مطالعه تنوع ژنتیکی توده های آویشن ایران با استفاده از نشانگرهای نیمه تصادفی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

چکیده

آویشن (Thymus spp.) از مهمترین گیاهان دارویی خانواده نعناعیان است. دورگه­گیری بین گونه­ای و اینترگرسیون مهمترین عامل تنوع گونه­ای بالا در آویشن است که شناسایی گونه­ها را با مشکل روبرو کرده است. با توجه به مشکلات موجود در اصلاح این گیاه دارویی، استفاده از نشانگرهای مولکولی DNA می‌تواند ابزار قدرتمندی در ارزیابی ژرم‌پلاسم و بهره‌برداری‌های به‌نژادی به شمار ­آید. در این مطالعه از 30 آغازگر نیمه­تصادفی اینترون-اگزونی (semi random intron-exon splice junction) برای ارزیابی تنوع ژنتیکی 70 توده آویشن ایران استفاده گردید. مجموع آغازگرها 694 باند قابل امتیازدهی تولید کردند که 683 باند آنها چندشکل بود. تجزیه خوشه­ای با نرم­افزار DARwin5 و روش میانگین فاصله و ماتریس تشابه دایس، توده­ها را به شش گروه تقسیم کرد. بیشترین شباهت بین دو توده T. kotschyanus و
T. transcaucasius از قزوین و گیلان و کمترین شباهت مربوط به توده T. lancifolius فارس و
 T. fedtschenkoi از آذربایجان غربی بود. بیشترین و کمترین میزان اطلاعات چندشکلی به ترتیب مربوط به آغازگر IT15-36 وIT18-2  بود. بیشترین و کمترین شاخص نشانگر را به ترتیب دو آغازگر ET15-33 و ET18-6 به خود اختصاص دادند. نتایج نشان دادند که گروه‌بندی حاصل از تجزیه خوشه­ای تا حدودی با منشأ جغرافیایی هماهنگی داشت و توانست تا حدودی گونه­ها را از هم تفکیک نماید. نتایج این تحقیق نشان داد که استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز با آغازگرهای نیمه­تصادفی در بررسی تنوع ژنتیکی توده­های آویشن ایران مناسب بوده است.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Study of Genetic Diversity of Iranian Thymus Accessions, Using ISJ Semi-random Markers

نویسندگان [English]

  • Farzaneh Mojiri
  • Ahmad Esmaeili
  • Farhad Nazarian Firouz Abadi
  • Hassan Maddahi Arefi
  • Hadi Ahmadi
چکیده [English]

Thymus is one of the famous medicine herbs of Lamiaceae genus. Due to the high potential of hybridization and introgression among thymus species, they have high genetic variability and study of genetic variability is difficult in this genus. According to the existing problems in the field of breeding of this medicine herb, use of molecular markers could be a valuable tool for evaluation and exploitation of germplasm. In this study, for assessment of genetic diversity among 70 Iranian Thymus, 30 semi-random ISJ (Intron-exon Splicing Junction) primers were used. Total primers produced 694 bands that 683 bands were polymorphic. Average band number per primer and per genotype was 23.13 and 9.91, respectively. Cluster analysis using DARwin5 software and UPGMA method based on Dice's similarity matrix divided accessions into 6 clusters. The highest similarity was estimated between T. kotschyanus and T. transcaucasius and lowest similarity was estimated between T. lancifolius and T. fedtschenkoi. The highest and lowest of polymorphic information content (PIC) revealed by IT15-36 and IT18-2 primers, respectively. The highest and lowest marker index (MI) included ET15-33 and ET18-6 primers, respectively. Results showed that clustering based on cluster analysis partly adapted with geographical origin dispersion. Totally, application of semi-random primers could be useful in assessment of genetic diversity of Thymus accessions.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Thymus
  • Semi-random Marker
  • ISJ
  • genetic diversity
  • polymorphism

مطالعه تنوع ژنتیکی توده­های آویشن ایران با استفاده از نشانگرهای نیمه­تصادفی ISJ

 

فرزانه مجیری1، احمد اسماعیلی*2، فرهاد نظریان فیروزآبادی3، حسن مداح عارفی4، هادی احمدی2

1 دانش­آموخته کارشناسی ارشد، گرایش اصلاح نباتات، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه لرستان

2 استادیار، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه لرستان

2 دانشیار، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه لرستان

4 دانشیار، موسسه تحقیقات ثبت و گواهی بذر و نهال

تاریخ دریافت: 14/09/1391، تاریخ پذیرش: 01/07/1392

چکیده

آویشن (Thymus spp.) از مهمترین گیاهان دارویی خانواده نعناعیان است. دورگه­گیری بین گونه­ای و اینترگرسیون مهمترین عامل تنوع گونه­ای بالا در آویشن است که شناسایی گونه­ها را با مشکل روبرو کرده است. با توجه به مشکلات موجود در اصلاح این گیاه دارویی، استفاده از نشانگرهای مولکولی DNA می‌تواند ابزار قدرتمندی در ارزیابی ژرم‌پلاسم و بهره‌برداری‌های به‌نژادی به شمار ­آید. در این مطالعه از 30 آغازگر نیمه­تصادفی اینترون-اگزونی (semi random intron-exon splice junction) برای ارزیابی تنوع ژنتیکی 70 توده آویشن ایران استفاده گردید. مجموع آغازگرها 694 باند قابل امتیازدهی تولید کردند که 683 باند آنها چندشکل بود. تجزیه خوشه­ای با نرم­افزار DARwin5 و روش میانگین فاصله و ماتریس تشابه دایس، توده­ها را به شش گروه تقسیم کرد. بیشترین شباهت بین دو توده T. kotschyanus و
T. transcaucasius از قزوین و گیلان و کمترین شباهت مربوط به توده T. lancifolius فارس و
 T. fedtschenkoi از آذربایجان غربی بود. بیشترین و کمترین میزان اطلاعات چندشکلی به ترتیب مربوط به آغازگر IT15-36 وIT18-2  بود. بیشترین و کمترین شاخص نشانگر را به ترتیب دو آغازگر ET15-33 و ET18-6 به خود اختصاص دادند. نتایج نشان دادند که گروه‌بندی حاصل از تجزیه خوشه­ای تا حدودی با منشأ جغرافیایی هماهنگی داشت و توانست تا حدودی گونه­ها را از هم تفکیک نماید. نتایج این تحقیق نشان داد که استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز با آغازگرهای نیمه­تصادفی در بررسی تنوع ژنتیکی توده­های آویشن ایران مناسب بوده است.

واژه­های کلیدی: آویشن، نشانگر نیمه­تصادفی،ISJ ، تنوع ژنتیکی، چندشکلی



مقدمه

آویشن .Thymus spp از جمله پرکاربردترین گیاهان دارویی است که به دلیل دارا بودن ترکیبات شیمیایی فراوان با کاربردهای دارویی، ضدعفونی‌کننده، غذایی و صنعتی از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است. نام آویشن به کلیه گونه­های Thymus مخصوصاً
T. kotschyanus (آویشن منطقه طالقان) که پراکندگی زیادی در ایران به ویژه در دامنه­های البرز و نواحی شمال ایران دارد، اطلاق می­شود (Zargari, 1973). از آنجا که شناسایی آویشن به دلیل دورگه­گیری بین گونه­ای، دگرگشنی و
پلی­پلوئیدی آن با مشکلاتی همراه است، استفاده از نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA نسبت به سایر نشانگرها که نسبت به شرایط متفاوت متغیر هستند، ابزار قدرتمندی در استفاده موثر از گیاهان دارویی محسوب می­شود. از مهمترین کاربرد نشانگرهای مولکولی DNA ارزیابی تنوع ژنتیکی است. آگاهی از این تنوع برای انتخاب دقیق والدین مناسب جهت استفاده در تلاقی‌ها و معرفی رقم مناسب اهمیت فراوانی است (Kumar, 1999; Sharma et al., 2002). مطالعاتی در مورد تنوع مورفولوژیکی، آلوزایمی و ژنتیکی جنس آویشن توسط محققین صورت گرفته است. گیاه آویشن دارای سیستم تولیدمثلی دگرگرده­افشان می­باشد که گرده­افشانی آن بوسیله حشرات به خصوص زنبور­های عسل صورت می­گیرد (Brabant et al., 1980) و نسبت خودگشنی آن از صفر تا 80 درصد در شرایط طبیعی متغیر است (Valdeyron et al., 1977). محققین گزارش کردند که بعلت دگرگرده­افشانی آویشن، دورگه­گیری در آن به خصوص در انواع تتراپلوئید بسیار معمول است (Stahl-Biskup & Saez, 2002). همچنین گزارش شد که گونه­های آویشن به علت دورگه­گیری بین گونه­ای بسیار متنوع‌اند (Nei, 1973; Yeh et al., 1999). بیشتر گونه­‌های جنس Thymus به دلیل سهولت
دورگه­گیری بین‌ گونه­‌ای، هیبریدهای بارور فراوانی تولید می­کنند که تنوع ژنتیکی بالایی در این جنس ایجاد می­نماید بطوریکه در این جنس چندین هیبرید طبیعی وجود دارد (Jamzad, 2009). بنابراین می­توان این گونه بیان کرد که ارزیابی تنوع ژنتیکی در توده­های آویشن با استفاده از ابزاری دقیق (مثل نشانگرهای ملکولی DNA) می­تواند در پیشبرد امور به‌نژادی این گیاه مفید واقع شود.

محققین پس از مطالعه تنوع آلوزایمی گونه بومی Thymus loscosii گزارش کردند که تنوع ژنتیکی بالایی در این جمعیت وجود دارد (Lopez-Pujol et al., 2004). در تحقیقی، تنوع ژنتیکی و چندشکلی شیمیایی 31 نمونه از گونه Thymus caespititius از دو منطقه متفاوت با نشانگر RAPD مورد بررسی قرار گرفت. نتایج داده­های مولکولی با نتایج به دست آمده از اطلاعات نیمرخ مواد شیمیایی مطابقت نداشت. همچنین همبستگی مستقیمی بین مکان
جمع­آوری، آنالیز شیمیایی و بررسی­های مولکولی یافت نشد. بنابراین پیشنهاد شد که ابزارهای مولکولی دیگری باید برای شناسایی میزان نفوذ ژنتیک و محیط در ترکیبات مواد شیمیایی استفاده گردد (Trindade et al., 2008). در تحقیقی شش نشانگر میکروساتلایت در گونه تتراپلوئید Thymus praecox agg. مطالعه شد. اطلاعات توالی حاصل از 150 آلل میکروساتلایت و نواحی دو طرف آنها، در این مطالعه تنوع زیادی را نشان داد که ممکن است مشخصه­ای برای پلی­پلوئیدها باشد. همچنین مشخص شد که تکنیک PCR برای تعیین تعداد کپی آللی تحت وراثت
پلی­زومی بسیار مناسب بوده است (Landergott et al., 2006). در تحقیقی تنوع ژنتیکی، مورفولوژیکی و فیلوژنتیکی هفت توده آویشن با نشانگر میکروساتلیت ISSR مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که از بین 20 آغازگر، 7 آغازگر باندهای چندشکل تولید کردند. بیشترین تعداد لوکوس در agg. T. praecox و کمترین در serpyllum T. بود. همچنین در این مطالعه با انجام یکسری آزمایشات مزرعه­ای تنوع مورفولوژیکی گسترده­ای درون توده­های آویشن مشاهده شد (Smolik et al., 2009).

یک نوع از نشانگرهای مولکولی مبتنی بر PCR، نشانگرهایی است که توالی آغازگرهای آنها بر اساس نواحی برش اتصال اینترون-اگزون یا ISJ[1] طراحی شده­اند. در ابتدا از این نشانگر در تنوع ژنتیکی گونه­های غلات استفاده شد (Weining & Langridge, 1991; Weining & Henry, 1995). آغازگرهای ISJ توالی­هایی با تعداد نوکلئوتید متفاوت دارند که برخی از این آغازگرها نواحی غیر کدکننده اینترونی و برخی دیگر نواحی کدکننده اگزونی را تکثیر می­کنند و از این نظر قابل تشخیص­اند (Rafalski et al., 1997; Przetakiewicz et al., 2002; Nowoseielski et al., 2002). چندشکلی حاصل از این آغازگرها به دلیل تفاوت در تکثیر قطعاتی از ژنوم گیاه است که مورد رونویسی قرار
می­گیرند (Rafalski et al., 1997). از آنجا که این آغازگرها کاملاً تصادفی نیستند، الگوی باندی آنها نسبت به نشانگر تصادفی RAPD پیچیدگی کمتر، تکرار پذیری بالاتر و چندشکلی بیشتری را داراست (Rafalski et al., 2002; Rafalski et al., 1997). این آغازگر همانند RAPD نیاز به دانستن اطلاعات اولیه در مورد ردیف توالی DNA جهت طراحی و ساخت آغازگرها ندارد. یکی از معایب آغازگرهای ISJ توارث غالبیت آنهاست. از نشانگرهای ISJ در بررسی تنوع ژنتیکی برخی گیاهان استفاده شده است (Samiei et al., 2008; Rafalski et al., 1997; Bandani et al., 2005). اگر چه از نشانگرهای ISJ برای مطالعات تنوع ژنتیکی در مورد سایر گیاهان استفاده شده است، اما تاکنون تحقیقی از نشانگر ISJ جهت ارزیابی تنوع ژنتیکی توده­های آویشن ایران صورت نگرفته است. در این تحقیق با توجه به توانمندیهای این نشانگر با ارزش، برای اولین بار به مطالعه تنوع ژنتیکی 70 توده آویشن ایران با استفاده از 30 آغازگر نیمه­تصادفی ISJ پرداخته شد که از این تنوع ژنتیکی برای استفاده در انتخاب والدین تلاقی توده­های مختلف و سایر کاربردهای بهنژادی استفاده می­شود.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی مورد استفاده در این مطالعه شامل 63 توده از مناطق مختلف ایران (گیلان، سمنان، قزوین، آذربایجان غربی، آذربایجان شرقی، تهران، کردستان، یزد، اصفهان، لرستان، مرکزی، خراسان و کرمان) و 7 توده آویشن با منشأ جغرافیایی نامشخص بود که همگی در مزرعه تحقیقاتی بانک ژن موسسه تحقیقات جنگل­ها و مراتع کشور (کرج) نگهداری می‌شوند (جدول 1). از آنجایی که هدف اصلی از مطالعه روی این گیاه بررسی تنوع ژنتیکی تمامی این توده­ها به منظور تعیین میزان تنوع ژنتیکی و تعیین والدین مناسب جهت اهداف آینده بهنژادی این گیاه بود، لذا از کلیه توده­ها استفاده گردید زیرا ممکن می‌نماید که برخی از توده­های با منشأ نامشخص از پتانسیل مناسبی در بهره‌برداریهای به‌نژادی برخوردار باشند و لذا نبایستی شانس آنها را در ارزیابی‌ها نادیده در نظر گرفت.

 

 

جدول 1- نام گونه­ها و محل جمع­آوری توده­ها.

Table 1- Name and loction of species accessions.

گونه­ها (Species)

منشأ جغرافیایی (Locality)

گونه­ها (Species)

منشأ جغرافیایی (Locality)

T. daenensis

قزوین، مرکزی، اصفهان، لرستان، سمنان

Qazvin, Markazi, Isfahan, Lorestan, Semnan

 

T. migricus

آذربایجان غربی

West Azarbaijan

T. vulgaris

مرکزی

Markazi

T. fedtschenkoi

زنجان، آذربایجان غربی، سمنان

Zanjan, West Azarbaijan, Semnan

T. pubescens

گیلان، زنجان، قزوین، آذربایجان غربی، آذربایجان شرقی، کردستان

Guilan, Zanjan, Qazvin, West Azarbaijan, East Azarbaijan, Kurdistan

T. kotschyanus

تهران، قزوین، کردستان، آذربایجان غربی، زنجان، کرمان

Tehran, Qazvin, Kurdistan, West Azarbaijan, Zanjan, Kerman

T. transcaucasius

زنجان، گیلان

Zanjan, Guilan

T. transcaspicus

یزد، خراسان

Yazd, Khorasan

T. lancifolius

مرکزی، کردستان، فارس، لرستان، اصفهان

Markazi, Kurdistan, Fars, Lorestan, Isfahan

 

 

این تحقیق در سال 89-1388 در آزمایشگاه زیست‌فناوری دانشکده کشاورزی دانشگاه لرستان انجام گرفت. جهت استخراج DNA ژنومی، از هر توده 20 بوته به طور تصادفی انتخاب و از هر بوته تعداد مساوی برگ جدا شد و یک جمعیت بالک تشکیل گردید. استفاده از جمعیت بالک جهت حذف تنوعات درون گروهی و نشان دادن تنوعات واقعی بین توده­ها، روش مفیدی است. با توجه به وجود ترکیبات بازدارنده مثل ترکیبات فنلی، تاننی و پلی­ساکاریدها در برگ گیاه آویشن، استخراج DNA از این گیاه با مشکلاتی روبروست. به‌طوریکه برای بدست آوردن DNA ژنومی با کیفیت مطلوب، روش­های مختلف استخراج DNA از برگ آویشن انجام شد و در نهایت روش استخراج Khanuja et al., (1999) با اندکی تغییرات به عنوان بهترین روش معرفی شد (Mojiri et al., 2010). به منظور تعیین کمیت و کیفیت DNA ژنومی استخراج شده از دستگاه بیوفتومتر مدل Biophotometr-eppendorf 6131 دارای کووتی با حجم 500 میکرولیتر استفاده شد. همچنین برای تعیین کمیت DNA در مقایسه با غلظتهای مختلف DNA لامبدا از الکتروفورز بر روی ژل آگارز 8/0 درصد استفاده شد. از تمامی محلولهای DNA، یک محلول پایه با غلظت 10 نانوگرم در میکرولیتر تهیه شد و برای واکنش PCR استفاده گردید. آغازگرهای بکار رفته نیز دارای غلظت 10 پیکومول بر میکرولیتر بودند. مخلوط واکنش 15 میکرولیتری PCR شامل 45 نانوگرم در میکرولیتر DNA ژنومی، 5/1 میکرولیتر بافر x10، کلرید منیزیم با غلظت نهایی 5/2 میلی­مولار، dNTP با غلظت 2/0 میلی­مولار از هر کدام، 5/0 پیکومول از هر آغازگر و 25/1 واحد آنزیم Taq پلیمراز بود. به علت اختصاصی بودن قسمتی از توالی آغازگرها (Rafalski et al., 1997; Przetakiewicz et al., 2002; Weining & Henry, 1995) واکنش PCR در دو مرحله در دستگاه ترموسایکلر مدل Master cycle gradient 5331 صورت گرفت (Przetakiewicz et al., 2002). چرخه­های حرارتی شامل تک رشته­ای شدن اولیه در 94 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه و سپس 40 چرخه دمایی بود که در 7 چرخه اولیه، دمای اتصال آغازگر دو درجه سانتی­گراد و در طول 33 چرخه بعدی شش درجه سانتی­گراد بالاتر از دمای ذوب آغازگر در نظر گرفته شد. در تمامی چرخه­ها، تک رشته­ای شدن به مدت 40 ثانیه و در دمای 94 درجه سانتی­گراد و اتصال آغازگر به مدت یک دقیقه و مرحله سنتز به مدت دو دقیقه در دمای 72 درجه سانتی­گراد صورت گرفت. مرحله سنتز نهایی نیز به مدت 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی­گراد انجام شد. پس از افزودن سه میکرولیتر بافر بارگذاری x1 (loading buffer)، محصولات PCR بر روی ژل آگارز 5/1 درصد بارگذاری شدند. پس از رنگ­آمیزی با اتیدیوم بروماید به مدت 15 دقیقه، عکسبرداری زیر نور UV با دستگاه ژلداک مدل ITech صورت گرفت. برای امتیازبندی باندها، اطلاعات حاصل به صورت کد صفر (عدم وجود باند) و کد یک (وجود باند) در برنامه Excel وارد شد. برای تعیین ارتباط ژنتیکی نمونه­ها تجزیه خوشه­ای با نرم­افزارDARwin5  به روشهای دایس، جاکارد[2] و ضریب تطابق ساده[3] (SM) انجام شد و مناسبترین روش انتخاب شد. تعداد باندها و میزان اطلاعات چندشکلی (PIC[4]) با فرمول PIC=Σ[2pi (1-pi)] (Thimmappaiah et al., 2008) و شاخص نشانگر (MI[5]) با فرمول
MI= PIC.β (Thimmappaiah et al., 2008) برای هر آغازگر محاسبه گردید. در این معادلات piفراوانی باند iام و β درصد چندشکلی برای هر آغازگر می­باشد. تجزیه هماهنگ اصلی نیز با
نرم­افزارNTSYS  برای تعیین نحوه پراکنش نشانگرها در سطح ژنوم و تعیین سهم هر مولفه در توجیه تنوع انجام شد (Rohlf, 1998).

 

نتایج و بحث

در این تحقیق 30 آغازگر نیمه­تصادفی 683 باند چندشکل تولید کرد که 98 درصد از کل 694 عدد باند تولید شده را شامل گردید. متوسط تعداد کل باندها به ازای هر آغازگر 13/23 عدد و برای هر ژنوتیپ 91/9 عدد بود. همچنین متوسط تعداد باند چندشکل به ازای هر آغازگر 80/22 عدد بود. در مطالعه­ای بر روی تنوع ژنتیکی ارقام لوبیا با استفاده از آغازگرهای نیمه­تصادفی، متوسط تعداد باند به ازای هر ژنوتیپ 5/11 عدد گزارش شد (Nowoseielski et al., 2002). متوسط تعداد باند تولید شده به ازای هر یک از ژنوتیپهای چاودار 9/8 عدد برآورد شد (Rafalski et al., 2002). در مطالعه­ای دیگر میانگین تعداد قطعات تکثیر شده به ازای هر یک از آغازگرهای
نیمه­تصادفی 14 عدد گزارش شد (Gawel et al., 2002). مقایسه این نتایج با دیگر نتایج بر روی سایر گیاهان با آغازگرهای ISJ، نشان داد که این آغازگرها در آویشن کارایی بالاتری نسبت به برخی دیگر گیاهان دارد. تعداد کل باندهای چندشکل از 17 عدد باند برای آغازگر ET18-6 تا 27 عدد باند برای آغازگرهای ET12-27 و ET15-34 متغیر بود. کمترین چندشکلی را آغازگر ET12-26 با 91 درصد چندشکلی نشان داد. بیشترین و کمترین میزان اطلاعات چندشکلی را آغازگرهای IT15-36 و IT18-2 به ترتیب با 40/0 و 21/0 تشکیل دادند. میانگین این شاخص برای کل آغازگرها 31/0 بدست آمد. همچنین بیشترین و کمترین شاخص نشانگر را به ترتیب دو آغازگر ET15-33 و ET18-6 تشکیل دادند. بنابراین آغازگر ET15-33پتانسیل تولید باند بیشتری را نسبت به سایر آغازگرها دارد (جدول 2). 

در این تحقیق توده­های آویشن به روشUPGMA  و ضریب تشابه دایس به شش گروه تقسیم شدند (شکل 1). گروه اول فقط شامل آویشن lancifolius T. daenensis subs از استان فارس (توده 38) بود. علت جدا قرار گرفتن این توده احتمالاً به علت تفاوت شرایط اقلیمی محل جمع­آوری آن نسبت به بقیه
توده­های این گونه بود. گروه دوم دندروگرام بیشترین تعداد توده­های آویشن را در خود جای داد.

 

جدول 2- اطلاعات چندشکلی حاصل از آغازگرهای ISJ در توده­های آویشن.

Table 2- Polymorphism information obtained by ISJ primers in Thymus accessions.

ردیف

Row

نام آغازگر

Primer name

کل باندها

Total bands

باندهای چندشکل

Polymorphism bands

درصد

چند شکلی

Percent of polymorphism

میزان اطلاعات چندشکلی (PIC)

شاخص نشانگر (MI)

1

IT 10-1

24

24

100

0.32

7.68

2

IT 10-2

22

21

95

0.34

7.14

3

IT 10-3

25

25

100

0.31

7.75

4

IT 10-4

25

24

96

0.27

6.48

5

IT 10-5

23

23

100

0.28

6.44

6

IT 10-6

25

25

100

0.36

9.0

7

ET 12-25

23

22

96

0.30

6.6

8

ET 12-26

22

20

91

0.22

4.4

9

ET 12-27

27

27

100

0.33

8.91

10

ET 12-28

21

20

95

0.34

6.8

11

ET 12-29

21

20

95

0.35

7.0

12

ET 12-30

26

26

100

0.31

8.06

13

IT 15-31

23

22

96

0.30

6.6

14

IT 15-32

26

26

100

0.26

6.76

15

IT 15-34

25

25

100

0.33

8.25

16

IT 15-35

18

18

100

0.33

5.94

17

IT 15-36

23

23

100

0.40

9.2

18

ET 15-31

20

20

100

0.27

5.4

19

ET 15-32

27

26

96

0.27

7.02

20

ET 15-33

26

26

100

0.36

9.36

21

ET 15-34

27

27

100

0.28

7.56

22

ET 15-35

20

20

100

0.35

7.0

23

ET 15-36

21

21

100

0.27

5.67

24

IT 18-1

25

25

100

0.28

7.0

25

IT 18-2

22

22

100

0.28

4.62

26

ET 18-6

18

17

94

0.22

3.74

27

ISJ 1

21

21

100

0.34

7.14

28

ISJ 3

24

24

100

0.26

6.24

29

ISJ 5

24

24

100

0.36

8.64

30

ISJ 9

20

19

95

0.30

5.7

 

Total

694

683

98

0.33

7.30

 

 

 

شکل1- دندروگرام حاصل از روش UPGMA توده­های آویشن به کمک نرم­افزار DARwin.

Figure 1- Dendrogram of Thymus accessions based on UPGMA method as revealed by DARwin5 software.

 

 

مشاهده شد که اکثر توده­های آویشن
T. kotschyanus از مناطق سردسیری کشور شامل آذربایجان غربی (توده­های 9 و 15)، قزوین (توده­های 3، 5 و 20)، زنجان (توده­های 7، 8 و 10) و کردستان (توده­های 19 و 21) در این گروه قرار داشتند. علاوه بر آن یک توده از آویشن
T. fedtschenkoi از آذربایجان غربی (توده 18) با چند توده آویشن T. pubescens (توده­های 6، 13، 16 و 17) و یک ژنوتیپ هیبرید که از تلاقی T. fedtschenkoi * T. pubescens (توده 12) بدست آمده بود، در این گروه جای گرفتند. توده T. transcaspicus از قزوین (توده 22)، چهار توده از آویشن lancifolius T. daenensis subs (توده­های 1، 4، 14 و 23) و تمام توده­های آویشن T. transcaucasicus (توده­های 2 و 11) در این گروه قرار داشتند. در گروه سوم فقط یک توده از subs daenensis  T. daenensis (توده 62) قرار داشت که از نظر نوع گل­آذین و میزان کرک اندام­های مختلف با دیگر توده­های آویشن دنایی اختلاف داشت. علاوه بر آن این توده از نظر شرایط اقلیمی محل جمع­آوری از منطقه گرمسیری سمنان بود، در حالیکه بقیه توده­ها از مناطق سردسیری کشور (اصفهان، لرستان، مرکزی و قزوین) جمع­آوری شده بودند. در گروه چهارم دندروگرام چند توده از آویشن T. kotschyanus (توده­های 25، 27، 47، 52 و 54)، آویشن
 T. pubescens (توده­های 24، 26، 30 و 51)، یک نمونه T. transcaspicus از یزد (توده 33) و یک نمونه subs daenensis  T. daenensis از سمنان (توده 70) دیده شد. در گروه پنجم تمام توده­های T. migricus (توده­های 55، 67 و 69) که همگی از آذربایجان غربی بودند قرار داشتند. همچنین یک ژنوتیپ هیبرید از تلاقی
 T. kotschyanus *T. trautveteri از آذربایجان غربی (توده 63)، چهار توده آویشن
T. pubescens که دو نمونه از آذربایجان شرقی (توده 32 از مراغه و توده 36 از قره­چمن) و یک نمونه از کردستان (توده 43) و یک نمونه از زنجان (توده 49)، دو توده T. kotschyanus از زنجان (توده 46) و آذربایجان غربی (توده 66) و چند توده آویشن دنایی از هر دو زیر گونه مربوطه (توده 41 از کردستان، توده 61 از لرستان و توده 65 از مرکزی) وجود داشت. در گروه ششم تمام توده­های موجود از آویشن
T. vulgaris (توده­های 28، 34، 53، 59 و 60) و اکثر توده­های آویشن T. daenensis از دو زیر گونه daenensis T. و lancifolius T. از لرستان (توده­های 37، 40، 44 و 58)، مرکزی (توده­های 56 و 68)، اصفهان (توده­های 39، 42، 45 و 64) و قزوین (توده 35) قرار داشتند. همچنین یک ژنوتیپ هیبرید T. lancifolius * T. pubescens از مرکزی (توده 57) و یک توده آویشن
T. transcaspicus از خراسان (توده 31)، به همراه یک نمونه از T. fedtschenkoi از میاندواب آذربایجان غربی (توده 48) و یک نمونه از آویشن T. kotschyanus از نقده آذربایجان غربی (توده 50) در این گروه قرار گرفته بودند. علت قرار گرفتن نمونه استان خراسان در این گروه با شرایط اقلیمی متفاوت از بقیه را می­توان تصادفی تصور نمود و یا ممکن است ناشی از مبادله و جابجایی بذرها باشد. در این گروه همه توده­های T. vulgaris قرار داشت که توده­های 28، 53 و 59 از مرکزی بودند اما منشأ جغرافیایی دو توده 34 و 60 آن نامشخص بود. نتایج ضرایب تشابه دندروگرام نشان داد که توده 60 بیشترین شباهت را با توده 59 آویشن T. vulgaris و توده 34 این گونه نیز بیشترین نزدیکی را با توده 53 آویشن
T. vulgaris  دارد. بنابراین می­توان گفت که به احتمالاً دو توده 34 و 60 آویشن T. vulgaris نیز از استان مرکزی خواهند بود. در مجموع در دندروگرام 70 توده آویشن بیشترین شباهت بین دو توده T. kotschyanus وT. transcaucasius به ترتیب از قزوین (توده 5) و گیلان (توده 2) و کمترین شباهت مربوط به توده T. daenensis subs lancifolius از استان فارس (توده 38) و آویشن fedtschenkoi T. از آذربایجان غربی (توده 48) بود. نتایج گروه‌بندی نشان داد که تمام توده­های آویشن T. vulgaris در گروه ششم، تمام توده­های T. migricus در گروه پنجم و تمام توده­های T. transcaucasius در گروه دوم دندروگرام بودند. توده­های آویشن
subs daenensis T. daenensis همگی به جزء دو نمونه (توده­های 61 و 62) در گروه ششم قرار داشتند. پراکندگی و تنوع بالایی درون توده­های آویشنT. kotschyanus در کل دندروگرام دیده شد. این پراکندگی نیز در توده T. pubescens، fedtschenkoi T.، T. transcaspicus و
T. daenensis subs lancifolius نیز مشاهده گردید. بنابراین می­توان این گونه بیان کرد که این گونه­ها توانایی بالایی در پذیرش مواد ژنتیکی از گونه­های مختلف را دارند، به عبارت دیگر احتمال رخداد هیبریداسیون بین گونه­ای و جریان ژنی در این گونه­ها بسیار بالاست. همچنین از آنجا که این توده­ها از مناطق با اقلیم­های متفاوت جمع­آوری شده­اند به علت اثر متقابل ژنوتیپ و محیط، ژنتیک این گیاهان طی تکامل طولانی مدت از محیط تأثیر پذیرفته است. بنابراین یکی از احتمال­های ممکن در خصوص توجیه این تفاوت­ها می­تواند مربوط به منشأ جغرافیایی و اثرات محیطی که از آن منشأ گرفته‌اند باشد. برای مثال سه توده آویشن fedtschenkoi T. شامل دو توده از آذربایجان غربی (توده­های 18 و 48) و یک توده از سمنان (توده 70) بود که هر کدام در یک گروه دندروگرام قرار گرفتند. با کمی تأمل درمی­یابیم که توده آویشن fedtschenkoi T. از سمنان (توده 70) مجاور توده آویشن
T. daenensis از سمنان (توده 62) و
T. kotschyanus از کرمان (توده 52) قرار گرفته بود. همچنین دو توده آویشن fedtschenkoi T. از آذربایجان غربی (توده­های 18 و 48) مجاور دیگر گونه­ها که از نظر منشأ جغرافیایی مشترک بودند قرار داشتند. بنابراین علت تنوع زیاد درون گونه fedtschenkoi T. را می­توان احتمالاً به شرایط اقلیمی مشابه این مناطق نسبت داد. نتایج مطالعه ارزیابی تنوع ژنتیکی 22 جمعیت بارهنگ (Plantago ovata) با استفاده از نشانگرهای مورفولوژیکی و نشانگرهای مولکولی RAPD وISJ  نشان داد که آغازگرهای ISJ مورد استفاده کارایی چندانی در تعیین تنوع ژنتیکی بین جمعیت­ها نداشتند و مطابقتی بین دندروگرام حاصل از ISJ با تنوع حاصل از نشانگر RAPD و مورفولوژیکی مشاهده نگردید (Vahabi et al., 2008). عده­ای از محققان طی مطالعه تنوع ژنتیکی 22 ژنوتیپ گلرنگ با نشانگرISJ  گزارش کردند که تطابق خوبی بین تنوع ژنتیکی و تنوع جغرافیایی وجود ندارد (Ramezani et al., 2009). در مطالعه­ای دیگر جهت تعیین تنوع ژنتیکی 20 رقم گندم بومی سیستان از نشانگرهای نیمه­تصادفی ISJ و نشانگر PCR-RAPD استفاده شد. نتایج حاصله از آن روابط خویشاوندی ارقام گندم با دو منشأ بومی سیستان و غیربومی را به خوبی آشکار کرد (Bandani et al., 2005). در تحقیقی که بر روی تنوع ژنتیکی 20 رقم گندم دوروم با نشانگرهایISJ  انجام شده بود گزارش شد که این نشانگرها قادر به تفکیک ارقام گندم دوروم از یکدیگر بوده است (Farahani & Arzani, 2004).

نتایج حاصل از تجزیه هماهنگ اصلی نشان داد که چهار مولفه اول 83/21 درصد از کل واریانس را توجیه نموده است که سهم مولفه اول 90/7 درصد بود (جدول 3). سهم کم مولفه‌های اول در توجیه واریانس کل بیانگر این است که آغازگرهای مورد استفاده در تمام سطح ژنوم گیاه پراکنده­اند و به عبارتی در نقاط خاصی از ژنوم متمرکز نگردیده‌اند. در واقع این وضعیت خلاف مطالعات و نتایج آنالیزهای آماری مشابه روی صفات مورفولوژیک می‌باشد؛ زیرا در مطالعه صفات مورفولوژیک محقق بدنبال تعیین مؤلفه‌ها و صفاتی است که بیشترین واریانس را توجیه کنند در حالیکه در مطالعات ملکولی اگر درصد واریانس بدست آمده توسط مؤلفه‌های اول عدد بزرگی باشد نشان دهنده آن است که بیشتر مناطق ملکولی تکثیر شده در بخش­های خاصی از کروموزومها یا ژنوم متمرکز گردیده‌اند و لذا این موضوع یک وضعیت مطلوب جهت بررسی جامع‌تر تنوع در سطح کل ژنوم نیست. در مطالعه روابط ژنتیکی سه گونه نعناع با استفاده از نشانگر R-ISSR نتایج نشان داد که که سه مولفه اول 85/29 درصد از کل تغیرات را توجیه کردند که عدد پایین بدست آمده نشان‌دهنده توزیع بسیار مناسب نشانگرهای R-ISSR در سراسر طول ژنوم بوده است (Rahimmalek, 2011). نتایج این گروه­بندی (شکل 2) کاملاً با گروه­بندی تجزیه خوشه­ای مطابقت داشت. مطالعاتی که بر روی سویا (Li & Nelson, 2002) و روی پنبه (Linos et al., 2002) با نشانگر تصادفیRAPD  صورت گرفت، مناسب بودن این تجزیه را تأئید نموده است. از آنجا که اجرای هر برنامه اصلاحی متکی به وجود تنوع ژنتیکی بوده پس انتخاب والدین مناسب در برنامه­های تلاقی برای تولید هیبریدهایی با حداکثر هتروزیس امری ضروری است. مطالعه حاضر نشان داد که نشانگر ISJ نشانگر مفیدی برای سایر مطالعات ژنتیکی و اصلاحی توده­های آویشن ایران به منظور مطالعه صفات مهم و بررسی روابط خویشاوندی در جنس آویشن است. همچنین مشخص شد که آغازگرهای نیمه­تصادفی ISJ مورد استفاده، لوکوس­های سازگاری اقلیمی را کمتر پوشش داده­اند لذا تنوع ژنتیکی حاصل از داده­های مولکولی با منشأ جغرافیایی تا حدودی مطابقت داشت. همچنین داده­های حاصل از آغازگرهای ISJ  توانستند تا حدودی گونه­های آویشن را از هم تفکیک کنند. پیشنهاد می­شود که جهت ارائه یک دید جامع­تر از تمامی آویشن­های ایران نمونه‌گیری به عمل آید و سایر نشانگرهای مولکولی در مطالعات تنوع ژنتیکی نیز مورد استفاده قرار گیرند.

 

سپاسگزاری

از موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور به خاطر در اختیار گذاشتن توده­های آویشن قدردانی می­نمائیم. از مسئولین مرکز تحقیقات داروهای گیاهی رازی دانشگاه علوم پزشکی لرستان که تأمین مالی این طرح را برعهده داشتند نیز تشکر و قدردانی می­گردد.

 

 

 

 

جدول 3- مقادیر ویژه، نسبت واریانس توجیه شده توسط هر مولفه و واریانس تجمعی حاصل از تجزیه هماهنگ اصلی بر اساس نشانگرهای نیمه­تصادفی.

Table 3- Eigen values, proportion of variance explained by each component and cumulative variance of principle coordinate analysis based on semi-random markers.

واریانس تجمعی

Cumulative variance

درصد واریانس

Percent of variance

مقادیر ویژه

Eigen values

مولفه­های اصلی

Main components

7.90

7.90

2.70

مولفه اول

First component

13.04

5.14

1.76

مولفه دوم

Second component

17.50

4.46

1.53

مولفه سوم

Third component

21.83

4.33

1.48

مولفه چهارم

Fourth component

 

 

 

شکل 2- نمودار دو بعدی توده­های آویشن با استفاده از تجزیه هماهنگ اصلی.

Figure 2- Two dimentional diagram of Thymus accessions using principal coordinate analysis.

 

 

منابع

Bandani AR, Mohhamadi AGh, Imamjomeh AA, Khalafbaghi MR, Ranan S, Akbari Moghadam H (2005). Estimation of genetic diversity in genotypes of wheat using RAPD-PCR (Random primers) and ISJ (Semi-Random Primers) markers. Proc. of 4th National Biotechnology Congress of Iran. Milad tower Conference Hall, of Tehran.

Brabant Ph, Gouyon PH, Lefort G, Valdeyron G, Vernet Ph (1980). Pollination studies in Thymus vulgaris L. (Labiatae). Acta Oecologica. Oecologia Plantarum 1: 37-45.

Farahani E, Arzani A (2004). The use of semi-random marker for evaluation of genetic diversity among cultivars and F1 hybrids of durum wheat. Proc. of 4th International Iran & Russia Conference.

Gawel M, Wisniewska I, Rafalski A (2002). Semi-specific PCR for the evaluation of diversity among cultivars of wheat and triticale. Cellular and Molecular Biology Letters 7: 577-582.

Jamzad Z (2009). Thymus and Satureja species of Iran. Reaserch Institute of Forests and Rangelands of Tehran, Iran Press.

Khanuja SPS, Shasany AK, Darokar MP, Kumar S (1999). Rapid isolation of DNA dry and fresh samples of plants producing large amounts of secondary metabolites and essential oils. Plant Molecular Biology Reporter 17: 1-7.

Kumar LS (1999). DNA marker in plant improvement. Biotechology Advances 17: 143-182.

Landergott U, Naciri Y, Schneller JJ, Holderegger R (2006). Allelic configuration and polysomic inheritance of highly variable microsatellites in tetraploid gynodioecious Thymus praecox agg. Theoretical and Applied Genetic 113: 453-465.

Li Z, Nelson RL (2002). RAPD marker diversity among cultivated and wild soybean accessions from four Chinese provinces. Crop Science 42: 1737-1744.

Linos AA, Bebeli PJ, Kaltsikes PJ (2002). Cultivar identification in upland cotton using RAPD markers. Australian Journal of Agriculture Research 53: 637-642.

Lopez-Pujol J, Bosch M, Simon J, Blanche C (2004). Allozyme diversity in the tetraploid endemic Thymus loscosii (Lamiaceae). Annals of Botany 93: 323-332.

Mojiri F, Zabeti SM, Ismaili A, Nazarian-Firouzabadi F, Madah-Arefi H, Ahmadi H (2010). Optimization genomic DNA extraction method in medicine leaf of plant in Thymus spp. Proc. of 4th Regional Congress on Advances in Agricultural Research Sanandaj. May. 12-13, 2010. University of Kordestan, Sanandaj. pp. 100.

Nei M (1973). Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proc. of the National Academy of Sciences, United States America. 70: 3321-3323.

Nowosielski J, Podyma W, Nowosielska D (2002). Molecular research on the genetic diversity of polish varieties and landraces of Phaseolus coccineus L. and Phaseolus vulgaris L. using the RAPD and AFLP methods. Cellular and Molecular Biology Letters 7: 753-762.

Przetakiewicz J, Nadolska-Orczyk A, Orczyk W (2002). The use of RAPD and semi-random markers to verify somatic hybrids between diploid lines of Solanum tuberosum L. Cellular and Molecular Biology Letters 7: 671-676.

Rafalski A, Gidzinska M, Wisniewska I (1997). PCR-based systems for evaluation of relationships among maize inbreds. Genetics and Biotechnology of Maize and Sorghum. Royal Society Chemistry Cambridge. UK, pp. 106-111.

Rafalski A, Madej L, Wisniewska I, Gawel M (2002). The genetic diversity of components of rye hybrids. Cellular and Molecular Biology Letters 7: 471-475.

Rahimmalek M (2011). Study of Genetic Relationships of Some Mint Species Using R-ISSR Markers. Agricultural Biotechnology 10:  11-17.

Ramezani M, Ismaili A, Nazarian-Firouzabadi F, Bakhshkhaniki Gh (2009). Study of genetic diversity among safflower genotypes (Carthamus tinctorius L.) using ISJ molecular markers. M.Sc. thesis of Payam Noor University, Tehran.

Rohlf M (1998). NTSYS-pc. Numerical taxonomy and multivariate analysis system. Version 2.02. Department of Ecology and Evolution, State University of New York.

Samiei K, Arzani A, Mirmohammadi Maibody SAM (2008). Evaluation of genetic diversity of Iranian indigenous clover populations, using random and semi randoms primers. Journal of Agricultural Sciences and Natural Resources 12: 157-164.

Sharma KK, Crouch JH, Hash CT (2002). Applications of biotechnology for crop improvrment: Prospects and constraints. Plants Science 163: 381-395.

Smolik M, Jadczak D, Korzeniewska S (2009). Assessment of morphological and genetic variability in some Thymus accessions using molecular markers. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca 37: 234-240.

Stahl-Biskup E, Saez F (2002). Thyme: The genus Thymus. Genetic Resources and Crop Evolution 50: 551–553.

Thimmappaiah W, Santhosh G, Shobha D, Melwyn GS (2008). Assessment of genetic diversity in cashew germplasm using RAPD and ISSR markers. Scientia Horticulturae 118: 1-7.

Trindade H, Costa MM, Pedro LG, Figueiredo AC, Barroso JG (2008). Genetic diversity and chemical polymorphism of Thymus caespititius from Pico, SaoJorage and Terceira islands (Azores). Biochemical Systematics and Ecology 36: 190-197.

Vahabi AA, Lotfi A, Solouki M, Bahrami S (2008). Molecular and morphological markers for the evaluation of diversity between Plantago ovata in Iran. Biotechnology 4: 702-709.

Valdeyron O, Dommee B, Vernet Ph (1977). Self-fertilization in male fertile plants of a gynodioecious species: Thymus vulgaris L. Heredity 2: 243-249.

Weining S, Henry RJ (1995). Molecular analysis of DNA polymorphism of barley (Hordeum spontaneum L.) germplasm using the polymerase chain reaction. Genetic Research Crop Evolution 42: 273-281.

Weining S, Langridge P (1991). Identification and mapping of polymorphisms in cereals based on the polymerase chain reaction. Theoretical and Applied Genetic 82: 209-216.

Yeh FC, Yang RC, Boyle T (1999). POPGENE: The user-friendly shareware for population genetic analysis. Molecular Biology and Biotechnology Center, Unerversity of Alberta, Canada.

Zargari A (1973). Medicinal plants, Volume IV, Fifth Edition. Tehran University Press.


Study of Genetic Diversity of Iranian Thymus Accessions, Using ISJ Semi-random Markers

 

Mojiri F.1, Ismaili A.*2, Nazarian F.2, Madah Arefi H.3, Ahmadi H.2

 

1 Former M.Sc. student, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Lorestan University, Khorramabad, Iran.

2 Assistant professor, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Lorestan University, Khorramabad, Iran.

3 Associated professor, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Lorestan University, Khorramabad, Iran.

4 Associated professor, Seed and Plant Certification and Registration Institute, Karaj, Iran.

 

 

Abstract

Thymus is one of the famous medicine herbs of Lamiaceae genus. Due to the high potential of hybridization and introgression among thymus species, they have high genetic variability and study of genetic variability is difficult in this genus. According to the existing problems in the field of breeding of this medicine herb, use of molecular markers could be a valuable tool for evaluation and exploitation of germplasm. In this study, for assessment of genetic diversity among 70 Iranian Thymus, 30 semi-random ISJ (Intron-exon Splicing Junction) primers were used. Total primers produced 694 bands that 683 bands were polymorphic. Average band number per primer and per genotype was 23.13 and 9.91, respectively. Cluster analysis using DARwin5 software and UPGMA method based on Dice's similarity matrix divided accessions into 6 clusters. The highest similarity was estimated between T. kotschyanus and T. transcaucasius and lowest similarity was estimated between T. lancifolius and T. fedtschenkoi. The highest and lowest of polymorphic information content (PIC) revealed by IT15-36 and IT18-2 primers, respectively. The highest and lowest marker index (MI) included ET15-33 and ET18-6 primers, respectively. Results showed that clustering based on cluster analysis partly adapted with geographical origin dispersion. Totally, application of semi-random primers could be useful in assessment of genetic diversity of Thymus accessions.

 

Key words: Thymus, Semi-random Marker, ISJ, Genetic Diversity, Polymorphism.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



* نویسنده مسئول: احمد اسماعیلی                        تلفن: 4200012-0661                              E-mail: ahmad_ismaili@yahoo.com

1- Intron-exon Splice Junction

1- Jacard

2- Simple Matching

[4]- Polymorphic Information Content

[5]- Marker Index

* Corresponding Author: Ismaili A.          Tel: +986614200012                  E-mail: ahmad_ismaili@yahoo.com

 
Bandani AR, Mohhamadi AGh, Imamjomeh AA, Khalafbaghi MR, Ranan S, Akbari Moghadam H (2005). Estimation of genetic diversity in genotypes of wheat using RAPD-PCR (Random primers) and ISJ (Semi-Random Primers) markers. Proc. of 4th National Biotechnology Congress of Iran. Milad tower Conference Hall, of Tehran.
Brabant Ph, Gouyon PH, Lefort G, Valdeyron G, Vernet Ph (1980). Pollination studies in Thymus vulgaris L. (Labiatae). Acta Oecologica. Oecologia Plantarum 1: 37-45.
Farahani E, Arzani A (2004). The use of semi-random marker for evaluation of genetic diversity among cultivars and F1 hybrids of durum wheat. Proc. of 4th International Iran & Russia Conference.
Gawel M, Wisniewska I, Rafalski A (2002). Semi-specific PCR for the evaluation of diversity among cultivars of wheat and triticale. Cellular and Molecular Biology Letters 7: 577-582.
Jamzad Z (2009). Thymus and Satureja species of Iran. Reaserch Institute of Forests and Rangelands of Tehran, Iran Press.
Khanuja SPS, Shasany AK, Darokar MP, Kumar S (1999). Rapid isolation of DNA dry and fresh samples of plants producing large amounts of secondary metabolites and essential oils. Plant Molecular Biology Reporter 17: 1-7.
Kumar LS (1999). DNA marker in plant improvement. Biotechology Advances 17: 143-182.
Landergott U, Naciri Y, Schneller JJ, Holderegger R (2006). Allelic configuration and polysomic inheritance of highly variable microsatellites in tetraploid gynodioecious Thymus praecox agg. Theoretical and Applied Genetic 113: 453-465.
Li Z, Nelson RL (2002). RAPD marker diversity among cultivated and wild soybean accessions from four Chinese provinces. Crop Science 42: 1737-1744.
Linos AA, Bebeli PJ, Kaltsikes PJ (2002). Cultivar identification in upland cotton using RAPD markers. Australian Journal of Agriculture Research 53: 637-642.
Lopez-Pujol J, Bosch M, Simon J, Blanche C (2004). Allozyme diversity in the tetraploid endemic Thymus loscosii (Lamiaceae). Annals of Botany 93: 323-332.
Mojiri F, Zabeti SM, Ismaili A, Nazarian-Firouzabadi F, Madah-Arefi H, Ahmadi H (2010). Optimization genomic DNA extraction method in medicine leaf of plant in Thymus spp. Proc. of 4th Regional Congress on Advances in Agricultural Research Sanandaj. May. 12-13, 2010. University of Kordestan, Sanandaj. pp. 100.
Nei M (1973). Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proc. of the National Academy of Sciences, United States America. 70: 3321-3323.
Nowosielski J, Podyma W, Nowosielska D (2002). Molecular research on the genetic diversity of polish varieties and landraces of Phaseolus coccineus L. and Phaseolus vulgaris L. using the RAPD and AFLP methods. Cellular and Molecular Biology Letters 7: 753-762.
Przetakiewicz J, Nadolska-Orczyk A, Orczyk W (2002). The use of RAPD and semi-random markers to verify somatic hybrids between diploid lines of Solanum tuberosum L. Cellular and Molecular Biology Letters 7: 671-676.
Rafalski A, Gidzinska M, Wisniewska I (1997). PCR-based systems for evaluation of relationships among maize inbreds. Genetics and Biotechnology of Maize and Sorghum. Royal Society Chemistry Cambridge. UK, pp. 106-111.
Rafalski A, Madej L, Wisniewska I, Gawel M (2002). The genetic diversity of components of rye hybrids. Cellular and Molecular Biology Letters 7: 471-475.
Rahimmalek M (2011). Study of Genetic Relationships of Some Mint Species Using R-ISSR Markers. Agricultural Biotechnology 10:  11-17.
Ramezani M, Ismaili A, Nazarian-Firouzabadi F, Bakhshkhaniki Gh (2009). Study of genetic diversity among safflower genotypes (Carthamus tinctorius L.) using ISJ molecular markers. M.Sc. thesis of Payam Noor University, Tehran.
Rohlf M (1998). NTSYS-pc. Numerical taxonomy and multivariate analysis system. Version 2.02. Department of Ecology and Evolution, State University of New York.
Samiei K, Arzani A, Mirmohammadi Maibody SAM (2008). Evaluation of genetic diversity of Iranian indigenous clover populations, using random and semi randoms primers. Journal of Agricultural Sciences and Natural Resources 12: 157-164.
Sharma KK, Crouch JH, Hash CT (2002). Applications of biotechnology for crop improvrment: Prospects and constraints. Plants Science 163: 381-395.
Smolik M, Jadczak D, Korzeniewska S (2009). Assessment of morphological and genetic variability in some Thymus accessions using molecular markers. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca 37: 234-240.
Stahl-Biskup E, Saez F (2002). Thyme: The genus Thymus. Genetic Resources and Crop Evolution 50: 551–553.
Thimmappaiah W, Santhosh G, Shobha D, Melwyn GS (2008). Assessment of genetic diversity in cashew germplasm using RAPD and ISSR markers. Scientia Horticulturae 118: 1-7.
Trindade H, Costa MM, Pedro LG, Figueiredo AC, Barroso JG (2008). Genetic diversity and chemical polymorphism of Thymus caespititius from Pico, SaoJorage and Terceira islands (Azores). Biochemical Systematics and Ecology 36: 190-197.
Vahabi AA, Lotfi A, Solouki M, Bahrami S (2008). Molecular and morphological markers for the evaluation of diversity between Plantago ovata in Iran. Biotechnology 4: 702-709.
Valdeyron O, Dommee B, Vernet Ph (1977). Self-fertilization in male fertile plants of a gynodioecious species: Thymus vulgaris L. Heredity 2: 243-249.
Weining S, Henry RJ (1995). Molecular analysis of DNA polymorphism of barley (Hordeum spontaneum L.) germplasm using the polymerase chain reaction. Genetic Research Crop Evolution 42: 273-281.
Weining S, Langridge P (1991). Identification and mapping of polymorphisms in cereals based on the polymerase chain reaction. Theoretical and Applied Genetic 82: 209-216.
Yeh FC, Yang RC, Boyle T (1999). POPGENE: The user-friendly shareware for population genetic analysis. Molecular Biology and Biotechnology Center, Unerversity of Alberta, Canada.
Zargari A (1973). Medicinal plants, Volume IV, Fifth Edition. Tehran University Press.