جایگاه تاکسونومیکی جدایه های ایرانی ویروس موزائیک خیار از استان های کرمان و یزد

جایگاه تاکسونومیکی جدایه های ایرانی ویروس موزائیک خیار از استان های کرمان و یزد

محمد مداحیان¹، حسین معصومی*²، جهانگیر حیدرنژاد²، اکبر حسینی پور²

¹دانشجوی سابق کارشناسی ارشد بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان.

²دانشیار بخش گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان.

تاریخ دریافت: 13/3/1391، تاریخ پذیرش: 22/5/1391

چکیده

ویروس موزائیک خیار (CMV Cucumber mosaic virus,) یکی از ویروس های مهم کدوئیان در نقاط مختلف دنیاست. به منظور شناسایی و تعیین جایگاه تکاملی جدایه­های این ویروس، تعدادی نمونه از استان­های کرمان و یزد جمع­آوری گردید. آلودگی به CMV در این نمونه­ها توسط آزمون DAS-ELISA مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس گیاه میزبان و مناطق نمونه­برداری، از نمونه های آلوده شش جدایه متفاوت، جهت مطالعات مولکولی انتخاب گردیدند. با استفاده از آزمون RT-PCR و آغازگرهای اختصاصی، یک قطعه 946 جفت بازی در برگیرنده ژن پروتئین پوششی، تکثیر، همسانه سازی و تعیین ترادف گردید. قطعات همسانه سازی شده جهت تعیین جایگاه تکاملی جدایه­های ایرانی با ترادف های مشابه مربوط به سایر جدایه های CMV موجود در بانک ژن مقایسه شدند. آنالیز فیلوژنتیکی نشان داد که جدایه­های بررسی شده در دو زیر گروه I و II قرار می­گیرند که زیر گروه I نیز به دو زیر گروه IA وIB تقسیم می­گردد. دو جدایه ایرانی CMV در زیر گروه IA و چهار جدایه دیگر در زیر گروه IB واقع گردیدند. بیشترین میزان تشابه ترادف نوکلئوتیدی در بین جدایه­های ایرانی به میزان 1/99% دربین دو جدایه Ker.Ker.Pep و Ker.Ker.Mel.2 از زیر گروه IB و کمترین میزان تشابه به میزان 1/92% بین دو جدایه Ker.Jir.Cu از زیر گروه IA و Yaz.Yaz.Tom از زیر گروه IB تعیین گردید. جدایه­های زیر گروه IB اختصاص به کشورهای شرق آسیا داشته و این بررسی اولین گزارش از وجود تعدادی ازجدایه­های CMV مربوط به زیر گروه IB از ایران و خاورمیانه می­باشد.

واژه های کلیدی: فیلوژنی، پروتئین پوششی، ویروس موزائیک خیار.

مقدمه

ویروس موزاییک خیار (Cucumber mosaic virus) دارای  میزبان­های گیاهی متعدد و متنوعی است که  با بیش از 60 گونه شته به طریقه ناپایا منتقل می گردد (Palukaitis & Garcia-Arenal, 2003). این ویروس باعث بروز اپیدمی های خطرناک از جمله  نکروز حاد و نابود کننده گوجه فرنگی در ایتالیا، اسپانیا و ژاپن و موزاییک حبوبات در جنوب شرقی ایالات متحده، موزاییک خربزه در کالیفرنیاشده است (Zhang, 2005 ).

ویروس موزاییک خیار (CMV)  از جنس کوکومو ویروس (Cucumovirus) وخانواده بروموویریده (Bromoviridae) می باشد (‌Arenal et al., 2000.). ژنوم ویروس از سه قطعه RNA شامل RNA-1 ، RNA-2 و RNA-3 تشکیل شده و حداقل دارای یک آر.ان.ای زیر ژنومی RNA4)) نیز می باشد که از ناحیه َ3 RNA-3 نسخه برداری می­گردند. RNA-1 پروتئین 1a، RNA-2 پروتئین های 2a و 2b و RNA-3 پروتئین پوششی (coat protein, CP) و پروتئین حرکتی (movement protein, MP) را رمز می نمایند. پروتئین 1a جزئی از آنزیم رپلیکاز است، پروتئین2a  به عنوان یک RNA dependent RNA polymerase (RdRp) عمل کرده و در همانند سازی ویروس دخالت دارد.  پروتئین2b  چندین وظیفه دارد از جمله به عنوان بازدارنده خاموشی ژن پس از ترجمه در برابر سیستم دفاعی میزبان عمل می نماید. MP نقش اساسی در حرکت ویروس در گیاه دارد و CP علاوه بر اینکه یکی از اجزاء پیکره های ویروس می­باشد در بیان علائم، انتقال توسط شته و کمک به حرکت سلول به سلول در گیاه و انتقال در مسافت­های طولانی نیز نقش دارد (Palukaitis & Garcia-Arenal, 2003). نژادهای CMV در مواردی از قبیل انتقال با ناقل، علائم ایجاد شده در گیاهان آزمون و میزبان طبیعی، خواص سرولوژی و ژنتیکی با یکدیگر متفاوت می­باشند. روش­های مختلفی جهت بررسی تنوع در بین جدایه های این ویروس از قبییل تعیین نقوش پپتیدی پروتئین پوششی (Palukaitis et al., 1992)، بررسی های سرولوژیکی (Wahyuni et al., 1992)، هیبریداسیون اسید نوکلئیک (Owen & Palukaitis, 1988) وتعیین ترادف اسیدهای نوکلئیک و اسیدهای آمینه (Palukaitis & Garcia-Arenal, 2003) مورد استفاده قرار گرقته­اند. از نظر فیلوژنتیکی جدایه های این ویروس بر اساس توالی ژن پروتئین پوششی  به دو گروه I و II تقسیم می شوند که گروه I نیز به دو زیر گروه IA و  IB تقسیم می گردد (Palukaitis & Garcia-Arenal, 2003; Rizos et al., 1992).

در ایران بررسی های مولکولی محدودی در مورد جدایه های ایرانی CMV صورت گرفته است. رسول پور و ایزدپناه دو جدایه این ویروس را از استان های اصفهان و فارس مورد بررسی قرار دادند (Rasoulpour & Izadpanah, 2008). همچنین (2006 & 2008)Bashir et al.,  برخی از جدایه­های ایرانی CMV را از مناطق شمال و شمال غربی کشور و (2009)Golnaz et al.,  جدایه های CMV از استان خراسان رضوی را از نظر مولکولی طبقه بندی نمودند. با توجه به اهمیت CMV و از آنجائیکه تاکنون در مورد وضعیت مولکولی جدایه­های این ویروس در استان های کرمان و یزد مطالعه­ای صورت نگرفته است، لذا هدف از انجام این تحقیق بررسی خصوصیات مولکولی تعدادی از جدایه­های این ویروس در استان های کرمان و یزد می باشد.

مواد و روش­ها

طی سال­های 1387 الی 1389 از مزارع و گلخانه­های گوجه فرنگی و کدوئیان استان یزد شامل مناطق: شمسی آباد، عسکر آباد، محسن آباد و خضر آباد شهر یزد و شهرستان تفت و تفت-محمد آباد و مزارع و گلخانه­های فلفل و کدوئیان استان کرمان شامل شهرهای کرمان، بافت، جیرفت و عنبر آباد نمونه برداری به عمل آمد. از گیاهان با علائم مختلف ویروسی از قبیل موزائیک، بندکفشی شدن، زردی، کوتولگی، شکستگی رنگ برگ­ها، رگبرگ نواری، تاولی شدن برگ­ها و میوه­ها و بدشکلی شدید برگ­ها نمونه برداری گردید و سپس به آزمایشگاه منتقل شدند.

به منظور شناسایی  ویروس  های آلوده کننده گیاهان نمونه برداری شده از آزمون ساندویچ دوطرفه الایزا به روش کلارک و آدامز (Clark & Adams 1977) و با استفاده از آنتی­سرم چند همسانه­ای CMV، Zucchini Yellow Mosaic Virus (ZYMV)، Squash mosaic virus (SqMV)، Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV)، Watermelon mosaic virus (WMV) و Papaya Ring Spot Virus (PRSV) تهیه شده از موسسه DSMZ کشور آلمان استفاده گردید. سپس نتایج  با استفاده از دستگاه الایزا خوان مدل (Biotek Instrument)  EL800 در طول موج 405 نانومتر مورد ارزیابی قرار گرفتند.

استخراج RNA از نمونه های آلوده با استفاده از کیت High Pure Viral Nucleic Acids Kit (شرکت Roche کشور آلمان) طبق دستورالعمل شرکت  سازنده انجام گردید. آر ان ای استخراج شده جهت واکنش نسجه برداری معکوس (Reverse transcription, RT) با آنزیم M-MLV reverse transcriptase شرکت Fermentas وآغاز گر پس سوی R-DAG: 5'- GACTGACCATTTTAGCCG- 3'  طراحی شده توسط (1999)Seung et al.,  استفاده شد. جهت انجام واکنش RT و ساخت دی.ان.ای مکمل 5/2 میکرولیتر آر.ان.ای کل، 5/2 میکرولیتر آغازگر پس­سو (10μM) و 5/8 میکرولیتر آب دیونیزه استریل به لوله ها اضافه و پس از 1 دقیقه در دمای C°95، بلافاصله بر روی یخ قرار داده شد. سپس مقدار چهار میکرولیتر بافر RT (5x)، دو میکرولیتر مخلوط دئوکسی ریبونوکلوتید تری فسفات (dNTPs, 10μM)، 5/0 میکرولیتر آنزیم نسخه برداری معکوس (M-MuLV) (µL/200U)، 5/0 میکرولیتر بازدارنده RNase (µL/10U) به لوله­ها اضافه و به مدت 45 دقیقه در دمای ºC42 قرار داده شدند. توقف واکنش با قرار دادن مخلوط به مدت 15 دقیقه در دمای ºC72 انجام گرفت. جهت تکثیر ژن پروتئین پوششی جدایه­های CMV مورد مطالعه در این تحقیق و  انجام آزمون RT-PCR به ترتیب از آغازگرهای هم­سو (F-DAG: 5'-TAGTTTTGAGGTTCAATTCC - 3') و پس­سوی (R-DAG: 5'- GACTGACCATTTTAGCCG- 3') بر اساس مقاله (1999)Seung et al.,  استفاده گردید. مراحل پی سی آر شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه به مدت چهار دقیقه در دمای ºC94، 35 چرخه شامل مرحله واسرشت سازی در دمای ºC94 به مدت یک دقیقه، مرحله اتصال در ºC 56 به مدت 30 ثانیه، مرحله گسترش در دمای ºC 72 به مدت یک دقیقه و مرحله گسترش نهایی به مدت 10 دقیقه در دمای ºC 72 صورت گرفت. در نهایت محصولات PCR به دست آمده، در ژل آگاروز یک ­در صد الکتروفورز گردیدند.

قطعات تکثیر شده توسط آغازگرهای اختصاصی F-DAG وR-DAG در واکنش RT-PCR با استفاده از کیت (InsTA cloneTM PCR Cloning Kit) در پلاسمید pTZ57R/T، سویه JM 107 باکتری Escherichia coli همسانه سازی گردیدند. پلاسمید­های نوترکیب پس از استخراج به وسیله آغازگرهای عمومی M13F و M13R توسط شرکت ماکروژن کشور کره جنوبی از هر دو سمت تعیین ترادف شدند. جهت جستجوی ترادف­های مشابه در بانک ژن از نرم­افزار بلاست استفاده گردید و ترادف­های مشابه مورد بررسی و مقایسه قرار گرفتند. همردیف سازی چندگانه (multiple sequence alignment) با برنامه Clustal X (1997 .Thompson et al) انجام و فایل های همردیف سازی شده حاصل از این برنامه در نرم افزار MEGA 4 برای ترسیم درخت فیلوژنتیکی به روش Neighbor-Joining استفاده گردیدند. همچنین جهت بررسی میزان همولوژی جدایه های مورد بررسی در این تحقیق و دیگر جدایه های CMV از نرم افزار DNAMAN Version 4.02 استفاده گردید.

نتایج و بحث

شناسایی جدایه های CMV

بر اساس نتایج بدست آمده از آزمون DAS-ELISA از مجموع 390 نمونه جمع آوری شده از گیاهان کدو، فلفل، گوجه فرنگی، خیار، هندوانه، طالبی و خربزه از استان های کرمان و یزد 28 نمونه آلودگی به ویروس CMV را نشان دادند (جدول 1). علائم CMV بر روی گیاهان خانواده کدوئیان عمدتا شامل تاولی شدن برگ­ها، بدشکلی شدید برگ و میوه و موزائیک شدید بودند. در دو جدایه گیاه فلفل و گوجه فرنگی نیز علائمی مانند رگبرگ روشنی، ماتل، بدشکلی و باریک شدن برگ­ها مشاهده گردید. از بین نمونه های دارای آلودگی به ویروس CMV شش نمونه جدا شده از گیاهان فلفل (Ker.Ker.Pep)، خیار (Ker.Jir.Cu) و دو نمونه خربزه (Ker.Ker.Mel.1 و Ker.Ker.Mel.2) از استان کرمان و دو نمونه گوجه‌ فرنگی (Yaz.Yaz.Tom) و کدو (Yaz.Sha.Cu) از استان یزد جهت مطالعات مولکولی انتخاب گردیدند (جدول 2). همچنین 105 نمونه آلودگی به ویروس موزائیک زردکدو (ZYMV)، 69 نمونه آلوده به ویروس موزائیک هندوانه (WMV)، 4 نمونه آلوده به ویروس موزائیک کدو (SqMV) و 1 نمونه آلودگی به ویروس لکه حلقوی پاپایا (PRSV) را نشان دادند. در ضمن آلودگی مزارع نسبت به ویروس موزائیک سبز خیار (CGMMV) مشاهده نگردید. علاوه براین، برخی از نمونه ها آلودگی توأم بصورت دوتائی (WMV+CMV و WMV+ZYMV) و سه تایی (CMV + WMV + PRSV) را نشان دادند. در مواردی که یک گیاه آلوده به دو یا چند ویروس بوده، این مسئله موجب اثر تشدید کنندگی ویروس ها بر روی یکدیگر گردیده و در نتیجه علائم ویروسی به نحو چشمگیری افزایش می یابند. همچنین تعدادی از نمونه ها دارای علائم ویروسی بودند که نسبت به هیچ کدام از آنتی سرم های مورد استفاده واکنش نشان ندادند که این نمونه احتمالا می توانند به دیگر ویروس های کدوئیان نظیر Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV)، Cucumber yellow stunting disorder virus (CYSDV)، Watermelon chlorotic stunt virus (WcSV) و Tomato leaf curl Palampur virus (ToLCPMV) آلوده باشند. ویروس های WMV، ZYMV، CMV و CABYV شایع ترین ویروس های آلوده کننده کدوئیان در ایرن می باشند و نتایج به دست آمده در این تحقیق با دیگر نتایج گزارش شده از ایران در مورد شیوع ویروس های آلوده کننده بر روی کدوئیان مطابقت دارد (Massumi et al., 2007; Bananej & Vahdat, 2008).

تکثیر و همسانه سازی ژن پروتئین پوششی

با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، گزارش شده توسط (1999)Seung et al., ، ژن پروتئین پوششی، جدایه های ایرانی CMV  مورد مطالعه در این تحقیق در آزمون RT-PCR قطعه ای به طول 946 جفت باز حاوی طول کامل ژن CP و نواحی غیر قابل ترجمه '3 و '5 در دو انتهای این ژن تکثیر گردید (شکل 1). تعیین ترادف محصولات همسانه سازی شده پس از حذف نوکلئوتیدهای اضافی نشان داد که طول ژن CP در جدایه­های تعیین توالی شده در این تحقیق 657 نوکلئوتید می باشد (شکل 2).

مطالعات فیلوژنتیکی

    جهت تعیین جایگاه فیلوژنتیکی جدایه­های مورد بررسی CMV در این تحقیق، جدایه­های مذکور به همراه 56 جدایه گزارش شده موجود در بانک ژن مورد بررسی قرار گرفتند (جدول 3). بر اساس درخت تبارزایی رسم شده بر پایه ترادف نوکلئوتیدی و اسیدهای آمینه ژن پروتئین پوششی، جدایه­های CMV در دو زیر گروه I و II قرار گرفتند. که گروه I خود نیز به دو زیر گروه  IAو IB تقسیم شد.

شکل 1- الکتروفورز محصول PCR تکثیر شده با استفاده از آغازگرهای  اختصاصی R-DAG/F-DAG و تشکیل باند 946 جفت بازی مربوط به ژن پروتئین پوششی جدایه های ایرانی CMV درون ژل آگاروز1%.  M) نشانگر  اندازهDNA  (Gene Ruler™1Kb DNA Ladder, Fermentase). 1) جدایه Ker.Jir.Cu. متعلق به زیر گروه IA. 2) جدایه Yaz.Yaz.Tom متعلق به زیر گروه IB.

Figure 1- Electrophoresis of the RT-PCR products using specific primers of R-DAG/F-DAG showing amplification of 946 bp segment of coat protein gene of Iranian Cucumber mosaic virus isolates. Lane M, 1-kb DNA ladder. lane 1, Ker.Jir.Cu isolate belonged to IA subgroup. lane 2, Yaz.Yaz.Tom isolate belonged to IB subgroup.

شکل 2 - الکتروفورز پلاسمید نوترکیب حاوی قطعه ژن پروتئین پوششی جدایه های ایرانی TAV هضم شده با آنزیم های EcoR1 و Pst1 درون ژل آگاروز1%. (M نشانگر اندازه 1Kb DNA Ladder, Fermentase) DNA (Gen RulerTM. 1) جدایه Ker.Jir.Cu. متعلق به زیر گروه IA. 2) جدایه Yaz.Yaz.Tom متعلق به زیر گروه IB.

Figure 2-B - Recombinant plasmids comprising coat protein gene of Iranian isolates of Cucumber mosaic virus digested with EcoR1 and Pst1 restriction enzymes. Lane 1, Ker.Jir.Cu isolate belonged to IA subgroup. Lane 2, Yaz.Yaz.Tom isolate belonged to IB subgroup.

بر این اساس جدایه های  Ker.Jir.Cu و Yaz.Sha.Cu به همراه چهارده جدایه دیگر گزارش شده از ایران (Bashir et al., 2006 & 2008; Rasoulpour & Izadpanah, 2008) و تعدادی از جدایه­های گزارش شده از کشورهای مختلف دنیا از قبیل Y، N، O، CH و CMV-ON از ژاپن، Lucknow از هند، Fny و C از آمریکا و دو جدایه از کشور برزیل در زیر گروه  IA قرار می­گیرند (شکل 3 و 4). چهار جدایه دیگر شامل جدایه های Ker.Ker.Pep، Ker.Ker.Mel.1، Ker.Ker.Mel.2 و Yaz.Yaz.Tom به ترتیب جدا شده از گیاهان خربزه، گوجه فرنگی و فلفل جمع آوری شده از شهرهای کرمان و یزد در زیر گروه IB به همراه جدایه های PE، SD و X65017.1 از چین، ABI و As از کره جنوبی، NT9 از تایوان، C7-2 و K از ژاپن، 2A1-A و Ixora از آمریکا)، Tfn از ایتالیا و جدایه های B2، J&K، DQ285569، AF350450.1 و X89652.1 از  هند قرار گرفتند (شکل 3 و 4). گروه II نیز شامل جدایه هایی از کشورهای ژاپن، آمریکا، استرالیا، مجارستان، ایران و انگلستان می­باشد. ضمنا هیچ کدام از جدایه­های ایرانی مورد بررسی دراین تحقیق در زیر گروه II قرار نگرفتند.

شکل 3- درخت فیلوژنتیکی رسم شده بر اساس روش neighbor-joining با استفاده از نرم افزار MEGA 4 بر پایه ترادف نوکلئوتیدی ژن پروتئین پوششی جدایه های ایرانی ویروس CMV و سایر جدایه های موجود در بانک ژن. جدایه های ایرانی مورد بررسی در این تحقیق به صورت Bold نشان داده شده­اند. جدا یه ای از TAV به نام AJ237849.2 و جدایه ای از PSV به نام NC_002040 به عنوان Outgroup انتخاب گردیده اند.

Figure 3- neighbor-joining tree illustrating the phylogenetic relationships between the Iranian and other published Cucumber mosaic virus isolates. The tree was constructed using the 657 bp of coat protein sequences. Multiple sequence alignments were generated with MEGA software (Version 4). The Iranian isolates investigated in this study are shown in bold. Tomato aspermy virus (TAV) and Peanut stunt virus (PSV) were selected as outgroup.

شکل 4- درخت فیلوژنتیکی رسم شده بر اساس روش neighbor-joining با استفاده از نرم افزار MEGA 4 بر پایه ترادف اسیدهای آمینه پروتئین پوششی جدایه های ایرانی ویروس CMV و سایر جدایه های موجود در بانک ژن. جدایه های ایرانی مورد بررسی در این تحقیق به صورت Bold نشان داده شده­اند. جدا یه ای از TAV به نام AJ237849.2 و جدایه ای از PSV به نام NC_002040 به عنوان Outgroup انتخاب گردیده اند.

Figure 4- Neighbor-joining tree illustrating the phylogenetic relationships between the Iranian and other published Cucumber mosaic virus isolates. The tree was constructed using the coat protein amino acid sequences. Multiple sequence alignments were generated with MEGA software (Version 4). The Iranian isolates investigated in this study are shown in bold. Tomato aspermy virus (TAV) and Peanut stunt virus (PSV) were selected as outgroup.

چهار جدایه ایرانی تشابه بالای ترادف نوکلئوتیدی و اسیدهای آمینه به ترتیب به میزان 9/97 تا 1/99 و 2/97 تا 5/99 درصد با یکدیگر داشتند (جدول 4) و بر اساس درخت فیلوژنی رسم شده نیز جدایه­های ایرانی به صورت یک زیر شاخه از دیگر جدایه­های موجود در زیر گروه IB مجزا شدند. بیشترین میزان تشابه ترادف نوکلئوتیدی در بین جدایه های ایرانی مورد بررسی در این تحقیق واقع در دو زیر گروه ( IAو IB) بین جدایه های Ker.Ker.Pep از زیرگروه IB و Yaz.Sha.Cu از زیرگروه IA به میزان 5/94 در صد و کمترین میزان تشابه به میزان 1/92 درصد بین جدایه های  Ker.Jir.Cu از زیرگروه IA و Yaz.Yaz.Tom از زیرگروه IB بود (جدول 4). در بین تمامی نمونه های مورد بررسی، بیشترین درصد تشابه ترادف نوکلئوتیدی و اسیدهای آمینه به ترتیب به میزان 8/99 و 100 درصد مربوط به جدایه ایرانی Yaz.Sha.Cu و جدایه Fny (از کشور آمریکا) می­باشند. جدایه EI1 از ایران و جدایه CH (از ژاپن) نیز مشابهتی به میزان 100 درصد از نظرترادف اسیدهای آمینه با جدایه Ker.Jir.Cu داشتند. در زیر گروه IB جدایه ایرانی Yaz.Yaz.Tom دارای تشابه بالای ترادف نوکلئوتیدی به میزان 3/97 درصد با جدایه J&K گزارش شده از کشور هند بود.

    جدایه­های مختلف CMV که از نقاط مختلف دنیا گزارش گردیده­اند از نظر خصوصیات بیولوژیکی، سرولوژیکی و فیزیکوشیمیایی متفاوت هستند (Palukaitis & Garcia-Arenal, 2003). جدایه­های CMV بر پایه خصوصیات سرولوژی، هیبریداسیون اسید نوکلئیک، ترادف نوکلئوتیدی ژن پروتئین پوششی و RFLP در دو زیر گروه I و II قرار می گیرند. جدایه های زیر گروه I نیز بر پایه ترادف نوکلئوتیدی ژن پروتئین پوششی و روابط فیلوژنتیکی به دو زیر گروه IA و IB تقسیم بندی می­گردند (Palukaitis & Zaitlin, 1997; Roossinck, 2002). بر اساس مطالعات انجام شده بر روی جدایه­های CMV در دنیا میزان مشابهت ترادف نوکلئوتیدی ژن پروتئین پوششی در بین جدایه­های واقع در دو زیر گروه I و II به ترتیب بالاتر از 88 و 96 درصد می­باشد. همچنین درصد تشابه در بین گونه­های مربوط به دو زیر گروه I و II حدود 69 تا 77 درصد بوده است. لذا این موضوع بیانگر آن است که نا­همگونی (Heterogenecity) بالایی در بین جدایه­های CMV وجود دارد (Roossinck, 2002). بر این اساس درصد تشابه ترادف نوکلئوتیدی جدایه­های ایرانی مورد بررسی در این تحقیق با جدایه­های زیر گروه II به میزان 1/76-3/78% و موقعیت این جدایه ها در درخت تبارزایی نشان دهنده تعلق این جدایه ها به زیر گروه I می­باشد. بشیر و همکاران بر اساس ترادف نوکلئوتیدی ژن CP و RFLP، جدایه­های ایرانی CMV را در دو زیر گروه IA و II قراردادند و هیچ کدام از جدایه­ها در زیر گروه IB قرار نگرفتند (Bashir et al., 2006 & 2008). بر پایه درخت تبارزایی رسم شده توسط رسول پور و ایزدپناه نیز جدایه­های ایرانی CMV در زیر گروه IA و یک جدایه در زیر گروه II قرار می­گیرند (Rasoulpour & Izadpanah, 2008). در این تحقیق نیز دو جدایه Ker.Jir.Cu و Yaz.Sha.Cu در درخت تبارزایی رسم شده در کنار جدایه های EI1، DI1، GI1، CMV-CU گزارش شده از ایران و جدایه CH گزارش شده از کشور ژاپن و Fny از کشور آمریکا در زیر گروه IA قرار گرفتند.

جدول 4- میزان تشابه ترادف نوکلئوتیدی (پایین-چپ) و اسیدهای آمینه (بالا-راست) جدایه های ایرانی CMV مورد بررسی در این تحقیق و دیگر جدایه های ایرانی  CMV موجود در بانک ژن.

Table 4- Percentage of nucleotide (Down-Left) and amino acid (Up-Right) sequence identity of Iranian CMV isolates investigated in this study and other Iranian CMV isolates of GenBank.

جدایه­های مربوط به زیر گروه IA و II در تمام دنیا یافت می­گردند و گروه بندی آن ها به ناحیه جغرافیایی ارتباطی ندارد، در حالیکه اکثر جدایه های زیر گروه IB از شرق آسیا گزارش گردیده اند و تنها یک جدایه مربوط به کشور ایتالیا و دو جدایه از کشور آمریکا در زیر گروه IB واقع گردیده­اند (Gallitelli, 2000; Lin et al., 2003; Ng et al., 2000). (2010)Dubey et al.,  و (2004)Srivastava & Raj  تمامی جدایه های گزارش شده از کشور هند (به جز جدایه Lucknow) به همراه تعدادی از جدایه های گزارش شده از کشورهای شرق و جنوب شرقی آسیا مانند چین، کره جنوبی، تایوان، اندونزی و ژاپن در زیر گروه IB قرار می گیرند. این در حالی است که چهار جدایه ایرانی Ker.Ker.Pep، Ker.Ker.Mel.1، Ker.Ker.Mel.2 و Yaz.Yaz.Tom به همراه جدایه­های گزارش شده از شرق آسیا نیز در این زیر گروه واقع گردیدند. بر این اساس در صد میزان همولوژی بالای چهار جدایه ایرانی با یکدیگر در مقایسه با سایر جدایه های زیر گروه IB و مجزا شدن این جدایه ها به صورت یک زیر شاخه و وجود در یک مکان جغرافیایی جدید (کشور ایران) می­تواند نشان دهنده یک منشاء مشترک بین این جدایه­ها باشد. این نتایج بر اساس اطلاعات مربوط به ترادف نوکلئوتیدی و اسیدهای آمینه ژن پروتئین پوششی می­باشد و تحقیقات بیشتری جهت مطالعه قسمت های دیگر ژنوم این جدایه­ها و سایرجدایه­های منطقه لازم می­باشد. بیش از 80 درصد جدایه­های گزارش شده CMV از مناطق مختلف دنیا و از میزبان های متفاوت به زیر گروه I تعلق دارند (Gallitelli, 2000)، لذا نتایج حاصل از این تحقیق و تحقیقات انجام شده گذشته در ایران (Bashir et al., 2006 & 2008; Rasoulpour & Izadpanah, 2008) نشان دهنده گسترش بیشتر جدایه های مربوط به زیر گروه I در کشور ایران می­باشد.

     تعیین زیر گروه­های جدایه های CMV در بررسی اپیدمیولوژی ویروس از اهمیت زیادی برخوردار است (Yu et al., 2005). همچنین ردیابی جدایه های CMV و تشخیص تنوع ژنتیکی آنها یک مرحله موثر در کنترل ویروس به ویژه از طریق مهندسی ژنتیک می باشد (Lin et al., 2003). در این تحقیق شش جدایه از CMV از نظر جایگاه تکاملی در درخت تبارزایی مورد بررسی قرار گرفتند. پیش از این بر اساس مطالعات مولکولی انجام شده بر روی جدایه­های ایرانی CMV تمامی جدایه­ها در دو زیر گروه IA و II قرار گرفته­اند (Bashir et al., 2006; 2008; Rasoupour & Izadpanah, 2008) و در این تحقیق برای نخستین بار چهار جدایه از ایران در زیر گروه IB طبقه بندی گردیدند. جدایه­های زیر گروه IB اختصاص به کشورهای شرق آسیا داشته (Gallitelli, 2000) و این بررسی اولین گزارش از وجود جدایه­های این زیر گروه از ایران و منطقه خاور­میانه می­باشد. ضمنا وجود جدایه­های مربوط به هر سه زیر گروه IA، IB و II در ایران نشان دهنده گوناگونی و تنوع ژنتیکی جدایه­های CMV در ایران می باشد، لذا تحقیقات بیشتر جهت شناسایی جدایه­های بیشتر CMV لازم می­باشد.