مقایسه بیان ژن PNOC و NPYدر جوجه خروس­های گوشتی سویه راس تغذیه شده با عصاره گیا ه خرفه

رضا وکیلی¹*، سونیا زکی زاده²

¹ استادیار گروه علوم دامی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کاشمر

² استادیار گروه علوم دامی مجتمع آموزش عالی جهادکشاورز ی خراسان رضوی

تاریخ دریافت: 08/03/1391، تاریخ پذیرش: 16/11/1391

چکیده

این آزمایش به منظور بررسی میزان بیان ژن prepronociceptin (PNOC), neuropeptide Y(NPY) در جوجه­های تغذیه شده با عصاره گیاهی  خرفه انجام شد، تعداد250 قطعه جوجه نر یک روزه سویه راس 308 به صورت تصادفی به 5 تیمار غذایی هر کدام با 5 تکرار اختصاص یافتند. هر تکرار شامل تعداد 10 قطعه جوجه بود و  اثرسطوح مختلف عصاره خرفه در قالب تیمارهای مختلف بر بیان ژن های مؤثر بر اشتهای جوجه­های گوشتی طی یک دوره 42 روزه بررسی شد. تیمارهای غذایی شامل 5 تیمار شاهد (جیره پایه بدون عصاره خرفه)، جیره پایه همراه 50،100،150 و 200 میلی گرم عصاره گیاه خرفه بودند. برای تعیین میزان بیان ژن­های  PNOC و NPYاز روش لیواک استفاده شد. در پایان 42 روز 2 پرنده از هر تکرار به طور تصادفی انخاب و کشتار شده و بافت ساقه مغز آنها برای تعیین اثر تیمارها بر میزان بیان ژن­های PNOC  و NPY استفاده شد. بیان ژنNPY    در تیمارهای  حاوی خرفه نسبت به شاهد از نظر آماری تفاوت معنی­داری نداشت، اگرچه در تیمار حاوی 200 میلی گرم خرفه بیشتر بود. بیان ژنPNOC  در تیمار حاوی 200 میلی گرم خرفه بیشتر از شاهد بود ((p>0.01، در حالیکه سایر تیمارهای  حاوی خرفه نسبت به شاهد  تفاوت معنی­داری نداشتند. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد  که استفاده از 200 میلی گرم عصاره خرفه  سبب افزایش  معنی­دار بیان ژن PNOC  و افزایش غیر معنی­دار بیان ژن NPY گردید، لذا می­توان عصاره خرفه را در افزایش بیان ژن­های نوروپپتیدهای افزاینده اشتها  موثر دانست.

کلمات کلیدی: عصاره دانه خرفه،  Prepronociceptin (PNOC)،  Neuropeptide Y(NPY)،جوجه گوشتی،  بیان ژن.

مقدمه

تحقیقات انجام گرفته در مورد سازوکار های کنترل اشتهای پرندگان  از سه دهه قبل آغاز شده است. ولی هنوز موارد بسیاری در این زمینه ناشناخته باقی مانده است. هیپوتالاموس نقش مهمی را در دریافت و پردازش سیگنال­های مربوط به اشتها برعهده دارد و از دو گروه نورونی تشکیل شده است . یکی از این گروه­ها اشتها را کم می کند.گروه دیگر دریافت غذا را از طریق تنظیم بیان ژن نوروپپتید وایNPY) ) و پپتید مرتبط با ژن آگوتی (AgRP) تحریک می­کند.NPY یکی از فراوان­ترین میانجی­‏های مغز است. میزان NPY در هیپوتالاموس تابعی از وضعیت تغذیه­ای بدن است، به طوری که در طی گرسنگی میزان آن افزایش و پس از تغذیه کاهش می‏­یابد. مهمترین بخش هیپوتالاموس که در آن NPY بیان می‏­گردد، هسته­ی کمانی استBungo et al., 2011) ). نورون­‏های حاوی NPY در هسته­ی کمانی به هسته­ی مجاور بطنی (PVN) کشیده می‏­شوند و تزریق مکرر درون بطن مغزی[1] (ICV) NPY به درونPVN پرخوری و چاقی ایجاد می‏­کند. تزریق مرکزی NPY مصرف انرژی را نیز کاهش می‏­دهد که منجر به کاهش میزان چربی قهوه­ای، تضعیف فعالیت سمپاتیک و مهار محور هیپوتالاموس ـ هیپوفیزقدامی ـ تیروئید می‏­گردد(Kelley et al., 2002 Kiris et al., 2007,). ماده Nociceptin/orphanin FQ (N/OFQ) یک اوپیوئید مرتبط باهپتا دکاپپتید بوده و آگونیست گیرنده­های ORL1 است (آگونیست ماده ای است که به رسپتور متصل و تحریک فیزیولوژیک آن را باعث می­شود). مطالعات اخیر نشان داده است که تزریق داخل بطن مغزی این ماده سبب افزایش اشتها می­گردد (Pawel et al., 2010). PNOC مولکول پیش سازی است که ساختار مشابه Nociceptin/OrphaninFQ دارد (1996 (Mollereau et al.,.

داده­های مقدار بیان ژن معمولا توسط سطوح بیان ژن کنترل که اصطلاحا ژن خانگی نامیده می­شود، نرمال می­گردند. گلسیرآلدئید تری فسفات دهیدروژناز یکی از رایج­ترین ژن­های خانگی است که برای مقایسه داده­های بیان ژن کاربرد فراوانی دارد. در انسان مشخص شده است که سن و جنس تاثیری روی مقدار بیان mRNA بافت­ها ندارند و می­توان از مقایسه سطوح بیان شده این ژن برای داده­های بیان ژن به عنوان کنترل داخلی استفاده نمود (Barber et al., 2005).

نتایج مطالعات دیگری نشان داده است که عصاره اتانولی درصد ساقه و برگ خرفه با اثر بر سیستم اعصاب مرکزی و محیطی موجب افزایش اشتها، فعالیت ضد تشنجی، مهار انقباضات عصبی – عضلانی به دنبال تحریک الکتریکی فعالیت شل کنندگی عضلانی و فعالیت ضد دردی می­شود که فعالیت ضد دردی عصاره به وسیله نالوکسان کاهش می­یابد که احتمال دارد بر اثر ضددردی خرفه از طریق گیرنده اوپیوئیدی باشد (Radhakrishnan et al., 2001). با توجه به اینکه تحریک گیرنده­های اوپیوئیدی موجود در دستگاه عصبی مرکزی سبب افزایش اشتها می­گردد، لذا به نظر می­رسد اثرات ضد دردی و افزاینده اشتها عصاره دانه خرفه از طریق تداخل با گیرنده های اوپیوئیدی باشد. هدف تحقیق حاضر اثر سطوح مختلف عصاره خرفه بر بیان ژن­های مذکور و رابطه آن با اشتهای جوجه­های گوشتی بود.  

مواد و روش ها

جامعه مورد مطالعه

تعداد 250 قطعه جوجه نر گوشتی یکروزه سویه تجاری راس 308 به 25 گروه 10 قطعه­ای با میانگین وزن گروهی مشابه تقسیم شدند. هر 5 گروه به طور تصادفی تحت یک تیمار قرار داشتند. . تیمارهای غذایی شامل 5 تیمار شاهد (جیره پایه بدون عصاره خرفه)، جیره پایه همراه 50،100،150 و 200 میلی گرم عصاره گیاه خرفه بودند. تیمارهای غذا شامل نسبت های مختلف گیاه خرفه، به مدت 42 روز اعمال گردید.

روش نمونه گیری

پس از کشتار جوجه­ها در 42 روزگی، از تکرارهای هر تیمار دو جوجه که  میانگین هر تکرار بودند، انتخاب (جمعا 50 جوجه) و پس از جدا نمودن سر، ساقه مغز به کمک تیغ  بیستوری جدا شد. نمونه های بافت ساقه مغز از هر دو جوجه، گرفته شد و با محلول PBS 10% شستشو و به تانک ازت مایع منتقل شد. نمونه بافت­ها تا زمان استخراجRNA  در دمای 80 – نگهداری شدند.

استخراج RNA و سنتز cDNA

برای استخراج RNA ابتدا نمونه­های هر تکرار به طور جداگانه هموژن گردید. بدین منظور مقداری از بافت مورد نظر را خرد کرده در هاون ریخته و با کمک نیتروژن مایع پودر یکنواختی از آن تهیه شد RNA با استفاده از کیت  RNeasy Mini Kit  (Qiagen، آلمان) طبق دستور العمل شرکت سازنده استخراج و کمیت و کیفیت آن توسط دستگاه اسپکتوفتومتر نانودراپ ND-2000 تعیین شد و عمل تیمار  RNA استحراجی با DNase و ساخت cDNA با استفاده از کیت فرمنتاز لیتوانی انجام شد ساخت cDNA تک رشته ای با استفاده از 1 میکروگرم از RNA کل تیمار شده با DNase ، اغازگرهای هگزامر و آنزیم ترانس کریپتاز معکوس Revertaid H Minus M-Mulvi در حجم 20میکرولیتر طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد.

طراحی آغازگر­های اختصاصی ژن­های  GAPDH,prepronociceptin ,neuropeptide Y(NPY) ابتدا ژنوتیپ­ها و توالی­های مربوط به ژن­های GAPDH, prepronociceptin (PNOC), neuropeptide Y(NPY) بطور جداگانه از بانک اطلاعات ژنی (NCBI) جمع آوری شدند و با استفاده از نرم­افزار primer premier-5 نسبت به طراحی آغازگرهای اختصاصی اقدام شد. سپس با استفاده از ابزار Blast از یکتا بودن محل اتصال جفت آغازگرها اطمینان حاصل شد. سنتز آغازگرها توسط شرکت  Bioneer کشور کره جنوبی انجام شد. از ژن گلیسرآلدئید-تری فسفات-دهیدروژناز یا GAPDH به عنوان ژن مرجع و مقایسه شاخص بیان سایر ژن­ها با آن استفاده گردید (Huggett et al., 2005; Tricarico et al., 2002).

جدول 1- مشخصات آغازگرهای مورد استفاده در واکنش­های Real-Time PCR.

 Table 1- Properties of primers used in Real-Time PCR.

pcr کیفی

بعد از استخراج RNA از بافت کبد PCR کیفی انجام شد. واکنش PCR در حضور یک مخلوط اصلی شامل بافر X10 آغازگرهای اختصاصی با غلظت5/1 میکرومولار، dNTP وMgCl₂ و آنریم Taq طبق برنامه زیر برای سه  ژن GAPDH, prepronociceptin (PNOC), neuropeptide Y(NPY)  و شش آغازگر انجام گرفت. رژیم حرارتی واکنش PCR در مرحله واسرشته سازی یک چرخه 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه بود که در ادامه برای 40 سبکل از حرارت مرحله واسرشته سازی 95 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگرها 60 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و بسط آغازگرها در 72 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه استفاده گردید. مرحله بسط نهایی آغازگرها دارای یک چرخه 72  درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه بود.

PCR  کمی نسبی (Relative Quantitative PCR) ‏

واکنش Real time -PCR کمی بر روی نمونه ها با 3 بار تکرار  با استفاده از کیت Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)  شرک فرمنتاز کشور لیتوانی و با استفاده از دستگاه (ABI (Applied Biosystems 7300  آمریکا ( Malinen et al., 2003; Vandesompele et al., 2002 )  با شرایط زیرانجام گرفت. مخلوط واکنش (25 ماکرولیتر) شامل 5/12 میکرو لیتر SYBR Green Master Mix ، 6/0 میکرومول از آغازگرهای رفت و برگشت، 500 نانوگرم از cDNA الگو بود. برنامه حرارتی زیر برای هر 3 ژن GAPDH, prepronociceptin (PNOC), neuropeptide Y(NPY)  به طور یکسان استفاده شد.

بهینه کردن واکنش  Real time PCRکمی نسبی

جهت آغاز بکار دستگاه از برنامه حرارتی شبیه برنامه RT-PCR کیفی که در بالا توضیح داده شد،   استفاده گردید و مقدار مواد واکنش به علت نداشتن الگوی قبلی از مقادیر استاندارد گفته شده در کیت فرمنتاز استفاده شد. اجزای واکنش استاندارد کیت بصورت زیر بهینه­سازی گردید. اجزای واکنش شامل Mastermix، سایبر گرین5/12 میکرولیتر، ،آغازگر رفت.15/0 میکرولیتر، آغازگر برگشت 15/0 میکرولیتر (10پیکومول)، نمونه cDNA  2 میکرولیتر (100 نانوگرم برمیکرولیتر) و آب دوبار تقطیر شده 2/10 میکرولیتر در حجم کل 25 میکرولیتر.می باشد.

آنالیز کمی داده­ها و بیان ­ژن­ها

در پایان انجام واکنش PCR، نرم افزار دستگاه به طور اتوماتیک خط آستانه را ترسیم نمود. تحلیل و تجزیه اطلاعات با استفاده از نرم افراز ABI 7300 sequence Detection system و نرم افزارBiosystems) SDS Ver. 1.4  Applied آمریکا) انجام شد. پردازش داده­ها با نرم افزار Excel  انجام گرفت. برای تعیین میزان بیان ژن­های NPY، PNOC و GAPDH از روش لیواک استفاده شد. در این روش فرض بر این است که بازده نمونه و کنترل داخلی برابر و 100 درصد است و از فرمول  مفدار هدف استفاده شد در این روش فرض بر این است که بازده نمونه و کنترل داخلی برابر و 100 درصد است  (Livak  et al., 1995; Livak  & Schmittgen.,2001; Gentle et al.,2001; Yuan et al., 2006 ).

جدول 2- سیکل های حرارتی واکنش PCR.

Table 2- PCR Cycles.

مقدارهدف     

R = 2^{- [rCTنمونه - rCTکنترل]}

rCT_هدف  = (CT_نمونه - CT _مرجع)

rCT_کنترل = (CT_کنترل - CT _مرجع)

rrCT = rCT_هدف - rCT_کنترل

تجزیه آماری rrCT  نمونه­های تیمار شده و شاهد با برنامه Excle آنالیز انجام گرفت. معنی­داری تفاوت بین rrCT نمونه­ها توسط آزمون t-استیودنت در سطح 01/0α=  آزمون شد.

نتایج و بحث

 تعیین کمیت و کیفیت RNA های استخراج شده

با اندازه­گیری مقدار جذب نور فرابنفش در سه طول موج 260، 280 و 230 نانومتر، توسط دستگاه نانودراپ مشخص شد که کمیت و کیفیت RNA استخراج شده خلوص بالا و مطلوب داشته و عاری از آلودگی­های پروتئین، بقایای فنلی و الکلی بود (شکل 1).

بهینه­سازی واکنشReal-Time PCR

- دمای مناسب اتصال پرایمر در واکنش و بهینه سازی غلظت آغازگرها

یکی از راه­های کاهش میزان پرایمر دایمر بهینه نمودن اتصال و غلظت آغازگرها می­باشد. لذا پس از بررسی­های صورت گرفته، بهترین دمای اتصال آغازگر 60 درجه سانتیگراد و مناسب­ترین غلظت آغازگر 15/0 میکرولیتر به دست آمد.

رسم منحنی ذوب

همانطور که در شکل 2 دیده می­شود پیک اضافی کوچکتر از پیک محصولات که نشانگر وجود پرایمر دایمر می­باشد وجود ندارد و این نشانگر این موضوع است که آغازگر­ها تقابلی با هم ندارند منحنی ذوب مناسب دارای ویژگی­هایی نظیر کشیده و نوک تیز بودن می باشد و همچنین منحنی ذوب تکرارهای یک نمونه کاملا بر روی هم قرار می­گیرند که در تصویر زیر این ویژگی­ها به خوبی مشاهده می­شود (Wang&Brown,2001;Gibson, et al., 1996).

واکنش  Real time PCRکمی نسبی

بعد از بهینه­سازی دمای اتصال آغازگرها و بهینه­سازی غلظت آغازگرها و سایر اجزاء واکنش نسبت به تکثیر قطعات اختصاصی ژن­های GAPDH, PNOC , NPY  اقدام شد. همان طور که در شکل 3 دیده می‌شود محل تلاقی خط آستانه و منحنی های تکثیر نشان دهنده چرخه آستانه (ct) می­باشد (Heid et al., 1996; Glulietti et al., 2001; Wong& Medrano, 2005)

نتایج  بیان ژن PNOC

سطح بیان ژن PNOC  در تیمار حاوی 200 میلی گرم خرفه بیشتر از سایر تیمارهای  حاوی نسبت­های مختلف گیاه بود (P<0.01) و باعث افزایش اشتها در  جوجه های گوشتی شد (شکل 4). تزریق درون بطنی مغزی Nociceptin/OrphaninFQ به عنوان لیگاند آندوژن گیرنده‌های شبه گیرنده‌های اپیوئیدی، مانند اپیوئیدهای کلاسیک، موجب افزایش اخذ غذا در جوجه‌های گوشتی می­گردد (Abbasnejad, et al., 2005).

شکل 4- نتایج بیان ژن  PNOC به صورت نسبی.

Figure 4- Relative gene expression of PNOC.

نتایج بیان ژنNPY

بررسی بیان ژن NPY در تیمارهای  حاوی خرفه نسبت به شاهد  تفاوت معنی­داری نداشت و در تیمار  حاوی 200 میلی گرم خرفه بیشتر بود اگرچه از نظر آماری معنی­دار نبود (شکل 5). اگرچه به نظر می‏­رسد که NPY یک سیگنال مهم افزایش دهنده­ی اشتها است، اما احتمالاً در صورت فقدان این سیستم به علت وجود مکانیسم­‏های جبرانی و یا دیگر مسیرهای افزایش دهنده اشتها مانند سیگنال­‏های پپتید مرتبط با آگوتی AgRP ، وزن بدن و میزان چاقی دستخوش تغییر چندانی نمی‏­شود. گیرنده­‏های Y₄ , Y₂ , Y₁ و Y₅ نوروپپتید Y  همگی در هیپوتالاموس وجود دارند و اثرات تغذیه­ای NPY را وساطت می‏­کنند (Wayne et al., 2005). مشخص شده AgRP   آنتاگونیست اندوژن  رسپتورهای ملانوکورتین-3 (MC3) و ملانوکورتین-4 (MC4) است و تزریق مرکزی AgRP دریافت غذا را به طور چشمگیری افزایش می­دهد (آنتاگونیست رسپتور را مهار می­کند). همچنین NPY یک عامل ارکسیژنیک (افزاینده اشتها) قوی است، اگرچه اثراتش کمتر از AgRP باقی می­ماند. NPY احتمالا غذا خوردن را از طریق رسپتورهای Y1 و Y5 تحریک می­کند (Kelley et al., 2002 Kiris et al., 2007;).

.

شکل 5- نتایج بیان ژن NPY به طور نسبی.

Figure 5- Relative gene expression of NPY.

نتیجه گیری

درتحقیق حاضر بیان ژن prepronociceptin در تیمار حاوی 200 میلی گرم خرفه بیشتر بود که نشان می­دهد عصاره خرفه می­تواند باعث افزایش اشتها در جوجه­های گوشتی شود. همچنین  بیان ژن NPY  در تیمارهای حاوی خرفه نسبت به شاهد تفاوت معنی­داری نداشت، اگرچه در تیمار حاوی200 میلی گرم خرفه بیان ژن بیشتر بود. مطالعات زیادی در مورد  اثر NPY بر اشتها انجام شده است. افزایش نوروپپتید (NPY) Y در  هسته کمانی (Actuate nucleus) هیپوتالاموس سبب پرخوری حیوان می­شود. یک منبع مهمNPY   در مغز هسته کمانی  می­باشد. به نظر می­رسد که این نوروترانمسمیتر اثرات افزاینده اشتهای خود را با اثر بر ناحیه هسته کمانی در هیپوتلاموس اعمال نموده است. بنابراین عصاره خرفه  را می توان موثر بر بیان ژن های نوروپپتید های افزاینده اشتها و در نتیجه افزایش دریافت خوراک دانست.