مطالعه ساختار ژنتیکی جایگاه ژن کالپاستاتین به روش PCR-SSCP و ارتباط آن با صفات رشد در گوسفند نژاد لری بختیاری

مطالعه ساختار ژنتیکی جایگاه ژن کالپاستاتین به روش PCR-SSCP و ارتباط آن با صفات رشد

در گوسفند نژاد لری­بختیاری

محسن عالی*¹، محمد مرادی شهربابک²، حسین مرادی شهربابک³، مصطفی صادقی³

¹ دانش­آموخته کارشناسی ارشد، گروه علوم دامی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران

² استاد، گروه علوم دامی، دانشکده علوم زراعی و دامی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران

³ استادیار، گروه علوم دامی، دانشکده علوم زراعی و دامی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران

 تاریخ دریافت: 03/07/1391، تاریخ پذیرش: 20/12/1391

چکیده

در این مطالعه، یک قطعه 254 جفت بازی شامل بخشی از اینترون­های 5 و 6 و تمام اگزون 6 ژن کالپاستاتین در تعداد 169 رأس گوسفندِ شجره­دار لری­بختیاری مربوط به ایستگاه اصلاح نژاد گوسفند لری­بختیاری (شولی) توسط واکنش­های زنجیره­ای پلیمراز تکثیر شد. جهت تعیین ژنوتیپ نمونه­ها، از روش PCR-SSCP و الکتروفورز عمودی نمونه­ها روی ژل اکریل­آمید 12% در دمای 4 درجه سانتیگراد و رنگ­آمیزی ژل به روش نیترات­نقره استفاده شد. تعداد 10 الگوی ژنوتیپی شامل AA، BB، AB، AC، AD، BE، AF، AG، AH و AJ به­ترتیب با فراوانی 029/0، 195/0، 065/0، 166/0، 024/0، 089/0، 325/0، 053/0، 012/0 و 042/0 مشاهده شد. اثر جایگاه ژن کالپاستاتین بر وزن تولد، وزن ­از شیرگیری و افزایش وزن روزانه از تولد تا ­از شیرگیری معنی­دار بود (05/0P

کلمات کلیدی: چندشکلی-ژن کالپاستاتین-گوسفند لری­بختیاری-صفات رشد -PCR-SSCP .

مقدمه

اکثر صفات اقتصادی از جمله صفات رشد تحت کنترل تعداد زیادی ژن قرار دارند. از طرف دیگر محیط نیز در بروز فنوتیپی این صفات نقش مهمی ایفا می­کند. از این­رو به هنگام انتخاب بر اساس رکوردهای فنوتیپی، این اثرات محیطی مانع شناسایی و انتخاب بهترین ژنوتیپ در مجموع ژن­های مؤثر شده که نتیجه آن کاهش صحت انتخاب و در نهایت کاهش پیشرفت ژنتیکی است (Falconer & Mackay, 1996). بنابراین تعیین چندشکلیِ ژن­های کاندیدای مؤثر بر صفات تولیدی و شناسایی آلل­ها و ژنوتیپ­های مطلوب برای صفات مورد نظر می­تواند زمینه را برای انتخاب به کمک نشانگر (MAS[1]) فراهم کند (Mara Carrijo et al., 2008). نتیجه این نوع انتخاب افزایش پیشرفت ژنتیکی به دلیل افزایش صحت انتخاب و نیز کاهش قابل توجه فاصله نسل به دلیل فراهم شدن امکان انتخاب در مراحل اولیه زندگی (دوران جنینی) است. علاوه بر این با انتخاب ژنومیک امکان تعیین ژنوتیپ در هر زمان از زندگی فراهم می­شود و لذا نیاز به نگهداری حیوان تا سن رکوردگیری خودش یا دخترانش نخواهد بود که این خود باعث کاهش هزینه­های اصلاح نژادی خواهد شد. کالپاستاتین (CAST) به عنوان یک ژن کاندیدا مورد توجّه است و بر صفات تولیدیِ مختلفی از جمله صفات رشد، لاشه و تردی گوشت در دام­های مختلف تأثیرگذار است (Byun et al., 2008; Goll et al., 2003; Koohmaraie, 1992). کالپاستاتین پروتئین مهارکننده کالپاین­ها (پروتئازهای وابسته به کلسیم) درون سلول ماهیچه است که با مهار کالپاین­ها و جلوگیری از تجزیه میوفیبریل­های ماهیچه نقش مهمّی در افزایش سرعت رشد در دوران حیات و  کاهش تردی گوشت پس از کشتار ایفا می­کند (Bickerstaffe et al., 2006). گوشت گوسفند در ایران به ­عنوان یک منبع تأمین پروتئین رایج بوده و در مقایسه با گوشت گاو و بز مصرف آن بیشتر است. گوسفند لری­بختیاری، نژادی درشت­جثه و دارای قدرت پرواری مناسب است ولی از معایب اصلی آن داشتن دنبه­ای بسیار بزرگ می­باشد (Khaldari, 2008). در حال حاضر این نژاد به دلیل فنوتیپ منحصر به فرد، مورد توجه محققین اصلاح نژاد دام کشور می­باشد. چندشکلی ژن کالپاستاتین در گوسفند اولین بار توسط Robert et al. (1996) در یک قطعه 622 جفت­بازی شامل بخشی از اگزون و اینترون 1 به روش PCR-SSCP در نژادهای دورست­داون و کوپ­ورس مورد بررسی قرار گرفت. آن­ها سه آلل A، B و C را به­ترتیب با فراوانیِ 69/0، 18/0 و 13/0 در نژاد دورست­دون و 46/0، 27/0 و 27/0 در نژاد کوپ­ورس مشاهده کردند. بررسی چندشکلی قطعه مذکور این­بار به روش PCR-RFLP در گوسفند نژاد دورست­دون منجر به شناسایی دو آلل M (که توسّط آنزیم هضم نشده) و N (که توسّط آنزیم هضم شده) به­ترتیب با فراوانی 77/0 و 23/0 گردید (Palmer et al., 1998). در ایران نیز تنوع ژنتیکی این جایگاه به روش PCR-RFLP در نژادهای قره­گل (Eftekhari Shahroudi et al., 2007)، کردی (Nassiry et al., 2006)، قزل، آرخارمرینو و آمیخته­های قزل × آرخارمرینو (Elyasi-Zaringhabaee et al., 2005)، عرب (Mohamadi et al., 2008) و لری­بختیاری، زل و ماکوئی (Moradi Shahrbabak, 2009) مورد بررسی قرار گرفته است. طی مطالعه­ای که ارتباط چندشکلی جایگاه اگزون و اینترون 1 ژن کالپاستاتین به روش PCR-SSCP با افزایش وزن روزانه از تولد تا از شیرگیری در گوسفند نژاد بلوچی مورد بررسی قرار گرفت، سه ژنوتیپ AA، AB و AC به­ترتیب با فراوانی 7/0، 08/0 و 22/0 مشاهده گردید. در این تحقیق ژنوتیپ AB دارای افزایش وزن روزانه از تولد تا از شیرگیریِ بیشتر نسبت به ژنوتیپ­های AA و AC (05/0>P) بود ( .(Tahmoorespour et al., 2005 بررسی چندشکلی یک قطعه 254 جفت­بازی در برگیرنده تمام اگزون 6 و بخشی از اینترون­های 5 و 6 ژن کالپاستاتین به روش PCR-SSCP روی نژادهای بی­دنبه مرینوس، رامنی، کوریدال، پول دورست و آمیخته­های NZ منجر به شناسایی 9 الگوی SSCP متفاوت حاصل از پنج آلل مختلف گردید که الگوهای 1، 2 و 3 و آلل­های 1 و 2 دارای بیشترین فراوانی بودند ((Zhou et al., 2007. مطالعه ارتباط چندشکلی جایگاه اگزون 6 و اگزون و اینترون  1 (هر دو به روش SSCP) با تردی گوشت و صفات لاشه در 150 رأس گوسفند بومی نیوزلند منجر به مشاهده­ آلل­­های a، b، c و d  در اگزون 6  و آلل­­های A، B، C و D در اگزون و اینترون 1 گردید. یک ارتباط معنی­دار بین آلل­ a در اگزون 6 و آلل­های A و B در اگزون و اینترون 1 با وزن گوشت راسته (05/0Pet al., 2006). هدف از مطالعه حاضر بررسی چندشکلی در جایگاه 254 جفت­بازی شامل بخشی از اینترون­های 5 و 6 و تمام اگزون 6 ژن کالپاستاتین و نیز بررسی ارتباط این جایگاه­ با صفات رشد و شناسایی ژنوتیپ­های مرتبط با صفات مورد مطالعه در گوسفند لری­بختیاری بود.

مواد و روش­ها

نمونه­برداری

در این مطالعه از تعداد 169رأس گوسفند خالص و شجره­دار لری­بختیاری شامل 63 رأس بره نر و 106 رأس بره ماده از ایستگاه­ اصلاح نژاد گوسفند لری­بختیاری (شولی) واقع در شهرستان شهرکرد با استفاده از ونوجکت­های حاوی EDTA از سیاهرگ وداج خون­گیری به عمل آمد. ضمناً اطلاعات مربوط به صفات وزن تولّد و وزن از شیرگیریِ برّه­های خون­گیری شده از این ایستگاه نیز جهت بررسی ارتباط آماری بین ژنوتیپ ژن کالپاستاتین با فنوتیپ و ارزش اصلاحی (BV[2]) صفات رشدِ بره­های لری­بختیاری مورد استفاده قرار گرفت. صفات افزایش وزن روزانه از تولد تا از شیرگیری و نسبت کلیبر[3] نیز به­ترتیب طبق دو فرمول: "سن هنگام از شیرگیری/(وزن تولد - وزن از شیرگیری)" و  "وزن متابولیکی پایان دوره/اضافه وزن روزانه" محاسبه شده و جهت ارتباط با ژن کالپاستاتین مورد استفاده قرار گرفتند. وزن متابولیکی پایان دوره (هنگام از شیرگیری) برابر با ^75/0(وزن پایان دوره) است.

استخراج DNA از 250 میکرولیتر خون کامل به روش بهینه­یافته نمکی انجام گرفت (Miller et al., 1998). کمیت و کیفیت DNA استخراج­شده با استفاده از الکتروفورز در ژل آگارز 1% و نیز روش اسپکتروفتومتری با دستگاه نانودراپ اندازه­گیری شد.

واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)

واکنش زنجیره­ای پلیمراز جهت تکثیر قطعه 254 جفت­بازی شامل تمام اگزون 6 و بخشی از  اینترون­های 5 و 6 ژن کالپاستاتین انجام گرفت. آغازگرهای اختصاصی رفت 5'-GTTATGAATTGCTTTCTACTC-3' و برگشت 5'-ATACGATTGAGAGACTTCAC-3' جهت تکثیر قطعه مورد نظر در ژن کالپاستاتین (Zhou et al., 2007) مورد استفاده قرار گرفتند. برنامه­ دمایی و زمانی ذکر شده در جدول 1 ایده­آل­ترین شرایط برای تکثیر قطعه ژن کالپاستاتین بود. واکنش PCR در حجم نهایی 20 میکرولیتر شامل 50 نانوگرم DNA ژنومی، بافر X1، 5/0 میکرومولار از هر پرایمر، 2/0 میلی­مولار از هر dNTP، 5/2 میلی­مولار MgCl₂، یک واحد آنزیم تک­پلیمراز و آب دیونیزه انجام شد.

تعیین ژنوتیپ محصولات PCR به روش چندشکلی ساختاری رشته­های منفرد (SSCP)

تعیین ژنوتیپ نمونه­ها به روش PCR-SSCP با استفاده از الکتروفورز عمودی روی ژل اکریل­آمید و رنگ­آمیزی با نیترات نقره انجام گرفت. بدین منظور 15 میکرولیتر بافر بارگذاری مخصوص SSCP (شامل 99% فرمامید، 9/0% EDTA 6 مولار، 05/0% برموفنل و 05/0% زینول­سیانید) با 5 میکرولیتر محصول PCR مخلوط و ورتکس شد و سپس در دستگاه ترموسایکلر به مدت 10 دقیقه در دمای 96 درجه­ی سانتی­گراد قرار داده شد تا رشته­های DNA واسرشت شوند. نمونه­های واسرشت­شده به مدت 10 دقیقه روی یخ قرار گرفتند تا از اتصال مجدد رشته­های مکمل جلوگیری شود. پس از آن مخلوط محصول PCR و بافر بارگذاریِ مخصوص SSCP درون چاهک­های ژل اکریل­آمید 12% بارگذاری شدند. سپس الکتروفورز نمونه­ها به مدت 20 ساعت و با اختلاف پتانسیل 300 ولت در دمای 4 درجه سانتیگراد و با بافر (X5/0) TBE  انجام گرفت. در ادامه رنگ­آمیزی ژل جهت مشاهده الگوهای باندی به روش نیترات­نقره انجام گرفت (Bassam et al., 1991).

جدول 1- برنامه­ی دمایی-زمانی مورد استفاده برای تکثیر جایگاه ژن کالپاستاتین.

 Table 1- Temperature-time program used for amplification of CAST gene locus.

آنالیز  آماری

شاخص­های ژنتیک جمعیت شامل فراوانی­های هاپلوتایپی و ژنوتیپی، هتروزیگوسیتی و تعادل هاردی­واینبرگ با استفاده از نرم­افزار  6.41 GenAlex محاسبه شد. هتروزیگوسیتی مورد انتظار با استفاده از فرمول­ 1-∑P_i² محاسبه شد که P_i فراوانی هاپلوتایپ i در جمعیت مورد نظر است.نرمال بودن توزیع باقیمانده­های مربوط به هر صفت در جمعیت مورد بررسی با استفاده از برنامه SAS 9.1 با رویه Univariate و آماره شاپیرو-ویلک^[4]بررسی شد. ارتباط جایگاه ژن کالپاستاتین هم با فنوتیپ و هم با ارزش اصلاحیِ صفات رشد با استفاده از مدل­های 1، 2 و 3 در برنامه SAS 9.1 و با رویه GLM و MIXED مورد بررسی قرار گرفت. رویه GLM برای تجزیه داده­ها به هنگام ارتباط جایگاه­ ژن کالپاستاتین با ارزش اصلاحی صفات رشد و رویه  MIXED برای تجزیه داده­ها به هنگام ارتباط جایگاه­ ژن کالپاستاتین با فنوتیپ که در آن اثر حیوان به عنوان اثری تصادفی در معادله مدل قرار گرفت، استفاده شد. ارزش­های اصلاحیِ برآوردشده از نتایج مطالعه Aali  (2012) اخذ و مورد استفاده قرار گرفت.

ارتباط جایگاه­ ژن کالپاستاتین با فنوتیپ صفات رشد

اثر جایگاه ژن کالپاستاتین، جنس، وضعیت تولد (چندقلو بودن)، ماه تولد و سن مادر هنگام تولد به عنوان عوامل ثابت قابل دسته­بندی و هم­خونی به عنوان متغیر همبسته در معادله مدل بکار رفت. همچنین برای وزن از شیرگیری، سن دام (بر پایه­ی روز) در هنگام از شیرگیری و وزن تولد به عنوان متغیرهای همبسته­ استفاده شدند. اثر حیوان نیز به عنوان عامل تصادفی وارد معادله مدل شد. در نهایت مدل­های 1 و 2 جهت ارتباط چندشکلی­ ژن کالپاستاتین با صفات رشد به صورت زیر بود:

مدل (1): مربوط به وزن تولد، اضافه وزن روزانه و نسبت کلیبر:

y1_{ijklmn =}  + M_i + S_j+ T_k + GC_l +Ad_m+ b₁(I_ijklmn -  ) + Animal_n + e_ijklmn

مدل (2): مربوط به وزن از شیرگیری:

y2_{ijklmn =}  + M_i + S_j+ T_k + GC_l +Ad_m + b₁(I_ijklmn - ) + b₂(Aw_ijklmn -  _W1 ) + b₃(Wb_ijklmn -  _b) + Animal_n + e_ijklmn

y1_ijklmn:  هر یک از مشاهدات مربوط به صفات وزن تولد، اضافه وزن روزانه و نسبت کلیبر،  :y2_ijklmnهر یک از مشاهدات مربوط به صفت وزن از شیرگیری، : میانگین صفت در جمعیت، M_i: اثر i اُمین ماه تولد حیوان (12 و 11i= )، S_j: اثر j اُمین جنس حیوان (2 و 1j=  )، T_k: اثر k اُمین تیپ تولد حیوان (3 و 2 و 1 =k)، GC_l: اثر l اُمین الگوی ژنوتیپی قطعه تکثیر شده از ژن کالپاستاتین (...2 و 1 =l)، Ad_m: اثر  m اُمین سن مادر هنگام تولد بر اساس ماه (107 و 95 و 84 و 72 و 59 و 48 و 36 و 24 و 17 m=)، b₁: ضریب تابعیّت Y روی I ( ضریب هم­خونی)، I_ijklmn: ضریب هم­خونی n اُمین حیوان، : میانگین ضریب هم­خونی حیوانات، b₂: ضریب تابعیّت Y روی A_W (سن حیوان هنگام از شیرگیری)، A_Wijklmn: سن از شیرگیری n اُمین حیوان،_W1: میانگین سن حیوانات هنگام از شیرگیری، b₃: ضریب تابعیّت Y روی Wb (وزن تولد حیوان)، Wb_ijklmn: وزن تولد n اُمین حیوان، b: میانگین وزن تولد حیوانات، Animal_n: اثر تصادفی n اُمین حیوان، :e_ijklmn اثر تصادفی باقیمانده.

ارتباط جایگاه­ ژن کالپاستاتین با ارزش اصلاحی صفات رشد

در ارتباط جایگاه­ مورد مطالعه با ارزش اصلاحی صفات رشد فقط اثر جایگاه ژن کالپاستاتین به عنوان تنها عامل مؤثر بر ارزش اصلاحی صفات وارد مدل شد. مدل 3 جهت ارتباط ژن کالپاستاتین با ارزش اصلاحی صفات مورد استفاده قرار گرفت.                                

  مدل (3):                   + GC_i + e_i BV_i=

BV_i: ارزش اصلاحی هر حیوان، GC_i: اثر i اُمین الگوی ژنوتیپیِ قطعه تکثیر شده، e_i: اثر تصادفی باقیمانده.

پس از آنالیز واریانس ابتدا معنی­داری یا عدم معنی­داریِ اثر مدل بر هر صفت مشخص شد، سپس معنی­داریِ اثر ژن کالپاستاتین بر آن صفت مورد توجه قرار گرفت. درصورت معنی­دار بودن اثر ژن کالپاستاتین بر صفت مربوطه، آزمون مقایسه میانگین حداقل مربعات (Lsmeans) جهت مقایسه بین الگوهای ژنوتیپیِ قطعه تکثیر شده از ژن کالپاستاتین انجام گرفت.

نتایج و بحث

SSCPِ ناحیه تکثیر شده ژن کالپاستاتین

نتایج حاصل از الکتروفورز عمودی محصولات PCR روی ژل اکریل­آمید نشان داد که جایگاه ژن کالپاستاتین در گوسفندان لری­بختیاری دارای چندشکلی بالایی است بطوری ­که در تعداد 169 رأس بره مورد بررسی 10 الگوی باندیِ متفاوت حاصل از 9 هاپلوتایپ مختلف شناسایی شد (شکل 1).

 شکل 1- الگوهای SSCPِ ژن CAST و هاپلوتایپ­های تشکیل­دهنده آن­ها.

Figure 2- SSCP patterns of CAST gene and their constitutive haplotypes.

تعداد زیاد الگوهای باندیِ این جایگاه ژن کالپاستاتین در گوسفندان دنبه­دار بومی ایران (لری­بختیاری) در مطالعه حاضر با نتیجهZhou et al. (2007) که 9 الگوی باندیِ متفاوت حاصل از پنج هاپلوتایپ مختلف را در این جایگاه در گوسفندان بی­دنبه­­ی پنج نژاد مرینوس، رامنی، کوریدال، پول دورست و آمیخته­های NZ گزارش نمودند، مطابقت دارد. هاپلوتایپ­های A و B و ژنوتیپ­های AA، BB و AB  در مطالعه .Zhou et al (2007) روی گوسفندان بی­دنبه بومی نیوزلند نیز مشاهده شدند درحالی که سایر هاپلوتایپ­ها و ژنوتیپ­ها برای اولین بار در مطالعه حاضر در گوسفندان دنبه­دار بومی ایران (گوسفند لری­­بختیاری) شناسایی شدند. نکته جالب توجه در این تحقیق هتروزایگوت بودن اکثر هاپلوتایپ­ها در جمعیت مورد مطالعه بوده بطوری که هشت ژنوتیپ از 10 ژنوتیپ شناسایی­شده هتروزایگوت بودند و در بین 9 هاپلوتایپ شناسایی­شده فقط ژنوتیپ هموزایگوتِ دو هاپلوتایپ A و B مشاهده شد و مهم­تر آن­که هفت هاپلوتایپ، هتروزایگوت با هاپلوتایپ A بودند. در مطالعه .Zhou et al (2007)  ژنوتیپ هموزایگوتِ هر پنج هاپلوتایپِ شناسایی­شده در جمعیت گوسفندان بی­دنبه نیوزلندی مشاهده شد.

فراوانی­های هاپلوتایپی و ژنوتیپی

فراوانی­های هاپلوتایپی و ژنوتیپیِ جایگاه ژن کالپاستاتین در جمعیت گوسفندان لری­بختیاری در جدول 2 ارائه شد. همان­طور که در جدول 2 مشخص است هاپلوتایپ­های A، B و F به­ترتیب با فراوانی 373/0، 272/0 و 163/0 دارای بیشترین فراوانی و هاپلوتایپ­های H و D  به­ترتیب با فراوانی 006/0 و 012/0 دارای کمترین فراوانی بودند. اگرچه فراوانی ژنوتیپ هموزایگوت هاپلوتایپ A کم بود ولی این هاپلوتایپ به دلیل این­که در همه ژنوتیپ­های هتروزایگوت به­جز یک ژنوتیپ ظهور پیدا کرده بیشترین فراوانی را در جمعیت گوسفندان لری­بختیاری به خود اختصاص داده است. فراوانی بالای دو هاپلوتایپ A و B در مطالعه حاضر در گوسفندان دنبه­دار بومی ایران (گوسفند لری­بختیاری) با نتیجه مطالعه .Zhou et al (2007) روی گوسفندان بی­دنبه بومی نیوزلند مطابقت دارد بطوری­ که در آن مطالعه هاپلوتایپ­های A و B به­ترتیب با فراوانی 35/0 و 47/0 دارای بیشترین فراوانی بودند. البته در جمعیت گوسفندان لری­بختیاری هاپلوتایپ A با فراوانی بیشتری نسبت به هاپلوتایپ B ظاهر شد درحالی­ که در جمعیت گوسفندان مرینوس، رامنی، کوریدال، پول دورست و آمیخته­های NZ برعکس بود. نکته جالب توجه فراوانی بالای هاپلوتایپ F به عنوان هاپلوتایپی جدید است که برای اولین­ بار در مطالعه حاضر در جمعیت گوسفندان دنبه­دار لری­بختیاری شناسایی شد (جدول 2). همان­طور که در جدول 2 مشاهده می­شود ژنوتیپ­های AF، BB و AC به­ترتیب با فراوانی 325/0، 195/0 و 166/0 دارای بیشترین فراوانی و ژنوتیپ­های AH، AD و AA به­ترتیب با فراوانی 012/0، 024/0 و 029/0 دارای کمترین فراوانی بودند. نتایج مطالعه حاضر با نتیجه مطالعه .Zhou et al (2007) که بیشترین فراوانی مربوط به ژنوتیپ­های BB و AA بود مغایرت دارد، در مطالعه حاضر ژنوتیپ AA جزء ژنوتیپ­های دارای فراوانی کم به حساب می­آید و بیشترین فراوانی مربوط به ژنوتیپ AF است که ژنوتیپی جدید بوده و برای اولین بار در گوسفندان بومی ایران شناسایی شده است. این تفاوت­ها می­تواند ناشی از تفاوت نژاد مورد مطالعه و تعداد دام مورد بررسی باشد. تفاوت در نحوه متابولیسم چربی نیز می­تواند منشأ تفاوت در ژنوتیپ­های ظاهرشده و فراوانیِ آن­ها باشد، گوسفند لری­بختیاری نژادی دنبه­دار درحالی­که گوسفندان مرینوس، رامنی، کوریدال و پول دورست نژادهایی بی­دنبه هستند. همچنین شرایط آب و هواییِ متفاوت می­تواند به عنوان ابزار مهم انتخاب طبیعی سبب ظهور هاپلوتایپ­های خاص در هر جمعیت­ شود یا این­که باعث شود هاپلوتایپ­ها با فراوانی متفاوتی در جمعیت­های مختلف ظاهر شوند. گوسفندان لری­بختیاری در شرایط آب و هوای سرد و خشکِ استان چهار محال و بختیاری درحالی ­که گوسفندان بی­دنبه بومی نیوزلند در شرایط معتدل و مرطوب این کشور پرورش داده می­شوند. 

جدول 2- فراوانی­های هاپلوتایپی و ژنوتیپی جایگاه ژن کالپاستاتین در جمعیت گوسفندان لری­بختیاری.

Table 2- Haplotype and genotype frequencies of CAST gene locus in Lori-Bakhtiari sheep population.

تعادل هاردی­واینبرگ و هتروزیگوسیتی

نتایج بدست­آمده نشان می­دهد که جمعیت مورد مطالعه برای گوسفند لری­بختیاری در جایگاه ژن کالپاستاتین در تعادل هاردی­واینبرگ قرار ندارد (جدول 3). با توجه به این­که تعداد کل ژنوتیپ­های ممکن 45 ژنوتیپ است و ارائه تعداد مشاهده­شده و مورد انتظار برای همه ژنوتیپ­ها حجم زیادی را به خود اختصاص می­داد از آوردن این مقادیر چشم­پوشی شد و فقط مقدار ²χ  و  درجه آزادی در جدول 3 ذکر شد.

ایستگاه اصلاح نژاد گوسفند لری­بختیاری (شولی) به عنوان یکی از بهترین و موفق­ترین ایستگاه­های اصلاح نژادی گوسفندان بومی ایران علاوه بر هدف حفظ ذخایر ژنتیکی کشور تلاش زیادی در جهت اصلاح نژاد گوسفند لری­بختیاری برای صفات عملکردی و اقتصادی از جمله صفات رشد انجام داده است. یکی از مهم­ترین پیامدهای انتخاب (به عنوان ابزار اصلی متخصصین اصلاح نژاد) بر هم خوردن تعادل هاردی­واینبرگ در جایگاه­های ژنیِ مؤثر بر صفاتی است که انتخاب برای آن­ها انجام گرفته است. بنابراین انتظار می­رود ژن کالپاستاتین از جمله ژن­هایی باشد که مورد هدف انتخاب قرار گرفته و یکی از نتایج آن بر هم خوردن تعادل هاردی­واینبرگ در جایگاه این ژن است.

جدول 3- هتروزیگوسیتی در جایگاه ژن کالپاستاتین و نتایج آزمون کای مربع در جمعیت گوسفندان لری­بختیاری.

Table 3- Heterozygosity in CAST gene locus and the results of chi-squared test in Lori-Bakhtiari sheep population. 

     ^***:اختلاف معنی­دار در سطح احتمال کمتر از 001/0

همان­طور که در جدول 3 مشاهده می­شود جمعیت گوسفند لری­بختیاری مورد مطالعه در تحقیق حاضر در جایگاه 254 جفت­بازی واقع در اگزون 6 و اینترون­های 5 و 6 ژن کالپاستاتین دارای سطح هتروزیگوسیتی مشاهده­شده و مورد انتظار بالایی است (به­ترتیب 775/0 و 75/0). مطالعاتی که روی چندشکلی جایگاه 622 جفت­بازی واقع در اگزون و اینترون 1 ژن کالپاستاتین در گوسفندان بومی ایران انجام شده است حاکی از سطح هتروزیگوسیتی پایین­تر این جایگاه نسبت به جایگاه اگزون 6 و اینترون­های 5 و 6 ژن کالپاستاتین مورد مطالعه در تحقیق حاضر است به این ترتیب که مقدار هتروزیگوسیتی برای جایگاه اگزون و اینترون 1 ژن کالپاستاتین در گوسفند نژاد بلوچی 48/0 (Tahmoorespour et al., 2005)، در گوسفند نژاد مغانی 49/0 (Torabi et al., 2008) و در گوسفند نژاد قزل 49/0 (Mahdavi et al., 2008) گزارش شده است. بنابراین می­توان اظهار کرد که جایگاه اگزون 6 و اینترون­های 5 و 6 ژن کالپاستاتین دارای تنوع ژنتیکی بالایی در جمعیت گوسفندان تحت اصلاح و انتخاب ایستگاه اصلاح نژاد گوسفند لری­بختیاری (شولی) است. اگرچه انتظار می­رود در جمعیتی که در آن، طی نسل­های متوالی انتخاب انجام گرفته است تنوع ژنتیکی کاهش یابد ولی همان­طور که می­دانیم در اصلاح نژاد علاوه بر انتخاب ابزار مهم دیگری به نام آمیخته­گری وجود دارد که می­تواند اثرات منفیِ کاهش تنوع ژنتیکیِ ناشی از اِعمال انتخاب در گله را جبران کند. در واقع با بکارگیری روش­های صحیح، اصولی و برنامه­ریزی­شده مبتنی بر علم اصلاح نژاد برای سیستم آمیزشی گله، می­توان ضمن انتخاب نه تنها تنوع ژنتیکی را در گله حفظ کرد بلکه باعث افزایش آن نیز شد. به عنوان مثال استفاده از تعداد بیشتری قوچ برای آمیزش با حیوانات ماده­ گله در ایستگاه اصلاح نژاد لری­بختیاری می­تواند یکی از دلایل کاهش خویشاوندی و افزایش تنوع باشد. وجود تنوع ژنتیکی بالا در یک گله برای اصلاح نژاد بسیار مطلوب است زیرا تنوع، ماده اولیه انتخاب جهت اصلاح نژاد محسوب شده و در گله دست اصلاح­گران را برای انتخاب باز می­کند.

اثر ژن کالپاستاتین بر فنوتیپ و ارزش اصلاحی صفات رشد

آماره شاپیرو-ویلک نشان داد که هر چهار صفت مورد بررسی در جمعیت گوسفندان لری­بختیاری دارای توزیع نرمال هستند. مقایسات میانگین حداقل مربعات در جمعیت لری­بختیاری نشان داد که اثر جایگاه ژن کالپاستاتین بر وزن تولد، وزن ­از شیرگیری و افزایش وزن روزانه از تولد تا ­از شیرگیری معنی­دار (05/0P

 تفاوت معنی­داری بین میانگین حداقل مربعاتِ وزن تولدِ گوسفندان دارای ژنوتیپ­ AC با گوسفندان دارای ژنوتیپ­های BB، BE و AJ و نیز بین گوسفندان دارای ژنوتیپ­ AB با گوسفندان دارای ژنوتیپ BE وجود داشت (05/0PPP

نکته جالب توجه این­است که گوسفندان دارای ژنوتیپ AJ که بعد از ژنوتیپ BE کمترین وزن تولد را داشتند دارای بیشترین افزایش وزن روزانه و وزن ­از شیرگیری بودند (جدول 4). این مسئله می­تواند به­ دلیل وراثت­پذیری پایین وزن تولد نسبت به وزن از شیرگیری (Duguma et al, 2002; Hanford et al, 2006; Matika et al, 2003 ) و به طور کلی روند صعودی وراثت­پذیری وزن بدن با افزایش سن (Moradian et al, 2007) باشد. وراثت­پذیری پایین وزن تولد می­تواند بدلیل تنوع زیاد اثرات مادری روی جنین باشد. رشد و تکامل جنین تحت تأثیر عوامل ژنتیکی و محیطی از قبیل محیط رحم، جفت، تغذیه جنین بوسیله مادر و غیره قرار دارد. بنابراین عوامل محیطی مؤثر در رشد مادر مخصوصاً کمیت و کیفیت مواد خوراکی و ذخیره غذایی مادر و نیز شماره زایش (زایش اول، دوم و ...) می­تواند رشد جنین را تحت تأثیر  قرار دهد. روند صعودی وراثت­پذیری مستقیم صفات رشد می­تواند به دلیل افزایش بروز تأثیر ژن­هایی با منشأ ژنتیکی افزایشی مستقیم بر رشد دام و کاهش اثرات مادری باشد (Mohammadi & Sadeghi, 2010).

جدول 4- مقایسه میانگین حداقل مربعات (SE±) اثر ژنوتیپ­های مختلف ژن کالپاستاتین بر فنوتیپ و ارزش اصلاحی(BV) صفات رشد در جمعیت لری­بختیاری.

Table 4- Least Square Mean Comparison (±SE) of the CAST gene effect on phenotype      and breeding value of growth traits in Lori-Bakhtiari sheep population.

 ^ns و ^*: به­ ترتیب اثر غیر معنی­دار و معنی­دار ژن بر صفت در سطح احتمال پنج درصد       BV: ارزش اصلاحی

v      میانگین­های دارای حروف مشابه با یکدیگر اختلاف معنی­دار ندارند.

در بررسی ارتباط چندشکلی جایگاه اگزون 6 و اینترون­های 5 و 6 ژن کالپاستاتینِ گوسفندی با صفات وزن تولد و افزایش وزن روزانه، اثر جایگاه ژن کالپاستاتین بر وزن تولد گوسفندان بومی نیوزلند معنی­دار شد که با نتایج مطالعه حاضر مطابقت دارد. تفاوت معنی­داری بین ژنوتیپ_­­های A و  C برای وزن تولد مشاهده شد ((Byun et al., 2008. ارتباط چندشکلی ژن کالپاستاتین در اگزون­های 24-28 به روش RFLP با صفات رشد در 359 رأس گوسفند نژاد پُلی­پِی، تارقی و آمیخته­های این دو نژاد، مورد بررسی قرار گرفت. اثر این جایگاه ژن کالپاستاتین بر صفات وزن تولد (007/0PPPet al., 1999 در حالی ­که در مطالعه دیگر روی 84 رأس گوسفند کردی شیروان نتایج متفاوتی به دست آمد به این ترتیب که ژنوتیپ ab منجر به افزایش وزن روزانه بیشتر نسبت به دو ژنوتیپaa  و ac (05/0Pet al., 2006).

نتایج تجزیه واریانس هیچ­گونه تفاوت معنی­داری بین میانگین حداقل مربعات ژنوتیپ­های جایگاه ژن کالپاستاتین برای ارزش اصلاحیِ صفات رشد نشان نداد (جدول 4). سؤال این است که چرا اثر ژن کالپاستاتین بر فنوتیپ صفت در جمعیت معنی­دار است ولی بر ارزش اصلاحی همان صفت در همان جمعیت معنی­دار نیست؟ دلایلی که می­توان برای توجیه این مسئله ذکر کرد این است که اولاً ممکن است دقت ارزش­های اصلاحیِ برآوردشده (EBV[5]) به دلایلی همچون تعداد کم رکوردهای مورد استفاده (6539 رکورد) و یا ناقص بودن اطلاعات شجره پایین باشد. در این­صورت اگر دقت برآوردها خیلی پایین باشد تفاوت زیادی بین مقادیر برآوردشده و واقعیِ ارزش­های اصلاحی وجود خواهد داشت (Bourdon, 1999).  بنابراین وقتی ارتباط ژن کاندیدا با ارزش­های اصلاحیِ برآوردشده برقرار می­شود نتایج کاملاً متفاوتی نسبت به برقراری این ارتباط با ارزش­های اصلاحیِ واقعی به­دست خواهد آمد. دلیل دیگری که می­توان ذکر کرد این­است که فنوتیپ یک صفت تحت تأثیر ژنتیک حیوان و محیط قرار دارد که بخش ژنتیکی آن شامل مجموع دو اثر ژنتیکی افزایشی یا همان ارزش اصلاحی و اثر ترکیبی ژنی شامل اثرات غالبیت و اپیستاتیک می­باشد. صفاتی مانند صفات رشد، کمّی و پلی­ژن هستند و بنابراین منظور از اثر ژنتیکی افزایشی بر روی این­گونه صفات مجموع اثرات ژنتیکی افزایشی کل جایگاه­های ژنی مؤثر بر صفت مورد مطالعه از جمله جایگاه ژن کالپاستاتین به عنوان ژن کاندیدای مؤثر بر صفات رشد است. در مورد اثر ترکیب ژنی بر روی این صفات نیز می­توان چنین تفسیری داشت (Bourdon, 1999). به هنگام ارتباط ژن کالپاستاتین با فنوتیپ یک صفت در واقع کل اثر ژنتیکی این ژن (اثر ژنتیکی افزایشی و اثر ترکیبی ژنی) روی صفت مربوطه مورد بررسی قرار می­گیرد. از این­رو می­توان گفت مجموع دو اثر ژنتیکی افزایشی و اثر ترکیبی ژنی باعث شده که ژن کالپاستاتین اثر معنی­داری روی فنوتیپ صفت داشته باشد درحالی که به هنگام ارتباط ژن کالپاستاتین با ارزش اصلاحی صفت، تنها اثر این ژن، که مرتبط با ارزش اصلاحی صفت است، اثر ژنتیکی افزایشی این ژن می­باشد. ممکن است سهم ژنتیک افزایشی در بروز فنوتیپی صفت بیشتر از اثر ترکیبی ژن باشد و بالعکس و شاید هم اثر مساوی روی فنوتیپ صفت داشته باشند. حال این که در مطالعه حاضر اثر ژن کالپاستاتین روی فنوتیپ صفت معنی­دارشده ولی بر ارزش اصلاحی آن معنی­دار نشده می­تواند بدلیل سهم بیشتر اثر ترکیبی ژن کالپاستاتین نسبت به اثر ژنتیکی افزایشی آن در بروز فنوتیپی صفات رشد باشد. تفاوت اجزای مدل نیز می­تواند دلیل دیگری برای نتایج متفاوت ارتباط ژن کالپاستاتین با فنوتیپ و BVِ صفات رشد باشد. 

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که جایگاه اگزون 6 و اینترون­های 5 و 6 ژن کالپاستاتین بین نژاد دنبه­دار بومی ایران (گوسفند لری­بختیاری) و نژادهای بی­دنبه بومی نیوزلند، دارای تعدادی چندشکلی­ با فراونی متفاوت است. همچنین نتایج نشان داد که این جایگاه ژن کالپاستاتین دارای تنوع ژنتیکیِ بالایی در جمعیت گوسفند لری­بختیاری است بطوری ­که چندین ژنوتیپ با تفاوت فنوتیپی معنی­دار در جمعیت شناسایی شد. همچنین نتایج  مطالعه حاضر نشان داد که ژنوتیپ­های AJ، AB و AC در جایگاه ژن کالپاستاتین ژنوتیپ­های مطلوب برای صفات رشد قبل از شیرگیری و از طرفی ژنوتیپ BE ژنوتیپی نامطلوب برای این صفات هستند. به­نظر می­رسد در صورت تعیین توالی این ناحیه ژنی و شناسایی SNP­های احتمالی در پژوهش­های بعدی و نیز انجام مطالعات ارتباطی روی تعداد بیشتری حیوان، می­توان آلل­ها و ژنوتیپ­های مطلوبِ این ناحیه ژنی را برای صفات رشد با دقت بسیار زیادی تعیین و در انتخاب به کمک نشانگر (MAS) استفاده نمود.

تشکر و قدردانی  

این مقاله مستخرج­ از پروژه پژوهشی مصوب در قطب علمی بهبود کمی و کیفی لاشه گوسفند دانشگاه تهران می­باشد و حمایت مالی آن نیز از محل اعتبارات قطب انجام گرفته است. لذا، بدین­وسیله از ریاست محترم قطب علمی بهبود کمی و کیفی لاشه گوسفند دانشگاه تهران تشکر و قدردانی می­گردد. عملیات آزمایشگاهیِ پروژه در آزمایشگاه بیوتکنولوژیِ گروه علوم دامی پردیس کشاورزیِ و منابع طبیعی دانشگاه تهران انجام شده لذا مراتب تقدیر و تشکر را از مسئولین مربوطه داریم. همچنین از مساعدت و همکاری­های مدیریت محترم ایستگاه اصلاح نژاد گوسفند لری­بختیاری (شولی) در تهیه نمونه­های این تحقیق، ریاست محترم مرکز تحقیقات کشاورزی شهرستان شهرکرد جهت اسکان در این شهرستان و استفاده از امکانات آزمایشگاهی، گروه علوم دامی دانشگاه شهرکرد جهت استفاده از امکانات آزمایشگاهی و نیز ریاست محترم مرکز اصلاح نژاد کل کشور در ارائه فایل اطلاعات و شجره گوسفندان ایستگاه اصلاح نژاد لری­بختیاری صمیمانه تشکر و قدردانی می­شود.