 4- Polymorphism in parental cultivar by SNP marker. Parents including: P₁: Fajr, P₂: Ghaem, P₃: Shastak, P₄: Domsiah, P₅: Nemat.

بحث

در این تحقیق از رقم دمسیاه با عطر و طعم بالا و شصتک زودرس (60 روزه در شصتک و 123 روزه در قائم) و با تراکم دانه بسیار بالا، فجر با کیفیت متوسط و نعمت با طول خوشه بلند (5/31 سانتی متر طول خوشه در نعمت و 28 سانتی متردر قائم) به منظور انتقال صفات کاندید شده در آنها، به رقم قائم استفاده گردید. در این بین شصتک با وجود صفات مطلوب ذکر شده دارای طول دانه بسیار کوتاه می­باشد. به منظور رفع این مشکل تنها بوته هایی که از نظر طول دانه بلند بودند، برای مطالعات بعدی انتخاب گشتند. با درنظر گرفتن وجود رقم شصتک در تلاقی 1 (فجر / قائم // شصتک / قائم) ، تلاقی 3 (نعمت / قائم // شصتک / قائم) و تلاقی 4 (شصتک / قائم // دمسیاه/ قائم)، نشانگر مورد استفاده در این تحقیق، باندهای هموزیگوت و هتروزیگوت مربوط به شصتک را مشخص نموده است. به دلیل غالب بودن صفت کوتاهی طول دانه ، وجود والد شصتک در هر یک از تلاقی­ها سبب انتقال این ژن به جمعیت در حال تفکیک شده و ژنوتیپ افراد جمعیت تلاقی مرکب با توجه به الگوی باندی حاصل از این نشانگر مشخص گردید و ژنوتیپ­های هموزیگوت مغلوب جهت بررسی­های بیشتر از نظر سایر ژن­های دخیل در کیفیت انتخاب شدند. چون طول دانه به طور کمی به ارث می­رسد و با توجه به اثرات متقابل ژنوتیپ و محیط در صفات کمی، اصلاح برنج با روش­های سنتی کار دشواری می­باشد. بنابراین استفاده از نشانگرهای مولکولی پیوسته با ژن هدف یا QTL های اصلی کمک زیادی به اصلاح کننده در انتخاب ژنوتیپ مطلوب در نسل های اولیه می­نماید. کشف جهش تک نوکلئوتیدی در ژن GS3 پایه و اساس طراحی نشانگرهای مولکولی ژن طول دانه بوده است. فاصله بسیار اندک نشانگر GS09 با جهش تک نوکلئوتیدی در اگزون 2 ژن GS3، تنوع بین ارقام والدینی را به خوبی نشان می­دهد که نشان دهنده پیوسته بودن این نشانگر با SNP لوکوس GS3 می­باشد. بر اساس گزارش مائو و همکاران (2010) مبنی بر وجود آلل­های مختلف در لوکوس GS3 در این تحقیق نیز والد شصتک اندازه آللی متفاوتی نسبت سایر والدین داشته (شکل3 و 4) که بیانگر وجود آلل های مختلف در واریته ها و ایجاد فنوتیپ های متفاوت می­باشد. همچنین  بر اساس گزارشی از وانگ و همکاران (2010) علاوه بر جهش تک نوکلئوتیدی در اگزون 2، وجود توالی­های تکراری در اینترون 2 (SR17) و آخرین اینترون (RGS1) و آخرین اگزون (RGS2) ژن GS3 نیز سبب تغییر در طول دانه در سایر ارقام برنج (O. rufipogon , O. glaberrima ) می­شود (Wang et al., 2010). نشانگر ریزماهواره RM411، در بین والدین هیچ چندشکلی نشان نداد، در مقابل نشانگر Indel GS09، فنوتیپ طول دانه در جمعیت تلاقی مرکب را به خوبی تفکیک نمود. فنوتیپ دانه بلند به وسیله آلل مغلوب کنترل شده در حالیکه هموزیگوت غالب و هتروزیگوت هر دو موجب شکل کوتاه دانه می­گردند. از این گذشته تشخیص بوته­های هتروزیگوت در برنامه­های اصلاحی جز با نشانگر مولکولی امکان پذیر نمی­باشد (Fan et al., 2006). در این بررسی کارایی نشانگر  GS09 در بررسی های مولکولی و MAS مورد بررسی قرار گرفت که نتایج حاصله کاملا با خصوصیات فنوتیپی لاین­های والدینی و در حال تفکیک مطابقت داشت. همچنین در مطالعات مختلف و نیز در این تحقیق نشانگرهایی که بر مبنای جهش تک نوکلئوتیدی و پیوسته با ژن اصلی طراحی شده اند از صحت بیشتری در ارزیابی­های مولکولی به منظور تعیین ژنوتیپ، برخوردار بودند (Mao et al., 2010. Fan et al., 2009, Ramkumar et al., 2010). با در نظر گرفتن توالی­های تکراری حاصل از نشانگر GS09 و پیوستگی آن با ژن اصلی، این نشانگر قادر به تمایز بین فنوتیپ ارقام والدینی بوده است. لذا با توجه به نتایج بدست آمده این انتظار می­رود که در نسل­های پیشرفته با تهیه لاین­های خالص امیدبخش و با ترکیب یا هرمی ساختن ژن­های دخیل در کیفیت دانه برنج، می­توان به ارقام اصلاحی با صفات کمی و کیفی مناسب دست یافت علاوه بر این به علت عدم نیاز این نشانگر به ژل اکریل آمید و هضم بعد از PCR از آن می­توان به عنوان ابزاری کاربردی در MAS استفاده نمود.

تشکر و قدردانی

از مجموعه مدیریت پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری طبرستان که اعتبار لازم را برای انجام این پروژه فراهم نموده­اند، قدردانی به عمل می­آید.