تأثیر غلظت‌ و منبع کربوهیدرات‌ بر تولید درون شیشه‌ای آنتوسیانین در سیب

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

چکیده

کشت سلول‌های گیاهی یک روش ایده‌آل برای تولید مقادیر زیاد برخی از متابولیت‌های ثانویه‌ی مهم مانند آنتوسیانین به صورت تجارتی است. در بین سیب‌های وحشی (Malus sp.) بومی آسیای مرکزی و سیبری، ژنوتیپ‌ها و هیبریدهایی وجود دارند که توانایی تولید آنتوسیانین را در بیشتر بافت­های خود حتی به صورت درون شیشه‌ای دارا هستند. عوامل بسیاری بر تولید آنتوسیانین در شرایط درون شیشه­ای تأثیرگذار می­باشند. در این پژوهش به منظور تعیین بهترین منبع کربوهیدرات و بهینه کردن غلظت­های مختلف ساکارز، گلوکز، فروکتوز، مالتوز، مانیتول، جهت تولید درون شیشه‌ای آنتوسیانین، از ریز نمونه­های برگی گیاهچه­های یک ژنوتیپ سیب وحشی جهت تولید کالوس استفاده گردید. نتایج نشان داد که از میان غلظت­های مختلف مانیتول جهت تولید آنتوسیانین، غلظت 3 درصد آن به همراه ساکارز 3 درصد بیشترین تأثیر را داشت. با افزایش غلظت مانیتول، میزان شاخص رشد کالوس و وزن‌ تر کالوس کاهش و وزن خشک کالوس افزایش یافت. همچنین بین تیمار‌های ساکارز بیشترین میزان تولید آنتوسیانین و کمترین میزان شاخص رشد در غلظت 6 درصد مشاهده گردید. تیمارهای گلوکز، فروکتوز و مالتوز تأثیر کمتری بر تولید آنتوسیانین داشتند.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Effect of concentration and source of carbohydrate on in vitro production of anthocyanin in apple

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Zahed Zadeh
  • Nasser Mahna
  • Farshad Kakavand
  • Fariborz Zare Nahandi
  • Jaber Panahande
چکیده [English]

In vitro culture of plant cells is an ideal method for commercial production of large amounts of several important secondary metabolites. There are some wild apples (Malus sp.) native to Central Asia and Siberia that can produce anthocyanin in their various organs even in vitro and contain compounds such as flavonoids and polyphenols, which have antioxidant activity. There are numerous factors affecting anthocyanin production in in vitro condition. The aim of this study was to determine the best source and optimum concentration of carbohydrates including sucrose, glucose, fructose, maltose and mannitol to produce anthocyanin in callus culture of an in vitro grown anthocyanin producing wild apple. The results showed that the mannitol concentration of 3% plus 3% sucrose was the most effective carbohydrate treatment for anthocyanin production. Increasing mannitol concentration to more than 3% resulted in reduced anthocyanin production. Increasing mannitol concentration, decreased callus growth index and callus fresh weight; while, callus dry weight increased. The highest anthocyanin production and the lowest callus growth index were observed in 6% among the other sucrose concentrations. Glucose, fructose and maltose had weaker effects on anthocyanin content.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Anthocyanin
  • carbohydrate
  • Apple
  • in vitro

تأثیر غلظت‌ و منبع کربوهیدرات‌ بر تولید درون شیشه‌ای آنتوسیانین در سیب

 

فاطمه زاهدزاده1، ناصر مهنا*2، فرشاد کاکاوند1، فریبرز زارع نهندی3، جابر پناهنده3

 

1دانشجوی کارشناس ارشد گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.

2 دانشیار گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.

3 استادیار گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.

تاریخ دریافت: 01/09/1391، تاریخ پذیرش: 20/02/1392

 

چکیده

کشت سلول‌های گیاهی یک روش ایده‌آل برای تولید مقادیر زیاد برخی از متابولیت‌های ثانویه‌ی مهم مانند آنتوسیانین به صورت تجارتی است. در بین سیب‌های وحشی (Malus sp.) بومی آسیای مرکزی و سیبری، ژنوتیپ‌ها و هیبریدهایی وجود دارند که توانایی تولید آنتوسیانین را در بیشتر بافت­های خود حتی به صورت درون شیشه‌ای دارا هستند. عوامل بسیاری بر تولید آنتوسیانین در شرایط درون شیشه­ای تأثیرگذار می­باشند. در این پژوهش به منظور تعیین بهترین منبع کربوهیدرات و بهینه کردن غلظت­های مختلف ساکارز، گلوکز، فروکتوز، مالتوز، مانیتول، جهت تولید درون شیشه‌ای آنتوسیانین، از ریز نمونه­های برگی گیاهچه­های یک ژنوتیپ سیب وحشی جهت تولید کالوس استفاده گردید. نتایج نشان داد که از میان غلظت­های مختلف مانیتول جهت تولید آنتوسیانین، غلظت 3 درصد آن به همراه ساکارز 3 درصد بیشترین تأثیر را داشت. با افزایش غلظت مانیتول، میزان شاخص رشد کالوس و وزن‌ تر کالوس کاهش و وزن خشک کالوس افزایش یافت. همچنین بین تیمار‌های ساکارز بیشترین میزان تولید آنتوسیانین و کمترین میزان شاخص رشد در غلظت 6 درصد مشاهده گردید. تیمارهای گلوکز، فروکتوز و مالتوز تأثیر کمتری بر تولید آنتوسیانین داشتند.

کلمات کلیدی: سیب، آنتوسیانین، کربوهیدرات، درون شیشه­ای.



مقدمه

متابولیت‌های ثانویه موادی هستند که مستقیماً مورد نیاز گیاه نیستند و در واکنش به عوامل و شرایط مختلف تولید می‌شوند. مشکلاتی برای تولید مستقیم متابولیت‌های ثانویه از گیاهان وجود دارد که می‌توان با استفاده از تولید آن­ها در شرایط درون شیشه‌ای بر این مشکلات غلبه نمود. کشت بافت، روش مهمی برای تولید مستقیم رنگ‌دانه‌ها در سطح وسیع می­باشد. تحقیقات در رابطه با تولید آنتوسیانین‌ها نشان داده‌اند که همیشه در مقادیر زیاد نمی‌توان این متابولیت ثانویه را از طریق کشت بافت گیاهی تولید نمود ولی با این وجود در پژوهش‌های اخیر عوامل موثر بر تجمع آنتوسیانین در کشت سلول و کالوس شامل شدت نور، اشعه‌ی فرابنفش، منبع نیتروژن، تنش‌های اسمزی و الیسیتورها مورد بررسی قرار گرفته است (Raluca et al., 2010)  این مواد تنها در معدودی از گونه‌های گیاهی تشکیل می‌شوند.

در بین سیب‌های وحشی بومی آسیای مرکزی و سیبری که بیشتر متعلق به گونه های (Malus pumila) و یا (Malus pumila var. niedzwetzkyana) هستند، ژنوتیپ‌ها و هیبریدهایی وجود دارند که توانایی تولید آنتوسیانین را در بیشتر بافت­های خود دارا بوده و توانایی تولید آنتوسیانین در شرایط درون شیشه­ای را دارند و می­توان با استفاده از کشت کالوس این گیاهان آنتوسیانین تولید کرد (Akbari, 2011; Kakavand, 2012).

عوامل بسیاری بر تولید آنتوسیانین در شرایط درون شیشه­ای تأثیرگذار می­باشند. تاثیر دما، نور و سایر فاکتور­ها در انگیزش تجمع آنتوسیانین در هر رقم متفاوت می­باشد. هر مرحله از مسیر­های بیوشیمیایی آنتوسیانین از نظر ژنتیکی برنامه­ریزی شده است و هر رقم پاسخ متفاوتی در شرایط مختلف می­دهد 2007) ,.et al Ritenour). القای کالوس و تشکیل آنتوسیانین به طور معنی‌داری وابسته به منبع کربن می‌باشد. منابع کربن یکی از مهم­ترین سوبستراها برای مسیر­های بیوسنتزی فنول­ها هستند (Castandea-Ovindo et al., 2009). با توجه به این که تاکنون تحقیقی در رابطه با بررسی مقایسه­ای اثر منابع کربوهیدرات­ و غلظت­های آن­ها در محیط کشت و همچنین اثر مانیتول بر تولید آنتوسیانین از طریق کشت کالوس سیب انجام نگردیده است، بنابراین، در این پژوهش اثر غلظت­ها و منابع مختلف کربوهیدرات­ها شامل ساکارز، گلوکز، فروکتوز، مالتوز و همچنین مانیتول بر تولید درون ­شیشه­ای آنتوسیانین در کشت کالوس سیب انجام گردید.

 

مواد و روش­ها

از ریز­نمونه­های به دست آمده از کشت مریستم و ریز ازدیادی یک سیب وحشی موجود در آزمایشگاه کشت بافت گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز که متعلق به گونه ای از جنس مالوس (Malus sp.) با ژنوتیپ R1R1 (Unpublished data) مربوط به صفت تولید آنتوسیانین در گوشت میوه می باشد، استفاده شد (شکل 1). جهت تکثیر گیاهچه­ها از محیط کشت MS حاوی BAP (1.5 mg/l)، سکوسترن آهن (FeEDDHA) (100 mg/l) و ساکارز (30 mg/l) استفاده شد. باز­کشت گیاهچه­ها در محیط کشت جدید به فواصل هر سه هفته از آغاز کشت به مدت 4 ماه انجام گردید. جهت کالوس­زایی از محیط­ کشت MS حاوی  KIN (0.5mg/l)، NAA (1 mg/l) و1.5 mg/l) ) 2,4-D استفاده گردید (شکل 2).

 

 

 

شکل 1- گیاهچه­های درون شیشه­ای سیب وحشی آنتوسیانین دار مورد استفاده در این آزمایش.

Figure 1- In vitro plantlets of the anthocyanin producing wild apple used in this research.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2- کالوس سیب وحشی آنتوسیانین دار مورد استفاده در این آزمایش.

Figure 2- Callus of the anthocyanin producing wild apple used in this research.

 

 

 

تیمار­های به­کار رفته و مورد بررسی در این آزمایش شامل غلظت­های مختلف مانیتول (1، 2، 3، 4، 5 درصد) به همراه ساکارز 3 درصد و غلظت­های مختلف ساکارز، گلوکز، فروکتوز و مالتوز هرکدام شامل چهار غلظت (3، 4، 5، 6 درصد) بود. در مجموع 21 تیمار در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار و چهار نمونه در هر تکرار مورد بررسی قرار گرفتند. بعد از اعمال تیمارها، در پایان هفته­ی سوم وزن تر و خشک (در دمای 60 درجه­ی سانتی‌گراد آون به مدت 24 ساعت) کالوس‌­ها اندازه­گیری شد. شاخص رشد کالوس نیز از فرمول زیر محاسبه شد:

Gi = (W2 – W1) / W1) * 100

Gi: شاخص رشد

W2: وزن کالوس در پایان آزمایش               W1: وزن کالوس در آغاز آزمایش

آنتوسیانین کل در هفته سوم آزمایش از کالوس‌های تیمار شده با استفاده از متانول اسیدی (٪99 متانول و ٪1 اسید کلریدریک حجمی به حجمی) استخراج ‌گردید و پس از سانتریفیوژ کردن در دمای چهار درجه سانتی‌گراد و 12000 دور به مدت 10 دقیقه، فاز مایع جدا گردیده و در طول موج 530 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر میزان جذب اندازه‌گیری شد (متانول اسیدی به عنوان شاهد در نظر گرفته شد) (Mizukami et al.,1989) (با واحد شاخص شدت رنگ در گرم وزن تر cv/gr FW). مقدار آنتوسیانین کل به روش Wrolstad (1976) نیز محاسبه گردید. تجزیه و تحلیل داده­ها با استفاده از نرم‌افزارIBM SPSS ver. 21 (IBM corp. 2012) انجام گرفت. قبل از انجام آنالیز داده­ها، صادق بودن مفروضات اولیه تجزیه واریانس پارامتریک داده­های صفات اندازه­گیری و محاسبه شده مورد بررسی و آزمون قرار گرفت. تبعیت داده­ها از توزیع نرمال با استفاده از روش­های کولموگروف- اسمیرنوف با تصحیح لیلیفورس و روش شاپیرو- ویلک مورد آزمون قرار گرفت. مشاهده شد که بعضی از تیمار­ها از توزیع نرمال تبعیت نمی کنند. برای حل این مشکل داده­ها از نظر وجود داده­های پرت مورد بررسی قرار گرفتند و داده­های پرت حذف شدند. سپس، توان باکس برای تبدیل داده­ها برآورد گردید و داده­ها بر اساس این توان مورد تبدیل واقع شدند. گرچه، با این تمهیدات توزیع داده­های مربوط به صفت محتوای آنتوسیانین کل نرمال شدند ولی داده­های سایر توزیع نرمال نداشتند. همچنین، آزمون لون برای بررسی یکنواختی واریانس­های درون تیماری برای همه صفات معنی­دار گردید. برای حل این مشکل ناچار دو روش زیر دنبال گردید:

1) جدا کردن تیمارهای مانیتول- ساکارز و ساکارز از بقیه تیمار­ها و آنالیز و تجزیه واریانس جداگانه آن­ها بعد از تبدیل داده با استفاده از توان باکس برای داده­های محتوای آنتوسیانین کل.

2) آنالیز غیر پارامتریک داده­ها بر اساس روش تجزیه واریانس یک طرفه کروسکال-والیس و مقایسه چند دامنه­ای میانگین­های رتبه­ای بر اساس همین روش در مورد همه­ی صفات مورد اندازه گیری.

برای مقایسه میانگین داده­ها در روش پارامتریک، به دلیل نامتعادل بودن طرح ترجیحا از روش توکی و توکی-ب استفاده شد. برای مقایسه میانگین داده­ها در روش غیرپارامتریک از روش مقایسه چند دامنه ای کروسکال – والیس Stepwise (step-down) استفاده گردید. همچنین، برای صفت آنتوسیانین کل، بررسی رگرسیونی برای هر ­کدام از گروه­های تیماری کربوهیدرات­ها از نظر وجود رابطه­ی خطی، درجه دو و درجه سه انجام گرفت.

 

نتایج و بحث

در این پژوهش بیشترین میزان تولید آنتوسیانین در منابع کربوهیدرات مورد استفاده در هفته­ی سوم بعد از اعمال تیمار­ها مشاهده شد که در تیمار همزمان مانیتول و ساکارز 3 درصد بود (جدول 1). غلظت­های بالاتر باعث کاهش میزان آنتوسیانین شدند که مشابه با نتایج تولید آنتوسیانین در کالوس­های هویج تحت تأثیر مانیتول و ساکارز بود (Ranjendran et al., 1992). رابطه­ی رگرسیونی معنی­داری از نوع درجه­ دو بین غلظت­های مختلف مانیتول- ساکارز و میزان آنتوسیانین وجود داشت (جدول 2). با افزایش غلظت مانیتول میزان آنتوسیانین نیز تا غلظت 3 درصد افزایش نشان داد و سپس میزان آنتوسیانین با افزایش غلظت بیشتر از 3 درصد کاهش یافت (شکل 3) رابطه­ی رگرسیونی معنی­داری از نوع درجه­ دو بین غلظت­های مختلف ساکارز و میزان آنتوسیانین نیز دیده شد (جدول 3).

 


 


جدول 1- مقایسه­ی چند دامنه­ای میانگین­های رتبه­ای شاخص شدت رنگ، مقدار آنتوسیانین کل، شاخص رشد کالوس، قطر کالوس، وزن تر و خشک کالوس تحت تأثیر تیمارهای کربوهیدرات.

Table1- Mean comparison of ranked data for color intensity index, total anthocyanin, callus growth index, callus diameter, dry and wet weight resulted from carbohydrate treatments. 

وزن خشک کالوس

 (میلی گرم)

Callus dry weight (mg)

وزن تر کالوس

 (میلی گرم)

Callus wet weight (mg)

قطر کالوس

 (میلی متر)

Callus diameter (mm)

شاخص رشد کالوس

Callus growth index

آنتوسیانین کل

 (میلی گرم در کیلوگرم وزن تر کالوس)

Total anthocyanin (mg/KgFW)

شاخص شدت رنگ

cv/gr FW

Color intensity index

تیمار

Treatment

97.22±7.95abcd

104.44±9.36abcd

107.63±10.29abcd

122.23±11.58ab

144.16±25.25a

96.47±21.83abcd

135.33±28.25abc

68.84±12.40cd

114.60±13.97abcd

62.36±6.77d

126.60± 22.55abc

142.84±18.73a

110.81±5.90abc

94.07±17.32abcd

89.14±7.28abcd

99.57±13.75abcd

114.37±7/00abcd

93.31±11.48abc

107.15±14.27abcd

78.71±8.05abcd

74.70±7.73bcd

845.62±27.55ab

833.12±21.94ab

802.65±18.77ab

758.62±21.16ab

768.75±12.58b

896.25±20.57a

878.75±20.28ab

845.93±11.53ab

848.43±29.43ab

848.75±26.95ab

843.43±26.23ab

846.87±31.32ab

846.25±30.63ab

847.18±17/84ab

841.56±23.02ab

827.18±21.89ab

824.37±26.27ab

893.43±22.94a

868.43±19.10ab

882.5±27.44ab

825.18±47.58ab

0.42cd±16

15.25±0.29cde

15.68±0.39cde

14.62±0.45de

14.06±0.42de

17.62±0.48ab

16.43±0.36abc

15.12±0.37cde

14.87±0.30cde

15.37±0.45cde

15.06±0.42cde

14.93±0.32de

15.25±0.60cde

15.75±0.73cde

15.37±0.51cde

15.56±0.53cde

13.75±0.29e

17.43±0.40a

15.93±0.38cd

16±0.55cde

15.37±0.42cde

4.73ab±72.40

4.38ab±66.6

60.50±3.7ab

±3.67b 59.60

53.75±2.51a

79.25±4.11ab

75.25±4.05ab

69.19±2.30ab

69.69±5.88ab

69.75±5.39ab

68.69±5.24ab

69.38±6.26ab

69.25±6.12ab

69.44±3.57ab

68.31±4.6ab

65.44±3.57ab

64.88±5.25ab

78.69±4.59a

73.69±3.82ab

76.50±5.48ab

68.71±9.38ab

27.28±1.28bc

40.30±1.47a

45.32±1.58a

35.93±2.14 a

18.75±1.14cdef

18.68±1.33def

22.8±1.46bcde

27.72±1.32b

40.54±2.59a

22.32±3.02bcdef

14.64±2.80ef

14.78±1.38def

14.23±2.00ef

13.84±2.93f

16.6±2.50def

20.63±2.60bcedf

23.25±5.88f

13.64±1.51f

13.62±1.37f

14.73±1.98ef

26.84±2.54bcd

0.18±0.008bc

0.28±0.009a

0.30±0.010 a

0.25±0.014a

0.12±0.007cdef

±0.009def 0.12

0.15±0.009bcde

0.18±0.008b

0.27±0.017a

0.15±0.020bcdef

0.09±0.019ef

0.1±0.009def

0.09±0.013ef

0.09±0.019f

0.11±0.016def

0.14±0.017bcdef

0.15±0.039f

0.09±0.010f

0.09±0.009f

0.1±0.013ef

0.18±0.017bcd

M 1% + S 3%

M 2% + S 3%

M 3% + S 3%

M 4% + S 3%

M 5% + S 3%

S 3%

S 4%

S 5%

S 6%

G 3%

G 4%

G 5%

G 6%

F 3%

F 4%

F 5%

F 6%

Ma 3%

Ma 4%

Ma 5%

Ma 6%

 میانگین­های با حروف غیر یکسان در هر ستون، نشانگر اختلاف معنی­دار در سطح 5 درصد با آزمون کروسکال- والیس می­باشند.

Means with different letters in each column indicates significant difference (p<0.05) using Kruskal-Wallis test.

M (Mannitol) (مانیتول); S (Sucrose) (ساکارز), G (Glucose) (گلوکز); F (Fructose) (فروکتوز); Ma (Maltose) (مالتوز)

 

 

y =0.01+0.212x+0.38x2

R2 = 0.83

شکل 3- منحنی رگرسیونی برای غلظت­های مختلف مانیتول- ساکارز و میزان آنتوسیانین.

Figure 3- Regression curve for concentration of mannitol-sucrose and anthocyanin level.

 

 

جدول 2- تجزیه­ی رگرسیونی غلظت­های مختلف مانیتول-ساکارز و میزان آنتوسیانین.

Table 2- Regression analysis of diverse concentration of mannitol-sucrose and anthocyanin level.

                            درجه­ آزادی  (Degree of freedom)   میانگین مربعات (Mean of squares)

رگرسیون (Regression)                        2                                      **0.096

باقیمانده (Residual)                            42                                     0.001

** معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد (Significant with p<0.01)  

 

 

y =0.251-0.85x+0.015x2

R2= 0.71

==

شکل 4-  منحنی رگرسیونی برای غلظت­های مختلف ساکارز و میزان آنتوسیانین.

Figure 4- Regression curve for concentration of sucrose and anthocyanin level.

 

 

با افزایش غلظت ساکارز از 3 درصد تا 4 درصد میزان آنتوسیانین با شیب کمتری افزایش نشان داد: در حالیکه در غلظت های بالاترروند افزایش شدیدتر بود، به طوری که بیشترین میزان آنتوسیانین در بالاترین غلظت (6 درصد) مشاهده شد (شکل 4). همچنین، بین غلظت­های مختلف مالتوز و میزان آنتوسیانین یک رابطه­ی رگرسیونی درجه­ دو معنی دار مشاهده شد (جدول 4). با افزایش غلظت مالتوز میزان آنتوسیانین نیز  بعد از کاهش ناچیزی تا بالاترین غلظت روند افزایشی داشت (شکل 5). کاهش رشد کالوس در غلظت­های بالای ساکارز می­تواند به دلیل جلوگیری از جذب عناصر غذایی باشد که احتمالاً ناشی از افزایش فشار اسمزی است. در نتیجه­ی فشار اسمزی بالا فنیل آلانین در سلول­ها تجمع می­یابد که می‌تواند در تولید آنتوسیانین مورد استفاده قرار ­گیرد (Ram et al., 2011)؛ و از طرفی، همزمان با کاهش تراکم سلول­ها مقدار نفوذ نور افزایش می­یابد که این عوامل موجب افزایش محتوی آنتوسیانین در سلول­های رنگدانه­ای می­گردد (Saito et al., 1999). افزایش غلظت ساکارز بیشتر از 3 درصد موجب افزایش آنتوسیانین در گیاه چای ترش (Hibiscus sabdariffa) شده است (Mizukami et al.,1989)، از میان منابع کربن مورد استفاده برای این گیاه ساکارز و گلوکز بیشترین تأثیر را بر تولید آنتوسیانین داشتند ولی فروکتوز و مالتوز به میزان کمتری تولید آنتوسیانین را افزایش دادند. میزوکامی و همکاران (1989) نیز بدون اشاره به دلایل، این امر را تایید کرده اند که پاسخ­های مطلوب تولید آنتوسیانین تنها به منابع محدودی از کربن از جمله ساکارز و گلوکز محدود می­گردد.

قند­ها به ویژه ساکارز به عنوان مولکول­های پیام­رسان در فعال کردن سیکلین­ها[1] و کیناز­های وابسته به سیکلین[2] عمل می­کنند که موجب فعال شدن عوامل رونویسی می­شوند. هم­چنین در چرخه سلولی، موجب بالا رفتن شاخص میتوز (و در نتیجه تولیدکالوس) و نیز تولید آنتوسیانین­ها بدنبال فعال شدن سلول می­گردد (Solfanlli, 2006). ارتباط معکوسی بین رشد سلولی و تجمع متابولیت­های ثانویه وجود دارد که مشخصه­ی رایجی در کشت سلول­های گیاهی می­باشد (Mantel and Smith, 1983). استرس اسمزی بالا نیز احتمالاً بر محتوای آب واکوئل تأثیر می­گذارد. بنابراین، تجمع آنتوسیانین به وسیله­ی غلظت­های بالای ساکارز نیز می­تواند محدود گردد. ساکارز به عنوان بهترین منبع کربن برای تولید آنتوسیانین و رشد سلول­ها در کشت سوسپانسیون سلولی هویج نیز شناخته شده است و بعد از ساکارز، گلوکز، گالاکتوز، مالتوز و فروکتوز به ترتیب جهت تولید و رشد سلول­ها قرار داشتند. زمانی که محققان آنتوسیانین را استخراج نمودند و نوع آن را مشخص کردند، دریافتند که نوع آنتوسیانین در محیط کشت با منابع مختلف متفاوت نمی­باشد، بنابراین منبع کربن بر سیستم آنزیمی زیست­سازی آنتوسیانین اثرگذار نمی­باشد (Narayan et al., 2005). افزایش غلظت منابع کربن اثر مثبتی بر غلظت متابولیت­ها دارد. ظرفیت الکتریکی سلول­های کشت شده، یک اختلاف در ساختار غشای بین سلول­های کشت شده در غلظت­ها مختلف ساکارز نشان داده است که این امر از این فرضیه که نفوذپذیری غشای سلول­ها در غلظت­های بالای ساکارز افزایش می­یابد، حمایت می­کند (Zhang and Furausaki, 1997). تغییر غلظت منابع کربوهیدرات در محیط کشت کالوس­زایی سیب مورد بررسی در این پژوهش بر میزان فاکتور­های رشدی از قبیل وزن تر، وزن خشک، قطر کالوس و شاخص رشد نیز اثر­گذار بود. بر این اساس بیشترین وزن تر کالوس، قطر کالوس و شاخص رشد کالوس متعلق به ساکارز 3 درصد بود. در این تیمار، رشد کالوس­ها نسبت به سایر تیمار­ها سریع­تر بود و بیشترین میزان بیومس تولید گردید و کمترین میزان رشد کالوس در مانیتول 5 درصد به همراه ساکارز 3 درصد به دست آمد.

 

سپاسگزاری

قسمتی از بودجه این تحقیق از هزینه پایان‌نامه کارشناسی ارشد فاطمه زاهدزاده تأمین شده است که در دانشگاه تبریز به انجام رسیده است.


جدول 3- تجزیه­ی رگرسیون غلظت­های مختلف ساکارز و میزان آنتوسیانین.

Table 3- Regression analysis of diverse concentrations of sucrose and anthocyanin level.

                            درجه­ آزادی  (Degree of freedom)   میانگین مربعات (Mean of squares)

رگرسیون (Regression)                        2                                      **0.061

باقیمانده (Residual)                            34                                      0.001

** معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد (Significant with p<0.01

 

 

 

y = 0.371 – 0.152 x + 0.02 x2

 R2 = 0.43

 

 

 

 

شکل5- منحنی رگرسیونی برای غلظت­های مختلف مالتوز و میزان آنتوسیانین.

Figure 5- Regression curve for different concentrations of maltose and anthocyanin level.

 

جدول 4- تجزیه­ی رگرسیون غلظت­های مختلف مالتوز و میزان آنتوسیانین.

Table 4- Regression analysis of diverse concentrations of maltose and anthocyanin level.

                            درجه­ آزادی  (Degree of freedom)   میانگین مربعات (Mean of squares)

رگرسیون (Regression)                         2                                     **0.034

باقیمانده (Residual)                            45                                     0.002

** معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد (Significant with p<0.01

منابع

Akbari T (2011). Effect of explant and plant growth regulators on callugenesis and anthocyanin in apple. Master thesis. University of Tabriz. pp. 453.

Castandea-Ovando A, Pacheco-Hernandez M, Paez-Hernandez M (2009). Chemical studies of anthocyanins. Food Chemistry 113: 859-995.

Kakavand F (2012). Effect of sucrose, Nitrogen and Light Intensity on In vitro Production of anthocyanin in Makamik apple. MSc. Thesis. University of Tabriz, Tabriz, Iran. 

Mantel SH, Smith H (1983). Cultural factors that influence secondary metabolite accumulations in plant cell and tissue cultures. In: Mantel SH, Smith H (Eds.), Plant Biotechnology. pp. 75-108.

Matkowsk A (2008). Plant in vitro culture for the production of antioxidants. Biotechnology Advances 26: 548-560.

Mizukami H, Tomita K, Ohashi H (1989). Anthocyanin accumulation and changes in activates of phenylalanine ammonia-layse and chalcone synthase in roselle (Hibiscus sabdariffa L.) callus cultures. Plant Cell Reports 8: 467-470.

Narayan MS, Thimmaraju R, Bhagyalakshmi (2005). Interplay of growth regulators during soild-state and liquid-state batch cultivation of anthocyanin producing cell line of Daucus carota. Process Biochemisty 40: 351-358.

Raluca M, Monica M, Brezeanu A, Cogalniceana G (2010). Two-stage system a possible strategy for the enhancement of anthocyanin biosynthesis in a long term grape callus cultures. Romanian Biotechnological letters 15: 413-452

Ram M, Prasad KV, Kaur CH, Singh SK, Arora A, Kumar S (2011). Induction of anthocyanin pigments in callus cultures of Rosa hybrid L. in response to sucrose and ammonical nitrogen levels. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 104: 171-179.

Ranjendran L, Ravishanka GA, Venkataraman LV, Prathiba KR (1992). Anthocyanin production in callus cultures of Daucus carota as influenced by nutrient stress and osmoticum. Biotechnology letters 14: 707-712.

Ritenour M, Khemira H (2007). Red color development of apple. Washington State University. Tree fruit research and Extension center. http://postharvest.tfrec.wsu.edu/rep2007A.pdf.

Saito A, Suzuki M (1999). Plant regeneration from meristem-derived callus protoplast of apple (Malus × domestica cv. Fuji). Plants Cell Reports 18: 549-553.

Solfanlli C, Poggi A, Loreti E, Alpi A, Perata P (2006). Sucrose- specific induction of the anthocyanin pathway in Arabidopsis thaliana. Plant Physiology 140: 637-646.

Wrolstad R E (1976). Color and pigment analysis in fruit products. Agricultural Experiment Station Oregon State University Station Bull 624.

Zhang W, Furausaki S (1997). Production of anthocyanins by plant cell cultures. Biotechnology and Bioprocess Engineering 4: 231- 252.

 

 

 


Effect of concentration and source of carbohydrate on in vitro production of anthocyanin in apple

 

Zahedzadeh F.1, Mahna N.*2, Kakavand F.1, Zaare-Nahandi F.3, Panahandeh Yengejeh J.3

 

1M.Sc. student, Department of Horticultural Sciences, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran.

2 Associate Professor, Department of Horticultural Sciences, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran.

3 Assistant Professor, Department of Horticultural Sciences, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran.

 

Abstract

In vitro culture of plant cells is an ideal method for commercial production of large amounts of several important secondary metabolites. There are some wild apples (Malus sp.) native to Central Asia and Siberia that can produce anthocyanin in their various organs even in vitro and contain compounds such as flavonoids and polyphenols, which have antioxidant activity. There are numerous factors affecting anthocyanin production in in vitro condition. The aim of this study was to determine the best source and optimum concentration of carbohydrates including sucrose, glucose, fructose, maltose and mannitol to produce anthocyanin in callus culture of an in vitro grown anthocyanin producing wild apple. The results showed that the mannitol concentration of 3% plus 3% sucrose was the most effective carbohydrate treatment for anthocyanin production. Increasing mannitol concentration to more than 3% resulted in reduced anthocyanin production. Increasing mannitol concentration, decreased callus growth index and callus fresh weight; while, callus dry weight increased. The highest anthocyanin production and the lowest callus growth index were observed in 6% among the other sucrose concentrations. Glucose, fructose and maltose had weaker effects on anthocyanin content.

Key words: Anthocyanin, carbohydrate, apple, in vitro.

 



* نویسنده مسئول: ناصر مهنا                              تلفن: 09141034096                                n.mahna@gmail.com Email:

[1] Cyclin

[2] Cyclin- dependent kinase

* Corresponding  Author: Mahna N.                      Tel09141034096                           Email: n.mahna@gmail.com

Akbari T (2011). Effect of explant and plant growth regulators on callugenesis and anthocyanin in apple. Master thesis. University of Tabriz. pp. 453.
Castandea-Ovando A, Pacheco-Hernandez M, Paez-Hernandez M (2009). Chemical studies of anthocyanins. Food Chemistry 113: 859-995.
Kakavand F (2012). Effect of sucrose, Nitrogen and Light Intensity on In vitro Production of anthocyanin in Makamik apple. MSc. Thesis. University of Tabriz, Tabriz, Iran. 
Mantel SH, Smith H (1983). Cultural factors that influence secondary metabolite accumulations in plant cell and tissue cultures. In: Mantel SH, Smith H (Eds.), Plant Biotechnology. pp. 75-108.
Matkowsk A (2008). Plant in vitro culture for the production of antioxidants. Biotechnology Advances 26: 548-560.
Mizukami H, Tomita K, Ohashi H (1989). Anthocyanin accumulation and changes in activates of phenylalanine ammonia-layse and chalcone synthase in roselle (Hibiscus sabdariffa L.) callus cultures. Plant Cell Reports 8: 467-470.
Narayan MS, Thimmaraju R, Bhagyalakshmi (2005). Interplay of growth regulators during soild-state and liquid-state batch cultivation of anthocyanin producing cell line of Daucus carota. Process Biochemisty 40: 351-358.
Raluca M, Monica M, Brezeanu A, Cogalniceana G (2010). Two-stage system a possible strategy for the enhancement of anthocyanin biosynthesis in a long term grape callus cultures. Romanian Biotechnological letters 15: 413-452
Ram M, Prasad KV, Kaur CH, Singh SK, Arora A, Kumar S (2011). Induction of anthocyanin pigments in callus cultures of Rosa hybrid L. in response to sucrose and ammonical nitrogen levels. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 104: 171-179.
Ranjendran L, Ravishanka GA, Venkataraman LV, Prathiba KR (1992). Anthocyanin production in callus cultures of Daucus carota as influenced by nutrient stress and osmoticum. Biotechnology letters 14: 707-712.
Ritenour M, Khemira H (2007). Red color development of apple. Washington State University. Tree fruit research and Extension center. http://postharvest.tfrec.wsu.edu/rep2007A.pdf.
Saito A, Suzuki M (1999). Plant regeneration from meristem-derived callus protoplast of apple (Malus × domestica cv. Fuji). Plants Cell Reports 18: 549-553.
Solfanlli C, Poggi A, Loreti E, Alpi A, Perata P (2006). Sucrose- specific induction of the anthocyanin pathway in Arabidopsis thaliana. Plant Physiology 140: 637-646.
Wrolstad R E (1976). Color and pigment analysis in fruit products. Agricultural Experiment Station Oregon State University Station Bull 624.
Zhang W, Furausaki S (1997). Production of anthocyanins by plant cell cultures. Biotechnology and Bioprocess Engineering 4: 231- 252.