تنوع آللی نشانگرهای ناحیهQTL کنترل کننده تحمل به شوری ( Saltol ) در مرحله گیاهچه ای در ارقام برنج ایرانی

تنوع آللی نشانگرهای ناحیهQTL  کنترل کننده تحمل به شوری ( Saltol ) در مرحله گیاهچه­ای در ارقام برنج ایرانی

رضیه زارع¹، قاسم محمدی نژاد*²، حسین شاهسوند حسنی²

¹دانشجوی کارشناسی ارشد بخش بیوتکنولوژی ، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان.

²اعضای هیات علمی بخش زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان.

تاریخ دریافت: 11/3/1391، تاریخ پذیرش: 6/5/1391

چکیده

با توجه به ضرورت تحمل به شوری در برنج و از طرفی وجود تحقیقات مختلف اصلاح نباتات مولکولی در شناسایی QTL­های بزرگ اثر کنترل کننده تحمل به شوری، ضرورت شناسایی حضور این QTL­ها در ارقام مختلف ایرانی و شناسایی تاثیرگذارترین QTL­ها در پیشبرد انتخاب در برنامه­های اصلاحی بسیار مفید است. در این مطالعه، پاسخ به شوری 20 رقم مختلف برنج ایرانی و دو شاهد متحمل (Pokkali) و حساس (IR29 ) در مرحله گیاهچه­ای در شرایط گلخانه ( dsm^-110 و 6 ، 0EC=) با استفاده از 6 نشانگر چند شکل ریزماهواره مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج تجزیه واریانس اختلاف بسیار معنی­داری بین ژنوتیپ­ها از نظر صفات مختلف نشان داد. ژنوتیپ­های برنج از نظر  تحمل به شوری پاسخ متفاوتی در مرحله گیاهچه­ای نشان دادند. دندروگرام به دست آمده از روش UPGMA (روش اتصال میانگین)، ارقام را به سه گروه طبقه­بندی کرد. بیست رقم برنج بر اساس  QTL بزرگ­اثر ناحیه Saltol برای تحمل به شوری بر روی کروموزوم 1 در گروه های هاپلوتیپی  جداگانه قرار گرفتند. نتایج نشان دهنده پتانسیل ژرم­پلاسم برنج­های ایرانی جهت یافتن ژن­های جدید تحمل در القاء تحمل به شوری، به غیر از ناحیه Saltol در مرحله گیاهچه­ای بود. همچنین ، نشانگر RM8094در مرحله گیاهچه ای به عنوان مؤثرترین نشانگر جهت شناسایی ژنوتیپ های متحمل به شوری می­باشد.

کلمات کلیدی: برنج، تحمل شوری، تنوع هاپلوتایپی، ریز ماهواره.

مقدمه

برنج بعد از گندم غذای اصلی مردم ایران است و در سطحی معادل 600 هزار هکتار زراعت می­شود (فتوکیان، 1383). 90 درصد شالیزارهای دنیا به نوعی تحت تاثیر شوری هستند (Ansari et al., 2001). شوری رشد گیاه برنج را در مراحل مختلف رشد از جوانه زنی تا رسیدن کامل به درجات مختلف تحت تاثیر قرار می­دهد (Lang et al., 2001b). واکنش برنج به شوری در مراحل مختلف رشد متغیر است، در مرحله جوانه زنی به شوری نسبتاً متحمل، در اوایل دوره گیاهچه­ای (3 برگی) خیلی حساس شده و مجدداً در مرحله رشد رویشی نسبتاً متحمل  می­گردد. در مرحله گرده افشانی و لقاح نیز به شوری حساس شده و در مرحله رسیدن دانه به طور فزاینده­ای متحمل­تر می­گردد (Moradi, 2002; Lang et al., 2001a). اصلاح تحمل به شوری توسط محققان زیادی مطالعه شده است (Gregorio et al., 2002; Ponnamperuma, 1984; Shannon, 1984) موفقیت های بدست آمده در گذشته به دلیل پیچیدگی کار اصلاح برای تحمل به شوری، فقدان احساس ضرورت و فوریت واقعی برای اصلاح آن، تنوع ژنتیکی ناکافی برای تحمل به شوری، پیچیدگی اثرات متقابل شوری با عوامل محیطی و فقدان تکنیک های گزینشی کارا چندان قابل توجه نبوده است (Flowers & Yeo, 1995; Gregorio, 1997). طراحی استراتژی­های اصلاحی پویا برای اصلاح تحمل به شوری در ارقام برنج نیازمند درک مکانیسم های تحمل به شوری است (Moradi, 2002). روش­های مولکولی از طریق نشانمندکردن ژن‎ها و گزینش به کمک نشانگر باعث تسریع برنامه‎های اصلاحی شده است. شناسایی نشانگرهای مولکولی کاملاً پیوسته با ژن مورد نظر و مکان‎یابی آن یک هدف مهم در اصلاح برنج است که از این طریق می­توان بر پیچیدگی­های روش­های اصلاحی متداول غلبه کرد (Flowers & Yeo, 1995). استفاده از نشانگرهای ریزماهواره درطی سال­های اخیر جهت نقشه­یابی QTL­ها در برنج مورد توجه فراوان قرار گرفته­است (McCouch et al., 1997). در برنج به طور بالقوه 5700 تا 10000 توالی ریزماهواره با واحدهای تکراری 2، 3 و یا 4  نوکلئوتیدی متفاوت وجود دارد (Arif , 2002; McCouch et al., 1997 ) مک کوچ و همکاران (McCouch et al., 2002) نقشه ای شامل 2240 نشانگر ریزماهواره تهیه نمودند که تمام ژنوم برنج را پوشش داد. پس از آن نقشه ژنتیکی کامل­تری توسط International Rice Genome Sequencing Project  ارائه شد که تعداد 18828 نشانگر SSR (دو، سه و چهار نوکلئوتیدی) را شامل می­شود (IRGSP، 2005). این نشانگرها در برنج قادرند چند شکلی را در بین واریته ها و یا درون واریته ها شناسایی نمایند (Olufowote et al., 1997; Yang et al., 1994). مکان کروموزومی بزرگ­اثر Saltol واقع بر روی کروموزوم 1، که در تنظیم جذب سدیم، پتاسیم، نسبت سدیم به پتاسیم و تحمل به شوری در مرحله گیاهچه در برنج مؤثر است، در سال 1997 توسط گریگوریو درنسل ₈F حاصل از تلاقی Pokkali×IR29 با استفاده از نشانگرهای ریز­ماهواره (SSR[1] و[2]SSLP) شناسائی گردید Gregorio,1997)). این نتیجه به وسیله محققین مختلفی تأیید گردیده است Mohammadi-Nejad, 2008; Flowers et al., 2000; Niones, 2004)). به منظور شناسایی نشانگرهای پیوسته با ناحیه Saltol که به منظور اصلاح برای تحمل به شوری در برنامه های انتخاب به کمک نشانگر (MAS[3]) ضروری است، بونیلا و نیونس (Bonilla et al., 2002; Niones, 2004) نقشه این ناحیه کروموزومی را با استفاده از جوامع حاصل از تلاقی Pokkali×IR29 با نشانگرهای [4]RFLP و SSLP اشباع نمودند.  در پژوهشی در کروموزوم یک برنج یک QTL اصلی برای تحمل به شوری گزارش دادند (Gong et al., 1999). در مطالعه دیگری  نشانگرهای RFLP و SSR پیوسته­ای با QTL­های صفاتی چون بقای گیاهچه در محلول شور، وزن خشک ریشه و جوانه، جذب سدیم و پتاسیم و نسبت سدیم به پتاسیم روی کروموزوم­های 1، 2، 3، 7، 9، 11 و12 با استفاده از 118 فرد جمعیت نسل هشتم RIL حاصل از تلاقی Tesnai2 و CB شناسایی نمودند (Lang et al, 2001). با استفاده ازتجزیه نشانگر AFLP شانزده QTL مسئول جذب یون­های سدیم و پتاسیم در جوانه­های برنج گزارش شد (Flowers et al., 2000). در پژوهشی از 118 فرد نسل ششم جمعیت RIL حاصل از تلاقی IR4630-22-2-51-3/IR15324-117-3-2-2 برای مکان­یابی صفات مرتبط با تحمل شوری استفاده نمودند. آنها تعداد 85 نشانگر AFLP و 27 نشانگر SSR چند شکل را در پژوهش خود به کار گرفتند. نتایج حاصل از تجزیه، 11 QTL روی کروموزوم های 1، 4، 6 و 9 برای صفات مختلف شناسایی نمود که تغییرات فنوتیپی از 4/6 تا 6/19 درصد را توجیه کردند (Koyama et al., 2001). در شرایط شوری صفات مرتبط با تحمل به شوری مثل طول اندام هوایی، مقدار کم­ یون سدیم و مقدار بیشتر یون پتاسیم در اندام هوایی، وزن خشک زیاد ریشه و اندام هوایی در گیاهچه‎های برنج مطالعه گردیدند و نشان داده شد که این صفات دارای آثار ژنتیکی افزایشی خیلی معنی‎دار می‎باشند، گر چه توارث‎پذیری آن­ها کم است. از این صفات می‎توان به عنوان معیار با ارزش در گزینش لاین­‎های متحمل به شوری در مرحله گیاهچه‎ای استفاده کرد (Gregorio, 1997; Gregorio et al., 2002). یک هاپلوتیپ، نشان دهنده‌ی توالی نوکلئوتیدهای ژنوم یک فرد بر روی تعدادی ازSNP است. ژنوم هر فرد ترکیبی از دو هاپلوتیپ به ارث رسیده از والدین است که این ترکیب را اصطلاحاً ژنوتیپ فرد می­‌نامند. با ادغام هاپلوتیپ پدری و مادری ژنوتیپ فرد که شامل یک رشته 0،1و2 است ایجاد می­گردد، اگر دو هاپلوتایپ مشابه باشند هوموزیگوس است که با 0 و 1 نشان داده می­شود و در حالت هتروزیگوسیتی با 2 نشان داده می­شود.  به نظر می­‌رسد تنوع هاپلوتیپ‌ها طی نسل‌های متوالی، در نواحی معینی از ژنوم بدون تغییر باقی می­‌ماند. این نواحی، ژنوم را به مجموعه‌ای از بلوک‌های هاپلوتیپی افراز می­‌کنند.  بدین منوال حتی زمانی زمانی که ناحیه­ای از کروموزوم­ها بحث می­گردد که براساس مکان­یابی QTL­ها حاوی ژن­های تاثیرگذار در کنترل صفتی می­باشد، می­توان بر مبنای مطابقت توالی ریز ماهواره­های آن ناحیه مورد نظر در یک جمعیت با هاپلوتیپ والد دهنده به بررسی هاپلوتیپ­های مختلف پرداخت و با بررسی فنوتیپی جمعیت تعیین نمود کدام هاپلوتیپ بیان بهتری از صفت مربوطه دارد و ضمن تعیین بهترین و موثرترین ترکیب آللی ناحیه QTL مورد نظر که برای انتخاب به کمک نشانگر بسیار ضروری و مفید می­باشد، بر اساس سایر هاپلوتیپ­ها که فنوتیپ متحملی دارند ولی از نظر مطابقت با والد دهنده QTL هیچگونه مطابقتی ندارند پی برد که ژرم پلاسم­های مورد نظر می­توانند حاوی لوکوس­های جدیدی برای صفت مورد نظر باشند.

از آنجا که برنج به شوری حساس و نیمه حساس  می­باشد (Mass & Hafman, 1997) بررسی تنوع آللی نشانگرهای ناحیه  QTL­ کنترل کننده تحمل به شوری و شناسائی موثرترین نشانگرهای این ناحیه   از اهداف مهم این مطالعه می­باشد. همچنین ارزیابی فنوتیپی صفات جهت بررسی و میزان الگوی تنوع ژنتیکی در بین ژنوتیپ ها، گروه­بندی و ایجاد زمینه بهره برداری از این تنوع ژنتیکی از طریق روش­های مرسوم و مولکولی از دیگر اهداف این پژوهش بودند.

مواد و روش­ها

ارزیابی­های فنوتیپی

روش غربال­گری سریع 20 رقم برنج بومی و اصلاح­شده ایرانی جهت ارزیابی پاسخ فنوتیپی آن­ها به تنش شوری و شناسایی وضعیت Saltol در این ارقام در مرحله گیاهچه­ای، طبق روش گریگوریو و همکاران (1997) انجام گرفت. در مرحله گیاهچه­ای 14 روز  پس از کشت، اعمال تنش در محلول غذایی یوشیدا با هدایت الکتریکی برابر با dsm^-110 به مدت 21 روز تحت شرایط کنترل شده در فیتوترون در دمای C ^º25 در روز و C ^º21 در شب و رطوبت 70 درصد انجام شد و امتیاز تحمل به شوری ژنوتیپ ها با استفاده از سیستم نمره­دهی 9-1 صورت پذیرفت (Gregorio et al., 1997). ژنوتیپ­ها در پنج گروه 1، 3، 5، 7 و 9 رتبه­دهی شدند که متحمل ترین ژنوتیپ رتبه 1 و حساس ترین ژنوتیپ رتبه 9 را به خود اختصاص دادند.

آزمایش به­صورت کرت­های خرد شده در قالب طرح بلوک کامل تصادفی با دو تکرار اجرا شد. تیمارهای آزمایشی شامل دو سطح نرمال و شوری (با هدایت الکتریکی 6 و 10 دسی­زیمنس بر متر) عامل اصلی و ارقام برنج ایرانی، که شامل ارقام گیل، ندا، نعمت، خزر، سپیدرود، عنبربو، بینام، شاه­پسند، حسنی، قشنگه، غریب، طارم پاکوتاه، درفک، اهلمی طارم، صدری، طارم محلی، موسی طارم، دم­سیاه، آمل و زاینده­ رود عامل فرعی بودند. صفات طول ریشه و ساقه، وزن خشک ریشه و ساقه، غلظت سدیم ، پتاسیم و نسبت سدیم به پتاسیم به روش فلایم­فتومتری برای گیاهان در مرحله 4 برگی اندازه گیری گردید.

ارزیابی ژنوتیپی

گیاهچه های 20 رقم برنج ایرانی و دو شاهد متحمل (Pokkali) و حساس (IR29) به شوری جهت استخراج DNA  ژنومی طبق روش تغییر یافته دلاپورتا کشت گردیدند (Delaporta, 1983). از 6 نشانگر چند شکل ریزماهواره در مرحله گیاهچه ای مربوط به ناحیه Saltol واقع بر روی کروموزوم­ 1 برای واکنش زنجیره­ای پلیمراز مورد استفاده قرار گرفتند.

واکنش زنجیره­ای پلی­مراز با استفاده از دستگاه ترموسایکلر Eppendorf  در حجم lµ 10  انجام شد. مخلوط واکنش حاوی،  PCR بافر یک برابر، MgCl2  5/1 میلی مولار، 1 میکرولیتر dNTPs، 5/0 میکرولیتر از هر پرایمر با غلطت 5 میلی مولار، Taq پلیمراز یک واحد و 50 نانو گرم از DNA الگو بود. به منظور تکثیر قطعات DNA چرخه­های PCR به شرح زیر انجام شد: بعد از 5 دقیقه واسرشت سازی در دمای °C94 سپس 35 چرخه شامل: 1 دقیقه در دمای °C 94، 45 ثانیه در دمای اتصال °C 55 ، 1دقیقه در دمای °C 72 و بسط نهایی7 دقیقه در دمای °C 72 انجام شد. محصولات PCR  در ژل پلی اکریل آمید 8% با ولتاژ 100در بافر TBE (1x) به مدت 2 ساعت تفکیک شدند. سپس در اتیدیوم برماید رنگ آمیزی شدند و امتیازدهی باندها با استفاده از نرم افزار AlphaEaseFC4 انجام شد.

تجزیه و تحلیل داده­های فنوتیپی

تجزیه واریانس برای صفات مختلف به صورت تجزیه مرکب در قالب طرح بلوک کامل تصادفی جهت برآورد تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپ ها با استفاده از  نرم‌افزار آماری SAS انجام گرفت.

تجزیه و تحلیل داده­های ژنوتیپی

ترکیب آللی برای هر ژنوتیپ برای هر یک از مکان­ها مشخص شد. جهت محاسبه فراوانی آللی هر لوکوس و هتروزیگوسیتی مشاهده شده برای هر لوکوس از نرم افزار Power Marker Ver 3.25 (Liu & Muse, 2005 )استفاده شد. محتوی اطلاعات چند شکلی(PIC) که نشان دهنده قدرت تمایز ژنوتیپ ها برای هر ترکیب پرایمری است ، طبق فرمول زیر محاسبه شد.             

Pij فراوانی i امین آلل برای نشانگر i و n تعداد کل آلل های مشاهده شده برای لوکوس نشانگری است. همچنین با استفاده از این نرم افزار شاخص­هایی نظیر تنوع ژنتیکی و تعداد آلل مشاهده شده در هر مکان ژنی نیز محاسبه گردید. ترسیم کلاستر با روش UPGMA با شاخص تشابه نئی و همکاران (1983) با استفاده از Power Marker Ver 3.25 انجام شد.

آنالیز داده­های هاپلوتیپی

ارزیابی تنوع هاپلوتایپی بر مبنای مطابقت توالی میکروساتلایت های ناحیه سالتول در ارقام مورد مطالعه با ژنوتیپ رفرنس (Pokkali) صورت گرفت (McCartney et al, 2004; Liu & Anderson, 2003; Bai et al ., 2003; Yu et al., 2006; Mohammadinejad et al., 2010; Yu et al., 2010).

نتایج و بحث

نتایج ارزیابی فنوتیپی

نتایج حاصل از تجزیه واریانس اختلاف بسیار معنی­داری (p<0.01) را بین ژنوتیپ­ها از نظر تحمل به شوری در مرحله گیاهچه­ای نشان داد که بیانگر وجود تنوع ژنتیکی از نظر صفات اندازه­گیری شده (طول ریشه، طول ساقه، وزن خشک ریشه، وزن خشک ساقه، وزن تر ریشه، وزن تر ساقه، نسبت وزن ساقه به ریشه، بیوماس، غلظت سدیم و پتاسیم، نسبت Na⁺/K⁺  و رتبه­دهی تحمل به شوری) می­باشد (جدول 1). وجود تنوع ژنتیکی موثر در تحمل به شوری برای انتخاب ژنوتیپ­های متحمل به شوری با عملکرد بالا و درک بهتر سازوکارهای فیزیولوژیکی تحمل به شوری در برنج می­تواند بسیار مفید باشد. اختلاف آماری معنی­دار بین ارقام بیانگر وجود تنوع ژنتیکی بالا بین مواد گیاهی مورد ارزیابی و احتمالاً مکانیسم­های متفاوت بین آن­ها در واکنش به تنش شوری است که می­توانند در انتخاب ارقام مناسب و تولید جمعیت­های در حال تفرق جهت مکان­یابی ژنی مورد استفاده قرار گیرند. اثرات متقابل ژنوتیپ در شوری در شرایط تنش برای اکثر صفات معنی­دار بود، که نشان دهنده واکنش متفاوت ژنوتیپ­ها در پاسخ به تنش­شوری می­باشد.

نتایج ارزیابی ژنوتیپی

با افزایش تعداد آلل تکثیر شده در یک مکان، میزان اطلاع ­رسانی آن مکان برای تعیین تنوع ژنوتیپ­ها افزایش می­یابد. در مرحله گیاهچه­ای تعداد 25 آلل در مطالعه به کمک 6 آغازگر ریز­ماهواره تکثیر شدند. بیشترین تعداد آلل، مربوط به جایگاه  RM8094 و برابر 6 آلل و کمترین تعداد آلل (3) مربوط به نشانگر  RM10890بود. محتوی اطلاعات پلی مورفیسم هر نشانگر میزان تنوع آن نشانگر را نشان می­دهد. در واقع PIC تخمینی از قدرت تمایز هر نشانگر با محاسبه تعداد آلل هایی که بیان شده­اند و همچنین فراوانی­های مرتبط با آن آلل ها می­باشد (Smith et al., 2000). محتوی اطلاعات پلی مورفیک از 77/0 تا 54/0 متفاوت بود. بالاترین PIC متعلق به نشانگرهای RM8094 (77/0) و RM493 (74/0) بود در حالی­که RM10890 کمترین میزان PIC (54/0) را نشان داد. نشانگرهای RM8094 و RM493 با داشتن بیشترین میزان PIC به عنوان بهترین نشانگر برای ارزیابی تنوع ژنتیکی نشانگرها در مرحله گیاهچه­ای شناسایی شدند (جدول 2).

جدول 1– تجزیه واریانس صفات در دو شرایط شوری و نرمال.

Table 1- Analysis of variance of traits in salinity and normal conditions.

x1: طول ریشه، x2طول ساقه، x3: وزن خشک ساقه، x4: غلظت سدیم، x5: غلظت پتاسیم، x6: نسبت سدیم/پتاسیم،  x7: بیوماس، x8: وزن ساقه به ریشه.

X1: root length, x2: shoot length, x3: shoot dry weight, X4: Na⁺ concentration, X5: K⁺  concentration, X6: Na⁺/K⁺ Ratio, X7: biomass, X8: shoot/root weight.

نتایج نشان داد که آنالیز ریز ماهواره سیستم نشانگری مفیدی جهت ارزیابی تنوع ژنتیکی است. اطلاع از شباهت­های ژنتیکی می­تواند جهت اجتناب از یکسان شدن ژرم پلاسم­ها از لحاظ ژنتیکی مفید باشد. کارایی و سرعت برنامه­های اصلاحی از طریق انتخاب به کمک نشانگر افزایش می­یابد. اطلاعات بدست آمده از این  بررسی می­تواند در مطالعات نقشه­یابی ژنومی و توسعه ژنوتیپ­های برنج با زمینه ژنتیکی وسیع­تر و متنوع­تر جهت دستیابی به بهره­وری بالاتر  در پروژه های نقشه یابی دقیق و  انتخاب به کمک نشانگر مفید واقع شود.

تجزیه خوشه­ای بر مبنای داده­های ریزماهواره ژنوتیپ­های برنج را در 3 گروه طبقه بندی کرد که در این گروه بندی ارقام حساس، متحمل و نیمه متحمل به طور مختلط قرار داشتند که به نوعی بیانگر زمینه ژنتیکی متفاوت ارقام متحمل ایرانی از نظر QTLهای دخیل در تحمل به شوری می باشد.

جدول 2- تعداد آلل­ و محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) 6 نشانگر SSR.

Table 2- Allele number and Polymorphic Information Content (PIC) of 6 microsatellites markers.

بررسی تنوع هاپلوتیپی QTL واقع بر روی کروموزوم 1 در مرحله گیاهچه­ای

شش نشانگر چند شکل پیوسته به QTL­ مقاوم به شوری در مرحله گیاهچه­ای واقع بر روی کروموزوم­ 1 (ناحیه کروموزومی Saltol ) جهت بررسی تنوع هاپلوتیپی مورد استفاده قرار گرفتند (جدول 3)، که 20 ژنوتیپ از لحاظ مطابقت با نواحی ریز ماهواره Pokkali در 12 گروه هاپلوتیپی قرار گرفتند (جدول 3) هیچ یک از 20 ژنوتیپ هاپلوتیپی مشابه با Pokkali نداشتند. بعبارت دیگر هیچ یک از ژنوتیپ­های استفاده شده ترکیب دقیقاً یکسان آللی از نظر همه نشانگرهای ریز ماهواره متعلق به Pokkali را نداشتند. محمدی نژاد و همکاران در بررسی تحمل به شوری  ژنوتیپ­های برنج، 30 ژنوتیپ را بر اساس QTL ناحیه saltol در 16 گروه هاپلوتیپی قرار دادند، که هیچ کدام از 30 ژنوتیپ هاپلوتیپی مشابه Pokkali (ژنوتیپ مرجع) تولید نکردند (Mohammadi-Nejad et al, 2010). هاپلوتیپ­های شماره 2، 4، 5، 8 ، 9 و 10 (شامل ارقام متحمل و نیمه­متحمل به شوری)، که از نظر جایگاه­ نشانگری RM3412 مشابهت آللی با پوکالی داشتند، می­توان گفت که QTL کنترل کننده تحمل به شوری موجود در پوکالی را در بر دارند. همچنین هاپلوتیپ­های شماره 3، 6، 7، 8 و 9 (شامل ارقام متحمل و نیمه متحمل) از نظر لوکوس RM10890 که در منطقه پایین­تر از Saltol قرار دارد شبیه Pokkali بودند. بررسی تنوع هاپلوتایپی با استفاده از نشانگرهای SSR پیوسته به QTL­های مرتبط با صفات  که بر مبنای مقایسه الگوی آللی ژنوتیپ­های مورد مطالعه با ژنوتیپ رفرنس (کولتیوارهای شناخته شده)، می­باشد، می­تواند اطلاعات مفیدی جهت شناسایی QTL­های جدید فراهم کند (Yu et al, 2006) اگر ژنوتیپ­ها الگوی آللی یکسان با مکان نشانگری پیوسته به QTL مقاومت در ژنوتیپ­های مقاوم شناخته شده داشته باشند به احتمال زیاد دربردارنده همان QTL می­باشند (Bai et al, 2003; McCartney et al, 2004). از طرف دیگر اگر دارای الگوی آللی  متفاوتی با ژنوتیپ مقاوم شناخته شده باشند به احتمال زیاد آلل­های متفاوتی نسبت به آن QTL دارند (Yu et al, 2006). 14 رقم ترکیب متفاوتی از برخی آلل­های Pokkali را شامل ­شدند که به احتمال زیاد دربردارنده ناحیه کنترل کننده تحمل به شوری یکسانی می­باشند، در حالی­که 6 رقم سپیدرود، طارم پاکوتاه، غریب، گیل، آمل و دمسیاه هیچ­یک از آلل­های نشانگر مرتبط با Saltol را نداشتند که می­تواند نشان دهنده این باشد که کنترل تحمل به شوری در این ارقام می تواند علاوه بر این ناحیه بوسیله سایر نواحی جدید صورت بگیرد و می­توانند بعنوان منابع جدیدی جهت مکان­یابی ژن­های جدید تحمل به شوری و توسعه لاین­های اصلاحی جدید تحمل به شوری مرحله گیاهچه­ای مورد استفاده قرار گیرند.

ارقامی که آلل نشانگر یکسان با Pokkali را برای RM3412 و RM18090دارا بودند، پاسخ متفاوتی نسبت به شوری نشان دادند ( شامل ارقام حساس، متحمل و نیمه متحمل) در حالی­که نشانگر RM8094 آلل مشابه با Pokkali را در ژنوتیپ­های متحمل (ندا، موسی­طارم و زاینده­رود) تکثیر کرد، بنابراین می­توان گفت این نشانگر، نشانگر مناسبی جهت مطالعات تحمل به شوری در برنج باشد از این نظر که آلل مشابه با ژنوتیپ مرجع را در ژنوتیپ­های متحمل تکثیر کرد (جدول 3).

براساس آخرین نتایج مکان یابی دقیق مکان Saltol در فاصله بین دو نشانگر RM8094 و RM3412 قرار دارد (MohammadiNejad et al, 2011). همچنین هاپلوتیپ شماره 5 (موسی­طارم)، از لحاظ نشانگرهای RM8094 و RM3412، آلل مشابه با Pokkali را داشت و روندی متحمل به تنش در مرحله گیاهچه­ای نشان داد، به نظر می­رسد QTL­ کنترل­کننده تحمل به شوری ناحیه Saltol در مرحله گیاهچه­ای، در این رقم وجود داشته باشد. نتایج این مطالعه نشان داد که نشانگر RM8094 برای انتخاب به کمک نشانگر برای ناحیه Saltol مفید می­باشد.

جدول 3- هاپلوتایپ­های تولید شده به وسیله نشانگرهای SSR واقع در ناحیه سالتول  بر روی کروموزوم 1 با ارجاع به Pokkali^*  (رفرنس).

Table 3- Haplotypes produced by SSR markers on Saltol region on chromosome 1 with compare to Pokkali^* (reference).

1:  Pokkali؛ 2: شاهپسند؛ 3: ندا؛ 4: بینام؛ 5: موسی­طارم؛ 6: درفک، طارم محلی، اهلمی طارم، حسنی، خزر؛ 7: نعمت؛ 8: زاینده­رود؛ 9: قشنگه؛ 10: عنبربو؛ 11:صدری؛ 12: سپیدرود، طارم پاکوتاه، غریب، گیل، آمل، دمسیاه

1- Pokkali, 2- Shahpasand, 3- Neda, 4- Binam, 5- Mosa Taram, 6- Dorfak, Tarom-Mahali, Ahlami-Tarom, Hassani, Khazar. 7- Neamat, 8- Zayanderood, 9- Ghashange, 10- Anbarbou, 11- Sadri, 12- Sepidrood, Traom-Pakoutah,Gharib, Gil, Amol, Domsiah.

نتیجه گیری

نشانگرهای RM8094 و RM493 با داشتن بیشترین میزان PIC به عنوان بهترین نشانگرها برای ارزیابی تنوع ژنتیکی نشانگرها در مرحله گیاهچه­ای شناسایی شدند.

بر اساس نتایج بدست آمده از بررسی تنوع هاپلوتیپی می­­توان ارقام سپیدرود، طارم پاکوتاه، غریب، گیل، آمل و دمسیاه را به عنوان منابع جدید جهت نقشه­یابی ژن­های تحمل به شوری در مرحله گیاهچه­ای همچنین نشانگر RM8094 واقع بر روی کروموزوم 1 را به عنوان نشانگر اطلاع رسان جهت انتخاب به کمک نشانگر معرفی کرد.

منابع

Fotokian MH (2004). QTL analysis of attributed traits to salinity tolerance and grain quality in rice, PhD Thesis, Dep. Of Plant Breeding, College of Agriculture, University of Tehran.

Ansari R, Shereen A, Flowers TJ, Yeo, AR (2001). Identification rice lines for improved salt tolerance from a mapping population. In: Peng, S. and B. Hardy (eds.). Rice research for food security and poverty alleviation. Proceeding of the International Rice Research Conference, 31 March- 3 April 2000, Los Banos, Philippines. pp: 285-291.

Arif M (2002). Molecular mapping of genes/QTLs affecting resistance to Xanthomonas oryzae pv. Oryzaeand grain quality traits in rice (Oryza sativa L.). Ph.D thesis. University of Philippines in Los Banos. Philippines.

Bonilla PS, Dvorak J, Mackill D, Deal K, Gregorio G (2002). "RFLP and SSLP mapping of salinity tolerance genes in chromosome 1 of rice (Oryza sativa L.) Using recombinant inbred lines", The Philippine Agricultural Scientist 85: 64-74.

Flowers TJ, Koyama ML, Flowers S, Sudhakar C, Singh KP and Yeo AR (2000). QTL: their place in engineering tolerance of rice to salinity. Journal of Experimental Botany 51: 99-106.

Flowers T J, Yeo A R (1995). "Breeding for salinity resistance in crop plants: where next?", Austuralian Journal Plant Physiology 22: 875-884.

Gregorio G B, Senadhira D, Mendoza RD, Manigbas NL, Roxas JP, Guerta CQ (2002). "Progress in breeding for salinity tolerance and associated abiotic stresses in rice", Field Crop Research 79: 91-101.

Gregorio GB, Senadhira D, Mendoza RD (1997). Screening rice for salinity tolerance, IRRI Discussion paper Series No.22. International Rice Research Institute, Los Baños. Laguna, Philippines.

Gong J M, Qian Q A, Shen L S, Zhu LH, Chen SY (1999). Identification of salt- QTL in rice. Chinese Science Bulletin 4: 68-71.

IRGSP (International Rice Genome Sequencing Project) (2005). "The map-based sequence of the rice genome", Nature 436: 793-800.

Koyama ML, Levesley A, Koebner RMD, Flowers TJ Yeo AR (2001). Quantitative trait loci for component physiological traits determining salt tolerance in rice. Plant Physiology 125: 406-422.

Lang NT, Yanagihara S, and Buu BC (2001). QTL analysis of salt tolerance in rice (Oryza sativa L.). SABRAO journal of  Breeding and Genetics 33: 11-20

Liu S, Anderson JA (2003). Targeted molecular mapping of a major wheat QTL for head resistance using wheat ESTs and synteny with rice. Genome 46: 817–823

Liu K, Muse SV (2005). Power Marker: an integrated analysis environment for genetic marker analysis. Bioinformatics 21: 2128-2129.

Maas EV, Hoffman GJ (1977). Crop salt tolerance, current assessment. Journal of the Irrigation and Drainage Division ASCE 103: 115-134.

McCouch S R, Chen X, Panaud O, Xu Y G, Cho N, Ishii T and Blair M (1997). Microsatellite marker development, mapping and application in rice genetics and breeding. Plant Molecular Biology 35: 89-99.

McCouch S R, Teytelman L, Xu Y, Lobos K B, Clare K, Walton M, Maghirang R, Ware Y D, Stein L (2002). Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice (Oryza sativa L.). DNA Research 9: 199-207 and 257-279.

McCartney CA, Sommers DJ, Fedak G, Cao W (2004). Haplotype diversity at Fusarium head blight resistance QTLs in wheat. Theoretical and Applied Genetics 109: 261-271.

Mohammadi-Nejad G, Arzani A, Rezai AM, Singh RK Gregorio GB (2008). Assessment of rice genotypes for salt tolerance using microsatellite markers associated with the saltol QTL. African Journal of Biotechnology 7: 730-736.

MohammadiNejad G, Singhb RK, Arzanic A, Rezaiec AM , Sabourid H, Gregoriob GB (2010). Evaluation of salinity tolerance in rice genotypes. International Journal of Plant Production 4 (3).

MohammadiNejad G, Sing RK, Rezaie AM, Arzani A,  Nakhoda B, Fotokian MH, Moumeni A, Gregorio GB (2011). Fine Mapping of Major Effect QTL Responsible for Salinity Tolerance (Saltol) in Rice. Journal of crop biotechnology 1(1): 49-59

Moradi F (2002). physiological characterization of rice cultivars for salinity tolerance during vegetative and reproductive stage. PhD thesis. University of Philippines, Los Banos. Philippines

Nei M, Tajima F, Tateno Y (1983). Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data II. Gene frequency data. Journal of  Molecular Evolution 19: 153-170.

   Niones J M (2004). "Fine mapping of the salinity tolerance gene on chromosome 1 of rice (Oryza sativa L.) Using near isogenic lines", M.S. Dissertation, University of Philippines, Los Baños, Laguna, Philippines.

Olufowote J O, Xu Y, Chen X, Park W O, Beachell H M, Dilday R H, Goto M McCouch S R (1997). Comparative evaluation of within cultivar variation of rice using microsatellite and RFLP markers. Genome 40: 370-378.

Ponnamperuma, F N (1984). Role of cultivar tolerance in increasing rice production in saline lands. Strategies for crop improvement. John Willey and Sons. 443 pages.

Prasad SR, Bagali PG, Hittalmani S, Shashidhar HE (2000). Molecular mapping of quantitative trait loci associated with seedling tolerance to salt stress in rice (Oyza sativa L.). Current Science 78: 162-164

Shannon M C (1984). Breeding, selection and the genetics of salt tolerance.In: Staples, R.CR , G.H. Toenniessen (eds.). Salinity tolerance in plants. Johan willey and Sons. pp: 231-254

Smith JSC, Kresovich S, Hopkins MS, Mitchell SE, Dean RE, Woodman WL, Lee M, Porter K (2000). Genetic diversity among elite sorghum inbred lines assessed with simple sequence repeats. Crop Science 40: 226-232.

Yang GP, Saghai Maroof MA, Xu CG, Zhang Q Biyashew R M (1994). Comparative analysis of microsatellited DNA polymophism in landraces and cultivars of rice. MolEcular and General Genetics 245: 187-194.

Yu JB, Ban T (2006). Marker-assisted characterization of Asian whea lines for resistance to fusarium head blight. Theoretical and Applied Genetic 113: 308-320. doi:10.1007.s00122-006-0297-z.

Yu LX, Liu S, Anderson JA, Singh RP, Jin Y, Dubcovsky J, Brown-Guider G, Bhavani S, Morgounov A, He Z, Huerta-Espino J, Sorrells ME (2010). Haplotype diversity of stem rust resistance loci in uncharacterized wheat lines. Molecular Breeding 26: 667–680.

Zhuang JY, Lin HX, Lu J, Qian HR, Hittalmani S, Huang N, Zheng KL (1997). Analysis of QTL×environment interaction for yield components and plant height in rice. Theoretical and Applied Genetics 95: 799–80.