بررسی تنوع ژنتیکی برخی از جمعیت‌های گیاه دارویی دم شیر در ایران با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD

بررسی تنوع ژنتیکی برخی از جمعیت­های گیاه دارویی دم شیر در ایران با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD

ابوذر سورنی*¹، وحیده ناظری²، محمد رضا فتاحی مقدم³، الهه احدی دولت­سرا⁴

¹دانشجوی کارشناسی ارشد علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تهران.

²دانشیار گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تهران.

³دانشیار گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تهران.

⁴دانشجوی کارشناسی ارشد علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تهران.

تاریخ دریافت: 4/4/1391، تاریخ پذیرش: 4/6/1391

چکیده

گیاه دم­شیر با نام علمی Leonurus cardiaca از خانواده Lamiaceae (نعناعیان) و زیر خانواده Lamioideae تنها گونه موجود از جنس Leonurus در ایران است. وجود ترکیبات مختلفی چون فلاونوئیدها، ایریدوئیدها، تری­ترپن­ها، تانن­ها، استرول­ها، کاروتنوئیدها خواصی چون درمان بیماری­های قلب و معده و اختلالات عصبی را برای این گیاه به همراه دارد. در این تحقیق نشانگر مولکولی RAPD برای بررسی تنوع ژنتیکی ژرم­پلاسم 47 نمونه گیاهی از 6 جمعیت وحشی جمع­آوری شده گیاه دارویی دم­شیر در ایران مورد استفاده قرار گرفت. تعداد 60 آغازگر تصادفی در انجام واکنش PCR روی DNA­ ژنومی استخراج شده از برگ آزمایش شد که 28 آغازگر نوارهای چند شکلی تولید نمودند و در کل 364 نوار DNA بدست آمد که تعداد 325 نوار چند شکل بودند. تجزیه کلاستر ژنوتیپ‌ها بر اساس ضریب تشابه دایس و به روش UPGMA انجام گرفت. میزان حداقل تشابه ژنتیکی در این تحقیق 08/0 بین نمونه­های درگز 1 و ساری 5 و حداکثر آن بین نمونه­های ساری 7 و ساری 3 معادل 87/0 بدست آمد. در تجزیه کلاستر ژنوتیپ‌ها در فاصله 20 دو کلاستر اصلی ایجاد شد که یکی از آن‌ها شامل نمونه­های درگز و کلاستر دیگر شامل نمونه­های خوانسار، کرمان، سراب، طالقان و ساری بود. بررسی تنوع درون جمعیت­ها با استفاده از میانگین تنوع ژنتیکی نی و شاخص اطلاعاتی شانون نشان داد تنوع ژنتیکی در درون جمعیت سراب و طالقان (10/0= ,h 15/0= I) نسبت به سایر جمعیت­ها، بیشترین و در جمعیت ساری (05/0 = h ,08/0 = I) کم‌ترین بوده است. تلاقی ژنوتیپ­های جمعیت درگز با دیگر جمعیت­ها با توجه به فاصله ژنتیکی تعیین شده در این مطالعه می­تواند گزینه مناسبی برای تولید هیبریدهایی با عملکردهای مورد نظر باشد.

کلمات کلیدی: گیاه دم­شیر، Leonurus cardiaca، چند شکلی، جریان ژنی، اصلاح

مقدمه

دم­شیر (Leonurus cardiaca) از خانواده Lamiaceae (نعناییان) و زیر خانواده Lamioideae تنها گونه موجود از جنس Leonurus در ایران است (Mozafarian, 1996). دم شیر گیاهی علفی پایا با ریزومی گسترده به ارتفاع 5.0 تا 5.1 متر با ساقه مستقیم، منشعب، چهار­گوش، کم و بیش توخالی با بافت نسبتاً چوبی شده و 20 تا 25 چرخه گل در هر ساقه است.

شکل 1- نمایی کلی از گیاه دارویی دم­شیر.

Figure 1-An overview of the vegetative organs of medicinal plants Leonurus cardiaca.

گل­ها پوشیده از کرک­های تک سلولی با کوتیکول نازک به رنگ گلی با خال­های ارغوانی که به شکل مجتمع (8 تا 11 گل) در زاویه برگ­های قسمت فوقانی ساقه قرار دارند (Zargari, 1990; Omidbeigi, 2010; Popescu, 2009; Ali & Nasir, 1990;).

مواد موثره شناسایی شده از عصاره اندام­های هوایی (برگ­ها، گل­ها و ساقه) گیاه دم­شیر شامل فلاونوئیدها (آگلیکن­ها و گلیکوزیدها)، پلی­فنل­کربوکسیلیک اسید، ایریدوئیدها، تری­ترپن­ها (آگلیکن­ها و گلیکوزیدها)، تانن­ها، استرول­ها، کاروتنوئیدها، مونوساکاریدها، پلی­ساکاریدها (موسیلاژها) و ترکیبات نیتروژن­دار غیر از آلکالوئیدها می­باشد. مطالعات نشان می­دهد که برگ­ها بالاترین میزان فلاونوئیدها و پلی­فنل­کربوکسیلیک اسید را دارا هستندو گل­ها در رده بعدی قرار دارند. ساقه­ها پایین­ترین میزان مواد فوق را دارا هستند (Popescu, 2009).

با توجه به نیاز برای تامین داروهای گیاهی با کیفیت مناسب و قابل اعتماد، روش هایی اصلاحی برای کشت تجاری و فرآیندهای پس از برداشت در دست بررسی است. Heuberger . و همکاران (2010) برنامه­هایی برای روش­هایی اصلاحی، کشت تجاری و فرآیندهای پس از برداشت در شرایط جنوب آلمان برای انتخاب گونه­های گیاهی جنس Leonurus مورد استفاده در چین از سال 1999 توسعه دادند. نتایج حاصل از آزمایشات مزرعه­ای، روش­های اصلاحی، خصوصیات گیاهی و شیمیایی مواد آزمایشی، مقایسه تجربی (آزمایشی) و وارداتی مواد گیاهی با توجه به کیفیت دارویی آن­ها، انتقال روش­های تولید و مواد گیاهی به کشاورزان متخصص، کاربرد دارویی و در نهایت اطلاع رسانی برای کاربران در زنجیره تولید در مورد مزایای تولید محلی مواد گیاهی مورد بررسی قرار گرفت. Heuberger . و همکاران (2010) از روش انتخاب همسانه برای اصلاح گونه‌های Leonurus استفاده کردند.

اهلی کردن یک گیاه دارویی فرآیندی طولانی است ولی اگر کار از یک ژنوتیپ مناسب آغاز شود فرآیند کوتاه­تر خواهد شد. یکی از مهم­ترین شاخص­ها برای تعیین ارقام و توده­های مناسب اهلی سازی استفاده از صفات موفولوژیک است اما نتایج آن کاملاً دقیق نیست چون این خصوصیات به شدت تحت تأثیر شرایط محیطی قرار دارند. شناسایی و بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان به طور گسترده­ای با استفاده از نشانگرهای مولکولی انجام می­شود. این تکنیک­ها تنوع ژنتیکی را به طور مستقیم در سطح مولکول DNA بررسی می­کنند و همچنین مشکلات تاثیر­پذیری از محیط را ندارند. با بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان با استفاده از روش­های مولکولی می­توان میزان تفاوت و تشابه بین گیاهان را مورد بررسی قرار داد. همچنین با استفاده از نشانگرهای مولکولی امکان شناسایی و جداسازی ژن­های مسئول در تولید متابولیت­های ثانویه در گیاهان دارویی وجود دارد (Kumar & Kumar Gupta, 2008). نشانگرهایی مانند SSR  و AFLP به طور وسیعی برای بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان به کار می­روند. نشانگر RAPD نیز روشی مناسب برای بررسی تنوع ژنتیکی است (Williams et al., 1990). زیرا قادر است با استفاده از مقادیر اندک DNA اختلاف موجود بین گیاهان را در سطح DNA شناسایی نموده در عین حال نیاز به اطلاعات قبلی از ژنوم مورد مطالعه ندارد. مطالعات نشان داده است که بخش زیادی از نوارهای RAPD در صورتی که در آزمایشات با رعایت دقت لازم تکرار شود دارای تکرارپذیری بالا و نتایج قابل اعتمادی خواهد بود (Chalmers et al., 1994). از این تکنیک نیز به طور گسترده برای بررسی تنوع در انواع گیاهان دارویی استفاده شده است.

در پژوهشی Chen et al (2009) از نشانگر مولکولی ISSR جهت بررسی تنوع در 19 ژنوتیپ Leonurus japonicus یکی دیگر از گونه مهم جنس Leonurus  استفاده کردند که در نتیجه تولید 164 نوار، 117 قطعه چند شکلی نشان دادند. YU Qi et al (2009) با استفاده از نشانگر AFLP تنوع 16 ژنوتیپ Leonurus japonicus   را مورد بررسی قرار دادند. از 182 نوار تولیدی 144 نوار چند شکلی نشان دادند. Momeni dehghi et al  (2001) بررسی روابط ژنتیکی در 17 نژاد بومی جنس نعناع (Menta) را با استفاده از نشانگرهای RAPD در ایران با استفاده از 17 آغازگر 10 نوکلئوتیدی انجام دادند که از این 17 آغازگر 25 آغازگر چند شکلی بالایی نشان دادند.

در پژوهشی Pejman mehr et al  (2001) تنوع ژنتیکی در بین و درون شش توده مختلف زیره پارسی (Bunium persicum) در ایران را با استفاده از نشانگرهای RAPD مورد مطالعه قرار دادند و ثابت کردند که توده­های مورد بررسی کاملاً از هم متمایز بوده و تکامل مستقل دارند.

Sing et al  (2004) روابط ژنتیکی 30 توده متعلق به 5 گونه ریحان را با استفاده از نشانگرهای RAPD مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد که نشانگرهای RAPD تکنیکی مناسب، دقیق و موثر در تجزیه ژنتیکی جنس ریحان می­باشد. Hadian et al  (2007) تنوع ژنتیکی 28 توده ایرانی مرزه تابستانه (Saturea hortensis) را با استفاده از نشانگر RAPD مورد بررسی قرار دادند. از 16 آغازگر مورد استفاده در این تحقیق 218 نوار چند شکل تولید گردید که 181 نوار بین تمام توده­ها چندشکل بود. ماتریس تشابه و نتایج حاصل از دندروگرام تولید شده از داده­های RAPD نشان داد که این نشانگرها در تعیین روابط بین توده­های بومی مرزه تابستانه در ایران از دقت خوبی برخوردار است.

درکشور ایران به دلیل عدم شناخت ذخایر ژنتیکی و ژن­های مطلوب، برنامه­های اصلاحی درخور توجهی روی گیاهان دارویی صورت نگرفته است؛ لذا می­توان با شناسایی گونه­های مختلف و ارزیابی آن‌ها، ژن­های مطلوب و مورد نیاز محققین را در دسترس آن­ها قرار داد. از جمله این گیاهان گیاه دم­شیر است که تا کنون هیچ گونه مطالعه مولکولی در محدوده پراکنش جهانی آن جهت بررسی ژرم­پلاسم با هدف مطالعه روابط ژنتیکی برای اصلاح، اهلی سازی و تولید ارقام متناسب با نیاز صنایع وابسته صورت نگرفته است. در این راستا تحقیق حاضر به بررسی تنوع ژنتیکی در درون و بین برخی از جمعیت­های دم­شیر در ایران با استفاده از نشانگر RAPD پرداخته است تا تنوع ژنتیکی موجود را بررسی و روابط بین آن­ها را گزارش نماید.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی مورد استفاده در این آزمایش شامل 47 نمونه گیاهی از 6 جمعیت جمع آوری شده از 6 استان مختلف ایران بود. نام، علامت اختصاری و محل جمع­آوری نمونه­های گیاهی در جدول شماره 1 ارائه شده است.

جدول 1- اطلاعات مربوط به رویشگاه­های مورد مطالعه جمعیت­های دم­شیر.

Table 1- Accessions of Leonurus cardiaca, used in this study, their species, origin and collection areas.

در فصل بهار، نمونه­های برگی از رشد فصل بهاره گیاهان جمع­آوری و در مجاورت یخ به آزمایشگاه منتقل شد. پس از چند بار شستشو با آب مقطر و خشک کردن آب روی برگ­ها، با استفاده از ازت مایع منجمد و در فریزر با دمای 80- درجه سانتی­گراد تا زمان استخراج DNA نگهداری شد.

استخراج DNA از 8 تک بوته هر جمعیت با استفاده از روش تغییر یافته Pirttila et al. (2001) انجام گرفت. کمیت و کیفیت DNA با استفاده از دستگاه نانودراپ و الکتروفورز در ژل آگارز 1% تعیین شد و به کمک آن­ها غلظت یکسان از DNA نمونه­ها ( 10 نانوگرم در میکرو لیتر) آماده شد. 

واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (Bio Rad, I Cycler, USA) انجام شد. برای بررسی واکنش زنجیره­ای پلی­مراز از 60 آغازگر تصادفی استفاده شد که در میان آن­ها 28 آغازگر نوارهای چند شکلی تولید نمودند. از این 28 آغازگر به عنوان آغازگرهای مناسب بر ای بررسی تنوع گیاه دم شیر استفاده شد. هر مخلوط واکنش PCR شامل 3 میکرولیتر DNA ژنومی با غلظت 10 نانوگرم در میکرولیتر، 5.2 میکرو لیتر از آغازگر با غلظت  10 پیکو مول و 5/7 میکرولیتر کیت PCR با غلظت X2 بود که در نهایت با اضافه کردن 3 میکرو لیتر آب مقطر دوبار تقطیر استریل حجم مخلوط واکنش PCR  به 16 میکرولیتر رسانده شد. چرخه­های حرارتی شامل C°94 برای واسرشت سازی اولیه به مدت 4 دقیقه، تعداد 5 چرخه به صورت C°92 به مدت یک دقیقه، دمای اتصال C°37 به مدت یک دقیقه و C°72 به مدت دو دقیقه برای تکثیر قطعات در چرخه دوم با 7/0 درجه کاهش دما در هر چرخه جهت اتصال بهتر آغازگر به DNA و تعداد 35 چرخه به صورت C°92 به مدت 30 ثانیه ، دمای اتصال C°37 به مدت 45 ثانیه و C°72 به مدت دو دقیقه برای تکثیر قطعات و در نهایت یک چرخه C°72 به مدت 5 دقیقه برای تکمیل بسط انجام شد.

پس از انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز، محصول واکنش در چاهک­های ژل آگارز 2/1 درصد تهیه شده در بافر TBE بارگزاری و به مدت 120 دقیقه و شدت 75 ولت الکتروفورز شد. بدین صورت که برای تخمین طول قطعات تکثیر شده از نشانگر اندازه یک کیلو بیس پیر (kb1) مربوط به شرکت فرمنتاز (Fermentas) در چاهک اول استفاده شد و در بقیه چاهک­ها DNA حاصل از PCR مربوط به نمونه­های هر جمعیت بارگزاری شد. پس از الکتروفورز به منظور رنگ­آمیزی، ژل به مدت 20 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید 5.0 میکروگرم در میلی­لیتر قرار گرفته و پس از شستشو با آب مقطر در دستگاه مخصوص عکس­برداری از ژل (دستگاه ژل داک)، تحت نور اشعه فرابنفش نوارهای تکثیر یافته DNA مشاهده و عکس­برداری شدند.

تجزیه داده­ها و آنالیز آماری

پس از انجام مراحل آزمایشگاهی، برای بررسی مراحل چند شکلی بین نمونه­ها به حضور یک نوار خاص عدد یک و به عدم حضور آن عدد صفر داده شد. بعد از تشکیل ماتریس صفر و یک، ماتریس تشابه ژنوتیپ‌ها با استفاده از نرم افزار NTSYSpc (Ver 2.02) و استفاده از ضریب تشابه دایس و به روش UPGMA محاسبه گردید. تجزیه پلات به صورت سه بعدی صورت گرفت. دندروگرام بدست آمده از ماتریس تشابه با استفاده از نرم افزار Bootstrap ترسیم شد. الگوی نواری داده­های مولکولی برای تمام جمعیت­ها و آنالیز تجزیه واریانس با استفاده از نرم­افزار GenAlEx (Ver 6.41) محاسبه شد. ماتریس فاصله جمعیت­ها به روش نی (Nei’s, 1972) و با استفاده از نرم افزار PopGene, Ver 1.31 صورت گرفت. تنوع ژنتیکی برای همه مکان­های آللی با کمک آنالیز نی محاسبه شد (Nei’s, 1972). قدرت تفکیک آغازگرها (Rp) با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد (جدول 2).

Rp= ∑ I_b

_{Ib= 1 – (2 × | 0.5  - p | )}

نتایج و بحث

در بررسی اولیه برای انتخاب آغازگر مناسب که تولید چند شکلی بیشتری بنماید، 60 آغازگر تصادفی RAPD مورد استفاده قرار گرفت که از این تعداد 28 آغازگر چند شکلی قابل توجهی در بین جمعیت­های مورد بررسی نشان دادند. بر اساس نتایج از کاربرد 28 آغازگر انتخابی در کل 364 نوار DNA بدست آمد که از این تعداد 325 نوار (89%) چند شکلی نشان داده و تنها 32 نوار (11%) یک شکل بودند. میانگین تعداد نوارها برای هر آغازگر 13 محاسبه شد. میانگین چندشکلی بدست آمده  (89%) در الگوی نواری نسبتاً بالا بود که بیانگر مناسب بودن تکنیک RAPD برای بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت­های دم شیر ایران است. تعداد نوارهای چند شکل حاصل از آغازگرهای RAPD در بین جمعیت­ها از 5 تا 21 نوار متغیر بود که بیانگر قدرت متفاوت آغازگرها در شناسایی چند شکلی در نمونه­های مورد بررسی است. در بین آغازگر­ها بیشترین نوار تکثیر شده توسط آغازگر 02 TIBMBC- با 22 نوار تکثیر شده ایجاد شد که 21 عدد آن­ها چند شکل بودند؛ و کم‌ترین نوار تکثیر شده مربوط به آغازگر TIBMBC-12 با 6 نوار تکثیر یافته بود که 5 عدد از آن­ها چند شکل بودند (جدول 2). اندازه قطعات تکثیر شده در تمام آغازگرها در محدوده 1500-300 جفت باز تخمین زده شد. میزان شباهت یا تفاوت بین جمعیت­ها توسط ماتریس فاصله و همچنین دندروگرام حاصل از آن­ها تعیین شد.

الگوی نواری جمعیت­ها

الگوی نواری داده­های مولکولی برای تمام جمعیت­ها به شرح جدول شماره 3 محاسبه شد. نتایج نشان داد بخش بیشتری از ژنوم جمعیت درگز با بیشترین تعداد نوار تولیدی توسط آغازگرها مورد پوشش قرار گرفته است. وجود تعداد بالای نوارهای اختصاصی این جمعیت نسبت به سایر جمعیت­ها نشان از تفاوت این جمعیت با سایر جمعیت­ها است که با اطلاعات تاکسونومی مطابقت دارد. جدایی جمعیت­های کرمان و سراب با تعداد نوار اختصاصی بیشتر نسبت به سایر جمعیت­ها حاکی از فاصله ژنتیکی بیشتر این جمعیت با دیگر جمعیت­هاست.

استفاده از ماتریس تشابه می­تواند در جهت شناسایی و درک بهتر شباهت­ها در میان جمعیت­های مورد بررسی بسیار موثر باشد. میزان حداقل تشابه ژنتیکی در این تحقیق 08/0 بین نمونه­های درگز 1 و ساری 5 و حداکثر آن بین نمونه­های ساری 7 و ساری 3 معادل 87/0 بدست آمد. دندروگرام بدست آمده از ماتریس تشابه با استفاده از نرم افزار Bootstrap تنوع ژنتیکی بالای بین جمعیت­ها و یکنواختی و شباهت بین ژنوتیپ­های درون جمعیت­های مورد بررسی را تایید می­کند (شکل 3). به طوری که در مقدار پایداری 100، ژنوتیپ‌ها را در 2 گروه اصلی جای داد. جدایی ژنوتیپ­های مربوط به جمعیت درگز از استان کرمان در سطح پایداری 100و تفکیک این جمعیت از جمعیت­های دیگر با تفاوت فاحش را می­­توان به طور قطع به دلیل جدایی در زیرگونه ­ (subsp.turkestanicus) و اختلافات اساسی در شرایط آب­ و هوایی، توپوگرافی و خاک منطقه دانست.

جدول 2- نوع، توالی و درصد چند شکلی آغازگرهای مورد استفاده در آنالیز RAPD جمعیت­های طبیعی دم­شیر.

Table 2- Type, frequency and percentage of polymorphic primers used in the RAPD analysis of natural populations of Leonurus cardiaca.

شکل 2- الگوی نواری حاصل از قطعات تکثیر 6 جمعیت گیاه دم­شیر (7-1 جمعیت کرمان، 15-8 جمعیت درگز، 23-16 جمعیت طالقان، 31-24 جمعیت خوانسار، 39-32 جمعیت سراب و 47-40 جمعیت ساری

Figure 2- Banding pattern of amplified fragments of sex populations Leonurus cardiaca.

جدول 3- الگوی نواری داده­های مولکولی برای جمعیت­های دم­شیر

Banding patterns, molecular data for populations Leonurus cardiaca

اختلافات اساسی در صفات مورفولوژیکی این زیرگونه  از قبیل ارتفاع ساقه، تعداد ساقه اصلی و فرعی و تراکم بوته­ها به طور واضح در زمان نمونه­ برداری مشخص بود. جدایی ژنوتیپ­های جمعیت کرمان از ژنوتیپ­های مربوط به جمعیت­های خوانسار، ساری و سراب در سطح پایداری 100 را با توجه به آنکه به یک زیرگونه  تعلق دارند می­توان به تفاوت فاحش در شرایط اقلیمی منطقه رابر کرمان با سه منطقه دیگر نسبت داد. اقلیم منطقه خوانسار و طالقان بسیار به هم شبیه بود چرا که نمونه‌ها فقط در باغات و در پای درختان رشد می­کردند ولی شرایط آب و هوایی منطقه ساری متفاوت از مناطق سراب و کرمان بود ولی تأثیر اقلیم به اندازه­ای نبوده که بتواند بین جمعیت­های یک زیرگونه  اختلاف فاحشی از نظر ژنتیکی ایجاد کند. اما اقلیم منطقه طالقان، دسترسی به آب و نور و خاک مناسب در باغات توانسته این جمعیت را به جمعیت­های سراب و خوانسار نزدیک کند.  

شکل 3- گروه­بندی ژنوتیپ­های شش جمعیت دم­شیر مورد مطالعه بر اساس ماتریس تشابه.

Figure 3- Dendrogram of RAPD analysis on 47 accessions of Leonurus cardiaca based on Jaccard similarity coefficient.

آزمون تجزیه پلات

در این تحقیق آزمون تری پلات برای بررسی فواصل ژنتیکی بین ژنوتیپ‌ها با استفاده از دو و سه عامل اصلی انجام شد که نتایج آن در شکل شماره 4  نشان داده شده است. این آزمون همانند تجزیه کلاستر بخوبی می­تواند جدا شدن ژنوتیپ‌ها و قرابت آن­ها را نشان دهد. در این آزمون نیز جمعیت درگز به خوبی از جمعیت­های دیگر جدا شد. جدایی ژنوتیپ­های مربوط به جمعیت کرمان و نزدیکی ژنوتیپ­های خوانسار و طالقان به وضوح قابل مشاهده است.

شکل 4- گروه­بندی ژنوتیپ­های شش جمعیت گیاه دم­شیر مورد مطالعه توسط تجزیه پلات سه بعدی.

Figure 4- Grouping of RAPD analysis on 47 accessions of Leonurus cardiac based on a nalysis of three-dimensional plot.

آنالیز منطقه­ای نمونه­ها

در این ارزیابی شاخص تنوع ژنتیکی نی (Nei's, 1972) و شاخص اطلاعاتی شانون (I) برای هر یک از جمعیت­ها (جدول شماره 4) و تعداد آلل­های مشاهده شده، تعداد آلل­های موثر برای هر آغازگر (جدول شماره 5) محاسبه شد. بر اساس ارزیابی انجام شده قدرت هر آغازگر در تولید نوار­های چند شکل برای هر جمعیت مشخص شد.

همچنین تنوع کل (Ht)، تنوع درون جمعیت­ها ( Hs )، ضریب تنوع بین جمعیت­ها (Gst)، تخمین جریان ژنی از Gst یا Gcs (Nm) برای هر یک از مکان­های آللی توسط نرم­افزار Popgene محاسبه شد که میانگین هر یک از آن­ها در زیر آمده است.

به طور کلی مقادیر بالای 25/0 نشان دهنده تفاوت زیاد بین مناطق یا جمعیت­های مورد مطالعه می­باشد. این مسئله نشان می­دهد که به دلیل دگرگشنی بین ژنوتیپ‌ها، نزدیکی بیشتری بین گیاهان دم­شیر یک منطقه با گیاهان بین جمعیت­ها دیده می­شود. بر این اساس می­توان از ژنوتیپ­های مناطق مختلف که دارای صفات مطلوبی هستند و از نظر ژنتیکی دور از هم هستند برای دورگ‌­گیری استفاده کرد.

جدول 4- پارامترهای تنوع ژنتیکی در جمعیت­های طبیعی گیاه دم­شیر.

Table 4- Parameters of genetic diversity in populations Leonurus cardiaca.

* h شاخص تنوع ژنتیکی نی، I: شاخص اطلاعاتی شانون، PPB(%): درصد نوارهای چند شکل

بررسی تنوع در درون جمعیت­های دم­شیر به کمک میانگین شاخص تنوع ژنتیکی نی و شاخص اطلاعاتی شانون مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که تنوع ژنتیکی درون جمعیت سراب و طالقان (10/0= ,h 15/0= I) نسبت به سایر جمعیت­ها، بیشترین و در جمعیت ساری (05/0 = h ,08/0 = I) کم‌ترین بوده است. ضریب تمایز ژنتیکی در میان جمعیت‌ها (Gst, Gst=(Ht-Hs)-.Ht) به مقدار 72/0 (72%) و برآورد جریان ژنی (Nm = 0.5 (1_ Gst).Gst)، به طور متوسط تعداد مهاجرت رد و بدل شده در هر نسل در میان جمعیت­ها برابر 28/0 (28%) با فرض تعادل هاردی واینبرگ محاسبه شد. مقدار پایین Nm نشان از تبادل پایین ژن در بین جمعیت­های دم شیر است که می­تواند به دلیل فاصله زیاد بین رویشگاه­های این گیاه باشد.

نتایج حاصل از بررسی تعداد آلل موثر و مشاهده شده حاکی از آن است که هر چه مقدار آلل مشاهده شده آغازگر به مقدار 2 (گیاه دم­شیر 2n است) نزدیک­تر باشد نشان از قدرت بالای آن آغازگر در تولید نوار چندشکل در بین جمعیت­هاست، که به نحوی می­توان آن را به تولید تعداد نوار­های اختصاصی برای آن جمعیت ربط داد، به گونه­ای که تعداد آغازگر بیشتری در جمعیت درگز (9 آغازگر) نسبت به سایر جمعیت­ها بیشترین تعداد آلل مشاهده شده را دارا بودند.

تجزیه خوشه­ای مناطق

تجزیه خوشه­ای مناطق تطابق کامل با دندروگرام حاصل از تفکیک ژنوتیپ‌ها را تایید می­کند. بررسی ماتریس تشابه در این مطالعه بیشترین همسانی را در بین توده­های خوانسار و طالقان و کم‌ترین همسانی را در بین توده­های درگز و ساری  نشان داد که به ترتیب حاکی از میزان نزدیکی و دوری ژنتیکی این جمعیت­ها نسبت به یکدیگر می­باشد (جدول 6). بررسی نتایج در غالب دندروگرام­ها و نمودارها امکان جمع­بندی سریع و آسان نتایج را امکان پذیر می­سازد (شکل 2).

جدول 5- پارامترهای تعداد آلل­های مشاهده شده و موثر برای هر آغازگر در جمعیت­های طبیعی گیاه دم­شیر.

Table 5- Parameters, number of alleles observed and effective for each primer in populations Leonurus cardiac.

na* تعداد آلل مشاهده شده، ne: تعداد آلل­های موثر.

در ارزیابی ماتریس تشابه، میزان تشابه محاسبه شده در بین جمعیت­های دم­شیر، بر اساس نوار­های چند شکل در دامنه­ای از65/0 تا 85/0 قرار داشت که این تنوع بالا می­تواند به واسطه توزیع جغرافیایی وسیع این گونه در ایران باشد. جمعیت­های طالقان و خوانسار با میزان تشابه 85/0 بیشترین شباهت را در بین جمعیت­های مورد مطالعه دارا بودند که دلیل آن را می­توان به شرایط آب و هوایی نسبتاً یکسان و شرایط آبی و خاکی نسبتاً مشابه محل جمع آوری دو نمونه دانست چرا که هر دو نمونه در باغات و در پای درختان که از آب و مواد غذایی کافی و سایه­بان مطلوب بهره می­بردند جمع آوری شدند. از طرف دیگر با توجه به نزدیکی مناطق جغرافیایی مذکور امکان جابه­جایی مواد گیاهی دور از انتظار نمی­باشد. نتایج جدول ماتریس تشابه نشان داد که جمعیت­های درگز و ساری با میزان تشابه 65/0 بیشترین تفاوت را در بین جمعیت­های مورد بررسی از آن خود کرده­اند که دلیل آن را می­توان به اختلاف در زیرگونه  (به ترتیب turkestanicus و cardiaca ) و شرایط آب و هوایی کاملاً متفاوت این دو منطقه دانست. جدایی جمعیت کرمان از چهار جمعیت دیگر با توجه به شباهت­ در طبقه­بندی گیاه‌شناسی را می­توان به شرایط خاص اقلیمی منطقه نسبت داد.

تجزیه واریانس داده­ها

آنالیز تجزیه واریانس داده­های مولکولی (AMOVA) میزان تنوع درون و بین جمعیت­های دم­شیر را به ترتیب 66% و 34% نشان داد.

جدول 6- میزان تشابه بین شش جمعیت مورد مطالعه.

Table 6-The similarity between the six populations studied

شکل 5- گروه­بندی شش جمعیت دم­شیر مورد مطالعه بر اساس ماتریس تشابه.

Figure 5-Grouping Six populations of Leonurus  cardiac based on similarity matrix.

نتیجه­گیری

با توجه به نتایج بدست آمده در مجموع این تحقیق توانایی نشانگر­های RAPD را در ارزیابی تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپ‌ها و جمعیت­های دم­شیر نشان می­دهد. در رابطه با 47 ژنوتیپ مورد بررسی نتایج بدست آمده نشان داد که در اکثر موارد هر چه محل­های جمع آوری دو ژنوتیپ به هم نزدیک­تر بوده شباهت­های ژنتیکی بیشتری با هم داشتند. آنالیز تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیت­ها این مطلب را اثبات می­کند. همان‌گونه که نمودار مربوط به تجزیه واریانس نشان داد 70% بین جمعیت­ها تنوع وجود دارد در حالی که این مقدار در درون جمعیت­ها ۳0% می­باشد. آنالیز منطقه با دندروگرام حاصل از تفکیک ژنوتیپ‌ها مطابقت نشان می­دهد. بنابراین طبق نتایج بدست آمده، تفاوت ژنتیکی بین ژنوتیپ‌ها در اکثر مناطق وجود دارد که حاصل از ذخیره ژنتیکی قوی، شرایط آب و هوایی مختلف و اثر انتخاب می­باشد. جدایی جمعیت درگز از سایر جمعیت­ها با اطلاعات تاکسونومی و جدایی این زیرگونه  مطابقت دارد. بیشترین اختلاف جمعیت درگز و ساری را می­توان به دلیل فاصله زیاد جغرافیایی و عدم تبادل مواد رویشی دانست که با اطلاعات تاکسونمی مطابقت دارد. شباهت بسیار زیاد جمعیت خوانسار و طالقان را می­توان به دلیل نزدیکی دو منطقه و احتمالاً جابه­جایی مواد رویشی دانست. هر چند جدایی زیرگونه ‌ها و اطلاعات تاکسونومی نمی­تواند دلیل قطعی و مطابق با اطلاعات ژنتیکی جمعیت­ها باشد. با این وجود از دگرگشن بودن این گیاه و جود تنوع بالای بین و درون جمعیت نمی­توان صرف نظر کرد. بنابراین می­توان از نمونه­های مناطق دور از هم به عنوان والد جهت تلاقی در برنامه­های اصلاحی استفاده کرد از جمله تلاقی ژنوتیپ­های جمعیت درگز با دیگر جمعیت­ها می­تواند گزینه مناسبی برای تولید هیبریدهایی با عملکردهای مورد نظر باشد.