تجزیه و تحلیل ژنتیکی و فیلوژنتیکی ناحیه کنترل ژنوم میتوکندریایی مرغ های بومی خراسان

تجزیه و تحلیل ژنتیکی و فیلوژنتیکی ناحیه کنترل ژنوم میتوکندریایی مرغ­های بومی خراسان

محمد رضا نصیری¹، خدیجه نصیری²*

¹ استاد گروه علوم دامی دانشگاه فردوسی مشهد. مشهد. ایران.

² دانشجوی مقطع دکتری ژنتیک و اصلاح نژاد دام (ژنتیک مولکولی) دانشگاه فردوسی مشهد. مشهد. ایران.

تاریخ دریافت: 06/03/1392، تاریخ پذیرش: 22/09/1392

چکیده

مطالعه بر روی مرغ­های بومی می تواند به حفظ تنوع ژنتیکی جمعیت­ها، پیاده نمودن برنامه­های اصلاح نژادی و بدست آوردن اطلاعات در رابطه با ساختار ژنتیکی آنها کمک کند. توالی­یابی ژنوم میتوکندری یکی از کاربردی ترین روش­ها برای تعیین رابطه فیلوژنتیکی بین جمعیت­ها و گونه­های نزدیک به هم محسوب می­شود. هدف از این مطالعه بررسی توالی نوکلئوتیدی ناحیه کنترل از DNA میتوکندریایی مرغ­های بومی خراسان و مطالعات ژنتیکی و فیلوژنتیکی بود. در این مطالعه از 5 قطعه مرغ بومی خراسان نمونه خون تهیه شد پس از استخراج DNA از نمونه­های خون، تکثیر ناحیه کنترل به طول 845 جفت باز با آغازگرهای اختصاصی صورت گرفت. توالی­یابی ناحیه تکثیر شده به روش سانگر انجام گردید. با استفاده ازتوالی­های مشابه ژنوم میتوکندریایی دیگر نژادهای مرغ موجود در پایگاه NCBI، درخت فیلوژنتیکی ترسیم شد و ماتریس فواصل ژنتیکی بین مرغ بومی خراسان  با دیگر نژادها برای ناحیه کنترل ژنوم میتوکندریایی تشکیل گردید. نتایج نشان داد که در بین توالی­های نمونه­های مورد مطالعه، تفاوت­های هاپلوتایپی وجود نداشت. نتایج آزمون فیلوژنتیکی نشان داد حداقل فاصله ژنتیکی بین مرغ­های بومی خراسان با مرغ­های مرندی از ایران، لگهورن سفید،  Buff Cochin و satsuma dori از ژاپن، Lv erwu از چین،  Denizli و Gerze از ترکیه، Dandarawi از مصر و هند وجود دارد. بنابراین، می­توان نتیجه گرفت که قرابت زیادی بین مرغ­های بومی خراسان از ایران با مرغ­های آسیایی وجود دارد.

کلید واژه­ها: مرغ بومی خراسان، DNA میتوکندریایی، ناحیه کنترل، درخت فیلوژنتیک. 

مقدمه

حیوانات بومی به عنوان سرمایه ملی و ذخایر استراتژیک هر کشور محسوب می­شوند و حفظ و تکثیر آن­ها از ارزش و اهمیت بسیاری برخوردار است. این موجودات پس از هزاران سال انتخاب طبیعی و مصنوعی و نیز گذر از موانع بسیار و با غلیه بر تمامی شرایط نامساعد محیطی همچنان به حیات خویش ادامه داده و به تکثیر و ازدیاد نسل پرداخته­اند و همچنین نسبت به بسیاری از محدودیت­های محیطی سازگاری پیدا کرده­اند (Mirhosseini,1998). همچنین منابع حیوانی برای تأمین خوراک و پایداری اقتصادی– اجتماعی و محیطی کشور ضروری می‌باشند. حفظ و استفاده از این منابع حیوانی و طیور در کشورهای توسعه­یافته متفاوت از کشورهای در حال توسعه می­باشد. در کشورهای توسعه­یافته فقط نژادهایی با ارزش اقتصادی بالا و دورگه‌های آن‌ها پرورش داده می­شوند اما کشورهای در حال توسعه با اینکه از نظر منابع نژادی  بسیار ثروتمند هستند اما حفاظت کافی نسبت به نژادهای بومی ندارند و ورود نژادهای خارجی منجر به بدتر شدن  کیفیت و کاهش  تعداد نژادهای بومی گردیده است.  این رفتارها هر دو موجب ایجاد بحران در  منابع ژنتیکی جهانی  و نقصان  در مخازن ژنی طیور و حیوانات می­شود (Wu, 2001). دو فرضیه برای خاستگاه  مرغ‌های اهلی امروزی وجود دارد. یک فرضیه این است که منشأ این مرغ­ها از مرغ جنگلی قرمز (gallus gallus) است و فرضیه دیگر بیان می‌دارد که مرغ­های اهلی امروز از چند زیر گونه gallus منشأ یافته­اند  (Crawford, 1990). بر مبنای شواهد گزارش شده، 120 نژاد مرغ در سرتاسر جهان زندگی می­کند (http://www.poultrypages.com/chicken-breeds.html). اخیراً منابع ژنتیکی بومی اهلی از اهمیت فراوانی برخوردار شده‌اند  و برای حفظ کردن تعداد حداقلی از این حیوانات تلاش­هایی صورت گرفته است (http://www.fao.org/dad-is/).

امروزه روش­های مولکولی، مانند توالی­یابی ژنوم میتوکندری یکی از کاربردی ترین روش­ها برای تعیین رابطه فیلوژنتیکی بین جمعیت­ها و گونه­های نزدیک به هم محسوب می­شود (Bruford et al.,  2003). اندازه ژنوم میتوکندریایی در بیشتر حیوانات از جمله پرندگان حدود 16-17 کیلو جفت­ باز می­باشد. ژنوم میتوکندری 22 tRNAs ، 2 rRNAs و 13 پلی پپتید را کد می­کند (Chinnery and Schon, 2003). بیان این ژن­ها در مهره داران برای تولید انرژی، متابولیسم، هموستاز سلولی و مرگ سلولی ضروری می­باشد ((DiMauro, 2004.

ناحیه کنترل[1] تنوع نوکلئوتیدی نسبتاً بالایی دارد و بیشتر نسبت به سایر نواحی دیگر mtDNA پلی­مورفیک است (Quinn and Wilson et al., 1993) و اغلب برای تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی داخل گونه­ها مورد استفاده قرار می­گیرد (Brown et al., 1982). ناحیه کنترل به عنوان نقطه شروع برای همانندسازی DNA میتوکندریایی عمل می­کند. ناحیه کنترلی به سه ناحیه کنترلی که شامل ناحیه­ای در انتهای '3 که ناحیه کنترل І (HVS-І) نامیده می­شود، ناحیه کنترل ІІ در بین ناحیه І و ІІ (توالی حفاظت شده) و ناحیه­ای در انتهای '5 که ناحیه کنترلی ІІІ (HVS-ІІ) نامیده می­شود، تقسیم شده است. بررسی­ها نشان داده است که نواحی کنترلی І و ІІІ  بالاترین میزان تنوع نوکلئوتیدی را در بر دارند و مطالعه تنوع ژنتیکی این نواحی به علت تکامل سریع در تعیین رابطه فیلوژنتیک میان گونه­ها از ارزش بالایی برخوردار است (Sultana et al.,  2004). ناحیه کنترلی هیچ پروتئینی را کد نمی­کند و نسبت به دیگر نواحی ژنوم mtDNA سریعتر تکامل یافته، طوریکه این ناحیه یک ناحیه باارزش و دارای حساسیت بالایی در تجزیه و تحلیل ژنتیکی جمعیت، بخصوص مناسب برای تنوع ژنتیکی داخل گونه­ها می­باشد.

مزایای DNA میتوکندریایی در تشخیص گونه­ها و ترسیم رابطه  فیلوژنتیکی شامل مواردی چون اندازه کوچک­تر آن، وراثت­پذیری مادری، تعداد کپی بالاتر در هر سلول، وجود نواحی حفاظت شده و وجود نواحی حفاظت نشده­ای همانند ناحیه کنترل یا D-Loop برای مطالعات تکاملی گونه­های وابسته و عدم وجود نوترکیبی می­باشد (Bellagamba et al.,  2001). DNA میتوکندریایی در مقایسه با DNA هسته­ای بیشتر پلی­مورفیک است و نرخ تکاملی آن 5 الی 10 برابر سریعتر از ژنوم هسته­ای است (Brown et al., 1982). توالی کامل mtDNA مرغ که تاکنون مشخص شده است هنگامی که با mtDNA دیگر گونه­های مقایسه می­شود نشان داده است که ویژگی­های حفاظت شده بالایی را دارا می­باشد، اگرچه بیشتر ویژگی­ها در همه mtDNA مهره­داران یکسان هستند اما برخی تفاوت­ها با ژنوم پرندگان دارند. ناحیه کنترل در پرندگان از دیگر مهره­داران متفاوت است که ژن­های tRNA^Gluو tRNA^Phe در جناحین واقع شده­اند (Desjardins and Morais, 1990).

در پژوهشی  Lee et al. (2007) mtDNA 31 مرغ Ogol کره­ای را به منظور بررسی ساختارهای ژنتیکی، تجزیه و تحلیل فیلوژنی و محاسبه تنوع ژنتیکی توالی­یابی کردند و 18 تغییرات نوکلئوتیدی را چهار4 در هاپلوتایپ گروه­بندی کردند.

Xiaojing et al (2007) به منظور شناسایی تنوعات ژنتیکی در mtGenome 53 پرنده (20 قطعه جوجه­های لگهورن سفید و 33 قطعه جوجه­های گوشتی) که شامل هم نواحی کد کننده و هم ناحیه غیر کد کننده (D-Loop) بود از ابزار آزمایشگاهی و in silico بهره گرفتند و 113 چند شکلی تک نوکلئوتیدی را شناسایی کردند و در تجزیه وتحلیل in silico، 91 SNPs شناسایی شد که 70 SNPs در ناحیه کد کننده و 21 SNPs در ناحیه غیر کد کننده بودند.

با توجه به ضرورت ارزیابی و حفظ منابع ژنتیکی، حفظ توده­ مرغ­های بومی ایران سزاوار توجه جدی است. هدف از این تحقیق تعیین و بررسی توالی نوکلئوتیدی بخشی از ناحیه ی کنترلی ژنوم میتوکندریایی مرغ بومی خراسان بود تا اطلاعاتی از وضعیت توالی این ناحیه در این نژاد بومی ایرانی بدست آورده و با سایر نژادهای موجود در ایران و سایر کشورها مقایسه شود و همچنین توالی بدست آمده از این توده بومی در بانک جهانی ژن ثبت شود.

مواد و روش­ها

جمع­آوری نمونه­ها، استخراج DNA و تعیین کمیت و کیفیت آن

در این تحقیق نمونه­های خون از تعداد 5 قطعه مرغ بومی استان خراسان گرفته شد. مرغ­های مورد استفاده جهت خونگیری از مرکز جهاد استان خراسان رضوی تهیه شد. استخراج DNA با استفاده از کیت GeNet Bio (GENET BIO , Korea) انجام گرفت. کمیت DNA استخراج شده با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ مدل ND 2000 شرکت THERMO امریکا مشخص شد و  کیفیت آن روی ژل آگارز 1 درصد تعیین شد.

طراحی آغازگرها و واکنش زنجیره­ای پلیمراز

در این تحقیق از نرم­افزار Primer premier برای طراحی آغازگرها جهت تکثیر بخشی از ناحیه کنترل از ژنوم میتوکندریایی به طول 845 جفت باز استفاده شد. پرایمرهای رفت در فاصله 16756-16776 و پرایمرهای برگشت در فاصله 845-865 از ژنوم میتوکندریایی متصل شدند. توالی پرایمرهای مورد استفاده به شرح زیر بود:

TTGTTCTCAACTACGGGAACA-3'-Forward: 5'

-3' CAAAGTGCATCAGTGTCAAGAT-Reverse: 5’

واکنش زنجیره­ای پلی­مراز توسط دستگاه ترموسایکلر Biometra مدل T-personal با برنامه حرارتی زیر انجام گرفت. واسرشت سازی اولیه در دمای 94 درجه سانتیگراد برای 10 دقیقه، 34 سیکل دمایی با دمای واسرشت سازی 94 درجه سانتی­گراد برای 30 ثانیه، اتصال در دمای 64 درجه سانتی­گراد برای 30 ثانیه، بسط در دمای 72 درجه سانتی­گراد برای 30 ثانیه و یک مرحله بسط نهایی در دمای 72 درجه برای 10 دقیقه. حجم واکنش 25 میکرولیتر و اجزای واکنش شامل 5/17 میکرولیتر آب دو بار تقطیر، 5/2 میکرولیتر بافرX10، 1 میکرولیتر MgCl₂ 50 میلی­مولار، 2 میکرولیتر dNTPs 10 میلی مولار، 1 میکرولیتر DNA و 1 میکرولیتر از مخلوط پرایمر 5 پیکو­مولار و 2/0 واحد آنزیم Taq پلیمراز بود. محصولات PCR به منظور تأیید تکثیر ناحیه مورد نظر طی واکنش روی ژل آگارز 1 درصد با رنگ­آمیزی اتیدیوم بروماید الکتروفورز شدند و نتیجه در دستگاه ژل داکیومنت مورد بررسی قرار گرفت.

تعیین توالی محصولات تکثیر شده

مقدار 20 میکرولیتر از محصولات PCR، با کیت Reaction recovery (Denazist, Iran) خالص سازی شد و به همراه 20 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای رفت و برگشت با غلظت 10 پیکومول به منظور تعیین توالی به شرکت MACRO GEN کره جنوبی ارسال شدند و نمونه­ها با استفاده از دستگاه ABI 3130 به روش اتوماتیک سانگر توالی­یابی شدند.

تجزیه و تحلیل توالی­ها

از رویه BLASTN در پایگاه NCBI جهت تعیین همولوژی و همپوشانی توالی­ها استفاده شد. به منظور اصلاح نوکلئوتیدی توالی­ها از نرم­افزار MEGA v.5 (2011 Tamura et al.,) استفاده شد. جهت رسم نمودار فیلوژنی از رویه Neighbor-Joining بر پایه روش حداکثر درست­نمایی نرم افزار MEGA v.5 استفاده شد. برای رسم ماتریس فواصل ژنتیکی و تعیین درصد شباهت توالی ناحیه کنترل از DNA میتوکندریایی مرغ بومی خراسان با توالی­های مشابه از مرغ­های نژادهای دیگر از نرم­افزار MegAlign استفاده شد. برای ثبت توالی به دست آمده از نرم افزار Sequin v 10 استفاده شد.

نتایج و بحث

استخراج DNA از نمونه­های خون مرغ­های بومی خراسان  با موفقیت انجام شد و نتایج طیف­سنجی نشان داد که DNA استخراج شده از کمیت و کیفیت خوبی برخوردار است. الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره­ای پلیمراز بر روی ژل آگارز 1 درصد نشان داد که پرایمرهای طراحی شده به خوبی فعالیت نموده و قطعات اختصاصی تولید نمود. نشانگر اندازه استفاده شده در کنار محصولات PCR صحت تکثیر قطعه مورد نظر را تأیید کرد (شکل 1).

شکل 1- الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره­ای پلیمراز به طور 845 جفت باز روی ژل آگارز 1 درصد.

Figure 1- Electrophoresis of 845bp PCR products on 1%  agarose gel.

توالی­یابی ناحیه کنترل ژنوم میتوکندریایی برای 5 نمونه انجام شد، اما نتایج حاصل از یکی از نمونه­ها به علت کیفیت پایین کنار گذاشته شد و در ادامه بررسی ها از آن استفاده نشد.  توالی مورد توافق برای ناحیه کنترل از ژنوم میتوکندری به طول 793 جفت باز به عنوان توالی شاخص در مرغ بومی خراسان تعیین گردید (شکل 2) و ترکیب نوکلئوتیدی آن در شکل 3 نشان داده شده است.

شکل 2- توالی­های نوکلئوتیدی از ناحیه کنترل ژنوم میتوکندریایی در مرغ ­های بومی خراسان.

Figure 2- Nucleotide sequences of mitochondrial DNA control region genome in Khorasan native chicken.

شکل 3- درصد ترکیب نوکلئوتیدی توالی­های مورد مطالعه در مرغ­های بومی خراسان (95/22% آدنین، 63/29% سیتوزین ، 52/16% گوانین و 90/30% تیمین)

Figure 3- Nucleotide composition percent of Khorasan native chicken sequences (A 22.95%, C 29.63%, G 16.52% and T 30.90%).

ترکیب نوکلئوتیدی توالی­های مورد مطالعه مورد محاسبه قرار گرفت و نشان دهنده فراوانی 15/46 %  نسبت G+C و 85/53 % نسبت A+T می­باشد. همچنین توالی ­های مورد مطالعه محتوی 95/22% آدنین، 63/29% سیتوزین، 52/16% گوانین و 90/30% تیمین بودند (شکل 3). مقایسه بین چهار توالی با استفاده از ابزار ClustalW Multiple alignment نرم افزار BioEdit (Hall, 1999) نشان دهنده عدم وجود اختلاف بین توالی­های مورد مطالعه بوده (P=0). این پدیده می تواند ناشی از  کم بودن تعداد نمونه و یا هموژن شدن توده مورد بررسی بخاطر چندین نسل انتخاب پیاپی با اهداف تجاری باشد.

مقایسه توالی­های مورد مطالعه با توالی­های ثبت شده در پایگاه NCBI مشخص نمود که میزان هم پوشانی  و همولوژی بالایی بین توالی­های مورد مطالعه و توالی­های موجود در این پایگاه وجود دارد و نشان می‌دهد ناحیه توالی یابی شده در این مطالعه مشابه توالی این ناحیه در مطالعات دیگر است. نتایج حاصل از بررسی درخت فیلوژنتیکی نشان می­دهد که توالی ناحیه کنترل از ژنوم میتوکندری مرغ بومی خراسان با توالی­های مرغ­های نژاد مرندی از ایران، لگهورن سفید،  Buff Cochinو satsuma dori از ژاپن، Lv erwu از چین، Denizli و Gerze از ترکیه، Dandarawi از مصر و مرغ هندی قرابت بیشتری دارد و در یک گروه قرار می­گیرند و با مرغ gallus از ژاپن و مرغ Silkie از سوئد فاصله دورتری دارند. همچنین نتایج درخت فیلوژنتیکی نشان می­دهد که مرغ Green Jungle Fowl از ژاپن به عنوان گروه غیر مرتبط می­باشد (شکل 4).

شکل4- درخت فیلوژنی براساس رویه Neighbor-Joining از ناحیه کنترل ژنوم میتوکندریایی مرغ­های بومی خراسان (اعداد روی گره­ها نشان­دهنده درصد مشابهت درون گروهی حاصل از 1000 مرتبه نمونه­گیری می­باشد).

Figure 4- Phylogenetic tree of mitochondrial DNA control region in Khorasan native chicken based on Neighbor-Joining method. The numbers at the nodes showed the percentage bootstrap values for interior branches after 1000 replications

در بررسی ماتریس فواصل ژنتیکی بین مرغ بومی خراسان با دیگر نژادها برای ناحیه کنترل از ژنوم میتوکندریایی مشخص شد که کمترین فاصله ژنتیکی بین مرغ بومی خراسان از ایران با مرغ­های مرندی از ایران، لگهورن سفید، Buff Cochin و satsuma dori از ژاپن، Lv erwu از چین وجود دارد که معادل صفر است و بیشترین فاصله ژنتیکی بین مرغ بومی خراسان با مرغ Green Jungle Fowl از ژاپن می­باشد که معادل 5/10 درصد است و این نتایج صحت ترسیم درخت فیلوژنتیک را تأیید می­کند (جدول 1). نتایج بدست آمده از تحقیق حاضر مؤید این مطلب است که قرابت زیادی بین مرغ­های بومی خراسان از ایران با مرغ­های آسیایی (شرق و جنوب شرق آسیا) وجود دارد در تحقیقی که به منظور تعیین توالی ناحیه HVR-І از ژنوم میتوکندری جمعیتی از مرغ مازندرانی ایران انجام گرفت، نتایج حاکی از آن بود که مرغ بومی مازندرانی ایران با مرغ مرندی ایران، بومی کشور آذربایجان، لگهورن سفید، پلیموت راک پرخط دار، مرغ ابریشمی و جنگلی خاکستری در یک دسته قرار دارند (Pirany et al., 2011). در مطالعه­ای که به منظور تعیین توالی بخش HVS-І از ناحیه D-Loop ژنوم میتوکندری مرغ مرندی ایران انجام گرفت نتایج فیلوژنی مشخص کرد که مرغان بومی مرندی ایران با مرغ بومی کشور آذربایجان، پلیموت راک پر خط دار، لگهورن سفید، مرغ ابریشمی و مرغ جنگلی خاکستری نزدیکی بیشتری دارند (Mohammadipestebik  et al., 2011). در پژوهشی Oka et al. (2007) گزارش کردند که مبدأ اولیه چندین جمعیت مرغ بومی ژاپن از جنوب شرق آسیا: چین، کره و اندونزی می­باشد (Oka et al., 2007).

et al Silva (2009) ارتباط ژنتیکی بین مرغ­های سریلانکا با مرغ جنگلی قرمز یافتند که مبدأ اولیه آن از چین، لائوس، ویتنام و تایلند از کشورهای آسیای جنوب شرقی می­باشد (Silva et al., 2009).

با توجه به فواصل ژنتیکی کم مرغ­ بومی خراسان با نژادهای مرغ آسیای جنوب شرقی، نتایج حاصل از این پژوهش نتایج گزارش شده توسط چندین مطالعه دیگر (Silva et al., 2009; Pirany et al., 2011; Oluwabukola., 2005; Oka et al., 2007 ) را مبنی بر فرضیه­ی اینکه کشورهای آسیایی و از جمله آسیای جنوب شرقی به عنوان نخستین محل اهلی شدن مرغ می­باشند را تأیید می­کند.

نتیجه گیری کلی

نتایج مطالعات فیلوژنتیکی نشان داد که ارتباط نزدیکی بین مرغ­های بومی خراسان با جمعیت مرغ های کشورهای آسیایی وجود دارد. اطلاعات ژنتیکی از این مطالعه می­تواند به عنوان گامی برای توسعه استراتژی­های آینده برای شناسایی، حفاظت و بهبود منابع ژنتیکی ارزشمند مرغ­های بومی کمک کند. بنابراین، از آنجا  که این نژادهای بومی تنها جمعیت­هایی می­باشند که برای حفظ ذخایر ژنتیکی مورد استفاده قرار می­گیرند باید مورد توجه و مراقبت بیشتری قرار گیرند تا تنوع ژنتیکی موجود در این نژادهای بومی کاهش نیابد. پیشنهاد می­شود مطالعات بعدی با تعداد نمونه بیشتر و بر روی دیگر نواحی ژنوم میتوکندیایی مرغان بومی خراسان به منظور تعیین تنوع ژنتیکی درون توده ای صورت گیرد. همچنین تعیین نقشه ژنتیکی ژنوم میتوکندری در شناخت بیشتر ویژگی های ژنتیکی این توده می تواند نقش بسزایی داشته باشد.