بررسی بیان ژن NHX در گیاه گلرنگ تحت تنش شوری

بررسی بیان ژن NHX در گیاه گلرنگ تحت تنش شوری

علی سعیدپور¹، حمید رضا کاوسی²*، قاسم محمدی­نژاد³، سارا خسروی⁴

¹ دانشجوی کارشناسی ارشد بخش بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه شهید باهنرکرمان.

² استادیار بخش بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه شهیدباهنرکرمان.

³  دانشیار بخش زراعت و اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه شهیدباهنرکرمان.

⁴ دانشجوی کارشناسی ارشد بخش بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه شهیدباهنرکرمان.

تاریخ دریافت: 09/02/1392، تاریخ پذیرش: 23/01/1393

چکیده

گیاه گلرنگ (Carthamus tinctorius L.) از خانواده آفتابگردان (Asteraceae) می­باشد. به دلیل مقاومت بالای گلرنگ در مقابل تنش­های محیطی، می­توان از آن به عنوان گیاه مدل جهت مطالعه اساس مولکولی تحمل به تنش­ها استفاده نمود. در گیاهان یک مکانیزم عمده در ترابری Na⁺ سیتوسولی و کاهش اثرات سمی آن وجود دارد که باعث جایگذاری مقادیر اضافی یون­های سدیم در واکوئل­ها یا بافت­هایی با حساسیت کمتر می­شود که این کار توسط آنتی پورتر غشای واکوئلی (NHX) صورت می­گیرد. در این تحقیق الگوی  بیان ژن NHX در گیاه گلرنگ تحت تنش شوری با استفاده از روش RT-PCR نیمه کمی مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور گیاهچه­های 14 روزه رقم نیمه مقاوم PBR-321 گلرنگ با غلظت­های 0، 50، 100، 150 و 200 میلی­مولار کلریدسدیم مورد تیمار قرار گرفتند. نمونه برداری از گیاهان شاهد و تیمار شده 6، 12، 24 و 48 ساعت پس از اعمال تنش صورت گرفت. نتایج حاصل از آنالیز مولکولی نشان داد که میزان بیان ژن NHX در تمام غلظت­های بررسی شده در ساعات مختلف نمونه­گیری در گیاهان تحت تنش نسبت به گیاه شاهد افزایش قابل توجهی نشان داد. حداکثر میزان بیان ژن در ساعات مختلف در غلظت 150 میلی­مولار کلریدسدیم مشاهده گردید. نتاج کلی نشان دهنده نقش ژن کدکننده آنتی­پورتر غشاء واکوئلی در پاسخ گیاه گلرنگ نسبت به تنش شوری می­باشد.

کلمات کلیدی: گلرنگ، آنتی­پورتر واکوئلی، کلرید­سدیم، RT-PCR نیمه­کمی.

مقدمه

شوری خاک یکی از عمده­ترین تنش­های غیر زیستی کاهش­دهنده تولیدات کشاورزی در جهان است. حدود یک­­سوم از زمین­های کشاورزی جهان بطور قابل ملاحظه­ای شور هستند. علاوه بر این، سالانه حدود 2 میلیون هکتار از زمین­های کشاورزی جهان (حدود 1%) تبدیل به زمین­هایی می­شوند که یا فاقد کارایی برای تولید محصول هستند یا تولید محصول در آنها کاهش می­یابد (Manchanda & Grag, 2008). اثرات شوری روی گیاهان  پیچیده می­باشد. نمک زیاد در خاک باعث کاهش پتانسیل آب می­شود و در نتیجه جذب آب و مواد غذایی برای گیاه مشکل می­شود. همچنین برهم­خوردن توازن یونی ناشی از کاهش جذب یون­های ضرورری و انباشتگی یونهای مضر و سمیت یونی در نهایت باعث کاهش رشد گیاه می­شود (Mahajan & Tureja, 2005; Moons et al., 1995). مکانیسم‌های مولکولی دخیل در فعال‌سازی پاسخ‌های دفاعی گیاه در برابر تنش‌های مختلف پیچیده هستند. به علت مقاومت بالای گلرنگ به شرایط تنش‌زای محیطی، دانشمندان از آن به عنوان یک گیاه مدل جهت بررسی و درک مکانیسم‌های دفاعی و شناسایی آن­ها و مسیرهای کلیدی دخیل در پاسخ به تنش­های محیطی استفاده می­کنند. از این رو جداسازی و شناسایی ژن­های دخیل در ایجاد تحمل به تنش و بررسی الگوی بیان آن­ها  در کنار مطالعات پروتئومیکسی و فیزیولوژیکی امکان شناسایی بهتر مکانیسم­های پیچیده پاسخ دهنده گیاهان به تنش­ها رافراهم می­کنند (Salekdeh & Komatsu, 2007).

تعادل غلظت­های درون سلولی برای فیزیولوژی سلول­های زنده فرایند اساسی می­باشد و تنظیم به موقع جریان یونی برای پایین نگه داشتن غلظت یون­های سمی و تراکم یون­های ضروری در درون سلول­ها ضروری است. گیاهان تحت تنش شوری، غلظت­های بالایی از یون K⁺ و غلظت­های پایینی از Na⁺ را در سیتوسول حفظ می­نمایند. در واقع حفظ نسبت بالای K⁺/Na⁺ از عناصر اصلی تحمل به شوری در گیاهان محسوب می­شود (Aharon et al., 2003). مقادیر اضافی یون­های سدیم به دلیل اثرات مخرب آن بر روی فعالیت آنزیم­ها، فتوسنتز و متابولیسم برای گیاهان مضر می­باشد (Niu et al., 1995). در گیاهان یک مکانیزم عمده در ترابری Na⁺ سیتوسولی و کاهش اثرات سمی آن وجود دارد که باعث جایگذاری مقادیر اضافی یون­های سدیم در واکوئل­ها یا بافت­هایی با حساسیت کمتر می­شود و این کار بوسیله فعالیت گروه آنتی­پورترهای Na⁺/H⁺ مربوط به زیر خانواده IC-NHE/NHX که در تونوپلاست قرار دارند، انجام می­شود. ژن­های NHX آنتی­پورترNa⁺/H⁺ واکوئلی را کد می­کنند که ترابری Na⁺ بواسطه H⁺ از عرض غشای واکوئلی و تجمع Na⁺ در واکوئل­ها را کاتالیز می­کنند (Nass et al., 1997). شیب الکتروشیمیایی H⁺ تولید شده بوسیله دو پمپ H⁺: H⁺-pyrophosphatase واکوئلی (V-ppase) و H⁺-ATPase واکوئلی (V-ATpase)، نیروی محرک لازم را برای جایگزینی یون­ها و دیگر محلول­ها را در واکوئل­ها فراهم می­نماید (Sze et al., 1992). جایگزینیNa⁺در واکوئل علاوه بر پایین آوردن غلظت این یون در سیتوسول، در تنظیم اسمزی برای حفظ جذب آب از محلول نمک نیز دخالت دارد. به دلیل انباشته کردن یون­های سدیم در واکوئل­ها ، ژن­های NHX در گیاهان به طور عمده در تحمل به شوری دخالت دارند (Apse & Blumwald, 2002; Tester & Devenport, 2003 ).

جهت بررسی الگوی بیان ژن­ها در سطح mRNA روش­های مختلی وجود دارد که به طور کلی می­توان آنها را به دو دسته روش­های مبتنی بر PCR همانند RT-PCR نیمه کمی و تکنیک­های مبتنی بر دورگ­سازی همانند نوردرن­بلات، درشت آرایه و ریز آرایه تقسیم بندی نمود (Lorkowski & Cullen, 2003). در سال­های اخیر با در اختیار داشتن روش­های فوق، و به منظور درک روشنتری از نقش ژن­های مختلف در پاسخ به تنش­های مختلف توجه برخی از محققین به مقایسه الگوی بیان ژن­ها در گیاهان متحمل و حساس به تنش­های محیطی مختلف جلب شده است.

مواد و روش­ها

در این مطالعه از بذور گلرنگ رقم  PBR-321، اهدایی توسط دکتر قاسم محمدی­نژاد، بخش زراعت و اصلاح نباتات، دانشگاه شهید باهنر کرمان استفاده گردید. این رقم طی تحقیقات باغبانی دانشگاه شهید باهنر در شرایط طبیعی مقاومت خوبی از خود نشان داد. بذور گلرنگ با الکل اتانول 70% به مدت 2 دقیقه و متعاقباً به مدت 15 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 5 درصد ضدعفونی گردیده و 5 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. بذور پس از 2 ساعت سرمادهی مرطوب، درون پتری دیش‌های حاوی کاغذ صافی استریل کشت شدند. بذور جوانه‌زده به گلدان‌های به قطر 15 سانتی‌متر حاوی شن شسته منتقل گردیدند. گلدان‌ها در گلخانه تحت شرایط دمایی 2±26 درجه سانتی­گراد و دوره نوری 8/16 ساعت (تاریکی/نور) با دوره آبیاری 2 روز در میان قرار گرفتند و تغذیه با محلول هوگلند (شرکت زیتون طلایی) از سن 7 روزگی شروع گردید. اعمال تنش شوری روی گیاهان در مرحله 3 الی 4 برگی (14 روزگی)در صبح زود انجام شد. تیمارها در 5 گروه در نظر گرفته شدند که این گروه­ها شامل آب مقطر، محلول 50 میلی­مولار کلریدسدیم، محلول 100 میلی­مولار کلریدسدیم، محلول 150 میلی­مولار کلریدسدیم و محلول 200 میلی­مولار کلریدسدیم بودند. نمونه برداری از گیاهان تحت تنش در 5 زمان شامل صفر (زمان اعمال تیمار)، 6، 12، 24 و 48 ساعت پس از اعمال تنش صورت گرفت.

طراحی آغازگرهای رفت 5'- TAC CGA CCG AGA AGT TGC -3' و برگشت 5'- CAT AAG ACCAGC CCA CCA -3' که قطعه­ای به اندازه 439 جفت­باز را تکثیر می­کند، بر اساس توالی ژن NHX گیاه گلرنگ  در بانک ژن NCBI و با استفاده از نرم‌افزار Primer Premier v.3.5 انجام شد. RNAی کل با استفاده از کیت RNX^TMplus شرکت سیناکلون از گیاهان تحت تنش و گیاهان شاهد استخراج گردید. کیفیت و کمیت RNAی استخراج شده به ترتیب با استفاده از ژل آگارز یک درصد و دستگاه نانو دراپ تعیین گردید (شکل 1). جهت حذف آلودگی احتمالی به DNA ژنومی، از آنزیم DNase1 شرکت فرمنتاز استفاده گردید. پس از تیمار RNA با آنزیم DNase1، یک میکروگرم RNA وارد فرآیند ساختن cDNA گردید و مراحل بر اساس دستورالعمل موجود در کیت Reverse Aid First Strand cDNA Synthesis Kit شرکت فرمنتاز انجام شد.

شکل 1 - الکتروفورز RNAی استخراج شده از بافت برگ گیاه گلرنگ بر روی ژل آگاروز 1 درصد. M: نشانگر وزن مولکولی 100bp (Fermentas).

Figure 1- Electerophoresis of extracted RNA from safflower leave tissue on 1% agarose gel. M: DNA ladder 100bp (Fermentas).

واکنش­های RT-PCR نیمه­کمی در حجم 25 میکرولیتر و با دو تکرار انجام شد. از آغازگرهای اختصاصی 18S rRNA به عنوان کنترل داخلی استفاده گردید. اجزای مخلوط واکنش شامل مواد مشروح در جدول 1 می­باشد. سیکل دمایی استفاده شده در واکنش SQ-RT-PCR مربوط به ژن کنترل داخلی و ژن NHX دقیقاً مشابه و به صورت زیر بود. 5 دقیقه در ^°C94و متعاقب آن 40 چرخه شامل 45 ثانیه در ^°C94، 30 ثانیه در ^°C46، 1 دقیقه در ^°C72 و تکثیر نهایی نیز به مدت 5 دقیقه در ^°C72 انجام شد. پس از پایان واکنش 5 میکرولیتر از محصولات بر روی ژل آگارز 1% بارگذاری و تحت ولتاژ ثابت 75 ولت به مدت 90 دقیقه الکتروفورز شدند. پس از اتمام الکتروفورز، ژل با استفاده از اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی شده و عکس برداری از آن با استفاده از دستگاه ژل­ داک انجام شد. تصاویر ژل با استفاده از برنامه Total Lab v1.10 کمی شدند. بدین منظور شدت باندهای ژن کنترل داخلی (18S rRNA) و شدت ژن NHX نسبت به باند 3000 مارکر 100bp که معادل 20 نانوگرم در لیتر بود، سنجیده شد. پس از تقسیم عدد مربوط به باند ژن NHX بر باند مربوط به ژن کنترل داخلی، تمام نمونه­ها نرمال شدند. نمودارهای مربوط به شدت بیان ژن NHX با استفاده از برنامه Excel رسم گردید.

جدول 1- مقدار مواد مورد استفاده در هر PCR.

Table 1- The amount of material used in each PCR reaction.

نتایج و بحث

نتایج حاصل از RT-PCR نیمه­کمی نشان داد که میزان بیان ژن NHX، 6 ساعت پس از اعمال تنش در تمام غلظت­ها نسبت به گیاهان شاهد افزایش چشمگیری داشت و بیشترین میزان بیان (48/2 برابر) در غلظت 200 میلی­مولار مشاهده گردید (شکل 2). نمودار رسم شده در Excel با استفاده از داده­های بدست آمده از نرم­افزار Total lab نشان می­دهد که میزان بیان با افزایش غلظت افزایش یافته و این روند صعودی را نشان می­دهد (شکل2). نتایج حاصل از RT-PCR نیمه کمی نشان داد که 12 ساعت بعد از اعمال تنش نیز میزان بیان ژن NHX در گیاه تحت تنش نسبت به گیاه شاهد افزایش قابل ملاحظه­ای را نشان می­داد و بیشترین میزان بیان نیز در غلظت 150 میلی­مولار مشاهده گردید (1.78 برابر) با افزایش میزان غلظت از 150 به 200 میلی­مولار میزان بیان ژن کاهش نشان داد (شکل 4) که نمودار رسم شده در Excel نیز همین روند را نشان داد (شکل 2). 24 ساعت پس از اعمال تنش میزان بیان ژن در تمام غلظت­ها نسبت به گیاه شاهد افزایش بیان نشان دادند و بیشترین میزان بیان در گیاهان تحت تنش در غلظت­های 100 و 150 میلی­مولار مشاهده گردید (به ترتیب 73/1 و 99/1 برابر نسبت به گیاه شاهد). در اینجا نیز در غلظت 200میلی­مولار میزان بیان ژن NHX نسبت به زمان 12 ساعت کاهش یافت (شکل 2 و 3).

همچنین 48 ساعت پس از اعمال تنش، میزان بیان ژن NHX در تمام غلظت­ها نسبت به گیاه شاهد افزایش چشمگیری داشتند. حداکثر میزان بیان در این زمان در غلظت 100 میلی­مولار مشاهده گردید (48/2 برابر) و در غلظت­های 100 و 150 میلی­مولار نسبت به 24 ساعت میزان بیان ژن کاهش یافت (شکل 2 و3).

در گیاهان آرابیدوپسیس، برنج، Atriplex gmelini، باقلا و گوجه نیز افزایش بیان ژن NHX پس از اعمال تنش شوری گزارش شده است (Gaxiola et al., 1998; Hamada et al., 2001; Zahran et al., 2007). در تحقیق حاضر میزان بیان ژن NHX در گیاه گلرنگ 6، 12، 24 و48 ساعت پس از اعمال تنش افزایش چشمگیری نسبت به گیاه شاهد نشان داد. همچنین در تمام زمان­های بررسی شده

شکل 2- نتایج RT-PCR نیمه کمی ژن NHX در غلظت­های مختلف کلریدسدیم. M: نشانگر وزن مولکولی 100bp(Fermentas) .  (الف): 6 ساعت پس از اعمال تنش. (ب): 12 ساعت پس از اعمال تنش. (ج): 24 ساعت پس از اعمال تنش. (د): 48 ساعت پس از اعمال تنش.

Figure 2- Semiquantitative RT-PCR results of NHX gene in different concentrations of sodium chloride. M: DNA ladder 100bp (Fermentas). (a) 6 hours after stress. (b) 12 hours after stress. (c) 24 hours after stress. (d) 48 hours after stress.

شکل 3- فراوانی نسبی mRNA ژن NHX گلرنگ در غلظت­های مختلف کلرید سدیم.

Figure 3- Relative abundance mRNA of Safflower NHX gene in different concentrations of sodium chloride.

حداکثر میزان بیان ژن در غلظت mM150 بعد از این غلظت، با افزایش میزان نمک شدت بیان کاهش نشان داد، هر چند هنوز نسبت به گیاه شاهد افزایش بیان دیده می­شد. بررسی الگوی بیان ژن NHX در گیاه گلرنگ با استفاده از روش مذکور حاکی از افزایش بیان ژن کدکننده آنتی­پورتر غشاء واکوئلی درپاسخ به تنش شوری بود که نشان دهنده اهمیت این آنتی­پورتر در مکانیسم تحمل به نمک درگیاه گلرنگ می­باشد.