رهیافت مولکولی برای شناسایی زوج‌سمان بر اساس چند شکلی ناحیه کنترل میتوکندری

رهیافت مولکولی برای شناسایی زوج‌سمان بر اساس چند شکلی ناحیه کنترل میتوکندری

وحید زمانی¹، حمیدرضا رضایی*²، سالومه بازیان¹، سید محمود عقیلی²، علی شعبانی²، مرضیه اسدی‌آقبلاغی³، نوید زمانی³

¹ دانش‌آموخته مهندسی منایع طبیعی- محیط زیست دانشگاه علوم کشاورزی و منابع‌طبیعی گرگان

² عضو هیات علمی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع‌طبیعی گرگان

³ دانش‌آموخته مهندسی منایع طبیعی- محیط زیست دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه تهران

تاریخ دریافت: 05/07/1392، تاریخ پذیرش: 07/03/1393

چکیده

در سال‌های اخیر جمعیت گونه‏های زوج‌سم بواسطه شکار غیر قانونی کاهش چشمگیری داشته است. در بسیاری از موارد شناسایی اعضای بدن و بافت‏های کشف شده از شکارچیان متخلف از طریق مشاهده چشمی میسر نیست و این امر اثبات تخلف صورت گرفته را با مشکل مواجه می‏کند. هدف از تحقیق حاضر ارائه روشی ملکولی بر مبنای نشانگر متداول ژنوم میتوکندری و استفاده از آغازگرهای عمومی برای شناسایی هشت گونه‏ از خانواده‌های گوزن‌ها، گاوها و گرازها است. به منظور اجرای این تحقیق نمونه‏های بافت هشت گونه زوج­‏سم شامل: مرال(Cervus elaphus maral) ، شوکا(Capreolus capreolus) ، جبیر (Gazella bennettii)، آهو (Gazella subgutturosa)، گوزن زرد ایرانی(Cervus dama mesopotamica) ، گراز(Sus scrofa) ، پازن (Capra aegagrus) و قوچ اوریال(Ovis vignei)  از جمعیت‌های وحشی مناطق مختلف مورد بررسی و شناسایی قرار گرفتند. نتایج به دست آمده نشان داد طول ناحیه کنترل میتوکندری (D-loop)  در گونه‌های مورد مطالعه چندشکلی بالایی دارد (مرال 569 جفت باز، شوکا جفت باز 573، جبیر 598 جفت باز ، آهو 644 جفت باز ، گوزن زردایرانی 578 جفت باز، گراز 566 جفت باز ، پازن 990 جفت باز و قوچ اوریال 1062 جفت باز)، که بر این اساس تشخیص گونه‌ها به کمک این  ویژگی امکان‌پذیر می‌باشد. به این ترتیب استفاده از این روش و ارایه مدارک ژنتیکی معتبر به دادگاه، تحولی در زمینه برخورد با تخلفات شکار به وجود خواهد آورد. همچنین، می‌توان حضور این گونه‌های کمیاب را در مناطق مختلف با قطعیت مشخص نمود و مطالعات بوم‌شناسی آن‌ها را بهبود بخشید.

کلمات کلیدی: زوج‌ سمان، ناحیه‌کنترل ژنوم میتوکندری، تخلفات شکار.

مقدمه

یکی از مهم‌ترین چالش ها در زمینه حفاظت از حیات وحش، آشنایی کامل با بوم‌شناسی گونه است. در این راستا شناسایی گونه‌ها در محیط زندگی آنها که نقش ویژه‏ای را در برآورد چگونگی وضعیت و متعاقب آن نرخ انقراض و یا ماندگاری گونه در طبیعت ایفا می‏کند، در الویت قرار دارد(Frankham, 2005) . مشاهده و شناسایی بسیاری از گونه‌های وحشی به علت ویژگی‌های خاص رفتاری، مانند شب‌زی بودن، گونه‌های فراری، ‌رنگ‌آمیزی استتاری با محیط، دشوار و در برخی موارد نیز با اشتباهاتی همراه است. روش‌های متفاوتی جهت شناسایی گونه‌های ‏وحشی مانند روش مشاهده مستقیم و بررسی‌های آزمایشگاهی استفاده می‌شود. در گذشته اکثر روش‌های شناسایی مبتنی بر روش‌های ریخت‌شناسی بوده است. اما امروزه در بسیاری از مطالعات میدانی جهت شناسایی گونه‌های حیات‏وحش با بررسی تغییرات ژنتیکی به راحتی می‌توان اطلاعات با ارزشی در خصوص شناسایی گونه‌ها با استفاده از نمونه‌های غیرتهاجمی مانند پوست، مو، پر و خون به دست آورد(Imaizumi et al., 2007; Bellis et al., 2003; Balitzki et al., 2005; Riddle et al., 2003; Kitano et al., 2007). روش‌های مختلفی برای تشخیص گونه‌ها بر پایه واکنش زنجیره‌ای پلیمراز وجود دارد، که شامل ایجاد آغازگرهای PCR خاص گونه و استفاده از آغازگرهای عمومی ترکیبی برای توالی‌های مشتق شده از سایر گونه‌ها است.(Jarman et al., 2004; Hill et al., 1996)  در دهه‌های گذشته چندشکلی ژنوم میتوکندری اغلب به‌عنوان یک نشانگر زیستی مناسب برای ردیابی سلول‌های گیاهی و جانوری مورد استفاده قرار گرفته است. علاوه بر آن ناحیه کنترل دارای قطعاتی است که چهار الی پنج بار سریع‌تر از کل DNA میتوکندریایی تکامل می‌یابد(Mitani et al., 2009; Reuter et al., 2009; Valentini et al., 2008) .

ژنوم میتوکندری به دلیل دارا بودن تعداد زیادی نسخه میتوکندری در هر سلول و تغییرپذیری زیاد در طول توالی آن، به ابزاری قدرتمند برای شناسایی گونه‌ها تبدیل شده و کاربرد گسترده‌ای در شناسایی گونه‌های اهلی و وحشی مانند سگ و گرگ دارد (Asadi, 2012). همچنین توالی ناحیه‌ کنترل این ژنوم در بسیاری از تاکسون‌های مطالعه شده نرخ تکاملی بالایی را نشان می‌دهد (Rastogi et al., 2007; Taberlet et al., 1999; Hebert et al., 2002; Tautz et al., 2003).

راسته زوج ‌سمان شامل پستانداران اهلی و وحشی است، که سه خانواده گراز، گوزن و گاو در ایران وجود دارند. گونه‌های این خانواده‌ها شامل گراز، گوزن زرد، مرال، شوکا، آهو، جبیر، بز (پازن)، قوچ و میش‌های اوریال و ارمنی هستند، که اغلب به صورت اجتماعی زندگی می‌کنند. در بسیاری از مناطق کشور به علت تعقیب و شکار بی‌رویه، تخریب زیستگاه و اشغال آبشخورها به وسیله دام‌های اهلی، جمعیت آن‌ها به شدت دچار کاهش شده و خطر انقراض نسل این موجودات را تهدید می‌کند Firoz, 1999) Ziaie, 2009;). بنابراین مطالعه و شناسایی دقیق این گونه‌های در معرض خطر، لازمه تدوین و اجرای برنامه‌های حفاظتی  است. بسیاری از گونه‌های زوج سمان به خصوص در زیستگاه‌های جنگلی دارای ویژگی‌های رفتاری خاص مانند فرار و استتار هستند، لذا تصمیم‌گیری در مورد اصولی‌ترین اقدامات حفاظتی برای آن‌ها سخت و یا غیر ممکن است (Riddle et al., 2003). از سویی دیگر اقدامات قانونی و خدمات مدیریت حیات‌وحش ممکن است به تشخیص نمونه‏های گیاهی یا جانوری که بر اثر کشتارهای انسانی، شکار غیرقانونی و تجارت گونه‌های حمایت شده، تصادفات جاده‏ای حیوانات و جستجوهای تغذیه‏ای به ‌دست آمده، نیاز داشته باشند. چنانچه بسیاری از مراکز فعال در زمینه حفاظت حیات‌وحش در اثبات جرم و برخورد با افراد متخلف با مشکل مواجه هستند. در این تحقیق سعی بر آن است به کمک یک جفت آغازگر عمومی، چندشکلی طول ژن ناحیه‌کنترل میتوکندری تعیین ‌گردد تا روشی قابل اعتماد، مقرون به صرفه و سریع برای شناسایی نمونه‌های مختلط یا ناشناخته و نمونه‌های کشف شده از متخلفین شکار ارائه گردد et al., 2006) (Sugimoto.

مواد و روش‌ها

جمع‌آوری نمونه‌ها

در پژوهش حاضر از گونه‌های، گراز (Sus scrofa)، بز و پازن(Capra aegagrus) ، مرال (Cervus elaphus maral)، گوزن‌زرد ایرانی (Cervus dama mesopotamica)، شوکا (Capreolus capreolus)، قوچ اوریال (Ovis vignei)، آهو (Gazella subgutturosa) و جبیر (Gazella bennettii) از نمونه‌های به‌ دست آمده از تخلفات شکار و تلفات جاده‌ای نمونه بافت تهیه شد (جدول 1). نمونه‌های بافت ابتدا در الکل قرار داده شدند و پس از 24 ساعت به تیوب­های حاوی سیلیکاژل منتقل گردید.

آماده سازی نمونه‌ها

استخراج DNA از نمونه های بافت با استفاده از کیت(AccuPower® PCR PreMix kit, Bioneer)  صورت گرفت و DNA استخراجی تا زمان PCR در دمای 20- درجه نگهداری شد. کیفیت و کمیت DNA استخراجی نیز با استفاده از ژل آگاروز یک درصد و دستگاه اسپکتروفتومتری تعیین شد.

جدول 1- فهرست نمونه­های استفاده شده در این مطالعه.

Table1: List of samples used in this study.

واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز و الکتروفورز

به منظور بررسی چندشکلی توالی ناحیه‌ کنترل در زوج ‌سمان قطعه چپ ناحیه‌ کنترل mtDNA توسط آغازگر پیشرو L15995 (Taberlet et al., 1994) و H16498 آغازگر پسرو et al., 1996) (Fumagalli تکثیر شد (جدول 2). تکثیر جایگاه‌های ژنی با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز در حجم 25 میکرولیتر شامل20 نانوگرم DNA یک واحد بین اللملی tap DNA پلی‌مراز، بافر PCR x1، 5/1 میلی‌مولار کلرید منیزیم و آب مقطر تا رسیدن به حجم 25 میکرولیتر انجام گرفت. چرخه دمایی برای تکثیر ناحیه کنترل ژنوم میتوکندری عبارت بود از: 3 دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد و در ادامه 35 چرخه، شامل30 ثانیه در 95 درجه سانتی‌گراد و 30 ثانیه در 54 درجه و 1 دقیقه در 72 درجه و بسط نهایی با 72 درجه در 5 دقیقه. سپس محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بر روی ژل آگاروز 2 درصد و ژل پلی‌اکریل آمید 8 درصد جدا سازی شدند. در نهایت تصاویر مربوط به ژل‌ها با استفاده از دستگاه مستندساز ژل ثبت شد و اندازه باندها با استفاده از نرم‌افزارGel pro Analyzer در مقایسه با مارکر[1] به طور دقیق ثبت گردید. قابل ذکر است که بعد از تشکیل باند بر روی ژل واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز و تهیه ژل برای هر گونه پنج بار تکرار شد.

تجزیه و تحلیل نتایج

توالی ناحیه‌‌کنترل ژنوم میتوکندری گونه‌های مورد استفاده ثبت شده در پایگاه ژن بانک از طریق بلاست[2] کردن با آغازگرهای مورد استفاده در این پژوهش در ژن‌بانک[3] جستجو شدند. مرتب‌سازی ردیف توالی‌ها با استفاده از آلاینمنت[4] در نرم‌افزار مگا[5] (با حدود اطمینان %95) صورت گرفت و سپس طول توالی‌ها اندازه‌گیری شد. در نهایت طول توالی‌های بدست آمده از گونه‌های ثبت شده در ژن بانک با طول توالی‌های بدست آمده در این پژوهش مقایسه شدند.

نتایج

شناسایی گونه‌های مورد بررسی

در پژوهش حاضر هشت گونه زوج سم مورد شناسایی قرار گرفتند. نتایج به دست آمده نشان می‌دهد که هر یک از قطعات تکثیر شده ناحیه کنترل میتوکندری بر اساس چگالی و با توجه به طول مخصوص، جایگاهی ویژه‌ای را در روی ژل پلی‌اکریل‌آمید به خود اختصاص  می­دهند (شکل 1). چنانکه اندازه طول توالی تکثیر شده ژن ناحیه‌کنترل میتوکندری در نمونه‌های مورد استفاده متفاوت بوده و هر کدام طول باند ویژه‌ای را بر روی ژل ایجاد کردند. اطلاعات حاصل از مقایسه اندازه‌گیری طول باندها بدست آمده با نمونه‌های مشابه موجود در ژن بانک اختلاف بارزی را در طول قطعه ناحیه‌کنترل ژنوم میتوکندری در بین گونه‌های مختلف و حتی در جمعیت‌های مختلف یک گونه نشان داد (جدول 3).

جدول 2- توالی‌ها آغازگرهای مورد استفاده ناحیه کنترل ژنوم میتوکندری در این مطالعه.

Table 2: Sequences of the primers of mitochondrial control region used in this study.

شکل 1- تصویر باند‌های ایجاد شده برای گونه‌های زوج‌سم بر روی ژل اکریل آمید. A-Ovis vignei ، B-Capra aegagrus، C-Sus scrofa ، D-Cervus dama mesopotamica ، E-Cervus elaphus،  F-Capreolus capreolu ، G-Gazella subgutturosa، H-Gazella bennettii، I- Lader.

Figure 1- Image created for species artiodactyls bands on polyacrylamide gel: A-Ovis vignei, B-Capra aegagrus, C-Sus scrofa, D-Cervus dama mesopotamica, E -Cervus elaphus, F-Capreolus capreolu, G-Gazella subgutturosa, H-Gazella bennettii, I- Lader.

جدول 3- طول توالی ناحیه کنترل میتوکندری بدست آمده برای گونه‌های مورد مطالعه و گونه­های موجود در پایگاه ژنبانک.

Table 3- The mitochondrial control region length obtained for the species studied and species at the base NCBI.

بحث

در مطالعه حاضر بر اساس اختلاف طول ژن ناحیه‌کنترل میتوکندری، شناسایی گونه‌های خانواده گراز، گاوسانان و گوزن‌سانان صورت گرفت. اندازه‌های ثبت شده طول توالی ناحیه‌کنترل میتوکندری در مطالعه حاضر نشان داد که از این ویژگی میتوان به عنوان یک کلید شناسایی ژنتیکی معتبر برای تشخیص گونه‌های مورد مطالعه سود برد. در واقع با توجه به این اختلافات طول ناحیه‌کنترل در گونه‌های مختلف و همسانی در بین افراد یک گونه، می‌توان با دقت بالایی به شناسایی گونه اقدام نمود. البته در گونه شوکا و مرال در طول چندشکلی قطعه مورد نظر اختلاف زیادی مشاهده نشد. در چنین مواردی پیشنهاد می‌گردد که از آنزیم‌های برش دهنده، زوج پرایمر متفاوت و یا توالی دیگری برای این منظور استفاده گردد Pun et al., 2009)). تفاوت طول قطعه میان داده‌های ژن‌بانک و داده‌های بدست آمده از این پژوهش قابل پیش‌بینی بود به دلیل اینکه که نمونه‌های موجود در ژن‌بانک هیچ‌ کدام متعلق به ایران نبود و چندشکلی در طول توالی تکثیر شده میان نمونه‌های مورد آزمایش با نمونه‌های ثبت شده در ژن‌بانک قابل انتظار بود. با استفاده از یافته‌های این تحقیق شناسایی زوج‌سمان از نمونه‌های ناشناخته بر اساس چندشکلی طول ژن ناحیه‌کنترل میتوکندری با دقت و صحت بالا امکان‌پذیر است. لذا با در اختیار داشتن نمایه‌های بیولوژیک (خون، بافت، ادرار، بزاق و مدفوع) می‌توان گونه‌های غیر‌ قابل تشخیص که بر اثر تصادفات جاده‌ای، حملات و تلفات طبیعی، جستجوهای تغذیه‌ای و یا کشف نمونه از متخلفین به‌ دست آمده‌اند را شناسایی کرد. در موارد جرم‌‌شناسی حیات‌وحش نیز می‌توان با اطمینان کامل از صحت نتایج، هزینه پایین و سرعت بالا گامی موثر در کاهش تخلفات و بررسی هرچه سریع‌تر وضعیت گونه‌ها برداشت Pun et al., 2009)) و اقدام به شناسایی گونه‌‌ها نمود. با نتایج این تحقیق مدراک مستند و موثق در اختیار دادگاه قرار می‌گیرد و امید است که تحولی در کاهش تخلفات شکار ایجاد نماید. کما اینکه در طی این پژوهش چهار نمونه بافت مکشوفه از متخلفان شکار از استان گلستان، یک نمونه از مازندران، یک نمونه از کرمانشاه و یک نمونه از خراسان رضوی با موفقیت شناسایی شد. قابل ذکر است که روش مذکور در شناسایی مناطق نمونه‌برداری نیز موثر است و بر اساس این نتایج، مناطق شکار نمونه‌های به دست آمده نیز قابل شناسایی است. چنانکه این روش در شناسایی گونه‌های گوشت‌خوار بویژه گونه‌های در معرض خطر مانند یوزپلنگ و برخورد با متخلفین نیز بکار می‌رود (Zamani, 2012). با استفاده از نمونه‌های زیستی یافته شده در مناطق مختلف می‌توان حضور گونه‌های کمیاب بویژه گونه‌هایی که از نظر حفاظتی در وضعیت انقراض قرار دارند و اثبات حضور آن‌ها در منطقه می‌تواند رهگشای مدیریت اکوسیستم‌ها و مشخص کردن زیستگاه‌های مورد استفاده آن‌ها باشد، استفاده کرد.

همچنان که در تمامی زمینه‌های علوم از جمله بوم‌شناسی نارسایی‌هایی در سطوح مختلف همانند عدم امکانات، ناکافی بودن اطلاعات و بویژه کمبود نمونه‌های وحشی جهت پژوهش‌های آزمایشگاهی به چشم می‌خورد. در زمینه تحقیق درخصوص DNA میتوکندری نیز این نقایص و اشتباهات آشکار است که می‌تواند ناشی از تغییرات پایه‌ای، جهش‌های غیر واقعی، اشتباهات پایه و نوترکیبی مصنوعی باشد (Yao et al., 2004). این گونه ابهامات با بکارگیری روش‌های مکمل مانند توالی‌یابی DNA، تحلیل‌های تکامل نژادی و مقایسه با توالی‌های مرتبط و متشابه از پایگاه اطلاعاتی دیگر می‌تواند شناسایی و رفع گردد. لذا با توجه به محدودیت‌هایی که ذکر گردید، روش ارائه شده در این مطالعه به دلیل استفاده از یک جفت آغازگر و عدم توالی‌یابی با کمترین زمان، هزینه و امکانات آزمایشگاهی بصورت متداول در اکثر آزمایشگاه‌ها قابل اجراست و نتایج قابل تکرار آن می‌تواند مورد استفاده محققین بوم‌شناسی جمعیت حیات‌وحش و همچنین سازمان‌های فعال در زمینه حفاظت محیط زیست، مراکز قضایی و سایر نهادهای مربوطه قرار گیرد.