همسانه سازی فرم اصلاح شده ژن tPAانسانی در ناقل کلروپلاستی و باززایی گیاهان ترانس پلاستومیک توتون

همسانه­سازی فرم اصلاح شده ژن  tPAانسانی در ناقل کلروپلاستی و باززایی گیاهان ترانس­پلاستومیک توتون

مریم عبدلی نسب¹، مختار جلالی جواران*²، امین باقی زاده³، هوشنگ علیزاده⁴

¹دانشجوی دکتری اصلاح نباتات،  دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس.

²دانشیار گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس.

³ دانشیار گروه بیوتکنولوژی، پژوهشگاه علوم، تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی کرمان.

⁴ استادیارگروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشگاه تهران.

تاریخ دریافت: 23/11/1391، تاریخ پذیرش: 01/05/1392

چکیده

گیاهان جایگزین مناسبی برای سیستم­های معمول بیان پروتئین­های نوترکیب و داروهای زیستی، نظیر حیوانات یا سیستم­های میکروبی تراریخته می­باشند. به دلیل پلی­پلوئیدی بالای ژنوم پلاستید گیاهی، در صورت تراریختی کلروپلاست، هزاران نسخه از ژن خارجی در هر سلول وارد و حجم بسیار بالایی از پروتئین نوترکیب تولید می­شود. پس از سرطان­ها، بیماریهای قلبی- عروقی دومین عامل مرگ و میر انسانی هستند. فعال­کننده پلاسمینوژن بافتی انسانی (tPA) یکی از مهمترین پروتئین­های نوترکیب داروئی است که جهت از بین بردن لخته خون در قسمت­های مختلف بدن از جمله رگ­های خونی قلب و مغز استفاده می­شود. فرم اصلاح شده پلاسمینوژن بافتی (K2S) دارای نیمه عمر پلاسمایی طولانی­تر، قدرت نفوذ در لخته و فعالیت فیبرینولیتیک بالاتر می­باشد. در این مطالعه، به­منظور انتقال ژن K2S به کلروپلاست گیاه توتون، پس از طراحی سازه، ژن هدف در ناقل کلروپلاستی pKCZ درج و سپس در باکتریcoli  .E همسانه­سازی گردید. پس از شلیک موفق ناقل حاوی ژن K2S (pKCZK2S) به ریزنمونه­های برگی با استفاده از تکنیک بیولستیک، ریزنمونه­ها بر روی محیط انتخابی حاوی 500 میلی گرم در لیتر آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین قرار گرفتند. پس از باززایی نوساقه­های رشد یافته بر روی محیط انتخابی، به منظور رسیدن به هموپلاسمی چهار دوره انتخاب و باززایی در حضور آنتی­بیوتیک اسپکتینومایسین انجام شد. حضور، درج در جایگاه مشخص، بیان ژن K2S و هموپلاستی در گیاهان ترانس­پلاستومیک با روش­های PCR، RT-PCR و سادرن بلات به تایید رسید.

واژه های کلیدی: زراعت مولکولی، تراریختی کلروپلاست، ترانس­پلاستومیک، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی.

مقدمه

بر اساس اعلام رسمی سازمان بهداشت جهانی، علل مرگ و میر 17 میلیون نفر از 6 میلیارد مردم جهان، بیماری­های قلبی-عروقی است (Ghareyazei, 2006). فعال­کننده پلاسمینوژن بافتی انسانی[1] (tPA)، از مهمترین پروتئین­های دارویی است که نقش مهم در سیستم فیبرینولیتیک و باز شدن لخته­های خونی دارد (Colen and Lijnen 2004).

پروتئینtPA   یک سرین پروتئاز با زنجیره پلی‌پپتید 527 اسیدآمینه­ای، 17 باند دی­سولفیدی، هفت درصد کربوهیدرات، وزن مولکولی 68-63 کیلودالتون و دارای پنج دُمین ساختاری ) دُمین انگشتی[2] (F)، فاکتور رشد پوستی[3] (EGF)، کرینگل[4]1 (K1)، کرینگل2 (K2)، و سرین پروتئاز) می­باشد (Ranby et al., 1982). فرم اصلاح شده فعال‌کننده پلاسمینوژن انسانی،(K2S) Reteplase  است که فاقد دُمین­‌های F، EGF وK1  فرم اصلی می‌باشد. این فرم فاقد جایگاه گلیکولیزه بوده، تعداد آمینواسید آن به 355 و تعداد باندهای دی‌سولفیدی آن به 9 کاهش یافته است. از ویژگی­های بارز آن می­توان به نیمه عمر پلاسمایی بیشتر، مقاومت بیشتر به مهارکنندگان پروتئازی پلاسما، توانایی بیشتر در اتصال انتخابی به فیبرین و توانایی ترومبولیتیکی بیشتر نسبت به tPA طبیعی اشاره کرد (Kohnert et al., 1992). گزارشات متعددی از تولید tPA نوترکیب در باکتری  ایشریشیا­کولی Saito et al., 1994) ; Qiu et al., 1998; Ji et al., 1998)، سلول­های تخمدان هامستر چینی (CHO) (Corwright, 1992)، مخمر ساکارومیس سرویزیا[5] (Lemontt et al., 1985)، لاین­های سلولی مشتق شده از مگس سرکه (Oka et al., 1990)، آسپرژیلوس نیدولانس[6] (Mariyln et al., 2001)، لیشمانیا (Soleimani et al., 2006)، سلول­های C127 موش (Reddy et al., 1987)، غدد شیری گاو و موش (Huang et al., 1999) و شیر بز (Ebert et al., 1991) موجود است. از مهمترین معایب سیستم­های ذکر شده می­توان به هزینه بالای تولید، بازده کم، واکنش­های ایمونولوژیک در اثر آلودگی باکتریایی (Dater et al., 1993)، خطر آلودگی به بیماری­های مشترک و ویروس­های حیوانی اشاره کرد (Verma and Daniell, 2007). با افزایش تقاضا برای تولید این پروتئین به دلیل استفاده­های مختلف آن برای درمان بیماری­های فیبرینولیتیک، وجود سیستم تولید در مقیاس وسیع، مقرون به صرفه و ایمن ضروری می­باشد. تولید داروهای زیستی در گیاهان و به عبارتی دیگر استفاده از گیاه به عنوان کارخانه زیستی تولید پروتئین‌های نوترکیب یا همان کشاورزی مولکولی[7] یکی از جدیدترین راهبردها می­باشد. با وجود گزارشات متعدد انتقال ژن­های مختلف در هسته گیاهان و بیان پروتئین­های نوترکیب، این نوع بیان ژن دارای نقایص متعددی از جمله حجم کم پروتئین نوترکیب تولید شده در هر گیاه و زمان طولانی رشد گیاه می­باشد. ژن tPA به هسته گیاه توتون (Hahn et al., 2009 Masumi asl et al., 2010;)، جلبک دریایی Laminaria japonica (Zhang et al., 2009) و ریشه­های موئینه خربزه شرقی (Kang et al., 2011) انتقال داده شده است. بیشترین میزان بیان tPA، 0014/0% پروتئین محلول کل در توتون و 15/0-17/0 میکروگرم در میلی گرم ریشه گزارش شده است. یکی از راهکارهای مناسب برای افزایش بیان پروتئین نوترکیب در گیاهان تراریخته، الحاق ژن یا ژن‌های کد کننده پروتئین نوترکیب مورد نظر در ژنوم کلروپلاست است. به دلیل ماهیت پلی­پلوئیدی موجود در سیستم ژنتیکی پلاستید که شامل هزاران نسخه از این ژنوم در هر سلول می­شود، در صورت تراریختی، حجم بسیار بالایی از پروتئین خارجی در این اندامک­ها تولید می­شود. یعنی پلاستیدهای تراریخت به منزله کارخانه­های قوی تولید پروتئین نوترکیب عمل خواهند کرد. عدم فرار ژن به دلیل توارث مادری پلاستید در بیشتر گیاهان، بیان ژن هدف در یک جایگاه خاص، عدم پدیده اثر مکانی و خاموشی ژن و بیان همزمان چند ژن انتقال یافته از دیگر مزایای انتقال ژن به کلروپلاست است. با توجه به نیاز مبرم به پروتئین tPA جهت مصارف درمانی در سکته­های قلبی و مغزی، کشور ما یکی از واردکنندگان اصلی این دارو می‌باشد. تولید پروتئین‌های نوترکیب در کلروپلاست گیاهان علاوه بر قیمت ارزان محصول تولیدی، امکان تولید انبوه آنها را فراهم می‌آورد. در این تحقیق، همسانه سازی ژن tPA فرم K2S در ناقل کلروپلاستی مخصوص گیاه توتون و انتقال آن به کلروپلاست گیاه توتون صورت پذیرفت. در گیاهان ترانس­پلاستومیک تولیدی وضعیت بیانی ژن هدف بررسی گردید تا گامی جهت تولید این پروتئین فراهم گردد.

مواد و روش­ها

در این تحقیق از ناقل pKCZ (دریافت شده از پروفسور هنز کوپ از دانشگاه مکسیمیلین مونیخ[8]) جهت تراریختی کلروپلاست گیاه توتون استفاده شد. این ناقل شامل ژن aadA است که مقاومت به آنتی­بیوتیک اسپکتینومایسین و استرپتومایسین را فراهم می­کند و تحت کنترل پیشبر­Prrn  مربوط به اپرون rRNA پلاستیدی به عنوان یک پیشبر­ دائمی بیان می­شود. همچنین دو ناحیه INSL و INSR که دقیقا مشابه دو ناحیه از ژنوم پلاستیدی گیاه توتون است، سبب انجام نوترکیبی همولوگ بین ناقل و ژنوم پلاستیدی و در نهایت درج ژن در کلروپلاست گیاه توتون می­شود. سازه ژنی جهت درج ژن tPA فرم K2S در ناقل pKCZ قبل از ژن aadA طراحی شد. ژن K2S و aadA به صورت دی سیسترون تحت کنترل پیشبر Prrn بیان خواهند شد (شکل1). بدین منظور آغازگرهای مناسب طراحی شد. در طراحی آغازگر رفت (PF1)، توالی جایگاه برشی NcoI (به منظور درج ژن در در ناقل کلروپلاستی pKCZ)، توالی شش هیستیدین (به منظور نشانمند کردن و تسهیل تخلیص پروتئین رتپلاز تولیدی)، توالی پروتئازی فاکتور [9]Xa (به منظور جدا کردن پپتیدهای هیستیدین از پروتئین  tPAپس از تخلیص) اضافه گردید. در طراحی آغازگر برگشت (PR1)، جایگاه اتصال ریبوزومی [10]RBS (به منظور بیان ژن aadA) و جایگاه برشی  NcoIدر نظر گرفته شد.

شرایط تکثیر با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و از طریق PCR با برنامه 30 سیکل شامل دمای واسرشته­سازی  ºC94 به مدت 60 ثانیه، دمای اتصال  ºC65 به مدت 30 ثانیه، دمای بسط  ºC72 به مدت 90 ثانیه، 5 دقیقه در ºC 94 به عنوان پیش دما و 10 دقیقه در  ºC72 به عنوان بسط نهایی بهینه شد.

همسانه­سازی ژن هدف (K2S) در ناقل تجاری T/pTZ57R: از طریق PCR با کمک آنزیمTaq DNA Polymerase به انتهای ´5 ژنK2S ، چندین نوکلئوتید A افزوده شد. عمل درج ژن هدف K2S در ناقل تجاری T/pTZ57R در حضور آنزیم لیگاز و بر اساس دستورالعمل کیت K1214 شرکت فرمنتاز صورت گرفت. استفاده از محل همسانه­سازی چندگانه ناقل تجاری T/pTZ57R امکان فعالیت بهتر جهت مراحل بعدی همسانه­سازی در ناقل کلروپلاستی خاص گیاه توتون را فراهم می­آورد. همچنین می­توان از آغازگرهای M13 دو طرف محل درج چندگانه برای تعیین توالی استفاده کرد (Esmaeili et al., (.2006

معرفی سازه تهیه شده به سلول­های مستعد باکتری ایشریشیاکولی: جهت آماده کردن سلول­های E. coli سویه DH5α از روش کلرید کلسیم و جهت تراریختی به درون باکتری از روش شوک حرارتی (Sambrook, 2001) استفاده شد. از کلون­های رشد یافته در محیط LB مایع حاوی آنتی­بیوتیک آمپی­سیلین، استخراج پلاسمید به روش لیز قلیایی ( (Sambrook, 2001انجام شد. صحت همسانه­سازی با استفاده از هضم برشی با آنزیم NcoI، کلونی [11]PCR و توالی­یابی تایید شد. پس از اطمینان از صحت توالی و چهارچوب خواندن ژن K2S، ناقل تجاریT /pTZ57R حاوی ژن K2S استخراج و توسط آنزیم برشی NcoI هضم شد. قطعه ژنی K2S از روی ژل آگاروز با کیت خالص سازی ساخت شرکت BioNeer جدا شد.

شکل 1- تصویر شماتیک سازه طراحی شده برای بیان دی سیسترونیک ژن K2S در ژنوم کلروپلاست توتون.

Figure 1- Schematic view of the designed construct for dicistronic expression of the K2S gene in tobacco chloroplast genome.

توالی آغازگرها به صورت زیر بود:

           GGA AAC AGT GAC TGC TAC TTT G

PR1: 5'- CAT GCC ATG GAT CCC TCC CTT CAT CAC GGT CGC ATG TTG TC -3'

Overhang: لنگرگاه، Gly: اسیدآمینه گلایسین، Histag: شش هیستیدین، Stop codon: کدون خاتمه، RBS: جایگاه اتصال ریبوزومی

همسانه­سازی ژن K2S در ناقل کلروپلاستی  :pKCZناقل کلروپلاستی pKCZ با آنزیم برشی NcoI خطی شد. فسفر انتهای ´5 ناقل خطی شده با کیت آلکالین فسفاتاز  EF0651 ساخت شرکت فرمنتاز، حذف شد و ژنK2S  با استفاده از واکنش اتصال در آن درج شد. ساختار تهیه شده به روش قبلی به سلول­های مستعد باکتری E. coli سویه DH5α وارد شد. از کلون­های رشد یافته در محیط LB مایع، استخراج پلاسمید  pKCZK2Sبه روش لیز قلیایی انجام گرفت. با توجه به اینکه دو طرف ژن و وکتور با یک آنزیم برش داده شده بود، این احتمال وجود داشت که قطعه ژنی به صورت معکوس در ناقل قرار گیرد، جهت صحیح درج ژن، با آغازگر طراحی شده از ناحیه Prrn وکتور، 80 جفت باز قبل از ژن به عنوان آغازگر رفت (PF2) و همراه با آغازگر برگشت ژن K2S (PR2) و از طریق PCR تایید شد. صحت کلونینگ با استفاده از هضم آنزیمی با آنزیم NcoI، کلونی PCR و توالی­یابی تایید شد. کلون­های حاصل در مرحله بعد جهت انتقال به کلروپلاست توتون مورد استفاده قرار گرفتند. PF2: 5'- GGC TAG CGG CAA TTC GCC GTC GTT CAA TGA GAA T-3'

PR2: 5'- TCA CGG TCG CAT GTT GTC ACG AAT CCA G -3

مواد گیاهی: بذور توتون  Nicotiana tabacum رقم Xhanti پس از ضدعفونی در محیط کشت MS در شرایط استریل، کشت شد و در فیتوترون در 16 ساعت روشنایی، 8 ساعت تاریکی و دمای 25 درجه سانتی­گراد قرار گرفت. برگ­های بالغ سبز تیره جهت تراریختی از گیاهان برداشت شدند.

تراریختی کلروپلاست: جهت تراریختی، برگ­ها 24 ساعت قبل بر روی محیط RMOP (محیط کشت [12]MS پایه حاوی  mgL-11/0 NAA=، mgL-1 3BAP= و تیامین mgL-11) در فیتوترون 16 ساعت روشنایی، 8 ساعت تاریکی و دمای 25 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند.

آماده سازی ذرات ناقل: جهت انجام تراریختی با تکنیک بمباران ذره­ای، از ذرات طلا با قطر 6/0 میکرومتر استفاده شد. پس از استریل ذرات با اتاتول 70%، ناقل حامل ژن (pKCZK2S)، توسط کلرید کلسیم 5/2 مولار و اسپرمیدین 1/0 مولار برروی آنها رسوب و بر روی صفحات ناقل توزیع شد.

تراریختی برگ­ها با ذرات ناقل حاوی DNA: جهت تراریختی از دستگاه  PDS-1000/Heشرکت بایورد[13] استفاده شد. قبل از تراریختی تمام اجزای غیر ثابت دستگاه کاملا استریل شد. شرایط مطلوب شلیک شامل فشار گاز هلیوم Psi 1100، فشار صفحات پاره شونده Psi 900، فشار خلاء  inch Hg24، فاصله بافت هدف تا صفحات متوقف شونده 6 سانتی­متر بود.

کشت برگ­های تراریخت: برگ­های بمباران شده به مدت 48 ساعت در شرایط کنترل شده و بر روی محیط RMOP قرار گرفتند. سپس به اندازه­های 5/0×5/0 خرد و در روی محیط گزینش­گر (RMOP حاوی mgL-1 500 آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین) در شرایط 16 ساعت روشنایی، 8 ساعت تاریکی و دمای 25 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. تعویض مرتب محیط­ها هر دو هفته یکبار انجام گرفت. پس از گذشت چهار هفته از زمان بمباران، اولین گیاهچه­های مقاوم بر روی محیط انتخابی ظاهر شدند. به منظور دستیابی به هموپلاسمی، ساقه­ها و برگ­های گیاهان تازه رسته به قطعات کوچک­تر تقسیم و به محیط­های غربال حاوی آنتی­بیوتیک منتقل شدند. این عمل برای دوره های متعدد باززایی (4 بار) صورت گرفت.

آنالیز گیاهان تراریخت در سطح DNA: DNA ژنومی برگ­های گیاهان تراریخت و شاهد به روشCTAB  (Murray and Thompson,1980) استخراج شد. تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده از طریق اسپکتروفتومتر و الکترفورز ژل آگاروز انجام شد. جهت آنالیز PCR، در حجم 25 میکرولیتر واکنش، 50 نانوگرم DNA استخراج شده، 4/1 میلی مولار کلرید منیزیم، 2/0 میلی مولار dNTPs، 10 میکرومولار آغازگر رفت و برگشت مربوط به ژن K2S و 1 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase استفاده شد. واکنش زنجیره­ای پلیمراز طبق شرایط بهینه شده انجام شد. محصول PCR بر روی ژل آگاروز 1% الکتروفورز شد. گیاهان دارای ژن K2S شناسایی و انتخاب شدند. به منظور تایید درج صحیح ژن در ژنوم کلروپلاست توتون، آنالیز PCR دیگری با آغازگر رفت طراحی شده از درون ژن K2S (PF3) و آغازگر برگشت طراحی شده از روی ژنوم کلروپلاست خارج از ناحیه درج (PR3) صورت گرفت. شرایط تکثیر از طریق PCR، شامل 30 چرخه در دمای واسرشته­سازی ºC 94 به مدت 60 ثانیه، دمای اتصال  ºC58 به مدت 30 ثانیه، دمای بسط  ºC72 به مدت 120 ثانیه، 5 دقیقه در ºC 94 به عنوان پیش دما و 10 دقیقه در  ºC72 به عنوان بسط نهایی بهینه شد. PF3: 5' –GCA TCT AAG TAG TAA GCC CAC CCC A -3'

PR3: 5ʹ-TTG ATG CGA AAC TGA GGC TG -3ʹ

طراحی کاوشگر و انجام آزمون سادرن بلات جهت تایید هموپلاسمی: به منظور تایید هموپلاسمی آزمون سادرن بلات صورت گرفت. بدین منظور توالی دو کاوشگر از ناحیه K2S و trnR طراحی و از طریق PCR با dNTP­ های نشان­دار و از روی سازه pKCZK2S به عنوان الگو تکثیر شد. DNA کل گیاهان تراریخت و شاهد استخراج و به طور جداگانه توسط دو آنزیم برشی HindIII  و  EcoRIبا قرار گرفتن در دمای 37 درجه سانتی­گراد به مدت 12 ساعت هضم کامل شد. غلظت محصولات هضم شده توسط نانودراپ تعیین و 20 میکروگرم از محصولات هضم شده، بر روی ژل آگاروز 1% به مدت 15 ساعت با ولتاژ 25 تفکیک شدند. قطعات DNA در حضور محلول­های نمکی واسرشت و با استفاده از خاصیت کاپیلاری (Brown, 1999) به غشای نیتروسلولزی منتقل شد. هیبریداسیون کاوشگر به غشا، تهیه بافرهای مورد نیاز و ظهور باندها طبق دستورالعمل کیت DIG-DNA Labeling and Detection kit (Roche, Germany) صورت گرفت.

آنالیز گیاهان تراریخت در سطح RNA: استخراج RNA از برگ­های جوان با استفاده از محلول RNX-Plus شرکت سیناژن صورت گرفت. RNA استخراج شده تحت تاثیر آنزیم DNAse شرکت Fermentase قرار گرفت. کیفیت و کمیت آن با الکترفورز بر روی ژل آگاروز 1% و از طریق اسپکتروفتومتر تعیین شد. ساخت cDNA با کیت K1214 شرکت Fermentase صورت گرفت. سپس واکنش RT-PCR با آغازگرهای اختصاصی طراحی شده از وسط ژن K2S (PF4 و PR4) صورت گرفت. جهت آنالیز PCR، در حجم 20 میکرولیتر واکنش، 50 نانوگرم cDNA الگو، 5/1 میلی­ مولار کلرید منیزیم، 2/0 میلی مولار dNTPs، 10 میکرومولار آغازگر رفت و برگشت و 1 واحد آنزیم Polymerase Taq DNA استفاده شد. شرایط تکثیر، 30 سیکل شامل دمای واسرشته سازیºC 94 به مدت 60 ثانیه، دمای اتصال ºC57 به مدت 30 ثانیه، دمای بسط ºC72 به مدت 30 ثانیه، 5 دقیقه در ºC 94 به عنوان پیش دما و 10 دقیقه در  ºC72 به عنوان بسط نهایی صورت گرفت. محصول RT-PCR بر روی  ژل آگاروز 1% الکتروفورز گردید.

PF4: 5ʹ- GGA AAC AGT GAC TGC TAC TTT GGG AA -3ʹ

PR4: 5ʹ- TTG ATG CGA AAC TGA GGC TG -3ʹ

نتایج

با استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده از ژن K2S طی واکنش PCR محصولی با اندازه 1200 جفت باز تولید گردید (شکل 2). با برش آنزیمی ناقل pTZ57RK2S با آنزیم NcoI، قطعه ژنی مربوط به  K2S (1200 جفت باز) آزاد گردید (شکل 3). ناقل pKCZK2S تخلیص شده تحت برش با آنزیم NcoI قطعه ژنی مربوط به ژن  K2S(1200 جفت باز) را مشخص کرد (شکل 4). همچنین نتایج کلونیPCR  با آغازگرهای اختصاصی ژن K2S و پرایمر طراحی شده از ناحیه Prrn ناقل قطعه ژنی 1280 جفت باز مورد انتظار را در بسیاری از کلون­ها تکثیر کرد (شکل 5). مقایسه نتایج توالی­یابی 3 کلون انتخابی با اطلاعات موجود در بانک های اطلاعاتی شباهت 100 درصد با توالی ژن tPA را نشان داد (شکل 6). چهار هفته پس از اولین بمباران ژنی تعداد بسیار معدودی گیاهچه تراریخت ظاهر شدند (شکل7 a) که در محیط کشت حاوی آنتی­بیوتیک قادر به تولید ریشه و برگ بودند (شکل7 b). همچنین ظهور چندین گیاهچه در محیط کشت حاوی آنتی­بیوتیک پس از سه دور باززایی، بیانگر تقسیم سلول­های تراریخت و رفتن گیاهان به سمت هموپلاسمی است (شکل7 c). آنالیز PCR تعداد 8 گیاهان تراریخت قطعه ژنی 1200 جفت باز را نشان داد و هیچ باندی در گیاه شاهد غیر­تراریخت مشاهده نشد (شکل 8). همچنین ظهور قطعه ژنی 1800 جفت باز در گیاهان تراریخت و عدم حضور آن در گیاه شاهد غیر تراریخت با استفاده از آغازگر طراحی شده از روی ژنوم کلروپلاست، بیانگر درج صحیح ژن K2S در ژنوم کلروپلاست توتون است (شکل 9). درج ژن و هموپلاسمی در گیاهان T0 با آنالیز سادرن بلات تایید شد. قطعه ژنومی گیاه شاهد (غیر تراریخت)، ترانس­پلاستومیک با pKCZK2S و ناقل pKCZ پس از هضم برشی با HindIII  و EcoRI در ناحیه درج در شکل 10a ،b  و c نشان داده شده است. با هضم برشی توسط آنزیمHindIII ، قطعه ژنیkb  8/2 در گیاهان ترانس­پلاستومیک و کنترل مثبت (ناقل pKCZK2S)،     kb 7/1 در ناقل pKCZ و قطعه kb 1 در گیاه شاهد غیر­تراریخت تولید شد (شکل 10 e و g). با هضم برشی توسط آنزیم EcoRI، قطعه ژنیkb  6/1 در گیاهان ترانس­پلاستومیک و کنترل مثبت (ناقلpKCZK2S)، kb  99/2 در ناقل pKCZ و kb 4/1 در گیاه شاهد غیر­تراریخت ایجاد شد (شکل 10 f و d). در گیاه ترانس­پلاستومیک، با استفاده از کاوشگر trnR، حضور باند kb 8/2 در هضم برشی با آنزیم HindIII و باند kb 6/1 در هضم برشی با آنزیمEcoRI  همانند کنترل مثبت تایید شد (شکل 10 f و g). با استفاده از کاوشگر K2S، با ظهور قطعه ژنی kb 6/1 در هضم برشی با آنزیمEcoRI  و kb 8/2 در هضم برشی با آنزیم HindIII همانند کنترل مثبت درج ژن  K2Sدر ناحیه trnR و  trnN گیاه ترانس­پلاستومیک تایید شد (شکل 10 e و d). نتایج RT-PCR تکثیر قطعه ژنیbp  300 را در گیاهان ترانس­پلاستومیک نشان داد و این قطعه در گیاه شاهد غیرتراریخت و کنترل منفی مشاهده نشد (شکل11).

شکل2- محصول PCR ژن K2S بر روی ژل آگاروز1%، M: نشانگر اندازه 1Kb (فرمنتاز)، :C^- کنترل منفی (آب به عنوان الگو).

Figure 2- PCR products of the K2S gene on the 1% Agarose gel. M: (Fermentase 1kb standard GeneRuler), C^-: Negative control (Water as a template).

شکل3- هضم آنزیمی ناقل TAK2S با آنزیم NcoI، M: نشانگر اندازه 1Kb (فرمنتاز).

Figure 3- Digestion of TAK2S vector with NcoI enzyme, M: 1kb standard GeneRuler (Fermentase).

شکل4- برش ناقل  pKCZK2Sبا آنزیم M NcoI= نشانگر اندازه 1Kb(فرمنتاز)، 1- 3- ناقل pKCZK2S، 4-6- ناقل  pKCZK2S برش یافته.

Figure 4- Digestion of pKCZK2S vector with NcoI enzyme, M: Fermentase 1 kb standard GeneRuler, Lane1–3: pKCZK2S Vector, Lane 4–6: digested pKCZK2S Vector.

شکل5- محصول کلونی  PCRبر روی ژل آگاروز 1% با پرایمر طراحی شده از ناحیه prrn، M= نشانگر اندازه، C⁺ کنترل مثبت (وکتور(pKCZK2S ، 10-1: کلون های رشدیافته بر روی محیط.

Figure 5- products of colony PCR with designed primer from prrn region on the 1% Agarose gel. M: 1 kb standard GeneRuler, C⁺: positive control (pKCZK2S Vector), Lanes 1–10: The clones those were grown on the medium.

شکل6- مقایسه توالی­یابی ژن K2S کلون شده در ناقلpKCZ  با اطلاعات موجود در بانک­های ژنی.

Figure 6- The results of sequencing of the cloned K2S gene as compared with data of GeneBank.

شکل7- a: ظهور اولین گیاهچه های باززایی شده تراریخت 4 هفته پس از بمباران بر روی محیط RMOP حاوی mgL^-1500 آنتی­بیوتیک اسپکتینومایسین، b: گیاهان تراریخت در محیط کشت MS حاوی mgL^-1500 آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین چهار ماه پس از تراریختی c: ظهور گیاهچه های مقاوم حاصل دور سوم باززایی بر روی محیط RMOP حاوی mgL^-1500 آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین.

Figure 7- a: The first regenerated tobacco plants, 4 weeks after bombardment in the RMOP medium containing 500 mg/l spectinomycin antibiotic. B: Transgenic plants in MS medium

containing 500 mg/l spectinomycin 4 months after bombardment. c: The third regenerated tobacco shoots in RMOP medium containing 500 mg/l spectinomycin.

شکل 8- محصول PCR گیاهان مقاوم به آنتی بیوتیک بر روی ژل آگاروز 1%، M: نشانگر اندازه 1kb، :C⁺ کنترل مثبت (ناقل pKCZK2S)، 1-6 و 8-9 گیاهان تراریخت، :wt گیاه غیرتراریخت.

Figure 8- PCR products of antibiotic resistant plants on the 1% Agarose gel. M: 1kb standard GeneRuler, C⁺: Positive control (pKCZK2S vector), Lane 1-6 and 8-9: Transgenic plants, wt: non-transgenic plant.

شکل 9- محصول PCR حاصل از تکثیر با آغازگر طراحی شده از ژنوم کلروپلاست بر روی ژل آگاروز 1%، M: نشانگر اندازه 1kb (فرمنتاز)، C^-  : کنترل منفی (آب به عنوان الگو)، wt: گیاه غیرتراریخت، 1-5: گیاهان تراریخت.

Figure 9- PCR amplifications with native chloroplast genome primer on the 1% Agarose gel, M: 1 1kb standard GeneRuler (Fermentas), C^- negative control (water as template), wt: non-transformed plant, Lanes 1–5: transplastomic plants.

شکل10- نتایج آزمون سادرن بلات در گیاهان ترانس­پلاستومیک، a: جایگاه­های برش آنزیمی کلروپلاست گیاه شاهد (غیرتراریخته)، b: جایگاه­های برش آنزیمی ناقل pKCZ، c: جایگاه­های برش آنزیمی کلروپلاست گیاه تراریخته و ناقل pKCZK2S در محل درج.  fو d: برش با آنزیم EcoRI. e و g: برش با آنزیم HindIII.  در گیاه تراریخت در هیبرید با کاوشگر trnR، قطعه ژنی kb 6/1 در هضم برشی با آنزیم EcoRI  (f) و kb 8/2 در هضم برشی با آنزیم HindIII (g) همانند کنترل مثبت بیانگر هموپلاسمی و در هیبرید با کاوشگر K2S، قطعه ژنی kb 6/1 در هضم برشی با آنزیم EcoRI  (d) و kb 8/2 در هضم برشی با آنزیم HindIII (e) همانند کنترل مثبت بیانگر درج ژن در جایگاه صحیح است. M:نشانگر اندازه(SM0333، فرمنتاز)، K: گیاه ترانس­پلاستومیک، wt: گیاه شاهد غیر تراریخت، P: ناقل pKCZ، C⁺: کنترل مثبت (ناقل pKCZK2S).

Figure 10- Southern-blot analysis of transplastomic T0 lines. Maps of non-transformed plant (a), pKCZ Vector (b) and transplastomic plant (c) genomes showing the positions of HindIII and EcoRI sites; broken lines indicate the expected size fragments. Southern-blot analysis confirmed transgene integration in the plastid genome. DNA was digested by either EcoRI (d, f) or HindIII (e, g) and blots were hybridized to a probe targeting a fragment of the K2S (d, e) or trnR gene (f, g). When DNA was digested with EcoRI (d), the K2S probe hybridized to a 1.6 kb fragment in the transplastomic plant and positive control. When DNA was digested with HindIII (e), the K2S probe hybridized to a 2.8 kb fragment in the transplastomic plant and positive control. When DNA was digested with EcoRI (f), the trnR probe hybridized to a 1.6 kb fragment in the transplastomic plant and positive control.When DNA was digested with HindIII (g), the trnR probe hybridized to a 2.8 kb fragment in the transplastomic plant and positive control.M: Mixed molecular weight marker (SM0333, fermentas), K: Transplastomic plant, Wt: non-transformed plant P: pKCZ vector, C⁺: Positive control (pKCZK2S vector).

شکل 11- محصول  RT-PCRگیاهان ترانس­پلاستومیک بر روی ژل آگاروز 1%، M: نشانگر اندازه 1Kb (فرمنتاز)، C⁺ : کنترل مثبت (ناقل pKCZK2S)، ₁C^- : کنترل منفی (RNA به عنوان الگو)، C^-₂ : کنترل منفی(آب به عنوان الگو)،wt:  کنترل منفی (گیاه غیرتراریخت)، 1-3: گیاهان تراریخت.

Figure 11- RT-PCR amplification of transplastomic plants on the 1% Agarose gel. M: 1 kb molecular weight marker (Fermentas), C⁺: positive control (pKCZK2S vector), C₁^-: negative control (RNA as template), C₂^-: negative control (water as template), wt: negative control (non-transformed plant), Lane 1–3: transplastomic plants.

بحث

فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (tPA) به خاطر تمایل بالای آن به فیبرین، به عنوان یک عامل ترومبولیتیک ارزشمند شناخته شده است. با تزریق پروتئین tPA به عنوان داروی ضد لخته خون یک ساعت پس از حمله قلبی، می­توان خطر مرگ را به طور معنی­داری کاهش داد (Frank, 1995). میزبان­های مختلفی از جمله لاین­های سلولی پستانداران (1992 Corwright)، باکتری Saito et al., 1994) ;Qiu et al., 1998; Ji et al., 1998)، مخمر (Lemontt et al., 1985)، قارچ Mariyln et al., 2001))، لیشمانیا (Soleimani et al., 2006) و گیاهان (Masumi asl et al., 2010; Kang et al., 2011; Hahn et al., 2009;) جهت تولید tPA استفاده شده­اند. هیچ یک از سیستم­های بیانی ذکر شده قادر به بیان پروتئین نوترکیب در مقیاس وسیع نیستند. به دلیل پلی­پلوئید بودن ژنوم کلروپلاست، با انتقال ژن خارجی به کلروپلاست، تجمع بسیار بالایی از پروتئین­های نوترکیب را در این اندامک­ها خواهیم داشت. به گونه­ای میزان بیان پروانسولین انسانی در کلروپلاست توتون تا 47% کل پروتئین محلول و در کاهو 53% کل پروتئین محلول گزارش شده است (Boyhan and Danielle, 2011). اما تاکنون هیچ گونه گزارشی در خصوص تولید پروتئین tPA در کلروپلاست گیاه ارائه نشده است. در این تحقیق از فرم کوتاه شده tPA (Retplase) به دلیل نیمه عمر پلاسمایی بیشتر نسبت به tPA طبیعی و فقدان جایگاه گلیکولیزه، برای بیان در کلروپلاست گیاه توتون استفاده شد. ژن مورد نظر همراه با ژن مقاومت به آنتی­بیوتیک (aadA) تحت کنترل پیشبر بسیار قوی 16srRNA، به منظور بیان دی­سیسترونیک در ناقل کلروپلاستی pKCZ خاص گیاه توتون قرار گرفته و همسانه­سازی شد. این پیشبر منجر به تجمع بسیار بالایی از رونوشت­ها در کلروپلاست خواهد شد ((Zou, 2001. به دلیل رایج بودن جهش­های خودبخودی در 16SrRNA پلاستیدی که منجر به ایجاد مقاومت نسبت به آنتی­بیوتیک اسپکتینومایسین می­شود، ممکن است گیاهان به ظاهر تراریخت مقاوم وجود داشته باشند ((Zou, 2001، این گیاهان همانند گیاه شاهد تراریخت نشده هیچ تکثیری را با آغازگرهای اختصاصی K2S نشان ندادند (شکل 8 چاهک 7). ناقل pKCZ تحت کنترل توالی­های تنظیم کننده 5ʹ-UTR است، گزارش شده است که در حضور این ناحیه، بیان ژن 300-500 برابر افزایش خواهد یافت (Fernandez-San et al., 2003). در روش­های مرسوم تولید پروتئین­های نوترکیب جهت سهولت در مرحله تخلیص، قبل از انتقال ژن یک توالی کوتاه به آن افزوده می­شود تا پس از ترجمه به پروتئین، تمایل به لیگاند اختصاصی داشته باشد. قبل از ژن K2S، توالی کوتاه شش هیستیدین قرار گرفت تا پس از ترجمه به پروتئین به دلیل تمایل به لیگاند اختصاصی نیکل از ستون کروماتوگرافی به راحتی تخلیص شود. همچنین به منظور جداسازی پپتیدهای هیستیدینی از پروتئین پس از تخلیص، توالی پروتئازی فاکتور Xa بین توالی شش­تایی هیستیدین و توالی ژن K2S قرار گرفت. یکی از نواحی مناسب ورود ژن خارجی در ژنوم پلاستیدی توتون حدفاصل بین دو ژن tRNA آرژنین (R-ACG) و آسپاراژین (N-GUU) در جایگاه برشی Mun1 واقع در نواحی تکراری (IR) است که مورد هدف ناقل pKCZ است. نواحی INSL و INSR ناقل به طور اختصاصی از روی این نواحی تکثیر شده و سبب انجام نوترکیبی همولوگ و واردسازی ژن هدف به محل مورد نظر می­شود، بنابراین تعداد نسخه­های ژن وارد شده که قادر به قرارگیری در هر نسخه ژنوم کلروپلاست هستند به دو برابر افزایش می­یابند. در صورتی که درج ژن در جایگاه خاص صورت گیرد، قطعه ژنی  Kb8/1 مربوط به درج ژن K2S تکثیر خواهد شد، آنالیز PCR وجود ژن مزبور را در گیاهان تراریخت تائید می­کند (شکل9). پس از انجام تراریختی، به دلیل ماهیت پلی­پلوئیدی ژنوم پلاستیدی و حذف حالت هتروپلاسمی، نیاز به انتخاب قوی، تدریجی و طولانی مدت سلول­های در حال تکثیر است، بدین منظور دوره­های متعدد انتخاب و باززایی در حضور غلظت­های بسیار بالای آنتی­بیوتیک اسپکتینومایسین صورت گرفت. در آنالیز سادرن بلات الگوی باندی مشاهده شده در گیاه ترانس­پلاستومیک شبیه کنترل مثبت (ناقل pKCZK2S) بوده و قطعه ژنی مربوط به گیاه شاهد غیرتراریخت در آنها مشاهده نشد (شکل 10). این آنالیز موید هموپلاست بودن گیاهان تراریخت پس از چهار دور باززایی است. گیاهانی که در مراحل انتخاب به کمک آنتی­بیوتیک وPCR  به عنوان تراریخت شناسایی شدند، در RT-PCR نیز تکثیر شدند و تکثیر این قطعه در گیاه شاهد غیرتراریخت و کنترل منفی صورت نگرفت. از این آنالیز می توان نتیجه گرفت که گیاهان تراریخت هم ژن K2S را دریافت کرده اند و هم این ژن با موفقیت در این گیاهان در حال بیان و رونویسی است.