تجزیه ارتباط صفات مورفولوژیک در انگور با استفاده از نشانگرهای SSR و AFLP

تجزیه ارتباط صفات مورفولوژیک در انگور با استفاده از نشانگرهای SSR  و AFLP

حامد دولتی بانه¹، سید ابوالقاسم محمدی²، بابک عبدالهی مندولکانی*³، ساسان رحمان­پور⁴

¹ دانشیار پژوهشی مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان آذربایجان غربی، ارومیه

² استاد گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز

³ دانشیار گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه

⁴ دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه

تاریخ دریافت: 21/12/1391، تاریخ پذیرش: 07/12/1392

چکیده

انگور متعلق به تیره Vitaceae است و به علت داشتن مصارف متعدد به عنوان یک منبع مهم غذایی همیشه مورد توجه بوده است. به منظور شناسایی نشانگرهای مرتبط با 14 صفت شامل حجم آب میوه، درصد جوانه‌زنی دانه گرده، درصد تشکیل میوه، میانگین وزن تک خوشه و وزن تک حبه، وزن گوشت میوه، وزن تک بذر، طول و عرض خوشه و سیستم باردهی، مواد جامد محلول میوه، مقدار اسید و pH میوه در 48 رقم انگور ایرانی موجود در کلکسیون مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان آذربایجان غربی از 22 جفت آغازگر SSR و 7 ترکیب آغازگری AFLP استفاده گردید. تجزیه رگرسیون گام به گام رابطه معنی­داری بین تعدادی از نشانگرهای SSR و تمامی 14 صفت مورد مطالعه در ارقام انگور نشان داد. در کل 49 آلل از 18 نشانگر SSR ارتباط معنی­دار با تغییرات 14 صفت نشان دادند. وزن حبه و وزن گوشت میوه هرکدام با 7 آلل بیشترین و صفات pH میوه، اسید میوه، حجم آب میوه و درصد جوانه زنی گرده با یک آلل کمترین تعداد آلل مرتبط را داشتند. از 7 جفت ترکیب آغازگری AFLP مورد استفاده، 49 قطعه رابطه معنی­داری با تغییرات 14 صفت نشان دادند. تعدادی از این قطعات برای صفات مختلف مشترک بودند. وزن گوشت میوه با 11 نشانگر مرتبط بیشترین و صفات مواد جامد محلول، درصد تشکیل میوه، جوانه زنی گرده و عرض خوشه با یک نشانگر مرتبط، کمترین تعداد نشانگرهای مرتبط AFLP را به خود اختصاص دادند.

واژه‌های کلیدی: انگور، تجزیه ارتباط، صفات مورفولوژیک، نشانگرهای مرتبط

مقدمه

        انگور به علت داشتن مصارف متعدد به عنوان یک منبع مهم غذایی همیشه مورد توجه بشر بوده است. این گیاه متعلق به تیره Vitaceae است که بیش از 13 جنس و 700 گونه دارد. گل‌ها در این تیره یا کامل بوده و یا به صورت تک جنس نر و ماده دیده می­شوند. جنس‌های Ampelopsis، Vitis و Parthenocissus  در نواحی معتدله رشد می­کنند و سایر جنس­ها در نواحی گرمسیری و نیمه گرمسیری پراکنده می­باشند (Doulati Baneh, 2007). مهم‌ترین جنس این خانواده از لحاظ اقتصادی و غذایی جنس Vitis می‌باشد که شامل دو زیرجنس Euvitis با 38 کروموزوم و زیرجنس Muscadinea با 40 کروموزوم است. زیرجنس Muscadinea در قاره آمریکا پراکنده بوده در حالی‌که زیر جنس Euvitis دارای تعداد زیادی گونه در مناطق مختلف جهان می­باشد (Janick and James, 1996). در حال حاضر منشاء اغلب ارقام انگور موجود، مورد بحث کارشناسان می­باشد بطوری‌که هیچ توافقی در مورد مرکز اولیه اهلی‌شدن انگور و یا مراکز ثانویه آن وجود ندارد (Labra et al., 2003). براساس مطالعات باستان‌شناسی گیاهی پیشنهاد شده ‌است که اهلی‌شدن انگور ابتدا در نیمه دوم هزاره چهارم قبل از میلاد مسیح در دو ناحیه هم‌جوار، ناحیه مزوپوتامیا (شامل جنوب آناتولی، سوریه، شمال لبنان، کردستان و غرب ایران) و جنوب دریای خزر اتفاق افتاده است. برطبق تئوری واویلوف اهلی شدن انگور Vinifera ابتدا در ناحیه دریای خزر اتفاق افتاده که در آن ناحیه بیشترین تنوع ژنتیکی مشاهده گردیده‌است (McGovern, 2003).

بر اساس گزارشات موجود در حدود 800 تا 1000 رقم انگور در ایران وجود دارد که تعدادی از این ارقام از اهمیت اقتصادی بالایی بویژه برای مصارف تازه خوری و تهیه کشمش برخوردار می­باشند (Zahedi, 1996). از جمله ارقام مهم انگور می­توان به بیدانه سفید، بیدانه قرمز، عسکری، یاقوتی، شاهرودی، شاهانی، ریش بابا، پیکانی، فخری، رشه، صاحبی و چندین رقم دیگر اشاره نمود. انگورهای خوراکی ایران از گونه Vinifera می­باشند. در ایران علاوه بر این گونه، دو نوع انگور شامل گونه Labruscae در شمال کشور و انگورهای وحشی از زیر گونه Silvestris در جنگل‌های شمال و مناطق مرطوب دامنه کوه‌های زاگرس نیز وجود دارند (Doulati baneh et al., 2007).

به دلیل تنوع ارقام انگور و اهمیت اقتصادی آن، مطالعات وسیعی در شناسایی ارقام و گونه­های جدید، بهبود خصوصیات مورفولوژیکی، مقاومت به آفات و بیماری‌ها و تنش­ها از طریق به‌نژادی انجام گرفته ‌است (Karami, 1996). اندازه ژنوم انگور با 38 کروموزوم در حدود 10⁸× 75/4 جفت باز است. این ژنوم ترکیبی از توالی­های تکراری و غیرتکراری می­باشد که DNA تکراری بیش از 95% کل ژنوم را تشکیل می­دهد (Grassi et al., 2002). شناسایی نواحی ژنومی دخیل در کنترل صفات کمی بر مبنای عدم تعادل پیوستگی است و به دو روش اصلی صورت می­گیرد: تجزیه پیوستگی که در این روش اغلب از جمعیت­های ساختگی مانند نسل F2، تلاقی برگشتی، هاپلوییدهای مضاعف که در آنها عدم تعادل پیوستگی در بیشترین حد خود است استفاده می­شود. این روش بر مبنای تعیین همبستگی نواحی کروموزومی مشترک بین خویشاوندان در یک جمعیت در حال تفرق با صفت مورد مطالعه است. امروزه علاوه بر این از روش تجزیه ارتباط (Association analysis) نیز برای شناسایی مکان­های ژنی دخیل در صفات کمی و کیفی استفاده می­شود. در این روش برخلاف تجزیه پیوستگی، ارتباط بین ژنوتیپ و فنوتیپ افراد مستقیما برای شناسایی نواحی کروموزومی دخیل در کنترل صفت بررسی می­شود. روش تجزیه پیوستگی در گیاهان چند ساله و بویژه درختان میوه بواسطه نیاز به زمان طولانی برای تولید جمعیت­های مصنوعی و حساسیت برخی از گونه­ها به خویش­آمیزی در راستای ایجاد این جمعیت­ها، عملی به نظر نمی­رسد. بنابراین به عنوان روشی جایگزین، اخیرا از تجزیه ارتباط ژنوتیپ و فنوتیپ در این گیاهان استفاده می­شود (Gupta et al., 2005). این مطالعات شامل استفاده از ژرم­پلاسم گیاهان برای شناسایی نشانگرهای مولکولی مرتبط با تغییرات صفات مورد بررسی است. در پژوهشی Fanizza et al. (2005) برای شناسایی QTLهای موثر در عملکرد میوه در انگور، جمعیتی شامل 184 ژنوتیپ انگور V. vinifera را با استفاده از 203 نشانگر AFLP و 55 جفت آغازگر SSR مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد که عملکرد انگور با توجه به طبیعت چند ساله این گونه، کنترل ژنتیکی پیچیده‌ای دارد. نتایج حاصل از بررسی QTLهای موثر در باروری انگور نشان داد که یک QTL بزرگ اثر در گروه لینکاژی 5 پایداری بالایی در نسل‌های بعدی دارد. بعلاوه 3 QTL دیگر در گروه لینکاژی 5 و دو QTL در گروه لینکاژی 14 شناسایی شدند که در نسل‌های بعدی فقط در برخی نتاج فعال بودند (Doligez et al., 2010). تاکنون تجزیه ارتباط برای بسیاری از صفات مورفولوژیک به منظور شناسایی مکان­های کروموزومی دخیل در کنترل این صفات در انگور گزارش نشده است. بنابراین هدف از این تحقیق انگشت‌نگاری تعدادی از ژنوتیپ‌های انگور به منظور شناسایی نشانگرهای مرتبط با برخی صفات مورفولوژیک بود.  

 مواد و روش‌ها

مواد گیاهی

در این مطالعه از 48 رقم انگور زراعی موجود در کلکسیون مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان آذربایجان غربی استفاده گردید (جدول 1).

جدول 1-  اسامی ارقام انگور مورد استفاده در تحقیق حاضر.

Table 1- Grapevine varieties used in the current study.

ارزیابی صفات کمی و کیفی

        از هرکدام از این ارقام 12 بوته 14 ساله انتخاب شدند. تاک­ها به صورت ایستاده با روش تربیت کوردون دو طرفه، در باغ کلکسیون انگور ایستگاه تحقیقات باغبانی دکتر نخجوانی کهریز نگهداری می­شوند. در زمان تشکیل میوه و زمان رسیدن حبه­ها هر‌کدام از صفات حجم آب میوه، درصد جوانه‌زنی دانه گرده، درصد تشکیل میوه (در حالت گرده افشانی آزاد و کنترل شده)، میانگین وزن تک‌خوشه و وزن تک حبه، وزن گوشت میوه و تک بذر، تعداد بذر، طول، عرض خوشه، مواد جامد محلول میوه، مقدار اسید و pH میوه در 10 تکرار در 3 سال اندازه­گیری شدند. برای اندازه گیری حجم آب میوه (بر حسب میلی­لیتر)، عصاره استحصالی از 100 گرم میوه هر رقم بعد از آب­گیری و صاف کردن با استوانه مدرج اندازه‌گیری شدند. برای اندازه‌گیری درصد جوانه‌زنی دانه گرده، خوشه­های ارقام انگور در زمان 50 الی 70 درصد گل‌دهی از بوته جدا و روی یک ظرف شیشه­ای تمیز تکان داده و سپس دانه­های گرده با استفاده از تیغ، جمع­آوری و در ظروف مخصوص نگهداری شدند. گرده­ها روی محیط یک درصد آگار همراه با 5 درصد ساکارز کشت و به­مدت یک شبانه­‌روز در دمای 26 درجه سانتی­گراد نگه­داری شدند. سپس در چندین میدان دید میکروسکوپ تعداد دانه­های جوانه­زده و تعداد کل، شمارش و درصد جوانه‌زنی محاسبه گردید. برای محاسبه درصد تشکیل میوه، از دو روش کیسه گذاری سه عدد خوشه از هر رقم (با اندازه و موقعیت تقریباً مشابه) و هم بدون کیسه­گذاری (گرده افشانی آزاد) استفاده شد.

با شمارش تعداد کالیپترا و تعداد حبه­های تشکیل شده، درصد تشکیل میوه از فرمول 100× تعدادگل/تعداد حبه = تشکیل میوه (%) محاسبه شد. میانگین وزن تک خوشه و وزن تک حبه از توزین چهار عدد خوشه و 100 عدد حبه به­دست آمد. برای اندازه‌گیری وزن گوشت میوه و تک‌بذر، تعداد 30 حبه انگور از هر رقم انتخاب و توزین شدند و سپس با جدا کردن بذرهای هر حبه، وزن گوشت میوه به ­دست آمد و از اختلاف وزن کل به گوشت حبه، وزن بذر محاسبه شد. همچنین تعداد بذر موجود در هر حبه نیز شمارش و میانگین­گیری گردید. از هر بوته تعداد سه خوشه از موقعیت­های یکسان روی شاخه انتخاب و صفات طول و عرض خوشه اندازه­گیری شدند. مقدار مواد جامد محلول میوه با استفاده از دستگاه رفراکتومتر، مقدار اسید با تیتراسیون و pH میوه با استفاده از دستگاه pH­متر اندازه­گیری شدند.

ارزیابی­های مولکولی

جهت استخراج DNA، 10-5  عدد برگ جوان (5-2 سانتی متر) از هر نمونه انگور بدون دمبرگ برداشته شدند و پس از اتیکت‌گذاری، در ازت مایع منجمد و به فریزر 80-  درجه سانتی گراد منتقل شدند.  استخراج DNA با روش Lodhi  و همکاران (1994) انجام شد. برای ارزیابی کمیت و کیفیت DNA استخراجی به ترتیب از اسپکتروفتومتر در طول موجهای 260 و 280 نانومتر و الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد استفاده شد. پس از تعیین غلظت نمونه­ها، جهت استفاده در واکنش زنجیره­ای پلی مراز غلظت آنها به مقدار 25 نانوگرم در میکرولیتر برای تجزیه نشانگرهای ریزماهواره و AFLP رقیق شدند.

واکنش‌های تکثیر­ ریزماهواره‌ها

در این بررسی از 22 جفت آغازگر ریزماهواره هسته­ای استفاده شد (جدول 2). اساس انتخاب این آغازگرها، چندشکلی بالای آنها در مطالعات قبلی بود(Sefc et al., 2000; Laucou et al., 2011) . برای تکثیر جایگاه‌های ریزماهواره، واکنش زنجیره­ای پلی‌مراز با حجم 10 میکرولیتر با اجزایی به ترکیب بافر PCR 1 برابر، کلرید منیزیوم 5/2 میلی مولار، dNTP10 میلی مولار، آنزیمTaq  پلیمراز 1 واحد، هر کدام از آغازگرها با غلظت 10 میکرومولار و DNA الگوی 25 نانوگرم انجام شد. چرخه­های حرارتی PCR بصورت یک چرخه شامل واسرشته‌سازی اولیه به مدت 4 دقیقه و دمای 94 درجه سانتی­گراد، 35 چرخه شامل واسرشته‌سازی: 94 درجه سانتی­گراد به مدت یک دقیقه، اتصال آغازگرها به رشته‌های الگو بسته به نوع آغازگرها 50 تا 59 درجه سانتی­گراد به مدت یک دقیقه، بسط در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 2 دقیقه و بسط نهایی شامل 72 درجه سانتی­گراد به مدت 7 دقیقه بود. برای تفکیک محصولات PCR از ژل پلی‌اکریلامید واسرشته‌ساز 6 درصد و رنگ‌آمیزی نیترات نقره استفاده شد. جهت تعیین اندازه نسبی قطعات تکثیری، از آلل­های پنج رقم انگور مرجع شامل Cabernet sauvignon, Cabernet franch, Pinot noir, Chardoney, Barbera  به صورت بارگذاری چند تایی محصول PCR آنها برای هر نشانگر در طول ژل و استفاده از نشانگر وزن مولکولی،DNA Molecular Weight Marker VIII (0.019-1.11kbp) » از شرکت Roche در دو انتها و وسط ژل  استفاده گردید. برای الکتروفورز از دستگاه الکتروفورز عمودی شرکت Bio Rad استفاده شد.

واکنش­های AFLP

واکنش­های AFLP بر اساس روش Vos و همکاران (1995) انجام گرفت. بدین ترتیب که DNA (200 نانو گرم) به مدت سه ساعت با آنزیم­های برشی EcoR1(1U) وMse1(1U) هضم و سپس آداپتورهای EcoR1 (pmol5) وMse1 (pmol5) توسط آنزیم T4-DNA-Ligase به قطعات حاصل از برش متصل شدند. این واکنش در دمای 37  درجه سانتی‌گراد و به مدت شش ساعت ادامه یافت. این محلول به عنوان الگو در واکنش تکثیر اولیه استفاده شد که حاوی آغازگرهای مکمل توالی ناحیه مرکزی آداپتورهای دو آنزیم بکار رفته می­باشد. اجزای واکنش شامل 20 میکرولیتر مخلوط DNA برشی/ متصل شده به آداپتور، 50 نانوگرم از آغازگرهای انتخابی، 200 میکرومول از هر کدام ازdNTP ، 5/0 واحد آنزیم Dynazyme П و 5 میکرولیتر بافر بود.

جدول 2- نام، توالی و خصوصیات آغازگرهای ریزماهواره مورد استفاده در تحقیق حاضر.

Table 2- Name, sequence and properties of SSR primers used in current study.

Ta: دمای اتصال، LG: گروه لینکاژی، He: هتروزیگوسیتی مورد انتظار، PIC: محتوای اطلاعاتی نشانگر. گروه لینکاژی نشانگرهای VMC6g10 و VMC6g7 مشخص نمی­باشد.

این واکنش تکثیر در حجم 50 میکرولیتر انجام شد. چرخه­های حرارتی شامل 94 درجه سانتی­گراد (2 دقیقه)، 20 چرخه شامل واسرشته­سازی در 94 درجه (45 ثانیه)، اتصال در 60 درجه (30 ثانیه) و بسط در 72 درجه (1 دقیقه) و سپس مرحله بسط نهایی در 72 درجه به مدت 7 دقیقه بود. محصول تکثیر  اولیه به نسبت 50 : 1 با آب رقیق و برای تکثیر انتخابی استفاده شد. آغازگرهای ECOR1 با استفاده از ایزوتوپ Y32 p ATP نشان دار شدند. مخلوط تکثیر انتخابی به حجم نهایی 20 میکرولیتر، شامل 5/2 میکرو مخلوط رقیق شده تکثیر اولیه، 5 نانوگرم از آغازگر ECOR1 نشان دار شده، 30 نانو گرم از آغازگر MseI ، 200 میکرو مول از هر dNTP ، 5/0 واحد آنزیم Dynazyme П  و 1 میکرولیتر از بافر آنزیم بود. چرخه­های حرارتی در این مرحله نیز شامل دو دقیقه واسرشته سازی اولیه در 94 درجه سانتی­گراد و 36 چرخه شامل واسرشته­سازی در 94 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال در 65 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه در چرخه اول و کاهش 7/0 درجه سانتی­گراد در 13 چرخه بعدی و 56 درجه سانتی گراد برای 23 چرخه دیگر و در نهایت بسط در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 60 ثانیه بود. 5/1 میکرولیتر از محصول پی­سی­آر با حجم مساوی از بافر بارگذاری (80 درصد فرمامید، گزیلن سیانول FF یک mg/ml، بروموفنل بلو یک mg/ml، EDTA 10 میلی مول، pH 8 ) مخلوط و به مدت 5 دقیقه در دمای 92 درجه سانتی­گراد واسرشته شد. بقیه مراحل همانند روش تجزیه ریز ماهواره­ها بود.

 جدول 3-  نام و توالی آغازگرهای AFLP مورد استفاده در تحقیق حاضر.

Table 3- Name and sequence of the AFLP primers used in current study.

تجزیه و تحلیل داده‌ها

برای هر نشانگر ریزماهواره، آلل­ها در ژنوتیپ­های مورد بررسی به صورت a، b و c نامگذاری شدند. همچنین بر‌اساس نشانگر وزن مولکولی، اندازه و طول هر کدام از باندها محاسبه گردید و به هر نشانگر بسط داده شد. در روش AFLP هر ردیف باندی چند شکل به عنوان یک مکان یا نشانگر در نظر گرفته‌ شد. قطعات DNA تکثیری براساس هم‌ردیفی باندها و بصورت یک (حضور باند) و صفر (عدم حضور باند) امتیازبندی شد.  به منظور انجام تجزیه ارتباط و بررسی ارتباط داده­های ژنوتیپی حاصل از نشانگرهای ریزماهواره و AFLP و داده­های فنوتیپی ارقام انگور، و شناسایی نواحی ژنومی درگیر در کنترل آن‌ها از تجزیه رگرسیون گام به گام با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 19 استفاده شد.

نتایج و بحث

ارتباط نشانگرهای ریزماهواره­ای و صفات زراعی

تجزیه واریانس رگرسیونی رابطه معنی­داری بین تعدادی از نشانگرهای ریزماهواره و تمامی 14 صفت مورد مطالعه در ارقام انگور نشان داد. در کل 49 آلل از 18 نشانگر ریزماهواره ارتباط معنی­دار با تغییرات 14 صفت نشان دادند. وزن حبه و وزن گوشت هر کدام با 7 آلل بیشترین و صفات pH، اسید میوه، حجم آب میوه و درصد جوانه‌زنی گرده با یک آلل کمترین تعداد آلل مرتبط را تولید نمودند. همه 7 آلل مرتبط شناسایی شده برای صفات وزن حبه و وزن گوشت یکسان بودند و این آلل­ها به ترتیب 75 و 74 درصد تغییرات وزن حبه و وزن گوشت میوه را در ارقام انگور مورد بررسی تبیین نمودند.

همچنین 3 آلل مثبت مرتبط با وزن تک بذر و 5 آلل مثبت مرتبط با طول خوشه، حدود 60 درصد تغییرات این صفات را توجیه نمودند. کمترین میزان تغییرات تبیین شده توسط نشانگرهای مرتبط با به صفت pH میوه بود که حدود 9 درصد تغییرات را شامل می­شد. تعدادی از آلل­ها برای صفات مختلف مشترک بودند. به عبارت دیگر رابطه معنی­دار (مثبت یا منفی) با بیش از یک صفت داشتند (جدول 5). بعنوان مثال آلل i  جایگاه VMC6G7 دارای رابطه مثبت با صفات وزن حبه، وزن گوشت و تعداد بذر بود. آلل a جایگاه ISV4  دارای رابطه منفی با صفات تشکیل میوه و طول خوشه، آلل i در جایگاه VrZAG64 با صفات تشکیل میوه و عرض خوشه رابطه منفی و آلل b جایگاه VVMD25 برای صفات طول و وزن خوشه مشترک و دارای رابطه مثبت بودند. شناسایی نشانگرهای مشترک برای برخی صفات در این آزمایش احتمالا ناشی از اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی مکان­های مربوطه باشد (Jun et al., 2008). جایگاه VMC6G7 با بیشترین تعداد آلل مرتبط، دارای رابطه مثبت با pH میوه (آلل h )، وزن حبه، وزن گوشت میوه، تعداد بذر (آلل i) و عرض خوشه (آلل d) و رابطه منفی با طول خوشه (آلل m) بود. همچنین جایگاه VVMD8 با شش آلل مرتبط با صفات اندازه­گیری شده، دارای رابطه مثبت با وزن حبه و وزن گوشت (آلل h)، وزن تک بذر (آلل i)، درصد تشکیل میوه (آلل f) و جوانه‌زنی گرده (آللg) و دارای رابطه منفی با عرض خوشه (آلل n) بود. جایگاه ISV4 با 4 آلل مرتبط، رابطه منفی با صفات تعداد بذر (آلل d)، طول خوشه، درصد تشکیل میوه (آللa) و وزن خوشه (آلل f) نشان داد.

جدول4- ترکیبات آغازگری AFLP  مورد استفاده در تحقیق حاضر و خصوصیات آنها.

Table 4- AFLP primer combinations used in current study and their characteristics.

ارتباط نشانگرهای AFLP و صفات زراعی

تجزیه رگرسیون گام به گام، رابطه معنی­داری بین برخی نشانگرهای AFLP و صفات اندازه­گیری شده در ارقام نشان داد. از هفت جفت ترکیب آغازگری مورد استفاده، 49 باند رابطه معنی­داری با تغییرات 14 صفت نشان دادند. تعدادی از این باندها برای صفات مختلف مشترک بودند. چنانچه قبلا ذکر شد وجود نشانگرهای مشترک برای برخی صفات احتمالا ناشی از اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی مکان­های مربوطه باشد (Jun et al., 2008). وزن گوشت میوه با 11 نشانگر مرتبط بیشترین و صفات مواد جامد محلول، درصد تشکیل میوه، جوانه زنی گرده و عرض خوشه با یک نشانگر مرتبط کمترین تعداد نشانگرها را به خود اختصاص دادند (جدول 6).

جدول 5 – ضریب تبیین)  (R²   تصحیح شده و ضریب رگرسیون نشانگرهای SSR مرتبط با صفات زراعی در ارقام انگور.

Table 5- Adjusted R² and regression coefficient of SSR markers associated with agronomical traits in grapevine varieties.

   * حروف داخل پرانتز آلل‌های مرتبط با صفت در هر مکان ریزماهواره را نشان می‌دهد.

یازده نشانگر مرتبط شناسایی شده برای صفت وزن گوشت در مجموع 91 درصد تغییرات این صفت را در ارقام انگور تبیین کردند. همچنین 6 نشانگر مرتبط با pH میوه، 5 نشانگر مرتبط با وزن حبه و 5 نشانگر مرتبط با وزن تک بذر به ترتیب 68، 66 و 61 درصد از تغییرات کل این صفات را تبیین نمودند. کمترین میزان تغییرات توجیه شده (15 درصد) توسط یکی از نشانگرهای مرتبط با صفت مواد جامد محلول بود.

برخی از نشانگر های AFLP با چندین صفت رابطه معنی­داری داشتند. نشانگر شماره 56 مربوط به ترکیب آغازگری E31-M32 دارای رابطه مثبت با وزن حبه، وزن گوشت و وزن تک بذر بود. همچنین نشانگر شماره 38 حاصل از ترکیب آغازگری E38-M36 رابطه مثبت با مقدار اسید میوه و رابطه منفی با وزن گوشت نشان داد. نشانگر شماره 12 از همین ترکیب آغازگری دارای رابطه مثبت با وزن حبه و رابطه منفی با درصد تشکیل میوه در گرده افشانی آزاد بود. نشانگر 47 از آغازگرE34-M38  نیز رابطه منفی با وزن و گوشت حبه نشان داد. بیشترین و کمترین تعداد نشانگرهای AFLP مرتبط با صفات، به ترتیب مربوط به ترکیبات آغازگری E38-M36 (15 نشانگر مرتبط) و ترکیبات آغازگری E34-M35 و E34-M32 (یک نشانگر مرتبط) بود. از 15 نشانگر ترکیب آغازگری E38-M36، تعداد 7 نشانگر با 6 صفت رابطه مثبت نشان دادند. در بررسی ارتباط بین داده­های مولکولی و صفات زراعی در انگور گزارش شد که صفات اندازه حبه و خوشه با تنوع مولکولی همبستگی دارند (Siret et al., 2002). 

مطالعه حاضر اولین گزارش در استفاده از تجزیه ارتباط برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات مورفولوژیک در ارقام انگور ایرانی می­باشد. نتایج مطالعه حاضر و تحقیقات یاد شده نشان می­دهد که چنانچه از آغازگرهای بیشتر و جمعیت­های بزرگتر و متنوع­تری استفاده شود می­توان نشانگرهای دارای همبستگی بالا و قابل اعتماد با صفات مورد مطالعه را شناسایی و از آنها در پژوهش­های دیگر استفاده نمود. البته لازم است نشانگرهای مرتبط شناسایی شده در چنین مطالعاتی، در جمعیت­های بزرگ و همچنین در جمعیت­های در حال تفرق مورد آزمون قرار گیرد تا از پیوستگی آنها با صفات مربوطه اطمینان بعمل آید و بدین ترتیب کارآیی استفاده از این نشانگرها در برنامه­های اصلاحی افزایش یابد.                همچنین با توجه به اینکه اکثر نشانگرهای تولیدی توسط آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق بر روی صفات مورد مطالعه مؤثر بودند،

جدول 6- ضریب تبیین)  (R²   تصحیح شده و ضریب رگرسیون نشانگرهایAFLP مرتبط با صفات زراعی در ارقام انگور.

Table 6- Adjusted R² and regression coefficient of associated AFLP markers with agronomical traits in grapevine varieties.

   * اعداد داخل پرانتز آلل‌های مرتبط با صفت در هر ترکیب آغازگری را نشان می‌دهد.

بنابراین احتمال دارد بتوان از این نشانگرها و آغازگرهای مربوط به آنها در برنامه­های اصلاحی انگور برای شناسایی والدین مناسب برای تهیه جمعیت­های نقشه­یابی و تولید ارقام هیبرید استفاده کرد. همچنین انجام چنین مطالعاتی می­تواند دانش پایه­ای در مورد ارقام انگور زراعی و ژنوتیپ­های ایرانی را بهبود بخشیده و در آینده راهگشا و راهنما برای برنامه­های اصلاحی انگور در کشور باشد.