تاثیر تغییرات تک نوکلئوتیدی در ژن‌های کاپاکازئین، استئوپونتین وPPARGC1α روی صفات تولید شیر و کیفیت تولید پنیر نژاد براون سوئیس

تاثیر تغییرات تک نوکلئوتیدی در ژن­های کاپاکازئین، استئوپونتین وPPARGC1α روی صفات تولید شیر و کیفیت تولید پنیر نژاد براون سوئیس

سونیا زکی زاده*¹، میرجلال هاشمی²، هادی غلامی²، محسن قدس روحانی³، رضا وکیلی⁴

^{1 و 3} استادیاران گروه علوم دامی و صنایع غذایی موسسه آموزش عالی علمی کاربردی جهاد کشاورزی

^{2، 4} فارغ التحصیلان کارشناسی ارشد و استادیار گروه علوم دامی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد کاشمر

تاریخ دریافت: 29/03/1392، تاریخ پذیرش: 23/09/1392

چکیده

شیر از دیرباز به عنوان غذای کامل و تامین کننده بخشی از نیازهای تغذیه­ای روزانه انسان مورد توجه بوده است. یکی از ترکیبات مهم شیر پروتئین­ها می­باشند که در صنایع فرآوری شیر و تکنولوژی تولید محصولات شیری مانند پنیرسازی، فاکتور مهمی بشمار می­آیند. عوامل متعددی از جمله ژنتیک می­توانند بر مقدار و ترکیبات شیر و نهایتا کمیت و کیفیت پنیر تاثیر گذارند. در این راستا، از طریق تکنیک­های ژنتیک مولکولی نواحی متعددی روی ژنوم گاو از جمله کروموزوم 6 شناسایی شده است. در این پژوهش تاثیر 3 ژن کاپاکازئین، اوستئوپونتین و PPARGC1α از کروموزوم فوق روی صفات تولیدی شیر و راندمان تولید پنیر بررسی شد. استخراج DNA به روش استخراج نمکی از نمونه خون 100 راس گاو براون سوئیس انجام شد. ژنوتیپ­ها به روش PCR-RFLP و با استفاده از آنزیم­های HinfI، BsurI،NheI و BsrI تعیین شدند. ارزش­های اصلاحی با نرم افزار ِDFREML برآورد و چهار فاکتور راندمان، درصد چربی و پروتئین و ماده خشک پنیر اندازه­گیری شدند. همچنین، ارتباط چندشکلی­ها با ارزش اصلاحی صفات و کیفیت محصول پنیر در سطح معنی­داری 5% با رویه GLM بررسی گردید. فراوانی­های ژنی و ژنوتیپی محاسبه شد و نتایج نشان داد که بجز کاپاکازئین بقیه جایگاه­ها در حالت تعادل هاردی-واینبرگ قرار داشتند. در این تحقیق ژنوتیپ روی محصول پنیر اثر معنی­دار نداشت اما تاثیر همزمان ژنوتیپ PPARGC1α -T19C و کاپاکازئین روی ارزش­های اصلاحی تولید شیر معنی­دار بود. ارتباط معنی­دار بین چندشکلی­های تک نوکلئوتیدی با صفات تولید شیر، راهکار مناسبی جهت بهبود ارزیابی­های گاو شیری است. استفاده از روش­های­ شناسایی تک نوکلئوتیدهای متراکم در پژوهش­های تکمیلی، توصیه می­شود.

واژه­های کلیدی: صفات تولیدی شیر، راندمان تولید پنیر، کاپاکازئین، اوستئوپونتین، PPARGC1α.

مقدمه

امروزه اهمیت وجود شیر و فراورده های آن در سبد غذایی خانوارها بر کسی پوشیده نیست. در نژادهای مختلف، ترکیبات اصلی شیر متفاوت است. بدون شک تمام پدیده­های بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی که ترکیب خون را تحت تاثیر قرار می­دهند، بر ترکیب شیر نیز موثرند. پروتئین­ها از ترکیبات مهم شیر هستند که در صنایع فرآوری شیر و تکنولوژی تولید محصولات شیری از جمله پنیرسازی اهمیت به سزایی دارند. پروتئین اصلی شیر کازئین نام دارد که در فرآیند تولید پنیر نقش اساسی دارد. کازئین حدود 80% از پروتئین­های شیر را به خود اختصاص داده و دارای اشکال متفاوتی است. گزارش­های متعددی راجع به تاثیر مشخص تفاوت­های ژنتیکی پروتئین­های شیر بر پایداری حرارتی، ویژگی­های انعقادی و غلظت و توزیع ترکیبات شیر وجود دارد (Kűbarsep et al., 2005; Wdholm et al., 2006; Buchberger and Dovc, 2000; Bonfatti et al., 2010). تاکنون نواحی متعددی روی ژنوم گاو شناسایی شده­اند که روی مقدار و ترکیبات شیر موثرند. از این میان می­توان به ژن­هایی روی کروموزوم 6 اشاره نمود. کروموزوم 6 دارای 11 میلیون جفت باز است که ژن­های مربوط به پروتئین شیر در ناحیه غیرقابل ترجمه  3 کروموزوم قرار دارند. مهمترین ژنی که در این خوشه روی مقدار و درصد پروتئین شیر تاثیر می­گذارد، ژن کاپاکازئین است. پروتئین کاپاکازئین با 179 اسیدآمینه از مهم­ترین پروتئین­های شیر می­باشد که توسط سلول­های اپی تلیال غدد پستانی سنتز شده و نقش عمده­ای در فرآیندهای انعقاد شیر و پنیرسازی دارد. در بررسی کل ژنوم گاو بیان شده است که نقاط عمده­ای از کروموزوم­های 5، 6، 11 و 14 با صفت درصد پروتئین شیر در ارتباط هستند که در این رابطه کروموزوم 6 به طور معنی­داری با هر 6 نوع پروتئین مهم شیر (کازئین­ها و پروتئین­های آب پنیر) مرتبط است (Schopen et al., 2011). ژن کاپاکازئین در منطقه 3َ مجموعه کازئین و در فاصله­ی 6/5 سانتی مورگان از کازئین S1α قرار گرفته و با طول 13 کیلوباز، دارای 5 اگزون و 4 اینترون است. تاثیر معنی­دار چندشکلی­های این ژن روی تولید شیر، مقدار و درصد پروتئین و مقدار و درصد چربی گزارش شده است (Tsiaras et al., 2005؛ Schopen et al., 2011).

از طرف دیگر، ژن PPARGC1A نیز روی کروموزوم 6 قرار گرفته و نقش کلیدی در فعال­سازی گیرنده­های هورمونی هسته­ای و رونویسی فاکتورهای تنظیم کننده هموستازی انرژی دارد (Weikard et al., 2004). این ژن در تعادل محیط داخلی بدن، متابولیسم اکسیداتیو و سوخت و ساز چربی و گلوکز تاثیر گذار است و در اندام­های فعال متابولیکی به میزان زیادی بیان می­شود (Pasandide et al., 2010, a, b; Komisarek et al., 2009). از تعداد 11 چندشکلی که تاکنون برای این ژن شناسایی شده است، مشخص شده که جهش نقطه­ای T/C در موقعیت 1892 اینترون 9 تاثیر معنی­دار روی شیر و ترکیبات آن در نژادهای مختلف گاو دارد (Weikard et al, 2004; Komisarek and Dorynek, 2009; Pasandideh et al., 2011).

اوستئوپونتین (OPN) که قبلا به نام­های سیالوپروتئین استخوانی[1]،  فسفوپروتئین ترشحی-1[2] و فعال کننده-1 سلول­های T[3] نامیده می­شد، گلیکوپروتئینی اسیدی و فاکتور مهمی در تغییر حالت استخوان و محکم شدن استئوکلاست، چسبیدگی سلولی، تنظیم شیمیایی بدن، حفظ سلول­ها، تغییر حالت بافت­ها، تنظیم التهاب، تولیدمثل (Kilian et al., 2010)، لقاح و باروری (Khatib et al.,2009) و رشد و نمو جنین است (Leonard et al.,2009). بیان این ژن در غدد پستانی از هنگام زایمان شروع می­شود و در تمام طول شیردهی افزایش پیدا می­کند (Cohen-Zinder et al., 2005). ژن اوستئوپونتین روی کروموزوم 6 واقع بوده و با دارا بودن حدود 7000 جفت باز و 6 اگزون، پروتئینی با 278 اسیدآمینه را کد می­کند (شماره شناسایی NW_255516). مشخص شده است که چندشکلی تک نوکلئوتیدی درناحیه اینترون 4 و موقعیت باز 8514 روی تولید شیر و شمارش سلول­های بدنی شیر تاثیر دارد (Leonard et al.,2009؛ Nasiri et al., 2010a؛ Schnabel et al., 2005). طبق پژوهش­های انجام شده آلل C بیشتر روی ترکیبات، پروتئین وچربی شیر وآللT غالباٌ روی رشد بدن تأثیرگذار است (Khatib et al., 2007; Pasandideh et al, 2011; Leonard et al.,2009).

ژن­های کاپاکازئین، PPARGC1A و استئوپونتین (OPN) از جمله ژن­های کاندیدا برای صفات مربوط به ترکیبات شیر هستند و به دلیل موقعیت قرارگیری آنها روی کروموزوم 6 گاو (شکل 1) و تاثیری که از آنها روی صفات تولیدی و ترکیب شیر گزارش شده است، هدف از این پژوهش مطالعه تعیین فراوانی ژنی و ژنوتیپی در جایگاه­های اگزون 4 کاپاکازئین، اینترون 9 و ناحیه´3 ژن PPARGC1A و اینترون 4 ژن OPN و بررسی تاثیر همزمان هاپلوتیپ­های این 3 ژن روی مقدار و ترکیبات شیر و همین طور کیفیت و راندمان تولید پنیر، درصد پروتئین، چربی و ماده خشک پنیر به دست آمده از شیر گاوهای نژاد براون سوئیس است.

مواد و روش­ها

جمعیت مورد مطالعه و خونگیری

در این آزمایش به صورت تصادفی از تعداد 100 راس گاو شیری نژاد براون سوئیس مجتمع آموزش جهادکشاورزی خراسان رضوی که دارای ثبت مشخصات و شجره، رکورد تولید، چربی و پروتئین شیر بودند، استفاده شد.

نمونه خون کامل ورید دمی، از هر گاو و با استفاده از ونوجکت­های خلادار حاوی ماده ضد انعقاد EDTA جمع آوری شد. نمونه­ها روی یخ به آزمایشگاه منتقل و سپس در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری گردیدند. استخراج DNA از 3 میلی­لیتر خون کامل و به روش استخراج نمکی تغییر یافته (Javanrouh et al., 2006) انجام گرفت. کیفیت و کمیت نمونه­های DNA استخراج شده با روش اسپکتروفتومتر و ژل آگارز 1% تعیین شدند.

اجزای واکنش و شرایطPCR

اجزای واکنش برای تکثیر تمام ژن­ها شامل 50 نانوگرم بر میکرولیتر DNA ژنومی، بافر 1XPCR، Mgcl₂ 5/2 میلی مولار، 200 میکرومولار dNTP، 5/0 واحد آنزیم Taq پلی مراز، 5 پیکومول بر میکرولیتر از هر کدام از آغازگرهای رفت و برگشت و مابقی حجم تا 25 میکرولیتر آب دوبار تقطیر بود. تنها تفاوت این بود که برای کاپاکازئین از 6/0 واحد آنزیم Taqپلی مراز و برای PPARGC1α نیز از 1 پیکومول بر میکرولیتر از آغازگرهای رفت و برگشت استفاده گردید.

شرایط دمایی در نظر گرفته شده و تعداد سیکل­های تکثیر به تفکیک هر جایگاه در جدول 1 آورده شده است. آغازگرهای مورد استفاده به صورت لیوفیلیزه (شرکت  Generay Biotech، آلمان) تهیه و طبق دستور سازنده آماده شد. مشخصات پرایمرها، محل و طول قطعه تکثیری به همراه آنزیم برش دهنده هر جایگاه در جدول 2 آورده شده است.

هضم آنزیمی با استفاده از روش RFLP

تمامی آنزیم­های برشی مورد استفاده در این پژوهش ساخت شرکت Fermentas (آلمان) بودند. واکنش هضم آنزیمی طبق توصیه شرکت سازنده و در حجم نهایی 20 میکرولیتر شامل 3 میکرولیتر محصول PCR، 2 میکرولیتر بافر مخصوص و 6/0 میکرولیتر آنزیم مربوطه و مابقی حجم آب دوبار تقطیر، انجام شد. فرآیند هضم برای تمامی آنزیم هادر دمای 37 درجه سانتیگراد و در طول شب انجام شد. تنها هضم فرآورده PCR ژن OPN در دمای 65 درجه سانتیگراد و به مدت 16 ساعت انجام شد.

تعیین ژنوتیپ، فراوانی آللی و ژنوتیپی

برای تعیین ژنوتیپ گاوها مقدار 4 میکرولیتر از محصول هضم آنزیمی روی ژل آگارز 3 درصد مدت 50 دقیقه با ولتاژ 90 الکتروفورز شد. پس از رنگ آمیزی ژل­ها با رنگ اتیدیوم بروماید و مشاهده توسط دستگاه ژل داک، ژنوتیپ هر فرد به طور مستقیم از روی ژل تعیین شد. سپس با استفاده از نرم­افزار PopGen  نسخه 31/1، فراوانی­های آللی و  ژنوتیپی به ازاء هر جایگاه و به روش شمارش مستقیم محاسبه شدند. همچنین، با استفاده از نرم­افزار مذکور جمعیت مورد مطالعه از نظر تعادل هاردی واینبرگ در سطح معنی­داری 95% بررسی شد.

.

شکل 1- موقعیت قرارگیری ژن­های کاپاکازئین، OPN (یا SPP1) و PPARGC1A روی کروموزوم 6 (منبع سایت ncbi).

Figure 1- The location of kappa casein, OPN (or SPP1) and PPARGC1A on chromosome 6 (reference: ncbi site).

جدول 1- شرایط واکنش به تفکیک هر جایگاه ژن.

Table 1- PCR conditions of each locus.

^*  این دو مرحله فقط یک بار انجام می­شوند و جزء چرخه نیستند. ^§ کاهش دمای اتصال آغازگر به میزان 2 درجه سانتیگراد در هر چرخه بود.

جدول 2- مشخصات پرایمرها، توالی آغازگرها، طول قطعه تکثیر شده و آنزیم برشی مورد استفاده برای هر جایگاه.

Table 2- Characters of the primers, length of amplification and desirable restriction enzymes.

^* Untranslated region

پیش­بینی ارزش­های اصلاحی و ارتباط آنها با انواع ژنوتیپ در جایگاه­های مورد بررسی

ارزش اصلاحی صفات تولید شیر، درصد چربی و پروتئین شیر دوره اول شیردهی1024 گاو حاصل از 55 پدر و 220 مادر، با استفاده از مدل 1 نرم افزار DFREML پیش­بینی شد. مدل شامل اثرات ثابت سال-فصل زایش و متغیر کمکی تعداد روزهای شیرواری و اثرات تصادفی شامل اثر حیوان و باقیمانده بودند.

Y = Xb + Za + e       (مدل 1)

Y: بردار صفات مشاهده شده؛ b: بردار عوامل اثرات ثابت (سال-فصل زایش، تعداد روزهای شیردهی)؛ X: ماتریسی که b را به Y ارتباط می­دهد؛ a: بردار ارزش اصلاحی برای اثرات ژنتیک افزایشی مستقیم؛  Z: ماتریسی که اثرات ژنتیکی افزایشی مستقیم را به Y ارتباط می­دهد.

از ارزش­های اصلاحی تعداد 100 گاو گله که تعیین ژنوتیپ شده بودند، برای بررسی ارتباط بین ارزش اصلاحی صفات با چندشکلی در جایگاه­های مورد مطالعه، استفاده گردید. تجزیه و تحلیل آماری توسط نرم­افزار SAS (2000) و با استفاده از روال مدل خطی تعمیم یافته[4] (GLM) و بر اساس مدل خطی زیر، در سطح معنی­داری 95 درصد انجام شد. همواره ژنوتیپ کاپاکازئین به عنوان اثر ثابت جهت تصحیح تاثیر ژن عمده در مدل گذاشته شد و عامل دیگر لحاظ شده در مدل، ژنوتیپ در جایگاه OPN یا PPARGC1A بود. در مورد PPARGC1A هاپلوتیپ دو جایگاه اینترون 9 و 3`-UTR نیز بررسی شد.

Y_ijk= ارزش اصلاحی برآورده شده برای صفات تولید شیر، درصد چربی و پروتئین؛ μ= میانگین جامعه؛ KCN_i= اثر ثابت ژنوتیپ iام در جایگاه چندشکلی کاپاکازئین؛ Bj= اثر ثابت ژنوتیپ jام در یک جایگاه چندشکلی از ژن­های اوستئوپونتین یا PPARGC1A.

برای بررسی هاپلوتیپ­های ژن PPARGC1A و محاسبه مقدار عدم تعادل پیوستگی، از نرم افزار Haploview 4.04 (Barrett et al, 2005) استفاده شد.

کیفیت و راندمان تولید پنیر

جهت بررسی اثر چندشکلی هاپلوتیپ­­های شناسایی شده روی چهار فاکتور مهم پنیرسازی (راندمان تولید پنیر، ماده خشک پنیر، درصد چربی و درصد پروتئین پنیر) تعداد 5 راس از گاوهایی که ژنوتیپ­های مشاهده شده را پوشش می­دادند، انتخاب و در قالب طرح کاملا تصادفی با 5 تیمار و 3 تکرار از شیر نمونه گرفته و پنیرسازی انجام شد. نحوه انتخاب این گاوها، پس از مشخص شدن ژنوتیپ­ها و در بخش نتایج توضیح داده شده است.

پنیرسازی مشابه فرآیند متداول صنعت و در پایلوت تحقیقاتی شیر مجتمع آموزش جهاد کشاورزی خراسان رضوی انجام شد. با توجه به ظرفیت کارخانه، روزانه از تعداد 3 نمونه شیر متعلق به 3 گاو به مقدار وعده شیردوشی کامل (حدود 7 کیلوگرم شیر)، جهت تولید پنیر استفاده شد که این روند به مدت 5 روز کاری ادامه داشت. پس از تعیین ترکیبات شیر (پروتئین، چربی و مواد جامد)، جهت سالم سازی آن از روش پاستوریزاسیون 65 درجه سانتی­گراد به مدت 30 دقیقه استفاده گردید (Ghods Rohani, 2006). شیر پس از پاستوریزاسیون، تا دمای حدود 35 درجه سانتی­گراد سرد شد و مقدار 1% استارتر مخلوط (ترموفیل و مزوفیل) به تیمارها افزوده شد. پس از گذشت حدود 30 دقیقه و تولید اسید (زمان پیش رسی) pH به 6/4 رسید. سپس مایه پنیر به میزان 001/0 درصد لیتر و کلرید کلسیم به میزان 01/0 درصد لیتر به شیر اضافه گردید. شیر تلقیح شده در ظروف هفت کیلویی پرگردید و در انکوباتور در دمای 32 درجه سانتی­گراد نگهداری شد تا دلمه تشکیل گردد.

پس از اطمینان از آمادگی لخته، دلمه­ها به آرامی ‌توسط ابزارهای مخصوصی به مکعب‌های حدود 5/1 تا 2 سانتی­متری برش داده شد. به منظور آبگیری لخته­ها، محتویات درون قالب­های سوراخ­داری که روی صفحات مشبک قرار داشت ریخته شد و عمل آبگیری به تدریج انجام گرفت. سپس قطعات پنیر در آب نمک 14 درصد قرار گرفت و نمونه­ها به سردخانه منتقل و در دمای زیر 7 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند.

تاثیر هاپلوتیپ­ها روی صفات راندمان پنیرسازی و کیفیت پنیر تولیدی

نحوه محاسبه راندمان تولید پنیر، به صورت اندازه­گیری وزن شیر و پنیر تولید شده هر تکرار به صورت جداگانه بود. مقدار کمی از پنیر تولید شده هر نمونه برای محاسبه ماده خشک، درصد چربی و درصد پروتئین آن، به آزمایشگاه کنترل کیفی مواد و خوراک دام و طیور استان خراسان رضوی فرستاده شد و مابقی آن در آب نمک 15 درصد نگهداری گردید. آنالیز آماری تاثیر هاپلوتیپ­ها روی صفت عملکرد تولید پنیر و شاخص­های مربوط به کیفیت آن، در نرم افزار SAS به طور جداگانه برای هر یک از صفات مورد نظر در قالب طرح کاملا تصادفی آنالیز و در سطح معنی­داری 5% انجام شد.

مده آز

نتایج و بحث

تعیین ژنوتیپ و محاسبه فراوانی ژنی و ژنوتیپی

نمونه­های DNA استخراجی از کمیت و کیفیت مناسبی برخوردار بودند. همچنین تکثیر قطعات مورد نظر در هر جایگاه و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی با موفقیت انجام شد. پس از هضم قطعات تکثیر شده، ژنوتیپ هر جایگاه تعیین گردید (شکل 2). برآورد فراوانی آللی، ژنوتیپی، هتروزیگوتی مشاهده شده و مورد انتظار و نیز تعادل هاردی واینبرگ در جدول 3 آورده شده است. همانطور که مشاهده می­شود به جز در جایگاه ژن کاپاکازئین، در سایر جایگاه­ها جامعه در حالت تعادل بود. در پژوهش حاضر فراوانی آلل T و C ژن اوستئوپونتین (OPN) به ترتیب 54/0 و 46/0 برآورد شد. در سایر تحقیقات در نژاد هلشتاین نیز حد متوسط این دو ژن گزارش شده است (Leonard et al., 2009؛ Nasiri et al., 2010؛ Khatib et al., 2007; Pasandideh et al., 2011a ). اما در دو نژاد گاو بومی ترکیه مقدار آلل C کمتر بود (16/0 و 26/0) (Oztabak et al., 2008). فراوانی آللی A و C جایگاه PPARGC1A-A968C 786/0 و 214/0 برآورد گردید. بیشترین فراوانی ژنوتیپی مربوط به AA و کمترین فراوانی مشاهده شده مربوط به ژنوتیپ CC بود، به طوری که تنها دو گاو دارای این ژنوتیپ بودند. بیشتر بودن فراوانی آلل A نسبت به C در پژوهش­های دیگر نیز گزارش شده است (Komisarek et al., 2009؛ Kowalewska et al., 2010؛ Pasandide et al., 2011b) که با نتایج این پژوهش مطابقت داشت اما با نتایج Khatib و همکاران  (2007)همسو نبود. فراوانی آللی T و C در جهش T19C موقعیت 1892 اینترون 9  ژن PPARGC1A به ترتیب 379/0 و 621/0 برآورد گردید. بیشتر بودن فراوانی آلل C در این مطالعه با نتایج برخی از پژوهش­ها مطابقت داشت (Pasandide et al., 2011a؛ Khatib et al.- 2007؛ Schennink et al., 2009؛ Komisarel and Dorynek, 2009) و با برخی دیگر موافق نبود (Kowalewska, 2010). خطیب و همکاران (2007) دلیل خارج بودن جامعه مورد مطالعه از تعادل هاردی-وینبرگ را بیشتر بودن فراوانی ژنوتیپ CC ذکر کردند. این نکته در مورد جمعیت هلشتاین اطراف استان­های تهران و اصفهان نیز مشاهده شد (Pasandide et al, 2010b).

جدول 3- فراوانی آللی، ژنوتیپی، هتروزیگوتی مشاهده شده و مورد انتظار و تعادل هاردی واینبرگ.

Table 3- Allele and genotype frequencies (Freq.), observed (Obs) and expected (Exp.) heterozygosity (Het) and Hardy-Weinberg equilibrium.

^*(p<0.05)

در مطالعه حاضر فراوانی آللی B کاپاکازئین از آلل A بیشتر بود و به ترتیب برابر 648/0 و 352/0 محاسبه شد که با نتایج پژوهش­های انجام شده روی نژاد هلشتاین مطابقت ندارد (Tsiaras et al., 2005؛Alinaghizadeh et al., 2007؛ Rajesh et al., 2007؛ Daniela et al., 2010؛ Mohammadi et al., 2009; Dogru and Ozdemir, 2009). فراوانی آلل B در نژادهای بوس ایندیکوس گلپایگانی 32/0(Zakizadeh et al., 2006) ، مازندرانی 35/0 (Zakizadeh et al., 2006) و سیستانی 36/0 (Alinaghizadeh et al., 2007) و در نژادهای بوس تائوروس سیمنتال 24/0 (Trakovicka et al., 2012)، براون سوئیس 495/0 (Dogru and Ozdemir, 2009) و سرابی 57/0 (Zakizadeh et al., 2006) گزارش شده است. فراوانی این آلل در  گاوهای محلی کرمان 30/0 (Mohammadi et al., 2009) و در آمیخته­های بوس تائوروس و بوس ایندیکوس برابر 34/0 و کمتر از آلل A  گزارش شده است (Rajesh et al., 2007). در پژوهش دیگری که روی پنج نژاد گاو روسی انجام شد، فراوانی آلل B از 16/0 تا 5/0 گزارش گردید (Sulimova et al., 2007).

تفاوت­های مشاهده شده در فراوانی آللی جایگاه­ها می­تواند به دلیل محتوای ژنتیکی متفاوت نژادها و یا تعداد نمونه بررسی شده در تحقیقات مختلف باشد. جمعیت مورد مطالعه در این پژوهش از نظر جایگاه­های اوستئوپونتین و PPARGC1A در حالت تعادل بودند اما فراوانی آللی کاپاکازئین متعادل نبود. دلیل این امر می­تواند به دلایل نمونه­گیری از جمعیت، تلاقی­های غیرتصادفی و یا فشار انتخاب روی تولید شیر باشد.

تاثیر ژنوتیپ روی صفات تولیدی

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که در بررسی­ تاثیر جایگاه­های اوستئوپونتین و پروموتور ژن PPARGC1α-A968C با کاپاکازئین روی صفات تولید شیر، درصد چربی و درصد پروتئین هیچگونه ارتباط معنی­داری بین ارزش اصلاحی صفات و ژنوتیپ­ها یافت نشد، در حالی که هاپلوتیپ PPARGC1A-T19C و کاپاکازئین با  ارزش­های اصلاحی صفت تولید شیر، ارتباط معنی­داری را نشان داد، اگرچه روی سایر صفات تاثیر نداشت ((P<0.05.  بیشترین و کمترین ارزش اصلاحی مقدار تولید شیر به ترتیب مربوط به ژنوتیپ­های هموزیگوت­ CSN1S3-AA/PPARGC1-TT و CSN1S3-AB/PPARGC1-CC بود (جدول 4). تاثیر سایر جایگاه­ها روی ارزش اصلاحی صفات مورد بررسی معنی­دار نبود (اطلاعات آورده نشده است)

.

جدول 4-  میانگین حداقل مربعات ژنوتیپ­هایPPARGC1α-T19C و کاپاکازئین با ارزش­های اصلاحی صفت تولید شیر.

Table 4- Least square means of PPARGC1α-T19C and k-casein with breeding values of milk.

^**معنی­دار در سطح احتمال 1%.

مطالعات گذشته بیانگر این مطلب است که آلل C ژن استوپونتین با افزایش درصد چربی (Leonard et al., 2007؛ Khatib et al., 2007) و درصد پروتئین (Leonard et al., 2007؛ Schnabel et al., 2005؛ Khatib et al., 2007) مرتبط است اما برخی گزارشات نیز حاکی از عدم وجود ارتباط بین ژنوتیپ­های این ژن با مقدار تولید شیر (Leonard et al., 2007)، مقدار چربی (Leonard et al., 2007؛ Khatib et al., 2007)، درصد چربی (Cohen-Zinder et al., 2005)، مقدار پروتئین (Leonard et al., 2007؛ Khatib et al., 2007)، درصد پروتئین (Cohen-Zinder et al., 2005) و تعداد سلول­های سوماتیک (Leonard et al., 2007؛ Khatib et al., 2007) است. در تحقیقی گزارش شده است اگرچه تاثیر آلل C روی مقدار تولید شیر معنی­دار نبود اما تمایل به کاهش مقدار شیر با توجه به همبستگی منفی بین این صفت با درصد پروتئین شیر، منطقی به نظر می­رسد (Leonard et al., 2005). گزارش شده است که افراد هتروزیگوت با ژنوتیپ CT نسبت به دو ژنوتیپ دیگر درصد چربی تصحیح شده برای دو بار دوشش و درصد پروتئین تصحیح شده 305 روز بیشتری تولید کرده­اند (Pasandideh et al., 2011a).

گزارش شده است که آلل A کاپاکازئین بر خلاف آلل B با افزایش تولید شیر (Matejicek et al., 2007 ؛ Nijole et al., 2007؛ Tsiaras et al., 2005)، درصد پایین پروتئین شیر (Matejicek et al., 2007 ؛ Tsiaras et al., 2005) و افزایش چربی (Nijole et al., 2007؛ Tsiaras et al., 2005) در ارتباط است، اگرچه روی تولید و درصد لاکتوز شیر تاثیر ندارد (Tsiaras et al., 2005). از طرف دیگر، آلل B با کیفیت بالای شیر (Matejicek et al., 2007) مرتبط می­باشد. اثر مشابه ژن­ کاپاکازئین روی اکثر پارامترهای تولیدی، کیفی، انعقادی شیر و اجزای ماده خشک معنی­دار گزارش شده است (Matejicek et al., 2007)، اگرچه در برخی پژوهش­ها چنین تاثیر مشاهده نشده است (Trakovicka et al., 2012).

در تحقیق دیگر ژنوتیپ BB کاپاکازئین با تولید بالای شیر با چربی کم و تولید متوسط پروتئین در ارتباط بود (Rajesh et al., 2007). در مجموع گاوهای با ژنوتیپ BB در مقایسه با ژنوتیپ AA از نظر تولید شیر سودمندتر بوده و میانگین پروتئین و چربی مناسب­تری دارند. علیرغم تاثیر منفی که ژنوتیپ BB روی تولید شیر دارد اثر اصلی آن روی چربی و پروتئین شیر و همچنین ترکیب پروتئین شیر است (Nijole et al., 2007). اگرچه بررسی­های گذشته (Matejicek et al., 2007؛  Alinaghizadeh et al., 2007؛ Rajesh et al., 2007؛ Nijole et al., 2007؛ Daniela et al., 2010؛ Dogru and Ozdemir, 2009) ارتباط معنی­داری بین ژنوتیپ­های کاپاکازئین و به خصوص آلل B با تولید شیر و ترکیبات آن نشان داده است، در این پژوهش ارتباط معنی­داری در سطح 95 درصد اطمینان بین ژنوتیپ با ارزش اصلاحی صفات تولید شیر، درصد چربی و درصد پروتئین بدست نیامد اما در بررسی هاپلوتیپ کاپاکازئین و اینترون 9 ژن PPARGC1α با ارزش­های ارثی صفت تولید شیر، ارتباط معنی­دار بود (P<0.01). بیشترین و کمترین ارزش اصلاحی تولید شیر برای هاپلوتیپ­های AATT و ABCC به ترتیب معادل  2/1359 و 4/147- مشاهده شد.

پژوهش حاضر با نتایج برخی تحقیقات در رابطه با تاثیر چندشکلی A968C ژن PPARGC1α روی تولید شیر (Khatib et al., 2007، Komisawrek et al., 2009؛ Weikard et al., 2004)، درصد چربی (Khatib et al., 2007؛Komisawrek et al., 2009؛  Weikard et al., 2004) و درصد پروتئین (Komisawrek et al., 2009) و همچنین، در مورد ارتباط چندشکلی T19C این ژن با تولید شیر (Khatib et al., 2007، Komisawrek et al., 2009؛ Schennink et al., 2009)، درصد چربی (Khatib et al., 2007، Komisawrek et al., 2009؛ Weikard et al., 2004؛ Schennink et al., 2009) و درصد پروتئین (Khatib et al., 2007؛ Weikard et al., 2004؛ Schennink et al., 2009) مشابهت داشت. در حالی که در تحقیقی دیگر، ارتباط معنی­دار بین چندشکلی T19C و تولید چربی شیر یافت شد، اگرچه روی درصد چربی شیر تاثیری نداشت (Weikard et al., 2004). همچنین، نتایج معنی­داری از ارتباط بین چندشکلی­های A968C و T19C و میزان عدم برگشت در تلیسه­ها و اثر کم­تری از تاثیر این جایگاه روی تولید پروتئین گزارش شده است (Komisawrek et al., 2009).

تعیین هاپلوتیپ­ها

از میان 8 نوع هاپلوتیپ­های (آلل­های) محتمل در بررسی توام دو جایگاه چندشکل PPARGC1α و کاپاکازئین (2×2×2)، مشخص شد که 3 هاپلوتیپ (CSN3A- PPARGC1α19C- PPARGC1α 968A/ CSN3B-PPARGC1α19-C-PPARGC1α968A/ CSN3B-PPARGC1α19T-PPARGC1α968A) وجود دارد. برای دو جایگاه اوستئوپونتین و کاپاکازئین، هر 4 نوع  هاپلوتیپ (آلل) (CSN3A-OPNC/ CSN3A-OPNT/ CSN3B-OPNC/ CSN3B-OPNT) مشاهده شد. سایر هاپلوتیپ­های CSN3A- PPARGC1α19C- PPARGC1α 968C/ CSN3A- PPARGC1α19T-PPARGC1α968A/ CSN3A- PPARGC1α19T-PPARGC1α968C / CSN3B- PPARGC1α19C-PPARGC1α968C/ CSN3B- PPARGC1α19T-PPARGC1α968C مشاهده نشدند؛ اگرچه احتمال وجود آنها به دلیل هتروزیگوت بودن برخی از گاوها رد نمی­شود، اما قابل تشخیص نمی­باشند. بیشترین فراوانی هاپلوتیپی مربوط به KCN-B/c.3359C (458/0) بود، اما نمونه­ای با هاپلوتیپ KCN-A/c.3359A دیده نشد (جدول 5).

با توجه به این موضوع که تاثیر ژن­های PPARGC1α و اوستئوپونتین هرکدام جداگانه به همراه ژن کاپاکازئین بررسی شدند، این امکان وجود داشت گاوی که برای هاپلوتیپ PPARGC1α/کاپاکازئین انتخاب می­شود، برای هاپلوتیپ اوستئوپونتین/کاپاکازئین نیز انتخاب شود. این امر باعث کم شدن تعداد نمونه­های مورد نیاز شد.  به همین علت و با توجه به اینکه برخی از هاپلوتیپ­ها در نمونه گرفته شده وجود نداشت، از تعداد 5 راس گاو که دارای ژنوتیپ­های مشاهده شده بود، نمونه شیر گرفته شد و پنیر تهیه گردید (جدول 5).

جدول 5- انواع حالت­های ممکن و/یا مشاهده شده آللی در بررسی توام ژن­های PPARGC1α و اوستئوپونتین با ژن کاپاکازئین.

Table 5- Different kinds of possible and/or observed alleles in combined investigation of PPARGC1α and osteopontin with kappa casein.

^* از چپ به راست: جایگاه­های کاپاکازئین، T19C و A968C ژن PPARCG1α.        Left to right: CSN3, A968C, PPARCG1α

با توجه به بررسی جهش­ موقیت­های اینترون و انتهای ´3 ژن PPARGC1α در این پژوهش، احتمال پیوستگی این دو جایگاه با یکدیگر و  همچنین پیوستگی بین هاپلوتیپ آنها با ژن کاپاکازئین، فراوانی هریک از این هاپلوتیپ­ها و مقدار لینکاژ بین آنها جداگانه بررسی گردید. عدم تعادل پیوستگی بین تک شکلی­های نوکلئوتیدی، با استفاده از آماره  r² یا ضریب همبستگی دو جایگاه ژنی، برابر 282/0 محاسبه شد که بیانگر عدم تعادل پیوستگی (LD) ضعیف است  (جدول 6). با توجه به مقدار r² و بیشتر بودن فراوانی آلل B کاپاکازئین، بالاتر بودن فراوانی هاپلوتیپ­های دارای این آلل، دور از انتظار نخواهد بود. در تحقیق دیگری، ضریب r²برای نژاد هلشتاین 86/0 محاسبه شده است (Pasandideh et al., 2011a).

جدول 6- فراوانی انواع هاپلوتیپ­های محتمل و بررسی لینکاژ دو جایگاه PPARCG1α  و کاپاکازئین.

Table 6- Haplotypes frequencies and linkage of PPARCG1α and CSN3.

تاثیر ژنوتیپ روی کیفیت پنیر

فاکتورهای اندازه­گیری شده راندمان تولید و کیفیت پنیر در هر هاپلوتایپ در جدول 7 و نتایج آنالیز واریانس تاثیر هاپلوتیپ­ها روی صفات کیفیت پنیر در جدول 8 آورده شده است. همچنین مشخص شد که اثر ژنوتیپ­ها روی صفات مورد مطالعه کیفیت پنیر، از نظر آماری در سطح 95 درصد اطمینان، معنی­دار نبود (جدول 8).

خواص لخته شدن تاثیر بسزایی روی تولید و کیفیت پنیر دارد، به طوریکه در شیر با خواص مطلوب پنیرسازی، مدت زمان انعقاد و تشکیل لخته کوتاهتر و استحکام لخته نیز بیشتر است. این مرحله از آن جهت اهمیت دارد که بسیار حساس بوده و اولین مرحله در ساخت پنیر است و روی مراحل بعدی پنیرسازی تاثیر می­گذارد (Comin et al., 2008؛ Kubarsep et al., 2005). در تحقیق حاضر، ژنوتیپ جایگاه­های مورد مطالعه تاثیر معنی­دار روی راندمان تولید پنیر و ویژگی­های کیفی پنیر تولیدی نشان نداد اما سایر پژوهش­ها حاکی از این مطلب است که انواع ژنوتیپ بتاکازئین، کاپاکازئین و بتالاکتوگلوبولین روی زمان لخته شدن مایه پنیر (Comin et al., 2008؛ Penasa et al., 2010؛ Kubarsep et al., 2005) و استحکام دلمه تاثیر دارد (Penasa et al., 2010). گزارش شده است که بهترین ژنوتیپ از نظر زمان لخته شدن هنگامی است که حداقل یک آلل B در این دو جایگاه وجود داشته باشد (Comin et al., 2008). در تحقیقی روی گاوهای استونی گزارش شده است که خواص لخته شدن با آنزیم مایه پنیر در ژنوتیپ BB از ژن کاپاکازئین بسیار بهتر از ژنوتیپ AA بود و درصد نمونه­های شیر لخته نشده کمتری وجود داشت، همچنین با بالا رفتن فراوانی آلل B کاپاکازئین در نژادهای بومی، خواص لخته شدن مایه پنیر بهتر شد (Kubarsep et al., 2005).

جدول 7- میانگین فاکتورهای اندازه گیری شده هر هاپلوتیپ در آزمایشات پنیرسازی.

Table 7- Mean of cheese parameters measured for haplotypes (Hap.).

Ŧهاپلوتیپ­های دوحرفی بیانگر دو ژن اوستئوپونتین و کاپاکازئین و 3 حرفی­ها برای دو جهش مربوط به PPARGC1α و کاپاکازئین درنظر گرفته شده اند. ترتیب حروف هاپلوتیپ­ها از چپ به راست به ترتیب کاپاکازئین، موقعیت T19C و 968AC  می­باشد.

ŦTwo alphabetic haplotypes means OPN and CSN3 genes and 3-alphabetic considered for 2 mutations of PPARGC1A and CSN3. The orders of haplotypes are CSN3, T19C and 968AC, respectively.

^* این گاو دارای هر دو نوع هاپلوتیپ مورد نظر در جایگاه­های PPARGC1A‌و اوستنوپونتین بودند.

^* These cows carry both of the desirable haplotypes in PPARGC1A and osteopontin.

جدول 8- تجزیه واریانس (ANOVA) صفات مربوط به پنیرسازی.

Table 8- Analysis of variance for cheese traits.

بهبود ژنتیکی خواص انعقادی شیر، راه شناخته شده­ای است که راندمان تولید پنیر را بهبود می­دهد، اما به دلیل فقدان تجهیزات مناسب برای تعیین و رکوردبرداری منظم این صفات، امکان استفاده مستقیم از آنها در انتخاب دام­ها برای این صفات محدود است. لذا یک راه غیرمستقیم می­تواند انتخاب به نفع ژنوتیپ­های مطلوب و در نتیجه بالا بردن فراوانی آلل­های مطلوب در جایگاه­های موثر بر پروتئینهای شیر باشد که با پارامترهای موثر بر پنیرسازی مرتبط هستند.

نتیجه گیری  و پیشنهادات

گزارشات متعددی از تاثیر چندشکلی در نواحی مختلف ژن، اعم از جایگاه­های اینترون، اگزون و یا سایر نواحی غیرقابل ترجمه بالا دست یا فرودست ژن، روی محصول ژنتیکی و یا فراورده­های آن وجود دارد.  به همین علت، در بررسی­های همزمان تاثیر چند جایگاه روی صفات تولیدی و به دلیل احتمال پیوستگی که بین برخی از جایگاه­ها به دلیل قرارگیری روی یک کروموزوم وجود دارد، مبحث توارث همزمان آنها و/یا وقوع کراسینگ اور مطرح می­شود. در این رابطه می­توان تاثیر جایگاه­های چندشکلی شناخته شده در داخل یک ژن روی صفات را به دلیل بالا بودن عدم تعادل پیوستگی بین آنها و یا عدم تعادل پیوستگی احتمالی این جایگاه­ها با نواحی شناخته نشده داخل ژن نسبت داد (Pasandideh et al. 2011). در پژوهش حاضر، مقدار عدم تعادل پیوستگی بین جایگاه­های بررسی شده کم بود، لذا احتمال وقوع کراسینگ اور و پیدایش ترکیبات جدید ژنی وجود داشت. در چنین شرایطی، بالا بودن تعداد نمونه مورد بررسی می­تواند منجر به مشاهده شدن تمام ترکیبات ژنوتیپی شود. همچنین استفاده از روش­های پیشرفته­ شناسایی SNPهای متراکم، جهت شناسایی دقیق­تر ژن­های موثر بر صفات مطلوب خواهد بود.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله محققین بر خود لازم می­دانند تا از مسوولان محترم مجتمع آموزش جهاد کشاورزی خراسان رضوی به ویژه آقای مهندس زرقی بابت تهیه نمونه­های خون و آقای مهندس زارع به جهت همکاری در تهیه پنیر در پایلوت تحقیقاتی شیر، کمال تشکر و قدردانی را بنمایند. مراحل ژنتیک ملکولی پژوهش در آزمایشگاه بیوتکنولوژی گروه علوم دامی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کاشمر انجام شد که بدینوسیله از همکاری حوزه معاونت محترم پژوهشی دانشکده سپاسگزاری می­شود.