شناسایی نشانگرهای AFLP مرتبط با صفات تحمل به تنش غرقابی در جو

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

چکیده

با توجه به اهمیت پژوهش­های مرتبط با تنش­های غیرزیستی، پژوهش حاضر در راستای شناسایی نشانگرهای مولکولی که ارتباط معنی­داری با صفات مرتبط با تحمل به تنش غرقابی در جو دارند، انجام گرفت. این بررسی با استفاده از نشانگرهای AFLP و 40 ژنوتیپ جو صورت پذیرفت. به طور کلی 22 متغیر شامل هشت صفت در هر دو شرایط نرمال و تنش غرقابی از جمله وزن خشک اندام هوایی، طول، حجم، وزن تر، وزن خشک، سطح، قطر و چگالی سطح ریشه به همراه شش شاخص تحمل به تنش (SSI، STI، GMP، TOL، YI و YSI) ارزیابی شد. هفت ترکیب آغازگری EcoRI و MseI در کل تعداد 245 نوار تولید نمودند که از این تعداد، 227 نوار چندشکل بودند و  به طور متوسط 37/92 درصد چندشکلی داشتند. سه ترکیب E90-M160، E100-M160 و E90-M150 نسبت به سایر ترکیبات مقادیر بالاتری از شاخص­های تنوع ژنتیکی را به خود اختصاص دادند و در تمایز ژنوتیپ­ها مؤثرتر بودند. تجزیه ارتباط با استفاده از ماتریس ساختار جمعیت و با مدل­های آماری GLM و MLM ، با استفاده از نرم­افزار TASSEL برای 22 متغیر انجام شد. مدل MLM در سطح احتمال پنج درصد، 87 نشانگر را مرتبط با صفات ارزیابی شده شناسایی نمود. مطابق نتایج تجزیه ارتباط در شرایط نرمال بالاترین ضریب تبیین به نشانگر E100-M160-27 با توجیه 32 درصد از تغییرات قطر ریشه و برای شاخص­های تحمل و تحت تنش غرقابی به ترتیب به نشانگر E80-M150-1 با 24 درصد توجیه تغییرات شاخص GMP و نشانگر E100-M150-22 با تبیین 24 درصد از تغییرات فنوتیپی وزن خشک اندام هوایی اختصاص داشت.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Identification of AFLP markers related to tolerance to flooding stress in barley

نویسندگان [English]

  • Raviyeh Heydari
  • Atefeh Sabouri
  • Hossein Sabouri
  • Hossein Ali Fallahi
  • Ahmad Reza Dadras
چکیده [English]

According to the importance of studies of abiotic stress, present study was done in order to identify of molecular markers with significant association to flooding stress tolerance in barley. This study carried out using of AFLP markers and 40 barley genotypes. Generally 22 variables in both normal and flooded, eight characters including shoot dry weight, length, volume, wet weight, dry weight, leaf area, root diameter and density tolerance was assessed with six indicators (SSI, STI, GMP, TOL, YI and YSI). Seven primer combinations of EcoRI and MseI a total of 245 bands were produced, of which, 227 bands were polymorphic and had an average of 92.37 percent polymorphism. Three combinations E90-M160, E100-M160 and E90-M150 had higher values of genetic variation compared to other combinations and were more effective in distinguish of genotypes. Association analysis was performed using structure matrix and statistical models of GLM and MLM by using of TASSEL software for 22 variables. The MLM model in 5 percent probability level identified 87 markers related to evaluated traits. According to the results of association analysis in normal condition the highest of coefficient of determination was for E100M16027 with explanation of 32 percent of root diameter variation and for tolerance indices and stress condition the highest coefficient of determination were for E80M1501 and E100M15022 with 24 percent explanation of variation of GMP index and shoot dry weight respectively.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Assosiation analysis
  • Population structure
  • Flooding stress
  • AFLP markers

شناسایی نشانگرهای AFLP مرتبط با صفات تحمل به تنش غرقابی در جو

راویه حیدری1، عاطفه صبوری*1، حسین صبوری2، حسین علی فلاحی3، احمدرضا دادرس4

 

1 به ترتیب دانشجوی کارشناسی ارشد و استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه گیلان.

2 دانشیار گروه تولیدات گیاهی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه گنبدکاووس.

3 عضو هئیت علمی مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی گلستان.

4 دانشجوی دکتری اصلاح نباتات گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه گیلان.

 

تاریخ دریافت: 20/01/1392، تاریخ پذیرش: 30/03/1392

چکیده

با توجه به اهمیت پژوهش­های مرتبط با تنش­های غیرزیستی، پژوهش حاضر در راستای شناسایی نشانگرهای مولکولی که ارتباط معنی­داری با صفات مرتبط با تحمل به تنش غرقابی در جو دارند، انجام گرفت. این بررسی با استفاده از نشانگرهای AFLP و 40 ژنوتیپ جو صورت پذیرفت. به طور کلی 22 متغیر شامل هشت صفت در هر دو شرایط نرمال و تنش غرقابی از جمله وزن خشک اندام هوایی، طول، حجم، وزن تر، وزن خشک، سطح، قطر و چگالی سطح ریشه به همراه شش شاخص تحمل به تنش (SSI، STI، GMP، TOL، YI و YSI) ارزیابی شد. هفت ترکیب آغازگری EcoRI و MseI در کل تعداد 245 نوار تولید نمودند که از این تعداد، 227 نوار چندشکل بودند و  به طور متوسط 37/92 درصد چندشکلی داشتند. سه ترکیب E90-M160، E100-M160 و E90-M150 نسبت به سایر ترکیبات مقادیر بالاتری از شاخص­های تنوع ژنتیکی را به خود اختصاص دادند و در تمایز ژنوتیپ­ها مؤثرتر بودند. تجزیه ارتباط با استفاده از ماتریس ساختار جمعیت و با مدل­های آماری GLM و MLM ، با استفاده از نرم­افزار TASSEL برای 22 متغیر انجام شد. مدل MLM در سطح احتمال پنج درصد، 87 نشانگر را مرتبط با صفات ارزیابی شده شناسایی نمود. مطابق نتایج تجزیه ارتباط در شرایط نرمال بالاترین ضریب تبیین به نشانگر E100-M160-27 با توجیه 32 درصد از تغییرات قطر ریشه و برای شاخص­های تحمل و تحت تنش غرقابی به ترتیب به نشانگر E80-M150-1 با 24 درصد توجیه تغییرات شاخص GMP و نشانگر E100-M150-22 با تبیین 24 درصد از تغییرات فنوتیپی وزن خشک اندام هوایی اختصاص داشت.

واژه­های کلیدی: تجزیه ارتباط، ساختار جمعیت، تنش غرقابی، نشانگرهای AFLP.



مقدمه

جو (Hordeum vulgare L.) بعد از گندم، برنج و ذرت جزء مهم­ترین غلات در تأمین غذای مردم جهان می­باشد. بیشترین اهمیت گیاه جو به خاطر توانایی رشد و تولید آن در محیط­های خشک، دمای پایین و شور می­باشد (Baum et al., 2003). از سوی دیگر جو به عنوان یک گیاه مدل در پژوهش­های ژنتیکی و فیزیولوژیکی محسوب می­شود که این قابلیت آن به خصوصیاتی از جمله داشتن تنوع ژنتیکی و مورفو-فیزیولوژیکی بالا، در دسترس بودن نقشه ژنتیکی قابل استناد، یکساله بودن، چرخه زندگی کوتاه و قابلیت تلاقی با گونه­های درون خزانه­های ژنی اولیه بر می­گردد (Tomas, 2002). جو (Hordeum vulgare L.) به­عنوان چهارمین غله مهم دنیا علی­رغم تحمل نسبتاً مطلوب به تنش خشکی و شوری، نسبت به تنش غرقابی به ویژه در استا­ن­های مستعد بارندگی، مقاومت چندانی نداشته و مورد خسارت جدی قرار می­گیرد (Emam, 2007). با توجه به اینکه مشکل تنش غرقابی، تقریباً یک میلیون هکتار از اراضی زیر کشت ایران را تهدید می­کند (Ghobadi et al., 2006) لذا مطالعه در زمینه به­نژادی تنش غرقابی در جو از جایگاه ویژه­ای برخوردار است. عامل اصلی تنش برای گیاه در خاک­های غرقاب، کمبود اکسیژن است (Brisson et al., 2002; Malekahmadi et al., 2005 ). کاهش اکسیژن قابل دسترس در شرایط غرقابی باعث کاهش توسعه ریشه و بخش هوایی گیاه می­گردد (Brisson et al., 2002). بنابراین مطالعه بر روی خصوصیات ریشه می­تواند در شناسایی ارقام مقاوم­تر جو و همچنین جایگاه­های کنترل کننده صفات درگیر در تحمل ارقام جو به تنش غرقابی بسیار کارا باشد. شناسایی جایگاه­های کنترل کننده صفات کمی پس از توسعه فناوری نشانگرهای مولکولی DNA، در بسیاری از گیاهان تاکنون توانسته اطلاعات ژنتیکی بسیار ارزشمندی در ارتباط با عوامل دخیل در کنترل صفات پیچیده در اختیار محققین قرار دهد (Gomez et al., 2011). اما در بسیاری از این مطالعات، QTLهای شناسایی شده فاصله ژنتیکی زیادی با نشانگرهای هم­جوار خود داشته­اند که این موضوع به عوامل زیادی از جمله اشباع نبودن نقشه پیوستگی و تفرق پایین افراد در جمعیت­های مصنوعی مورد مطالعه بر می­گردد و در نتیجه این امر برنامه­های ژنتیکی و اصلاحی بعدی همانند انتخاب به کمک نشانگر یا همسانه­سازی ژن بر اساس نقشه را دچار مشکل می­کند (Breseghello and Sorells, 2006). از سوی دیگر در مطالعات مبتنی بر تجزیه پیوستگی، اغلب از جمعیت­های مصنوعی حاصل از تلاقی دو والد هموزیگوت استفاده می­شود و نوترکیبی در چرخه­های میوزی طی فرآیند تولید جمعیت­های در حال تفرق مانند F2، هاپلوﺋید­های مضاعف، تلاقی برگشتی و لاین­های اینبرد نوترکیب، درجه ارتباط یک QTL معین و نشانگرهای دور از آن کاهش می­یابد و بنابراین، با توجه به وجود فقط یک چرخه میوزی در تولید جمعیت­هایی مانند F2، هاپلوﺋید­های مضاعف، تلاقی برگشتی، احتمال خطای نوع اول در آن­ها در شناسایی مکان­های کنترل کننده صفات بالا خواهد رفت. هر چند که در جمعیت لاین­های اینبرد نوترکیب وجود چرخه­ میوزی کافی، میزان عدم تعادل بین مکان­هایی با پیوستگی ضعیف و خطای نوع اول را کاهش می­دهد ولی میزان کاهش، به اندازه تلاقی تصادفی نیست. همچنین برای تولید چنین جمعیت­هایی نیاز به زمان طولانی در مقایسه F2، هاپلوﺋید­های مضاعف و تلاقی برگشتی است. از طرفی دیگر، تولید جمعیت­های مصنوعی به علت عدم امکان انجام تلاقی لازم در تعدادی از گونه­ها مثل انسان و یا گیاهان دگرگشن مثل درختان عملی نیست یا بسیار مشکل است (Gupta et al., 2005). برای غلبه بر این محدودیت­ها در سال­های اخیر روش مکان­یابی ارتباط یا تجزیه ارتباط معرفی شده است که نه تنها امکان مکان­یابی دقیق ژن­ها و مکان­های کنترل­کننده صفات کمی را فراهم می­کند، بلکه امکان شناسایی نواحی کروموزومی دیگری که در مطالعات مبتنی بر پیوستگی امکان­پذیر نیستند را نیز میسر می سازد. در این روش نیازی به تهیه جمعیت در حال تفرق که نیاز به زمان زیادی دارد نمی­باشد، ولی بهتر است از داده­های فنوتیپی چندساله استفاده شود (Breseghello and Sorells, 2006). در علوم گیاهی این روش همچنان رو به گسترش است. در این ارتباط می­توان به مطالعاتی بر روی جو در شرایط شور و یخ زدگی اشاره نمود. دستاورد این پژوهش­ها شناسایی 175 و 177 آلل نشانگر Bmag749 از مجموع نشانگرهای SSR استفاده شده در این پژوهش و دارای ارتباط معنی­دار آماری با صفت عملکرد دانه در شرایط شور و شاهد (Eleuch et al., 2008) و همچنین ردیابی 62 آلل از 38 جفت نشانگر ریزماهواره پیوسته به 12 صفت مرتبط با یخ زدگی از جمله درصد آب طوقه، LT50، وزن تر و خشک گیاهچه و میزان اتلاف آب نسبی (Gangkhanlou et al., 2012) بود. علاوه بر این می­توان به پژوهشی بر روی 55 ژنوتیپ گندم با استفاده از 20 جفت آغازگر ریزماهواره، دو جفت آغازگر SAMPL و 8 جفت ترکیب آغازگر AFLP که جمعا 519 نشانگر چندشکل تولید کرده بودند، اشاره نمود که منجر به شناسایی 131 آلل ریزماهواره، 43 نشانگر SAMPL و 166 نشانگر AFLP شد که دارای ارتباط معنی دار با 14 صفت زراعی بودند (Roy et al., 2006). نظر به اهمیت تحقیقات ژنتیکی در ارتباط با تنش غرقابی در جو پژوهش حاضر با هدف بررسی تنوع ژنتیکی 40 ژنوتیپ­ جو با استفاده از نشانگرهای AFLP و تجزیه ارتباط آنها به منظور شناسایی نشانگرهای پیوسته به صفات مرتبط با تنش غرقابی طراحی شد و به انجام رسید.

 

مواد و روش­ها

مواد گیاهی پژوهش حاضر شامل 40 ژنوتیپ جو بود که از مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان گلستان تهیه شد. در جدول 1 نام یا شجره آنها آورده شده است.

 

 

جدول 1- نام و شجره ژنوتیپ­های جو مورد مطالعه در پژوهش حاضر.

Table 1- Name and pedigree of barley genotypes in this study.

نام یا شجره

Name or pedigree

شماره  ژنوتیپ

Number Genotype

نام یا شجره

Name or pedigree

شماره  ژنوتیپ

Number Genotype

EB-86-6

21

Youssef

1

EB-86-4

22

Izeh

2

EB-86-3

23

N B 17

3

EB-85-5

24

N B 5

4

EB-87-20

25

L4 Shori

5

EB-88-1

26

Nimroz

6

EB-88-3

27

Kavir

7

EB-88-4

28

Prodogtive

8

EB-88-5

29

Bahman

9

EB-88-7

30

36 Motadel

10

EB-88-10

31

31 Motadel

11

EB-88-14

32

28 Garm

12

EB-88-16

33

24 Garm

13

EB-88-19

34

21 Garm

14

Bomi

35

EC-84-10

15

Rihane

36

45 Motadel

16

Arass

37

EC-82-11

17

Goharjow

38

EC-81-13

18

Karoon

39

MB-82-12

19

EB-88-2

40

EB-86-14

20

 

 

این آزمایش به صورت اسپلیت پلات در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی با دو عامل ژنوتیپ و تنش غرقابی (صفر، 10، 20 روز) با سه تکرار (هر تکرار شامل 3 گلدان و هر گلدان شامل سه گیاه بود) در دانشکده کشاورزی دانشگاه گیلان با عرض جغرافیایی 37 درجه و 16 دقیقه شمالی و طول جغرافیایی 51 درجه و 3 دقیقه ی شرقی از نصف النهار گرینویچ به صورت گلدانی اجرا شد. به منظور اعمال تیمارهای غرقابی، حوضچه­هایی به ابعاد 90 در 250 سانتی­متر با استفاده از دیوارهای بلوکی به ارتفاع 25 سانتی­متر و پوشش پلاستیکی ضخیم ایجاد شد و در زمان اعمال تنش یعنی زمانی­که 90 درصد گیاهان به مرحله سه برگی رسیدند، حوضچه­ها به میزانی­که سطح خاک گلدان­ها در حالت غرقاب قرار گیرد، از آب اشباع گردید. پس از به پایان رسیدن مدت تنش، صفات مربوط به ریشه  شامل طول ریشه اصلی [1](TL)، حجم ریشه [2](RV)؛ وزن تر ریشه [3](RFW) و وزن خشک ریشه [4](RDW) (پس از قرار دادن ریشه­ها به مدت 48 ساعت در آون با دمای 70 درجه سانتی­گراد) اندازه­گیری شد. به علاوه سطح ریشه [5](RA) (Alizadeh, 2006) و قطر ریشه [6](RD) (Schenk and Barber, 1979)و چگالی سطح ریشه [7](RSD) (Hajabbasi, 2001) با استفاده از روابط زیر محاسبه شدند:

5/0(حجم ریشه×π×طول ریشه)2=سطح ریشه

5/0((طول ریشه× π) / وزن تر ریشه×4)= قطر ریشه

(طول ریشه× قطر ریشه× π) = چگالی سطح ریشه

 

استخراج DNA و انجام AFLP

پس از اندازه­گیری صفات ، نمونه­های برگی از گیاهان در شرایط نرمال به منظور استخراج DNA تهیه شد. استخراج DNA به روش CTAB (Saghai Maroof et al., 1994) انجام شد و کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز 1 درصد و به همراه فاژ لامبدا تعیین شد.

روش AFLP مطابق روش وس و همکاران (Vos et al., 1995) با استفاده از آنزیم­های محدودگر EcoRI و MseI انجام شد. در مرحله پیش تکثیر، نمونه­ها با آغازگرهای EcoRI و MseI دارای یک نوکلئوتید انتخابی در انتهای '3 تکثیر یافتند و محصولات پس از رقیق­سازی به نسبت 5:1 با هفت ترکیب آغازگری (جدول 2) دارای 2 نوکلئوتید انتخابی دیگر در انتهای '3، تحت چرخه حرارتی Touch down شامل سه مرحله دمایی مختلف تکثیر شدند. فراورده­های PCR با استفاده از الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید شش درصد تفکیک و به روش نیترات نقره رنگ آمیزی شدند. در نهایت هم امتیازدهی نوارها به صورت صفر و یک به ترتیب برای عدم حضور و حضور نوارها انجام گرفت.

 

تجزیه­های آماری

بعد از امتیازدهی نوارها، آماره­های تنوع ژنتیکی شامل محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) با استفاده از رابطه

 

که در آن PICi، PIC نشانگر i­ام، fi فراوانی قطعه نشانگر i­ام هنگام وجود و (1-fi) فراوانی قطعه نشانگر i­ام در حالت عدم وجود نوار است (Roldain-Ruiz et al., 2000)، با استفاده از نرم افزار Excel و سایر آماره­ها مانند تعداد آلل­های موثر، شاخص تنوع ژنتیکی نی و شاخص شانون (Shannon and Weaver, 1963) با استفاده از نرم افزار PopGene (Yeh et al., 1997)  محاسبه گردیدند.


 

 

جدول2- ترکیبات آغازگری مورد استفاده در تجزیه AFLP.

Table2- Primer combination used for AFLP analysis.

آغازگرهای MseI

MseI Primer

 

آغازگرهای EcoRI

EcoRI Primer

 

توالی DNA

Sequencing DNA

نام

Name

توالی DNA

Sequencing DNA

نام

Name

GATGAGTCCTGAGTAAAGA

M150

GACTGCGTACCAATTCAAG

E060

GATGAGTCCTGAGTAAAGT

M160

GACTGCGTACCAATTCAAT

E070

 

 

GACTGCGTACCAATTCACG

E080

 

 

GACTGCGTACCAATTCACT

E090

 

 

GACTGCGTACCAATTCAGT

E100

 

 

GACTGCGTACCAATTCATC

E110

 

 

 

برای انجام تجزیه ساختار و تفکیک کل جمعیت به زیر جمعیت­های متمایز از لحاظ ساختار ژنتیکی از نرم افزار2.3.4  STRUCTURE (Pritchard et al., 2000) استفاده شد و ماتریس صفر و یک حاصل از نشانگرهای AFLP وارد نرم­افزار شد. از آنجائی­که در مورد ساختار جمعیت اطلاعات قبلی در دست نبود تعداد بهینه K با شبیه­سازی محاسبه گردید. K تعداد زیر جمعیت­های مورد مطالعه در جمعیت مورد نظر با استفاده از نرم افزار STRUCTURE می­باشد. در حقیقت تعیین تعداد زیر جمعیت­های ساختار ژنتیکی برای انجام تجزیه­های آماری مهم مثل تجزیه ارتباط برای تعیین نشانگرهای معنی­دار واقعی مرتبط با صفات اهمیت زیادی دارد. برای این منظور برای جمعیت مورد استفاده تعداد K از 2 تا 10 درنظر گرفته شد و برای محاسبه تعداد زیرجمعیت (K) از روش (Evanno et al., 2005) استفاده شد. بدین صورت که از دو ستون خلاصه شده K و LnP(D) برای محاسبات استفاده گردید و برای هرK، میانگین L(K) و انحراف معیار (Stdev) تکرارها محاسبه گردید. بعد از آن تفاضل میانگین تکرارها برای گروه­های مجاور به صورت گروه بالاتر منهای گروه پایین­تر و به­نام L'(K) تعیین و سپس تفاضل L'(K) برای گروه­های مجاور و به­نام L''(K) محاسبه گردید که در نهایت از این محاسبات K∆ تعیین شد. در صورتی که نمودار دو طرفه K و K∆ رسم گردد، نقطه اوج منحنی همان تعداد بهینه K خواهد بود. جدول 5 آماره­های محاسبه شده برای تعیین مقدار K برای ژنوتیپ­های جو را نشان می­دهد و شکل 1 نمودار دو طرفه برای تعیین بهینه K را نشان می­دهد. در این شکل مقدارK  و ∆K از نتایج مربوط به شبیه سازی در نرم­افزار STRUCTURE استخراج گردید. مقدار بهینه K نقطه اوج منحنی است که با توجه به نمودار، بهترین K در این مطالعه 3 می­باشد. در واقع تجزیه ساختار نشان داد که تعداد خوشه­هایی که پارامتر K∆ را به حداکثر خود می­رساند برابر 3 می­باشد. انتساب افراد به زیرجمیت­ها نیز مطابق روش  (Spataro   et al. 2011) انجام شد و برای هر فرد در هر گروه درصد عضویت محاسبه شد. مطابق این روش یک ژنوتیپ هنگامی می­تواند به انتساب یک گروه درآید که درصد عضویت آن 7/0 یا بیشتر از آن باشد و در صورتی که درصد عضویت کمتر از 69/0 باشد به عنوان ژنوتیپ مخلوط در نظر گرفته می­شود. در بررسی حاضر پس از تعیین تعداد K، ماتریس دودمان افراد یا Q بر اساس آن تشکیل گردید و برای انجام تجزیه ارتباط وارد نرم­افزار TASSEL 4.1.32 (Bradbury et al., 2007) گردید. تجزیه ارتباط با نرم­افزار TASSEL با استفاده از سه مدل (جدول 3) انجام گرفت.

این نرم­افزار امکان انجام تمام آزمون­های مرتبط با مدل­ها و رویه­هایی مانند [8]GLM و MLM[9] را فراهم می­کند. رویه­  GLMرویه­ای است که بدون دخالت ساختار جمعیت، ارتباط بین نشانگر و صفات اندازه­گیری شده را به ما می­دهد نمی­تواند خیلی مورد اعتماد باشد و کمتر مورد استفاده قرار می­گیرد. اخیراً بیشتر از رویه MLM برای درک ارتباط بین نشانگر و صفت استفاده می­شود چون در پیدا کردن ارتباط، هم ماتریس­های ساختار جمعیت و هم خویشاوندی بین افراد را دخالت می­دهد و اثرات ناشی از این عوامل را کم می­کند و ارتباطات معنی­دار شناسایی شده بین نشانگر و صفت از اطمینان و اعتبار بیشتری برخوردارند (Agrama et al., 2007).

 

نتایج و بحث

آماره­های تنوع ژنتیکی برای ترکیبات آغازگری بکاررفته در جدول 4 آورده شده است. نشانگرهای AFLP در کل تعداد 245 نوار تولید نمودند که از این تعداد، 227 نوار چندشکل بودند. متوسط درصد چندشکلی ترکیبات آغاگری 37/92 درصد بود. با توجه به درصد بالای چندشکلی بدست آمده در پژوهش حاضر می­توان انتظار داشت این نشانگرها بتوانند به عنوان یک ابزار قدرتمند در شناسایی و تفکیک ژنوتیپ­های جو عمل نمایند. Zhang et al., (2006) اظهار داشتند که دسترسی به نرخ بالایی از چند­شکلی، ارزیابی کارا و سودمندی را در بررسی­های مربوط به تنوع ژنتیکی به دست می­دهد. بنابراین می­توان از  نشانگر AFLP به عنوان یک ابزار قدرتمند در برنامه­های اصلاحی گیاهان زراعی بمانند جو استفاده نمود.


 

 

جدول 3-  سه مدل آماری استفاده شده برای انجام تجزیه ارتباط نشانگرهای AFLP و صفات فنوتیپی.

Table 3: The three used statistical models for doing of association analysis of AFLP markers and phenotypic traits.

مدل

Model

مجموعه داده مورد استفاده

Used data set

1: GLMa

Phenotype + AFLP

2: GLM

Phenotype + AFLP + Qb

5: MLMc

Phenotype + AFLP + Kd + Q

 

a: GLM: General linear model= مدل خطی عمومی،

b: Q: Population structure data or Inferred ancestry of individuals داده­های ساختار جمعیت یا اصل و نسب استنباط شده ازافراد،

c: MLM: Mixed linear model= مدل خطی مخلوط،

d: K: Kinship data derived from general similarity in genetic background arising from shared kinship  داده­های خویشاوندی حاصل از مشابهت کلی افراد از لحاظ زمینه ژنتیکی ناشی از خویشاوندی

 

 

از معیارهای دیگر برای ارزیابی کارایی نشانگر در تعیین چندشکلی، شاخص شانون است که مقدار آن برای ترکیبات E90-M150،E90-M160  و E100-M160 به ترتیب 56/0، 59/0 و 59/0 بدست آمد که با نتایج PIC هم­خوانی داشت. تعداد آلل­های مؤثر در بین نشانگرهای مطالعه شده متفاوت بود. میانگین تعداد آلل­های مؤثر در کل 58/1 بدست آمد و از 35/1 تا 74/1 متغیر بود. بیشترین تعداد آلل موثر برای ترکیبات E90-M160 و E100-M160 شناسایی شد. یکی از مهم­ترین شاخص­ها برای ارزیابی تنوع ژنتیکی در بین کل ژنوتیپ­ها، شاخص ژنتیکی نی است. برآورد شاخص نی نشان داد میزان تنوع از 25/0 تا 40/0 متغیر است و ترکیبات آغازگری E90-M160 و E100-M160 به ترتیب بیشترین میزان تنوع نی را دارا بودند. ترکیب E80-M160 کمترین میزان تنوع نی را در بین کلیه ترکیبات نشان داد. میانگین تنوع نی نیز 35/0 برآورد گردید. بررسی کلی آماره­های تنوع ژنتیکی نشان داد که از بین هفت ترکیب آغازگری AFLP، سه ترکیب E90-M160، E100-M160 و E90-M150 نسبت به سایر ترکیبات AFLP مقادیر بالاتری را به خود اختصاص دادند و در حقیقت می­توان اذعان داشت در تمایز ژنوتیپ­ها نقش بارزتری ایفا نمودند.


 


جدول4- آماره­­های تنوع ژنتیکی برای 7 ترکیب آغازگری AFLP.

Table 4- Statistical of genetic diversity for 7 primer combination in this study.

شاخص شانون

Shannon index

ضریب تنوع نی

Nei gene diversity

تعداد آلل های موثر

Effective Allel Number

محتوای اطلاعات چندشکلی

PIC

درصد چندشکلی (%)

Poly. Percentag

کل نوارها

Total. Bands

نوارهای چند­شکل

Poly. Bands

ترکیب آغازگری

Primer combination

0.52

0.34

1.56

0.29

93.33

30

28

E80-M150

0.56

0.38

1.68

0.42

95

40

38

E90-M150

0.50

0.33

1.56

0.31

91.42

35

32

E100-M150

0.53

0.33

1 58

0.41

84.37

32

27

E110-M150

0.42

0.25

1.35

0.30

87.87

33

29

E80-M160

0.59

0.40

1.74

0.40

97.36

38

37

E90-M160

0.59

0.40

1.71

0.42

97.29

37

36

E100-M160

3.71

2.45

11.08

2.55

646.46

245

227

کل

0.53

0.35

1.58

0.36

92.37

35

32.42

میانگین

 


تجزیه ساختار ژنتیکی

تجزیه ساختار جمعیت با استفاده از نرم افزار STRUCTURE، امکان شکستن کل جمعیت به زیر­جمعیت­هایی با ساختارهای متفاوت محتمل را فراهم می­سازد. زیرجمعیت­های تشکیل شده از لحاظ ژنتیکی متمایز از هم می­باشند و چنانچه ژنوتیپ­هایی به صورت اختلاط­یافته باشند، پس از انجام این تجزیه قابل تشخیص خواهند بود (Dadras, 2012). بر طبق نتایج نرم­افزار  STRUCTURE،K  و K∆ که بترتیب تعداد زیرگروه­ها و میزان تغییرات آنها با توجه به شبیه سازی های انجام شده در نرم­افزار می­باشد، استخراج و نمودار دو بعدی آن رسم شد. شکل 1 نمودار دو طرفه برای تعیین بهینه K را نشان می­دهد که با توجه به نمودار بهترین K در این مطالعه که در واقع نقطه اوج منحنی است، 3 می­باشد. در واقع تجزیه ساختار نشان داد که تعداد خوشه­هایی که پارامتر K∆ را به حداکثر خود می­رساند برابر 3 می­باشد. جدول 6 درصد عضویت 40 ژنوتیپ جو را نشان می­دهد. براین اساس 13 ژنوتیپ شامل 4، 5، 8، 6، 7، 9، 10، 11، 12، 13، 14، 15 و 16 منتسب به گروه 1 شدند و تعداد 17 ژنوتیپ شامل 1، 2، 35، 36، 17، 19، 23، 25، 26، 27، 28، 29، 30، 31، 32، 33 و 34 به عضویت گروه 2 و 4 ژنوتیپ 37، 38، 39 و 40 به عضویت گروه 3 درآمدند. 6 ژنوتیپ 3، 18، 20، 21، 22 و 24 هم جزو ژنوتیپ­های مخلوط بودند. بدین معنی که چون درصد عضویت کمتراز 69/0 داشتند بنابراین نتوانستند به هیچ کدام از گروه­ها منتسب گردند. بار پلات ساختار جمعیت مستخرج از STRUCTURE در شکل 2 آورده شده است.

 

 

جدول5- آماره­های محاسبه شده برای مقدار بهینه K با استفاده از نرم افزار STRUCTURE.

Table 5- statistics calculated for optimum K using the software STRUCTURE.

K

L(K)a

Stdev

L'(K)b

L''(K)c

∆ Kd

1

-4790.5

12.34

-

-

0

2

-4475.07

73.91

315.42

-1.6

0.02

3

-4161.24

46.19

313.82

-202.9

4.39

4

-4050.31

120.44

110.92

-8.4

0.06

5

-3947.79

113.28

102.52

-90.75

0.80

6

-3936.01

87.74

11.77

28.4

0.32

7

-3895.84

53.60

40.17

-92.57

1.72

8

-3948.24

151.51

-52.4

-137.25

0.90

9

-4137.9

466.65

-189.65

417.74

0.89

10

-3909.81

73.21

228.08

-228.08

3.11

 a میانگین LnP(D) تکرارها برای هر K،   ، c   و d 

 

 

 

شکل1- نمودار دو طرفه برای تعیین تعداد بهینه K.

Figure 1- Bilateral chart to determine the optimal number K.

 

 

 

شکل 2- بار پلات ساختار جمعیت مستخرج از STRUCTURE و 227 نشانگر AFLP که در سه بخش رنگی تقسیم شده است. نام ژنوتیپ­ها با شماره آنها در جدول 1 آورده شده است.

Fig 2: Bar plot of population structure as inferred by STRUCTURE and 227 AFLP markers data set, partitioned into K coloured segments (K=3). The genotypes names with their numbers exist in the table 1.

 

جدول 6- درصد عضویت ژنوتیپ­ها براساس نتایج مستخرج از نرم افزار STRUCTURE.

Table6- Member percentage of genotype taken based on the results of STRUCTURE software.

درصد عضویت گروه 3

Member percentage of group 3

درصد عضویت گروه 2

Member percentage of group 2

درصد عضویت گروه 1

Member percentage of group 1

ژنوتیپ

Genotype

شماره

Number

درصد عضویت گروه 3

Member percentage of group 3

درصد عضویت گروه 2

Member percentage of group 2

درصد عضویت گروه 1

Member percentage of group 1

ژنوتیپ

Genotype

شماره

Number

0.001

0.632

0.367

EB-86-6

21

0.143

0.854

0.003

Youssef

1

0.029

0.478

0.494

EB-86-4

22

0.002

0.992

0.005

Izeh

2

0

0.902

0.098

EB-86-3

23

0.004

0.511

0.485

N B 17

3

0.001

0.507

0.492

EB-85-5

24

0.213

0.007

0.78

N B 5

4

0.02

0.972

0.008

EB-87-20

25

0.001

0.043

0.954

L4 Shori

5

0

0.996

0.003

EB-88-1

26

0.001

0.001

0.998

Nimroz

6

0.001

0.995

0.004

EB-88-3

27

0.156

0.041

0.803

Kavir

7

0

0.821

0.179

EB-88-4

28

0.001

0.031

0.968

Prodogtive

8

0.008

0.937

0.059

EB-88-5

29

0.001

0.001

0.998

Bahman

9

0.018

0.942

0.04

EB-88-7

30

0.012

0.001

0.987

36 Motadel

10

0.022

0.968

0.01

EB-88-10

31

0.003

0

0.996

31 Motadel

11

0.023

0.96

0.018

EB-88-14

32

0.001

0.001

0.997

28 Garm

12

0.012

0.983

0.006

EB-88-16

33

0.007

0.008

0.985

24 Garm

13

0.003

0.994

0.003

EB-88-19

34

0.002

0.005

0.993

21 Garm

14

0.2

0.789

0.012

Bomi

35

0.001

0.018

0.981

EC-84-10

15

0.001

0.999

0.001

Rihane

36

0

0.152

0.847

45 Motadel

16

0.827

0.171

0.001

Arass

37

0.009

0.986

0.005

EC-82-11

17

0.995

0

0.004

Goharjow

38

0.007

0.671

0.322

EC-81-13

18

0.999

0.001

0

Karoon

39

0.004

0.832

0.164

MB-82-12

19

0.72

0.297

0

EB-88-2

40

0.002

0.523

0.475

EB-86-14

20

 

 

در مطالعه­ای که بر روی 225 توده جو (شامل 175 توده SBCC) با استفاده از 73 نشانگر SSR در طول ژنوم جو انجام شد، تجزیه ساختار جمعیت با نرم افزار STRUCTURE با استفاده از داده­های 64 نشانگر SSR توانست توده­های اسپانیایی را به­خوبی از سایر توده­های اروپایی تفکیک کند. پژوهش آنها نشان داد که اعمال اثر ساختار جمعیت در تجزیه ارتباط باعث کاهش تعداد ارتباط معنی­دار می­شود یعنی بخشی از ارتباطات واقعی بین صفت و نشانگر که ناشی از ساختار جمعیت نیست را نشان می­دهد. اگر چه تعداد نشانگرهای معنی­دار در این پژوهش کم بود، اما باز هم تعدادی نشانگر قوی پیوسته به QTL­های ممکن وجود داشت و این نشانگرها شناسایی شدند (Casas et al., 2006).

 

تجزیه ارتباط

تجزیه ارتباط با استفاده از نرم افزار TASSEL اجرا شد. در این بررسی، از سه مدل آماری برای تجزیه ارتباط استفاده شد که در جدول 3 نشان داده شده است. در کل برای 22 متغیر که شامل هشت صفت اندازه­گیری شده در شرایط نرمال و متوسط شرایط تنش و همچنین شش شاخص­ تحمل به تنش، تعداد 91 نشانگر ارتباط معنی­داری را با این صفات در سطح یک درصد نشان دادند (جدول 7).

از این تعداد 15 و 55 نشانگر بترتیب به صفات اندازه گیری شده در شرایط نرمال و متوسط شرایط تنش و 21 نشانگر به شاخص­های تحمل اختصاص داشت. در این جدول نشانگرهای دارای ارتباط معنی­دار شناسایی شده با استفاده از مدل MLM در سطح پنج درصد نیز آورده شده است. مدل MLM در این سطح توانست 87 نشانگر معنی­دار را مرتبط با 22 متغیر مورد بررسی شناسایی نماید. بدیهی است تعداد زیادی از این نشانگرها با استفاده از مدل­های GLM نیز تعیین شده بودند. در جدول 7 برای نشانگرهای معنی­دار سطح معنی­داری به همراه ضریب تبیین نشانگر آورده شده است.

در شرایط نرمال بالاترین ضریب تبیین به نشانگر E100M16027 با توجیه 32 درصد از تغییرات قطر ریشه با مدل MLM در سطح پنج درصد اختصاص داشت.

 نشانگر E80-M150-1 نیز مرتبط با سه صفت حجم ریشه، وزن تر و وزن خشک ریشه شناسایی شد. باید خاطر نشان نمود شناسایی نشانگرهای مرتبط با چندین صفت مهم می­تواند در برنامه­های اصلاحی بسیار کاربردی باشد.

مدل MLM در سطح پنج درصد برای شش شاخص تحمل مورد بررسی، 18 نشانگر معنی­دار را شناسایی نمود. بالاترین درصد توجیه تغییرات فنوتیپی به نشانگر E80-M150-1  با 24 درصد توجیه تغییرات GMP اختصاص داشت. 

 

 

 

 

 


جدول 7- نتایج تجزیه ارتباط بین نشانگرهای AFLP و صفات مختلف در شرایط نرمال، تنش غرقابی و  شاخص­های تحمل با  سه مدل آماری.

Table 7- The results of association analysis between AFLP markers and different traits in normal and flooding stress with tolerance index using three statistical models.

 

 

نشانگرهای معنی­دار در سطح احتمال یک درصد

Significant markers in 1% probability level

نشانگرهای معنی­دار در سطح احتمال پنج درصد

Significant markers in 5% probability level

صفت

Trait

نشانگر

Marker

مدل 1 Model 1

مدل 2 Model 2

مدل 3 Model 3

سطح احتمال

Prob

R2

سطح احتمال

Prob

R2

نشانگر

Marker

سطح احتمال

Prob

R2

YN1*

E80M15022

0.0011

0.55

0.0023

0.42

E100M15011

0.01625

0.23

E90M16037

0.0024

0.41

0.0018

0.36

E90M16037

0.00898

0.27

E100M16024

 

 

0.0084

0.27

 

 

 

 

YN2

E100M15028

0.0044

0.37

0.004

0.40

E100M15026

0.02824

0.21

E100M15032

0.0044

0.37

0.004

0.40

E80M1501

0.04552

0.18

YN3

 

 

 

 

 

E80M16014

0.04977

0.11

 

 

 

 

 

E100M16022

0.0233

0.22

 

 

 

 

 

E80M1501

0.02761

0.21

 

 

YN4

E90M16035

0.0041

0.37

0.0084

0.35

E90M16035

0.01978

0.23

E90M16037

0.0032

0.39

0.0054

0.38

E90M16037

0.00582

0.32

 

 

 

 

 

E80M1501

0.018

0.24

 

 

 

 

 

E90M15020

0.03851

0.12

 

 

 

 

 

E80M1608

0.01253

0.18

 

 

 

 

 

E110M1501

0.04361

0.11

 

 

 

 

 

E80M1601

0.01622

0.17

 

 

 

 

 

E80M16016

0.01964

0.16

 

 

 

 

 

E80M16017

0.01622

0.17

 

 

 

YN5

E90M16023

0.002

0.42

0.0059

0.31

E90M16023

0.02285

0.22

 

 

 

 

 

E100M15011

0.043

0.18

 

 

 

 

 

E100M15028

0.04595

0.18

 

 

 

 

 

E110M1505

0.0385

0.12

 

 

 

 

 

E110M15013

0.03942

0.12

 

 

 

 

YN6

E90M1508

0.0039

0.48

0.003

0.52

E110M15022

0.02786

0.14

E90M15015

0.009

0.42

 

 

E100M16012

0.0268

0.26

E90M15016

0.0067

0.44

0.0091

0.45

E100M16027

0.0126

0.32

E90M15020

 

 

0.0083

0.46

E100M16033

0.0204

0.28

E100M15010

0.007

0.34

 

 

E90M15037

0.0437

0.18

E90M16023

0.0034

0.39

 

 

E100M1609

0.04099

0.18

 

 

YN7

 

 

 

 

 

E80M1501

0.04245

0.18

 

 

 

 

 

E80M16014

0.03748

0.12

 

 

 

 

 

E100M1506

0.02148

0.22

 

 

 

 

 

E110M15013

0.02608

0.14

 

 

 

YN8

E90M16023

0.0052

0.36

 

 

E110M15010

0.02005

0.15

 

 

 

 

 

E90M16023

0.03048

0.19

 

 

 

 

 

E100M15019

0.0337

0.19

 

 

 

 

 

E110M1509

0.03611

0.12

 

 

 

 

 

E110M15019

0.02875

0.13

 

E100M15028

0.0000

0.78

0.0000

0.78

E100M15032

0.04428

0.18

SSI

E100M15032

0.0000

0.78

0.0000

0.78

E110M15025

0.04264

0.12

 

E90M15013

 

 

0.0064

0.44

 

 

 

 

 

GMP

E100M15026

 

 

0.0032

0.41

E110M15022

0.03727

0.12

 

 

 

 

 

E80M1501

0.01702

0.24

 

 

 

 

 

E90M16013

0.03311

0.20

 

 

 

 

 

E90M16037

0.04414

0.18

 

 

 

 

 

E100M16034

0.0346

0.20

 

 

 

ادامه جدول 7                                                                                                                                             (continue of Table 7)

 

 

STI

E100M15026

 

 

0.0028

0.42

E100M15026

0.03278

0.20

 

 

 

 

 

E90M16013

0.02603

0.21

 

 

 

 

 

E90M16037

0.04038

0.19

 

 

 

 

 

E100M16034

0.03688

0.19

 

E100M15028

0.0042

0.37

0.0015

0.40

E100M15026

0.04496

0.18

TOL

E100M15032

0.0042

0.37

0.0015

0.40

E100M1602

0.03751

0.198

 

E90M16016

0.0076

0.33

 

 

 

 

 

 

E90M15013

 

 

0.0081

0.40

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

E110M15014

0.0000

0.55

0.0012

0.35

E110M15014

0.04658

0.11287

 

E90M1607

0.0083

0.33

 

 

E90M15027

0.03718

0.19247

 

E100M1605

0.0056

0.35

 

 

 

 

 

 

E100M1606

0.0000

0.49

0.0096

0.25

 

 

 

YI

E100M1607

0.0056

0.35

 

 

 

 

 

 

E100M16015

0.001

0.46

 

 

 

 

 

 

E110M15015

 

 

0.0036

0.30

 

 

 

 

E90M16024

 

 

0.0043

0.29

 

 

 

 

E100M16036

 

 

0.0085

0.26

 

 

 

 

E100M15028

0.0000

0.78

0.0000

0.78

E100M15032

0.04428

0.18249

YSI

E100M15032

0.0000

0.78

0.0000

0.78

E110M15025

0.04265

0.11812

 

E90M15013

 

 

0.0064

0.44

E110M15014

0.04858

0.11146

 

 

 

YS1**

E80M15011

0.0049

0.46

0.0000

0.78

E90M16035

0.04863

0.16503

 

 

 

 

 

E80M1502

0.03879

0.17855

 

 

 

 

 

E80M1504

0.0232

0.20996

 

 

 

 

 

E80M1505

0.04411

0.17084

 

 

 

 

 

E80M1506

0.03228

0.18966

 

 

 

 

 

YS2

E110M15014

0.0000

0.55

0.0012

0.35

E110M15014

0.04693

0.11247

E90M1607

0.0084

0.33

 

 

E90M15027

0.03706

0.19266

E100M1605

0.0056

0.35

 

 

 

 

 

E100M1606

0.0000

0.49

0.0096

0.25

 

 

 

E100M1607

0.0055

0.35

 

 

 

 

 

E100M16015

0.001

0.46

 

 

 

 

 

E110M15015

 

 

0.0036

0.30

 

 

 

E90M16024

 

 

0.0043

0.29

 

 

 

E100M16036

 

 

0.0084

0.26

 

 

 

 

 

 

 

 

YS3

E90M15036

0.0026

0.50

 

 

E110M15014

0.02064

0.15496

E110M1504

0.0034

0.39

 

 

E110M15015

0.0114

0.2477

E110M15014

0.0000

0.66

0.0000

0.46

E90M15027

0.04307

0.18215

E90M1607

0.0000

0.48

0.0067

0.28

E90M16016

0.03358

0.19803

E90M16015

0.0048

0.36

 

 

 

 

 

E100M1604

0.0022

0.41

 

 

 

 

 

E100M1605

0.0036

0.38

 

 

 

 

 

E100M1606

0.0000

0.51

0.0059

0.28

 

 

 

E100M1607

0.01

0.31

 

 

 

 

 

E100M16015

0.0000

0.49

0.0057

0.28

 

 

 

E90M16024

 

 

0.0048

0.29

 

 

 

 

 

 

 

 

YS4

E110M1504

0.0014

0.44

 

 

E110M1504

0.01398

0.17775

E110M15014

0.0027

0.40

0.0082

0.28

E80M16015

0.04782

0.11178

E90M1607

0.0027

0.40

 

 

E90M16030

0.04473

0.18108

E90M16010

0.0025

0.41

 

 

E110M15022

0.02043

0.15667

E90M16015

0.0012

0.45

 

 

E90M16016

0.0252

0.21818

 

 

 

 

 

E90M16018

0.03471

0.19732

 

 

 

 

 

E90M16022

0.03305

0.2005

 

 

 

 

 

E90M16037

0.0357

0.19551

 

 


ادامه جدول 7                                                                                                                                             (continue of Table 7)

 

YS5

E110M15014

0.0024

0.41

 

 

E90M15027

0.02699

0.21461

E100M1606

0.0079

0.33

 

 

E110M15022

0.04087

0.12033

E80M15011

 

 

0.0057

0.42

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

YS6

E90M15029

0.0036

0.48

 

 

E90M15029

0.04066

0.18825

E90M15032

0.0036

0.48

 

 

E110M15014

0.03443

0.12945

E90M15035

0.006

0.45

 

 

E110M15022

0.02868

0.13914

E90M15036

0.0012

0.54

 

 

E100M16034

0.03717

0.19403

E100M1506

0.0068

0.34

 

 

E90M15015

0.04643

0.17975

E110M1506

0.0059

0.35

 

 

E90M16016

0.04124

0.18735

E110M15014

0.0000

0.64

1.93E-04

0.45

E100M16016

0.02929

0.20954

E110M15021

0.0052

0.36

 

 

 

 

 

E110M15022

0.0035

0.39

 

 

 

 

 

E90M1604

0.0082

0.33

 

 

 

 

 

E90M1607

0.0019

0.42

0.0043

0.31

 

 

 

E90M16024

0.0045

0.37

0.0011

0.38

 

 

 

E100M1604

0.0000

0.52

0.0058

0.29

 

 

 

E100M1605

0.0000

0.50

0.0094

0.27

 

 

 

E100M1606

0.0000

0.60

0.0011

0.37

 

 

 

E100M1607

0.0015

0.44

0.0076

0.28

 

 

 

E100M16015

0.0000

0.61

0.0000

0.38

 

 

 

E110M15015

 

 

0.0024

0.34

 

 

 

E90M16020

 

 

0.0043

0.31

 

 

 

E100M16034

 

 

0.0039

0.31

 

 

 

E110M1504

0.0048

0.36

 

 

 

 

 

E110M15014

0.0000

0.50

0.002

0.38

 

 

 

E90M1607

0.0069

0.34

 

 

 

 

 

E100M1606

0.0061

0.35

 

 

 

 

 

E80M15011

 

 

0.0053

0.42

 

 

 

 

YS7

 

 

 

 

 

E110M15022

0.02518

0.14579

 

 

 

 

 

E90M1509

0.03894

0.19055

 

YS8

E80M16020

 

 

0.0045

0.40

E80M16020

0.04679

0.11098

 

 

 

 

 

E100M15019

0.04137

0.18291

 

 

 

 

 

E100M15022

0.01773

0.23745

*: صفات اندازه گیری شده در شرایط نرمال YN1: طول ریشه، YN2: حجم ریشه، YN3: وزن تر ریشه، YN4: وزن خشک ریشه، YN5: سطح ریشه، YN6: قطر ریشه، YN7: چگالی ریشه، YN8: وزن خشک اندام هوایی. **: صفات اندازه گیری شده در متوسط شرایط تنش YS1: طول ریشه، YS2: حجم ریشه، YS3: وزن تر ریشه، YS4: وزن خشک ریشه، YS5: سطح ریشه، YS6: قطر ریشه، YS7: چگالی ریشه، YS8: وزن خشک اندام هوایی.

*: Evaluated traits in normal condition. YN1: Root length, YN2: Root volume, YN3: Root fresh weight, YN4: Root dry weight, YN5: Root surface, YN6: Root diameter, YN7: Root density, YN8: Shoot dry weight.

**: Evaluated traits in stress condition. YS1: Root length, YS2: Root volume, YS3: Root fresh weight, YS4: Root dry weight, YS5: Root surface, YS6: Root diameter, YS7: Root density, YS8: Shoot dry weight.

 

 

 

برخی از نشانگرها مثل E100M15032، E110-M150-25 و E110-M150-14 به بیش از یک شاخص مرتبط بودند که با توجه به وجود همبستگی بین شاخص­ها، این نتیجه دور از انتظار نبود. برای صفات اندازه گیری شده در متوسط شرایط تنش نیز تعداد 33 نشانگر ارتباط معنی­داری را با استفاده از مدل MLM در سطح پنج درصد نشان دادند. نشانگر E100-M150-22 با تبیین 24 درصد از تغییرات فنوتیپی وزن خشک اندام هوایی بالاترین درصد ضریب تبیین را در بین نشانگرها به خود اختصاص داد. نشانگر E110M15014 با سه صفت در شرایط تنش مرتبط بود.

در بررسی که بر روی توتون به منظور شناسایی نواحی ژنومی مرتبط با مقاومت به سه بیماری معمول توتون از نشانگرهای AFLP و 92 نمونه مختلف N. tabacum استفاده شد که در کل هفت نشانگر به ترتیب دو، سه و دو نشانگر مرتبط با مقاومت به بیماری پوسیدگی سیاه ریشه (Black root rot)، کپک آبی (Blue mold) و ویروس Y سیب زمینی (Potato Virus Y)  شناسایی شدند. همچنین آنها تعدادی از این نشانگرها را به SCAR تغییر داده و سپس در جمعیت لاین­های اینبرد نوترکیب و هاپلوئید مضاعف به تأیید رساندند. این نشانگرها قادر بودند نمونه­های بیمار و سالم را از هم تفکیک نمایند ((Julio et al., 2006.

در مطالعه­ای که بر روی جو که 14 صفت زراعی بر روی 55  ژنوتیپ الیت انجام شد، تجزیه ارتباط با استفاده از 519 نوار چندشکل مشتق از 20 نشانگر SSR، دو نشانگر SAMPLE و هشت نشانگر AFLP انجام شد و نتایج پژوهش آنها نشان داد در کل  بترتیب 131، 43 و 166 نشانگر SSR، SAMPLE و AFLP حداقل با یکی از 14 صفت ارتباط معنی­داری دارند. از بین این تعداد، با در نظر گرفتن هر دو مدل GLM و MLM در بررسی آنها، تعداد 51 نشانگر به عنوان نشانگرهای مثبت و آگاهی بخش شناسایی شدند و در نهایت اظهار داشتند این نشانگرهای معنی­دار پس از تأیید و اعتبارسنجی می­توانند در برنامه­های اصلاحی بسیار کاربردی باشند(Roy et al., 2010) . در بررسی دیگری که به منظور شناسایی نواحی مؤثر در محتوای بتا-گلوکان در دانه 89 توده جو با منشا لاتویان و 22 توده با منشا هالس با استفاده از 1273 نشانگر SNP انجام شد، با استفاده از مدل MLM همراه با ماتریس­های K و Q، تعداد سه نشانگر 1_0673، 2_0880 و 1_1445 بر روی کروموزوم 7H  شناسایی شد که ارتباط معنی­داری را با محتوای بتا-گلوکان داشتند از آنجایی­که محتوای بتا-گلوکان از مهم­ترین ترکیبات برای تعیین کیفیت دانه جو است با شناسایی نشانگرهای مرتبط با این ترکیب می­توان در جهت بهبود میزان و افزایش میزان این ترکیب گام برداشت (Mezaka et al., 2011).

در بررسی که به منظور شناسایی جایگاه صفات کمی و تجزیه ارتباط در 155 ذرت اینبرد با 1536 SNP انجام شد، نشان داد که استفاده از مدل MLM 15/1، 15/1 و 66/1 درصد SNP­ها ارتباط معنی­دار با تمامی محتوای توکوفرول در دانه ذرت، ارتفاع گیاه و طول دانه در سطح یک درصد داشتند. همچنین این تحقیق نشان داد که برای تمامی صفات استفاده از مدل مبتنی بر K و مدل مبتنی بر Q به تنهایی عملکرد خوبی ندارند اما استفاده از مدل مبتنی بر K و Q بطور مشترک در مدل MLM نتایج بهتر و مؤثرتری را در بردارد (Yang et al., 2010).

 


نتیجه­گیری کلی

در کل با توجه به بالا بودن آماره­های تنوع ژنتیکی در ترکیبات آغازگری E90-M160، E100-M160 و E90-M150 می­توان به کارایی بالای این ترکیبات اذعان داشت و از آن­ها در برنامه­های اصلاحی دیگر به عنوان ترکیبات مناسب و کارا استفاده نمود. تجزیه ارتباط با استفاده مدل MLM توانست 87 نشانگر معنی­دار مرتبط با 22 متغیر مورد بررسی را شناسایی نماید. تشخیص نشانگرهایی مانند E90-M160-37 و E80-M150-1 که مرتبط با چندین صفت بودند، می­توانند مقدمه­ای بر انجام تحقیقات دقیق­تر در نواحی کاندید شناسایی شده در ژنوم باشند. تبدیل نشانگرهای AFLP به نشانگرهای اختصاصی SCAR یا نواحی تکثیری با توالی مشخص پس از تأیید پیوستگی نشانگر AFLP به مکان­ ژنی کنترل کننده صفت، راهکار عملی و کاربردی است که انتظار می­رود که برای نشانگرهای مهم شناسایی شده در این تحقیق نیز مورد استفاده قرار گیرد.

 

 

منابع

Alizadeh A (2006). Soil, water-plant relationship. Astane of Ghodse of Razavi. 472 p.

Agrama HA, Eizenga GC, Yan W (2007). Association mapping of yield and its components in rice cultivars. Molecular Breeding 19: 341-356.

Baum M, Grando S, Backes G, Jahoor A, Sabbagh A, Ceccarelli S (2003). QTLs for agronomic traits in the mediterranean environment identified in recombinant inbred lines of the cross ‘Arta’ x H. spontaneum 41-1. Theoretical and Applied Genetics. 107: 1215-1225.

Bradbury PJ, Zhang Z, Kroon DE, Casstevens TM, Ramdess Y, Buckler ES (2007). TASSEL: Software for association mapping of complex traits in divers samples. Bioinformatics Applications Note. 2633-2635.

Breseghello F, Sorrells ME (2006). Association analysis as a stategy for improvement of  quantitative traits in plants. Crop Science. 46: 1323-1330.

Brisson N, Rebiere B, Zimmer D, Renalt D (2002). Response of the root system of winter wheat crop to water logging. Plant and Soil. 243: 43-55.

Casas AM, Kopahnke D, Habekub A, Schwizer G, Gracia MP, Lasa JM, Ciudad FJ, Codesal P, Moralejo MA, Molina-Cano JL, Igartua E, Ordon F (2006). Marker-trait association for disease resistance in the Spanish barley core collection. Eucarpia, Lleida. 141-145.

Dadras AR (2012). Evaluation of genetic diversity of tobacco (Nicotiana tabacum L.) cultivars using AFLP molecular markers. Iran, Shahib Bahonar University of Kerman. M. Sc. Thesis.

Emam Y (2007). Cereal production. Shiraz Univ. Press, third Edition. 190p.

Eleuch L, Jilal A, Grando S, Ceccarelli S, Schmising MK, Tsujimoto H, Hajer A, Daaloul A, Baum M (2008). Genetic diversity and association analysis for salinity tolerance, heading date and plant height of barley germplasm using simple sequence repeat markers. Journal of Integrative Plant Biology. 50(8): 1005-1015.

Evanno G, Reganut E, Goudet J (2005). Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology. 14: 2611-2620.

Julio E, Verrier JL, Dorlhac de Borne F (2006). Development of SCAR markers linked to three disease resistances based on AFLP within Nicotiana tabacum L. Theoretical and Applied Genetics. 112: 335-346.

Gangkhanlou A, Mohammadi SA, Moghaddam M, Ghasemi Golazani K, Shakiba M, Yosefi A (2012). Genetic diversity in barley as revealed by microsatellite markers and association of these markers by traits related to freezing tolerance. Seed and Plant Improvement Journal. 28(1): 101-114.

Ghobadi ME, Nadian H, Bakhshandeh A, Fathi Gh, Gharineh MH, Ghobadi M (2006). Study of root growth, biological yield and grain yield of wheat genotypes under waterlogging stress during different growth stages. Seed and Plant Improvement Journal. 22(4): 513-527.

Gupta PK, Rustgi S, Kulwal PL (2005). Linkage disequilibrium and association studies in higher plants: Present status and future prospects. Plant Molecular Biology. 57: 461-485.

Gomez C, Alvarez M, Mosquera T (2011). Association mapping, a method to detect quantitative trait loci: statistical bases. Agronomia Colombiana. 29(3): 367-376.

Hajabbasi MA (2001). Tillage effects on soil compactness and wheat root morphology. J. Agric. Science and Technology. 3: 67-77.

Malekahmadi F, Kalantari KhM, Torkzadeh M (2005). The effect of flooding stress on induction of oxidative stress and concentration of mineral element in pepper (Caosicum annum) plants. Iranian Journal of Biology. 18 (2): 110-119.

Mezaka L, Bleidere M, Legzdina L, Rostoks N (2011). Whole genome association mapping identifies naked grain locus NUD as determinant of β-glucan content in barley. Zemdirbyste-Agriculture. 98(3): 283-292.

Pritchard JK, Stephens M, Rosenberg NA, Donnelly P (2000). Association mapping in structured populations. The American Society of Human Genetics. 67: 170-181.

Roldain-Ruiz I, Calsyn E, Gilliand TJ, Coll R, Van Eijk MJT, De Loose M (2000). Estimating genetic conformity between related ryegrass (Lolium) varieties, 2 AFLP charscterization. Molecular Breeding. 6: 593-602.

Roy JK,  Bandopadhyay R,  Rustgi S,  Balyan SH, Gupta PK  (2006).  Association  analysis  of agronomically important traits using SSR, SAMPL and AFLP markers in bread wheat. Current Science. 5: 683-689.

Roy JK, Smith KP, Muehlbauer GJ, Chao S, Close TJ, Steffenson BJ (2010). Association mapping of spot blotch resistance in wild barley. Molecular Breeding. 26: 243-256.

Saghai  Maroof,  MA,  Biyashev  RM,  Yang GP,  Zhang  Q,  Allard  RW  (1994).  Extraordinarily polymorphic  microsatillate  DNA  in  barely  species  diversity,  choromosomal  location,  and population dynamics, Proceeding of the National Academy of Sceinces. USA. 91: 5466-5570.

Schenk MK, Barber SA (1979). Root characteristics of corn genotypes as related to P Uptake. Agronomy Journal. 71: 921-927.  

Shannon CE, Weaver W (1963). The mathematical theory of communication. University of Illinois Press, Urbana, Ill.

Spataro G, Tiranti B, Arcaleni P, Bellucci E, Attene G, Papa R, Spagnoletti Zeuli P, Negri V (2011). Genetic diversity and structure of a worldwide collection of Phaseolus coccineus L. Theoretical and Applied Genetics. 122: 1281-1291.

Thomas W (2002). Molecular marker-assisted versus conven- tional selection in barley breeding. In: Slafer G, Molina- Cano  JL,  Savin  R,  Araus  JL,  Ramagosa  I  (eds)  Barley science:   recent   advances   from   molecular   biology   to agronomy of yield and quality. Food Products Press, New York, pp 177–203.

Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Lee TVD, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research. 4407-4414.

Yang X, Yan J, Shah T, Warburton ML, Li Q, Li L, Gao Y, Chai Y, Fu Z, Zhou Y, Xu S, Bai G, Meng Y, Zheng Y, Li J ( 2010). Genetic analysis and characterization of a new maize association mapping panel for quantitative trait loci dissection. Theoretical and Applied Genetics.

Yeh FC, Yang RC, Boyle TJB, Ye ZH, Mao JX (1997). POPGENE, The user-friendly shareware for population genetic analysis. Edmonton, Molecular Biology and Biotechnology Center, University of Alberta, Canada.

Zhang HY, Liu XZ, Li TS, Yang YM (2006). Genetic diversity among flue-culerd tobacco (Nicotiana tabacum L.) revealed by amplified fragment length polymorphism. Botanical Studies. 47: 223-229.

 


Identification of AFLP markers related to tolerance to flooding stress in barley

 

Heydari R.1, Sabouri A.*1, Sabouri H.2, Fallahi H.A.3, Dadras A.R.4

 

 

1 MSc student of Plant Breeding and Assistant professor of Department of Agronomy & Plant Breeding, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran.

2 Associate professor Department of Plant Production, College of Agriculture and Natural Resources, Gonbad Kavous University., Golestan, Iran.

3 Assistant professor of Agriculture Research Center of Golestan-Agric. Res. Golestan, Iran.

4 PhD student of Plant Breeding of Department of Agronomy & Plant Breeding, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran.

 

Abstract

According to the importance of studies of abiotic stress, present study was done in order to identify of molecular markers with significant association to flooding stress tolerance in barley. This study carried out using of AFLP markers and 40 barley genotypes. Generally 22 variables in both normal and flooded, eight characters including shoot dry weight, length, volume, wet weight, dry weight, leaf area, root diameter and density tolerance was assessed with six indicators (SSI, STI, GMP, TOL, YI and YSI). Seven primer combinations of EcoRI and MseI a total of 245 bands were produced, of which, 227 bands were polymorphic and had an average of 92.37 percent polymorphism. Three combinations E90-M160, E100-M160 and E90-M150 had higher values of genetic variation compared to other combinations and were more effective in distinguish of genotypes. Association analysis was performed using structure matrix and statistical models of GLM and MLM by using of TASSEL software for 22 variables. The MLM model in 5 percent probability level identified 87 markers related to evaluated traits. According to the results of association analysis in normal condition the highest of coefficient of determination was for E100M16027 with explanation of 32 percent of root diameter variation and for tolerance indices and stress condition the highest coefficient of determination were for E80M1501 and E100M15022 with 24 percent explanation of variation of GMP index and shoot dry weight respectively.

Keywords: Assosiation analysis, Population structure, Flooding stress, AFLP Markers.

 

 

 

 

 

 

 

 

 



* نویسنده مسئول: عاطفه صبوری                         تلفن: 09113411496                               E-mail: a.sabouri@guilan.ac.ir

[1] . Taproot length

[2] . Root volume

[3] . Root fresh weight

[4] . Root dry weight

[5] . Root area

[6] . Root diameter

[7] . Root surface area density

 

[8]. General Linear Model.

[9] . Mixed Linear Model.

* Corresponding Author: Sabouri A.       Tel: 09113411496                  E-mail: a.sabouri@guilan.ac.ir

 
Alizadeh A (2006). Soil, water-plant relationship. Astane of Ghodse of Razavi. 472 p.
Agrama HA, Eizenga GC, Yan W (2007). Association mapping of yield and its components in rice cultivars. Molecular Breeding 19: 341-356.
Baum M, Grando S, Backes G, Jahoor A, Sabbagh A, Ceccarelli S (2003). QTLs for agronomic traits in the mediterranean environment identified in recombinant inbred lines of the cross ‘Arta’ x H. spontaneum 41-1. Theoretical and Applied Genetics. 107: 1215-1225.
Bradbury PJ, Zhang Z, Kroon DE, Casstevens TM, Ramdess Y, Buckler ES (2007). TASSEL: Software for association mapping of complex traits in divers samples. Bioinformatics Applications Note. 2633-2635.
Breseghello F, Sorrells ME (2006). Association analysis as a stategy for improvement of  quantitative traits in plants. Crop Science. 46: 1323-1330.
Brisson N, Rebiere B, Zimmer D, Renalt D (2002). Response of the root system of winter wheat crop to water logging. Plant and Soil. 243: 43-55.
Casas AM, Kopahnke D, Habekub A, Schwizer G, Gracia MP, Lasa JM, Ciudad FJ, Codesal P, Moralejo MA, Molina-Cano JL, Igartua E, Ordon F (2006). Marker-trait association for disease resistance in the Spanish barley core collection. Eucarpia, Lleida. 141-145.
Dadras AR (2012). Evaluation of genetic diversity of tobacco (Nicotiana tabacum L.) cultivars using AFLP molecular markers. Iran, Shahib Bahonar University of Kerman. M. Sc. Thesis.
Emam Y (2007). Cereal production. Shiraz Univ. Press, third Edition. 190p.
Eleuch L, Jilal A, Grando S, Ceccarelli S, Schmising MK, Tsujimoto H, Hajer A, Daaloul A, Baum M (2008). Genetic diversity and association analysis for salinity tolerance, heading date and plant height of barley germplasm using simple sequence repeat markers. Journal of Integrative Plant Biology. 50(8): 1005-1015.
Evanno G, Reganut E, Goudet J (2005). Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology. 14: 2611-2620.
Julio E, Verrier JL, Dorlhac de Borne F (2006). Development of SCAR markers linked to three disease resistances based on AFLP within Nicotiana tabacum L. Theoretical and Applied Genetics. 112: 335-346.
Gangkhanlou A, Mohammadi SA, Moghaddam M, Ghasemi Golazani K, Shakiba M, Yosefi A (2012). Genetic diversity in barley as revealed by microsatellite markers and association of these markers by traits related to freezing tolerance. Seed and Plant Improvement Journal. 28(1): 101-114.
Ghobadi ME, Nadian H, Bakhshandeh A, Fathi Gh, Gharineh MH, Ghobadi M (2006). Study of root growth, biological yield and grain yield of wheat genotypes under waterlogging stress during different growth stages. Seed and Plant Improvement Journal. 22(4): 513-527.
Gupta PK, Rustgi S, Kulwal PL (2005). Linkage disequilibrium and association studies in higher plants: Present status and future prospects. Plant Molecular Biology. 57: 461-485.
Gomez C, Alvarez M, Mosquera T (2011). Association mapping, a method to detect quantitative trait loci: statistical bases. Agronomia Colombiana. 29(3): 367-376.
Hajabbasi MA (2001). Tillage effects on soil compactness and wheat root morphology. J. Agric. Science and Technology. 3: 67-77.
Malekahmadi F, Kalantari KhM, Torkzadeh M (2005). The effect of flooding stress on induction of oxidative stress and concentration of mineral element in pepper (Caosicum annum) plants. Iranian Journal of Biology. 18 (2): 110-119.
Mezaka L, Bleidere M, Legzdina L, Rostoks N (2011). Whole genome association mapping identifies naked grain locus NUD as determinant of β-glucan content in barley. Zemdirbyste-Agriculture. 98(3): 283-292.
Pritchard JK, Stephens M, Rosenberg NA, Donnelly P (2000). Association mapping in structured populations. The American Society of Human Genetics. 67: 170-181.
Roldain-Ruiz I, Calsyn E, Gilliand TJ, Coll R, Van Eijk MJT, De Loose M (2000). Estimating genetic conformity between related ryegrass (Lolium) varieties, 2 AFLP charscterization. Molecular Breeding. 6: 593-602.
Roy JK,  Bandopadhyay R,  Rustgi S,  Balyan SH, Gupta PK  (2006).  Association  analysis  of agronomically important traits using SSR, SAMPL and AFLP markers in bread wheat. Current Science. 5: 683-689.
Roy JK, Smith KP, Muehlbauer GJ, Chao S, Close TJ, Steffenson BJ (2010). Association mapping of spot blotch resistance in wild barley. Molecular Breeding. 26: 243-256.
Saghai  Maroof,  MA,  Biyashev  RM,  Yang GP,  Zhang  Q,  Allard  RW  (1994).  Extraordinarily polymorphic  microsatillate  DNA  in  barely  species  diversity,  choromosomal  location,  and population dynamics, Proceeding of the National Academy of Sceinces. USA. 91: 5466-5570.
Schenk MK, Barber SA (1979). Root characteristics of corn genotypes as related to P Uptake. Agronomy Journal. 71: 921-927.  
Shannon CE, Weaver W (1963). The mathematical theory of communication. University of Illinois Press, Urbana, Ill.
Spataro G, Tiranti B, Arcaleni P, Bellucci E, Attene G, Papa R, Spagnoletti Zeuli P, Negri V (2011). Genetic diversity and structure of a worldwide collection of Phaseolus coccineus L. Theoretical and Applied Genetics. 122: 1281-1291.
Thomas W (2002). Molecular marker-assisted versus conven- tional selection in barley breeding. In: Slafer G, Molina- Cano  JL,  Savin  R,  Araus  JL,  Ramagosa  I  (eds)  Barley science:   recent   advances   from   molecular   biology   to agronomy of yield and quality. Food Products Press, New York, pp 177–203.
Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Lee TVD, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research. 4407-4414.
Yang X, Yan J, Shah T, Warburton ML, Li Q, Li L, Gao Y, Chai Y, Fu Z, Zhou Y, Xu S, Bai G, Meng Y, Zheng Y, Li J ( 2010). Genetic analysis and characterization of a new maize association mapping panel for quantitative trait loci dissection. Theoretical and Applied Genetics.
Yeh FC, Yang RC, Boyle TJB, Ye ZH, Mao JX (1997). POPGENE, The user-friendly shareware for population genetic analysis. Edmonton, Molecular Biology and Biotechnology Center, University of Alberta, Canada.
Zhang HY, Liu XZ, Li TS, Yang YM (2006). Genetic diversity among flue-culerd tobacco (Nicotiana tabacum L.) revealed by amplified fragment length polymorphism. Botanical Studies. 47: 223-229.