نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
In this study, genetic fingerprinting of 44 Iranian native apple cultivars were done using 16 simple sequence repeat pairs of primers and then the association of these markers with 16 morphological and biochemical traits were inspected. Based on marker data, 45 alleles were identified using 16 SSR pairs of primers. The number of allele per SSR locus was varied between 2 to 5 with mean of 2.8. Here in, the mean of number of effective allele was 2.2. Polymorphism information content ranged from 0.18 to 0.76 with mean of 0.49. To identify positive markers associated with studied traits, step wise regression was done among marker data as independent variables and studied traits as dependent variables. Results revealed that there is not any linked marker for traits including chlorophyll index, angle of branch and trunk cross sectional area. Considering to association analysis, thirteen traits include fruit volume, fruit diameter, fruit weight, fruit length, fruit firmness, days to ripening, organic acid content, total soluble solids, vitamin C, pH, leaf size, internodes length and tree height had linked SSR markers. The maximum number of allele (6 alleles) was seen for days to ripening and minimum number of allele (1 allele) was seen for traits including PH, fruit weight, fruit firmness and tree height. Regarding linkage between some SSR alleles with some traits, this is possible to use these markers in apple breeding programs effectively.
کلیدواژه‌ها [English]
شناسایی نشانگرهای ریزماهواره مرتبط با صفات مورفولوژیک و بیوشیمیایی در ارقام سیب بومی ایران (Malus × domestica .Borkh)
جواد فرخی1و2 ، رضا درویش زاده3، حمید حاتمی ملکی*4، لطفعلی ناصری1، فرهاد اصغری1
1گروه باغبانی، دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه
2جهاد دانشگاهی واحد استان اردبیل
3گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه
4گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی دانشگاه مراغه
تاریخ دریافت: 24/04/1392، تاریخ پذیرش: 12/03/1393
چکیده
در این مطالعه، انگشت‌نگاری ژنتیکی 44 رقم سیب بومی ایران با استفاده از 16 جفت آغازگر ریزماهواره (SSR) انجام گرفته و سپس ارتباط این نشانگرها با 16صفت مورفولوژیکی و بیوشیمیایی مختلف بررسی شد. بر اساس داده‌های نشانگری، در مجموع 45 آلل توسط 16 جفت آغاز ریزماهواره شناسایی شد. تعداد آلل‌ها در هر مکان ریزماهواره بین 2 الی 5 عدد متغیر بود و متوسط تعداد آلل 8/2 به دست آمد. در این مطالعه میانگین تعداد آلل مؤثر 2/2 بود محتوای اطلاعات چندشکل از 18/0(Hi03ao3) الی 76/0(CH03c02) نوسان داشت و میانگین آن 49/0 بود. برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات مورد مطالعه، تجزیه رگرسیون گام به گام بین داده‌های نشانگری (متغیرهای مستقل) و صفات مورد مطالعه (متغیرهای وابسته) انجام گرفت. نتایج تجزیه ارتباط نشان داد که برای سه صفت زاویه شاخه، شاخص کلروفیل و مساحت مقطع عرضی تنه هیچ نشانگر پیوسته‌ای وجود ندارد. با توجه به نتایج تجزیه ارتباط، سیزده صفت شامل وزن میوه، حجم میوه، طول میوه، قطر میوه، سفتی میوه، تعداد روز برای رسیدن، اسید آلی، میزان مواد جامد محلول، ویتامین ث، pH، اندازه برگ، طول میانگرهها و ارتفاع درخت دارای نشانگرهای ریزماهواره مرتبط با آن‌ها بودند. بیشترین تعداد الل (6 عدد) برای صفت تعداد روز برای رسیدن و کمترین تعداد الل (1 عدد) برای صفات pH، وزن میوه، سفتی میوه و ارتفاع درخت مشاهده گردید. با توجه به پیوستگی برخی از آللهای ریزماهواره با برخی از صفات، می‌توان از این نشانگرها در برنامه‌های به‌نژادی سیب به طور موثری استفاده نمود.
کلمات کلیدی: سیب، انگشت‌نگاری ژنتیکی، نشانگر ریزماهواره، تجزیه ارتباط.
مقدمه
جنس سیب (Malus) از خانوادۀ Rosaceae و زیرخانوادۀ Pomoideae، آلوپلیپلوئیدی از دو خانوادۀ Spiroideae (9x=) و Prunoideae (8x=) است که منجر به ایجاد پایه هاپلوئیدی (17x=) در این زیر خانواده گردیده است (Lespinase et al., 1999). اکثر گونه‌های زراعی سیب (Malus× domestica. Borkh) دیپلوئید میباشند و این در حالی است که در داخل برخی از گونه‌ها سطوح مختلف پلوئیدی نیز دیده میشود (Way et al., 1989). سیب نه تنها به خاطر ارزش اقتصادی آن، همچنین به دلیل اندازه کوچک نسبی ژنومی‌اش (75Mb/hapliod) به صورت یک گونه مدل برای تحقیقات کاربردی ژنومی در اکثر نهاندانگان چوبی مورد استفاده قرار میگیرد (Way et al., 1989). کشور ایران با تولید سالیانه حدود 2 میلیون و 431 هزار ونهصد ونود تن سیب دارای رتبه پنجم تولید در جهان است (FAOSTAT, 2011). . علیرغم اهمیت این محصول در ایران کارهای اصلاحی زیادی در مورد افزایش مقاومت به بیماری‌ها، آفات و کیفیت محصول در ارقام بومی صورت نگرفته و بیشتر از ارقام شناخته‌شده خارجی (وارداتی) استفاده میشود. با توجه به ژرم پلاسم غنی سیب موجود در کشور، میبایستی مطالعه پس زمینه ژنتیکی صفات مورفولوژیک ارقام بومی را جدی‌تر دنبال نمود تا گام عمده‌ای در زمینه اصلاح سیب برداشته شود. یکی از ابزارهای شناخت ژنتیکی هر محصولی استفاده از نشانگرهای مولکولی است (Goldstein et al., 1995). نشانگرهای مختلفی برای بررسی تنوع ژنتیکی سیب به کار رفته‌اند ولی هیچ یک از آن‌ها کارایی نشانگرهای SSR را نداشتهاند. به طوری که اکثر کارهای تحقیقاتی در زمینه بررسی تنوع ژنتیکی سیبهای بومی ایران با استفاده از نشانگر SSR انجام گرفته است (Naghshin et al., 2008; Gharghari et al., 2009; Jahromi-Shirazhi et al., 2009). شناسایی مکانهای ژنی کنترل‌کننده صفات و گزینش به کمک نشانگر، ابزاری مناسب برای گزینش صفات با وراثت‌پذیری پایین و با قابلیت ظهور در مراحل انتهایی رشد و توسعه گیاه میباشند (Davies et al., 2006; Ender et al., 2008 ). مکانیابی ژنهای کنترل‌کننده صفات مورفولوژیک در سیب بر اساس تجزیههای مبتنی بر پیوستگی (Linkage-based analysis) و با استفاده از نشانگرهای مولکولی انجام گرفته است (Liebhard et al., 2002; Silfverberg-Dilworth et al., 2006). اولین گروه پیوستگی با استفاده نشانگرهای SSR به همراه نشانگرهای آیزوزایم و RFLP در یک جمعیت مشتمل بر 152 دانهال حاصل از تلاقی ارقام Prima × Fiesta ایجاد شد که منجر به ارائه 17 گروه پیوستگی ژنی گردید (Maliepaard et al., 1999). سالها پیش نقشه کامل ژنوم سیب با 129نشانگر ریز ماهواره و تعداد زیادی از نشانگرهای غالب مثل AFLP و همچنین RAPD ایجاد گردیه است (Liebhard et al., 2002). با این وجود تهیه نقشه ژنتیکی به این روش محدودیتهای خاص خود را دارد از جمله آن اینکه امکان مکانی‌یابی دقیق ژن‌ها و QTL ها مقدور نبوده، شناسایی نواحی کروموزومی مشکل‌تر بوده و احتمال بروز کراسینگ اور نیز در جمعیت در حال تفرق زیاد است. همچنین نیازمند تهیه جمعیت در حال تفرق است که نیازمند زمان بیشتری است (Abdollahi et al., 2010). بنابراین می‌توان با انجام یک آنالیز ارتباط از داده‌های فنوتیپی چندساله استفاده نمود. کارایی این آنالیز در مکانیابی و کنترل صفات مندلی در چندین محصول زراعی به اثبات رسیده است. برای مثال در بررسی 55 لاین گندم با 55 نشانگر ریزماهواره، 38 نشانگر SAMPL و 54 نشانگرAFLP ملاحظه شد که حداقل با یکی از 14 صفت زراعی مورد مطالعه مرتبط بوده و میتواند به عنوان نشانگر کارآمدی برای برنامه‌های گزینش به کمک نشانگر این صفات معرفی شود (Roy et al., 2006). همچنین تجزیه ارتباط بر روی 68 ژنوتیپ بادام‌زمینی ایرانی با 13 جفت آغازگر SSR نشان داد که همه مکان‌ها بجز pPGPseq-2C11 روی صفات مورد مطالعه موثر بودند (Abdollahi et al., 2010). در مورد استفاده از تجزیه ارتباط برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات مورفولوژیک در ارقام بومی و خارجی سیب گزارش‌های محدودی وجود دارد. در این پژوهش، پس از ثبت ژنوتیپی (با استفاده از نشانگرهای SSR) و ثبت فنوتیپی (در سه سال زراعی) 44 رقم سیب شناخته‌شده ایرانی، نشانگرهای پیوسته با صفات مورفولوژیک با استفاده از تجزیه ارتباط شناسایی گردیدند.
مواد و روش‌ها
مواد گیاهی و ثبت فنوتیپی افراد: در این مطالعه، تعداد 44 ژنوتیپ سیب با خاستگاههای مختلف از بانک ژن ایستگاه تحقیقات کشاورزی کهریز واقع در استان آذربایجان غربی انتخاب گردیدند (جدول 1). درختان کاشته شده ده ساله بوده و در قالب طرح آماری آگمنت (هر بلوک 17 ژنوتیپ با سه ژنوتیپ شاهد) کاشته شده بودند. فاصله کاشت 5 در 5 متر بود و انجام هرس و سایر مراقبت‌های زراعی بر اساس آنچه که برای تمام باغات سیب معمولی متداول است، اعمال شد. انتخاب ارقام از بلوک‌های مختلف صورت گرفت. تعداد 16 صفت مورفولوژیکی مختلف بر روی میوه، برگ و نیز خود درخت در محل باغ مورد بررسی قرار گرفت. صفات گیاهی و وسیله و روش اندازه گیری آن ها عبارت بودند از: وزن میوه (گرم) توسط ترازوی دیجیتالی، حجم میوه (سانتیمتر مکعب) توسط غوطه ورسازی در استوانه مدرج، طول و قطر میوه توسط کولیس دیجیتالی، سفتی میوه به وسیله حذف پوست میوه توسط سفتی سنج مگنس- تیلور مجهز به پروب 8 میلی متری برای میوه های کوچک و 11میلی متری برای اقسام بزرگ تر، تعداد روز برای رسیدن براساس تعداد روزهای لازم بعد از تمام گل تا اولین برداشت، مواد جامد محلول توسط رفرکتومتر دستی، ویتامین ث میوه (میلی گرم در صد میلی لیتر) و اسیدآلی میوه ( گرم در 100 میلی لیتر) هر دو توسط روش توضیح داده شده (Rangana, 1977) ،pH میوه به وسیله pH متر، اندازه برگ توسط دستگاه LAIمتر، طول میانگرهها، ارتفاع درخت و مساحت مقطع عرضی تنه هر سه توسط متر نواری، زاویه شاخه با امتیاز دهی به صورت: ]بسته =1 ، نیمه باز=2 و باز=3 [ و شاخص کلروفیل(میلی گرم در صد گرم) توسط SPAD مدل (502 Japan,). اندازهگیری صفات بر اساس دیسکریپتور مخصوص برای این محصول و زیر نظر معیارهای پذیرفته‌شده سازمان تحقیقات جهاد کشاورزی بود. در این مطالعه، به دلیل مبارزه شیمیایی با آفات و بیماری‌های درختان موجود درکلکسیون، به بررسی آن‌ها پرداخته نشد.
جدول 1- اسامی 44 رقم سیب مورد مطالعه بر اساس دیسکریپتور.
Table 1- The Names of 44 studied apple cultivars based on descriptor.
|
رقم Cultivar |
|
رقم Cultivar |
|
رقم Cultivar |
|
رقم Cultivar |
|
|
Manoochehri |
34 |
Kokle |
23 |
Israeili-e Malayer |
12 |
Kochkine |
1 |
|
Morooti-e Shemiran |
35 |
Torsh-e Sefid |
24 |
Meshki-e damanande 2 |
13 |
Golab-e Nemat Yazd |
2 |
|
Shahrood-e 21 |
36 |
Sheikh Ahmad |
25 |
Tokhme Morgi Sarein |
14 |
Golab-e Damavande 2 |
3 |
|
Boshgabi-e Torsh |
37 |
Sore paeize |
26 |
Dirras-e Mashhad |
15 |
Tabestan-e Rostam |
4 |
|
Sifehshirin |
38 |
Ilame 4 |
27 |
Golab-e damavand e3 |
16 |
Shahriar-e 2 |
5 |
|
Sibgolab-e Germez |
39 |
Ferdose Shahriar |
28 |
Paeiz-e Boomi Ahar |
17 |
Boshgabi-e Talegan |
6 |
|
Beigi |
40 |
Damavand-e 1 |
29 |
Chaharmahal-e 3 |
18 |
Chaharmahal-e 5 |
7 |
|
Shahrood-e 19 |
41 |
Golden Asiaie |
30 |
Sattari |
19 |
Zanjan-e 12 |
8 |
|
Illam 2 |
42 |
Hamadan-e 3 |
31 |
Zanjan-e2 |
20 |
Salmas 4 |
9 |
|
Talkh-e arak |
43 |
Meshki-e Germez |
32 |
Golden-e Canadaei |
21 |
Zanjan-e14 |
10 |
|
Sor-e derige |
44 |
Torsh Alma |
33 |
Germez-e Gillan |
22 |
Panbeiy- e domazeh |
11 |
استخراج DNA ژنومی: استخراج DNA از برگ با استفاده از روش (Dellaporta et al., 1983) انجام شد. کیفیت DNA ژنومی استخراجی به وسیله الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد تعیین گردید. از بین 60 جفت آغازگر SSR تعداد 16 جفت بر اساس الگوی چندشکلی اولیه انتخاب گردیدند (جدول 2). آغازگرهای سریCH عمدتاً توسط (Liebhard et al., 2002) توسعه یافته‌اند. هر 4 آغازگر بکار رفته سری Hi دارای توالی تکراری کامل به صورت n(AG/CT) میباشند که توسط (Silfverberg - Dilworth et al., 2006) طراحی شده‌اند (جدول 3). ثبت ژنوتیپی افراد با نشانگر ریز ماهواره: واکنش زنجیرهای پلی‌مراز (PCR) در حجم 25 میکرولیتر شامل 5/12 میکرولیتر کیت PCR از شرکت سیناژن [200 میلیمولار Tris-Hcl با pH=8.55، 160 میلیمولار 2 SO4(NH4) یک درصد، 3 میلیمولار MgCl2، 4/0 میلیمولار dNTPs و (یک واحد)U 1[Taq DNA polymerase، 1 میکرومولار از هر آغازگر و 50 نانوگرم از DNA الگو در دستگاه ترموسایکلر (PerkinElmer–Applied Biosystems)® انجام گرفت. الگوی دمایی مورد استفاده در واکنش PCR عبارت بود از: یک چرخهC °95 به مدت 2 دقیقه برای واسرشت سازی اولیهDNA ، 35 چرخه شامل: به ترتیبC °93 به مدت 45 ثانیه دمای واسرشت سازی، C°50 تا 55 دمای اتصال (بسته به هر جفت آغازگر) به مدت 60 ثانیه و C°72 دمای گسترش به مدت 45 ثانیه و بالأخره در انتها جهت تکمیل مرحله گسترش یک چرخه C°72 به مدت 10 دقیقه اعمال گردید.
جدول 2- توالی معکوس و پیشرو آغازگرهای بکار رفته در این مطالعه.
Table 2 - Reverse and Forward Sequences of used primers for this study.
|
توالی پیشرو Forward Sequence |
توالی معکوس Reverse Sequence |
آغازگر Primer |
|
CAAGGATGCGCATGTATTTG |
GCGCTGAAAAAGGTCAGTTT |
CH03g12z |
|
CTGTTTGAACCGCTTCCTTC |
CGTGGCATGCTTATCATTTG |
CH02h11a |
|
AAAACCCACAAATAGCGCC |
GCACATTCTGCCTTATCTTGG |
CH03e03 |
|
GAGAAGGTCGTACATTCCTCAA |
CACAACCTGATATCCGGGAC |
CH05d11 |
|
TCCGAAGGTATGCTTCGATT |
ACTTGTGAGCCGTGAGAGGT |
CH05d04 |
|
CAAGTTGTTGTACTGCTCCGAC |
CGAATATTTTCACTCTGACTGGG |
CH05e03 |
|
CAACTCCCCTTATTCTTCTTCTCTC |
CACCTGACCTTCTCTCTACCTCTAC |
3 |
|
TTTCTCCTCACACCCAAACC |
CATAGAAGGTGGCATGAGCA |
Md-Exp7 |
|
TGCTCCTCTCTAGCTATTGCATAAT |
AAGACTCACAAACTAGCTGTCAAAT |
2 |
|
GTTTAACAGCGGGAGATCAAGAAC |
ACGGGTGAGACTCCTTGTTG |
Hi03e03 |
|
AAGTGCACCCACACCCTTAC |
GGAGAGTTCCTGGGTTCCAC |
Hi01d06y |
|
ATCCATGGTCCCATAAACCA |
CAGCCTGCAACTGCACTTAT |
CH04a12 |
|
ATTGCTCCATGCATAAAGGG |
GCCCAGAAGCAATAAGTAAACC |
CH03d12 |
|
GTTTGTTGCTGTTGGATTATGCC |
ACACTTCCGGATTTCTGCTC |
Hi03ao3 |
|
GTGCAGAGTCTTTGACAAGGC |
TCACTATTTACGGGATCAAGCA |
CH03c02 |
|
GTTTAAGTTCGCCAACATCGTCTC |
TGCTGAGTTGGCTAGAAGAGC |
Hi02d04 |
فراوردههای PCR پس از اضافه نمودن 10 میکرولیتر بافر نمونهگذاری به آن‌ها، توسط ژل آگارز 3 درصد از همدیگر تفکیک شدند. برای اطمینان از اندازه آللی هرمکان ژنی و درستی تکثیر آن ها از نشانگر وزن مولکولی kb1 در هر ژل استفاده شد. اندازه قطعات نشانگر وزن مولکولی بین 100 تا 1000 bp متغیر بود. رنگامیزی و عکسبرداری از ژل‌ها به ترتیب با استفاده از ماده اتیدیوم بروماید (1μg/ml) و دستگاه ژل داک (Gel Logic 212 PRO, USA) صورت گرفت.
جدول 3- دامنه اندازه آللی، تعدادآلل ،تعدادآلل‌های موثر و محتوای اطلاعاتی حاصل از چندشکلی ارقام تحت بررسی.
Table 3- Size range of alleles, number of alleles, number of effective alleles and polymorphic information content (PIC) values of studied cultivars.
|
|
محتوای اطلاعات حاصل از چند شکلی (PIC) |
تعداد آللهای موثر No. of effective alleles |
تعداد آلل‌ها No. of alleles |
دامنه اندازه آللی Size range of alleles (bp)
|
آغازگر Primer |
|
|
0.63 |
2.59 |
3 |
154-200 |
CH03g12z |
|
|
0.28 |
1.4 |
2 |
104-132 |
CH02h11a |
|
|
0.48 |
1.94 |
2 |
106-216 |
CH03e03 |
|
|
0.55 |
2.22 |
3 |
171-211 |
CH05d11 |
|
|
0.62 |
2.28 |
3 |
174-214 |
CH05d04 |
|
|
0.57 |
2.17 |
3 |
158-190 |
CH05e03 |
|
|
0.63 |
2.75 |
3 |
170 |
3 |
|
|
0.36 |
1.56 |
2 |
- |
Md-Exp7 |
|
|
0.35 |
1.52 |
2 |
205 |
2 |
|
|
0.41 |
1.74 |
2 |
160-228 |
Hi03e03 |
|
|
0.65 |
2.78 |
3 |
115-166 |
Hi01d06y |
|
|
0.50 |
1.94 |
3 |
158-196 |
CH04a12 |
|
|
0.31 |
1.46 |
3 |
108-154 |
CH03d12 |
|
|
0.18 |
2.72 |
3 |
160-228 |
Hi03ao3 |
|
|
0.76 |
3.68 |
5 |
116-136 |
CH03c02 |
|
|
0.60 |
2.56 |
3 |
224-250 |
Hi02d04 |
|
|
0.49 |
2.20 |
2.81 |
|
میانگین (Average) |
تجزیه دادهها
امتیازدهی الگوی باندها، به صورت یک برای وجود نوار و صفر برای عدم وجود نوار انجام شد. شاخص PIC با استفاده از فرمول محاسبه گردید. در این فرمول Pi فراوانی آللiام در یک مکان مشخص است. تعداد آلل موثر برای هر جایگاه ریزماهوارهای به کمک نرم‌افزارPopgene نسخه31/1 (Yeh et al., 1999) محاسبه شد. برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات مورفولوژیک مورد مطالعه، تجزیه رگرسیون گام به گام با در نظر گرفتن نشانگرها به عنوان متغیر مستقل و صفات مورفولوژیک به عنوان متغیرهای وابسته و با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 15 (Levesque, 2007) انجام گردید.
نتایج و بحث
نتایج نشان داد که همه مکانهای ریزماهواره مورد استفاده دارای الگوی نواری چندشکل میباشند. چندشکلی نشانگرهای ریزماهواره در ارقام تحت بررسی با بررسیهای(Guilford et al.,1997; Silfverberg-Dilworth et al., 2006) مطابقت داشت. در مجموع، 45 آلل توسط آغازگرهای ریزماهوارهای تولید شد (جدول 2). متوسط تعداد آلل، 8/2 در هر مکان ژنی به دست آمد (جدول 2). این ارزش عددی مشابه با متوسط تعداد آللهای SSR به دست آمده در مورد گیاهان خود گردهافشان و یک ساله مانند گوجه‌فرنگی 5/1 تا 1/3 آلل در هر مکان ژنی (Broun and Tanksly, 1996)، گندم 8/3 آلل (Devos et al., 1996) سورگوم 3/2 آلل (Brown et al., 1996) خیار 6/2 تا 9/2 (Katzir et al., 1996) و هندوانه 2 آلل در هر مکان ژنی (Jarret et al., 1996) است. در این تحقیق، بیشترین تعداد آلل (5) در مکان ژنی CH03c02 مشاهده شد که اندازه آن‌ها بین 116 الی 136 جفت باز متغیر بود (جدول2). از طرفی تعداد آللهای ایجاد شده خیلی کمتر از موارد گزارش شده با استفاده از این آغازگرها در مطالعات قبلی بود (Liebhard et al., 2002; Silfverberg-Dilworth et al., 2006). فقط تعداد آلل مربوط به مکان ژنی CH03c02، با مطالعات قبلی در توافق بود. علیرغم اینکه سیب گیاهی دگرگردهافشان است و انتظار میرود که تعداد آللهای بالایی را در هر مکان ژنی نشان دهد (Gianfrancesch et al., 1998; Hokanson et al., 1998)، نتایج نشان داد که تعداد آلل به دست آمده در مقایسه با مقادیر محاسبه شده در تحقیقات قبلی پایین است. نتایج نشان داد که میانگین تعداد آلل موثر 2/2 است که از 4/1 در مکان ژنی CH02h11a الی 68/3 در مکان ژنی CH03c02 متغیر است (جدول2). شاخص PIC نشان‌دهنده تعداد زیاد آلل و چندشکلی بالا است (Powell, 1996). در تحقیق حاضر کمترین مقدار محتوی اطلاعات چندشکل (PIC) در مکان ژنیHi03ao3 (18/0) و بیشترین مقدار آن در مکان ریزماهوارهای CH03c02 (76/0) مشاهده گردید. میانگین PIC، 49/0 میباشد که دلالت بر ظرفیت نسبتاً متوسط آغازگرهای مورد استفاده در توجیه چندشکلی موجود در ژرم پلاسم سیب دارد (جدول2). در مطالعهای که روی ارقام سیب گلاب ایرانی انجام گردید، مقدار شاخص PIC در محدوده 37/0 تا 77/0 و با میانگین 68/0 گزارش گردید (, 2008.Naghshin et al). همچنین در تحقیقی دیگر که بر روی 24 ژنوتیپ سیب بومی ایران و 5 پایه بومی و خارجی سیب انجام گرفت، متوسط شاخصPIC ، 8/0 به دست آمد (Jahrommi- Shirazhi et al., 2009).
نتایج تجزیه ارتباط ژنوتیپها بر اساس نشانگرهای ریز ماهواره و ارزش فنوتیپی آن با استفاده از تجزیه رگرسیون گام به گام برای شناسایی نواحی ژنومی دخیل در کنترل این صفات در سیب در جدول 4 درج شده است. نتایج تجزیه واریانس رگرسیون نشان داد که اکثر مکانهای ریزماهوارهای مورد مطالعه با 2 یا 3 صفت مورفولوژیک در ارتباط میباشند (جدول 4). در این مطالعه، صفات زاویه شاخه، شاخص کلروفیل و قطر تنه رابطه معنیدار با هیچ یک از نشانگرهای SSR نداشتند. در مجموع 45 آلل از 16 نشانگر ریزماهواره مورد استفاده ارتباط معنیدار با تغییرات 13 صفت داشتند. صفت تعداد روز تا رسیدن میوه با 6 آلل و صفات ارتفاع درخت، وزن میوه، سفتی میوه و pH هریک با 1 آلل به ترتیب بیشترین و کمترین تعداد آلل مرتبط را داشتند(جدول 4). مکان ژنی 3 با صفات حجم میوه، وسعت پهنای برگ (اندازه برگ) و تعداد روز برای رسیدن پیوستگی زیادی (بالای 80/0) نشان داد (جدول4). احتمال میرود که این مکان با عوامل ژنی دخیل در تولید میوه درشت، قرمز خوش‌رنگ و دیررس در ارتباط باشد. نشانگرهایی که بیشترین و حتی کمترین درصد تغییرات را در این تحقیق توجیه مینمودند، در گروههای پیوستگی 3، 2، 6 و 12 حاصل از نقشه ژنتیکی سیب قرار دارند (Silfverberg - Dilworth et al., 2006; Liebhard et al., 2002). در این تحقیق، صفت ارتفاع درخت با آلل دوم مکان ژنی CH03d12 پیوستگی دارد (جدول 4) که این مکان ریزماهوارهای روی گروه پیوستگی 11 در ژنوم سیب قرار دارد (Liebhard et al., 2002). این مکان ژنی 23درصد تغییرات مربوط به صفت ارتفاع درخت را کنترل مینماید (جدول 4).
تحقیقات قبلی نشان داده که مکانهای ریزماهوارهای CH03d11 و CH02a010 مسئول رشد ستونی درخت بوده که به ترتیب در روی کروموزوم‌های 10 و 15 قرار دارند (Sheng and Bao, 2005). تمامی این نشانگرها بجز نشانگر CH03e03 دارای توالی تکراری کاملی هستند. سری نشانگرهای Hi در سیب، به خاطر استفاده بیشتر از تکرارهای دو نوکلئوتیدی (GT, AG) درجه چندشکلی بالایی دارند (Silfverberg - Dilworth et al., 2006). در این بین فقط جفت آغازگر Hi03e03 دارای 2 آلل است. در این تحقیق نیز هماند گزارشات قبلی (Selvaraj et al., 2009) گروه بندی خاصی بین مکانهای ژنی توجیه کننده صفات روی کروموزوم‌ها وجود ندارد بطوریکه یک کروموزوم میتواند حامل نشانگرهای مرتبط با برخی صفات بوده و این در حالی است که همان کروموزوم ممکن است با صفات دیگر پیوسته نباشد. در داخل یک مکان ژنی منفرد نیز سطوح آللی تاثیرهای مختلفی بر روی صفات دارد. برای مثال آلل سوم مکان ژنی CH03g12z که کمترین ارتباط را با سفتی میوه دارد درحالی‌که آلل اول همان مکان ژنی بیشترین پیوستگی را با صفت حجم میوه نشان می‌دهد. مکانهای مشترک برای برخی صفات شاید به دلیل پیوستگی مکانهای مربوطه باشد.
جدول 4– نتایج حاصل از رگرسیون گام به گام بین صفات مورفولوژیک و داده‌های مولکولی برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با ارقام مورد مطالعه.
Table 4- Results of stepwise regression between morphological and molecular data to define informative markers with studied genotypes.
|
سطح معنی دار P-value |
R2 تصحیح شده Adgusted R2 |
مکان ژنی Locus |
صفات گیاهی
|
|
|
0.001 |
0.42 |
CH05e031 |
وزن میوه (g) Fruit weight |
|
|
0 |
0.84 |
CH03g12z-1, 3-1, Md-Exp7-2, CH05e03-1 |
حجم میوه Fruit volume (cm3) |
|
|
0.008 |
0.35 |
Hi03a03-1, CH05e03-1 |
طول میوه Fruit length (mm) |
|
|
0.009 |
0.34 |
CH04a12-3, Hi02d04-2 |
قطرمیوه Fruit diameter (mm) |
|
|
0.032 |
0.18 |
CH03g12z-3 |
سفتی میوه Fruit firmness |
|
|
0 |
0.73 |
Hi02d04-2, 3-1, Md-Exp7-2, CH04a12-3, CH04a12-2, Hi02d04-3 |
تعداد روز تارسیدگی Days to ripening |
|
|
0 |
0.57 |
2-1, Hi03a03-1, 3-1 |
اسید آلی Organic Acid (g/100ml) |
|
|
0 |
0.71 |
CH03e03-2, CH03d12-3, CH05e03-2, Hi03a03-2 |
مواد جامد محلول(Brix) TSS |
|
|
0 |
0.56 |
Hi01d06y-1, Hi02d04-1, CH05e03-2 |
ویتامین ث Vitamin C (mg/100ml) |
|
|
0.026 |
0.19 |
Hi01d06y-1 |
پ هاش pH |
|
|
0 |
0.82 |
CH04a12-1, CH05d04-2, 3-1, CH03g12z-1, Md-Exp7-2 |
اندازه برگ Leaf size |
|
|
0 |
0.9 |
Hi03a03-3, CH03e03-1, CH05e03-2, CH05d04-1, Hi03a03-2 |
طول میان گره‌ها Internodes length (mm) |
|
|
0.015 |
0.23 |
CH03d12-2 |
ارتفاع درخت Tree height (mm) |
|
نتیجه گیری کلی
تهیه نقشه ژنتیکی و شناسایی QTL ها در درختان چوبی چندساله براحتی محصولات زراعی عمدتا یکساله یا دو ساله صورت نمی گیرد. بنابراین می‌توان با استفاده از تجزیه ارتباط از داده‌های فنوتیپی چندساله استفاده نمود. با توجه به اینکه مکان های ریزماهواره ای مورد مطالعه بر روی صفات مورد مطالعه موثر بودند، بنابراین احتمال دارد تا بتوان از این مکان های ژنی در برنامه های اصلاحی برای شناسایی والدین برای تهیه جمعیت های نقشه یابی و نیز تولید هیبرید استفاده نمود.
تقدیر و تشکر
نویسندگان مقاله بر خود لازم میدانند تا مراتب تشکر و قدردانی خویش را از کارکنان محترم سازمان تحقیقات کشاورزی کهریز واقع در ارومیه و پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه به دلیل فراهم آوردن مواد گیاهی و امکانات لازم، به عمل آورند.
منابع
Abdollahi Mandolkani B, Alami A, Esfahani A (2010). Association analysis for morphological traits in peanut (Arachis hypogea L.) using microsatellite markers. Iranian Journal of Crop Sciences 12: 510-519 (In Farsi).
Broun P, Tanksley SD (1996). Characterization and genetic mapping of simple repeat sequences in the tomato genome. Molecular Genetics and Genomics 250: 39-49.
Brown AHD (1996). The core collection at the crossroads. In: Hodgkin T, Brown AHD, Hintum TJL, Morales EAV, (eds.) Core Collections of Plant Genetic Resources. (pp: 3- 19). John Wiley and Sons, Chichester, UK.
Dellaporta SL (1983). Aplant minipreparation. Plant molecular Biology Report 1: 19-21.
Devos KM, Bryan GJ, Collins AJ, Stephenson P, Gale MD (1996). Application of two microsatellite sequences in wheat storage proteins as molecular markers. Theoretical and Applied Genetics 90: 247-252.
FAOSTAT (2011). Agricultural Statistical Database, available online at: http:// faostat.fao.org
Gharghani A, Zamani Z, Talaie A, Oraguzie NC, Fatahi R, Hajnajari H, Wiedow C, Gardiner SE (2009). Genetic identity and relationships of Iranian apple( Malus× domestica Borkh.) cultivars and landraces, wild Malus species and representative old apple cultivars based on simple sequence repeats (SSR) marker analysis. Genetic Resource and Crop Evolution 1-14.
Gianfranceschi L, Seglias N, Tarchini R, Komjanc M, Gessler C (1998). Simple Sequence repeats for the genetic analysis of apple. Theoretical and Applied Genetic 96: 1069- 1076.
Goldstein DB, Linares AR, Cavalli-Sforza LL, Feldman MW (1995). An evaluation of genetic distances for use with microsatellite loci. Genetics 139: 463-471.
Guilford P, Prakash S, Zhu JM, Rikkerink E, Gardiner S, Bassett H, Forster R (1997). Microsatellites in Malus domestica (apple): abundance, polymorphism and cultivar identification. Theoretical and Applied Genetics 94: 249-254.
Hokanson SC, McFadden AK, Lamboy WF, McFerson JR (1998) Microsatellite (SSR) markers reveal genetic identities, genetic diversity and relationships in a Malus× domestica borkh core subset collection. Theoretical and Applied Genetics 97: 671-683.
Jahromi Shirazi R, Kheshavarzi M, Nhaghavi MR (2009). Identification of some cultivar and stocks of apple using SSR. Journal of Biotechnology 1(2): 17-27.
Jarret RL, Merrick LC, Holms T, Evans J, Aradhya MK (1996). Simple sequence repeats in watermelon [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum, Nakai]. Genome 40: 433-441.
Katzir N, Danine-Poleg Y, Tzur G, Karchi Z, Lavi U, Cregan PB (1996). Length polymorphism and homologies of microsatellites in several Cucurbitaceae species. Theoretical and Applied Genetics 93: 1282-1290.
Lespinase Y, Bounenir L, Djublic M, Cherveau E (1999). Haploidy in apple and pear. Acta Horticulture 484: 49-54.
Levesque R (2007). SPSS Programming and Data Management: A Guide for SPSS and SAS Users, Fourth Edition,SPSS Inc. Chicago
Liebhard R, Gianfranceschi L, Koller B, Ryder CD, Tarchini R, Van DeWeg E, Gessler C (2002). Development and characterization of 140 new microsatellites in apple (Malus× domestica Borkh.). Molecular Breeding10: 217-241.
Maliepaard C, Alston FH, Van Arkel G, Brown LM, Chevrea E, Dunemann F, Evans KM, Gardiner S, Guilford P, van Heusden AW, Janse J, Larens F, Lynn JR, Manganaris AG, den Nijs APM, Periam N, Rikkerink E, Roche P, Ryder C, Sansavini S, Schmnidt H, Tartarini S, Verhaegh J,Vrielink-van Ginkel JM, King GJ (1998). Aligning male and female linkage maps of apple (Malus pumila Mil.) using multi-allelic markers. Theoretical and Applied Genetics 97: 60-73.
Naghshin F, Bahari M, Sheid Tabatabaie B, Najjari KH (2008). Evaluation of genetic diversity among Iranian apple cultivars and landraces using sequence repeat markers. Journal of Horticultural 9: 69-82.
Powell W, Machray GC, Provan J (1996). Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends in plant Science 1: 215-222.
Rangana S (1977). Manual for analysis of fruit and vegetable products, Tata McGraw Hill Co. Pvt. Ltd., New Dehli. pp.5.
Roy, JKR, Bandopadhyay S, Rustgi HS, Balyan PK, Gupta (2006). Association analysis of agronomically important traits using SSR, SAMPL and AFLP markers in bread wheat. Current Science 5: 683-689.
Selvaraj MG, Narayana AM, Schubert JL, Ayers, MR, Burow MD (2009). Identification of QTLs for pod and kernel traits in cultivated peanut by bulked segregant analysis. Electronic Journal of Biotechnology 2: 1-10.
Silfverberg-Dilworth E, Matasci CL, Van de Weg WE, Van Kaauwen MPW, Walser M, Kodde LP, SoglioV, Gianfranceschi L, Durel CE, Costa F, Simioniuc D, Uptmoor R, Friedt W, Ordon F (2006). Genetic diversity and relationships among pea cultivars revealed by RAPDs and AFLPs. Plant Breeding 121: 429-435.
Way RD, Aldwinckle HS, Lamb RC, Rejman A, Sansavini S, Shen T, Watkins R, Westwood MN, Yoshida Y (1989). Apples (Malus). Acta Horticulture 290: 49-54.
Yeh, FC, Boyle T, Rongcai Y, Ye Z, Xian JM (1999). POPGENE version 3.1. http://www.ualberta.ca/-fyeh/fyeh.
Identification of microsatellite markers linked to morphological and biochemical traits in Iranian native apple (Malus × domestica .Borkh) cultivars
Farrokhi J.1,2, Darvishzadeh R.3, Hatami Maleki H.*4, Naseri L.1,Asghari F.1
1Department of Horticulture, Urmia University, Urmia, Iran
2 Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Ardabil branch
3Department of Plant Breeding and Biotechnology, Urmia University, Urmia, Iran
4Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, University of Maragheh, Iran
Abstract
In this study, genetic fingerprinting of 44 Iranian native apple cultivars were done using 16 simple sequence repeat pairs of primers and then the association of these markers with 16 morphological and biochemical traits were inspected. Based on marker data, 45 alleles were identified using 16 SSR pairs of primers. The number of allele per SSR locus was varied between 2 to 5 with mean of 2.8. Here in, the mean of number of effective allele was 2.2. Polymorphism information content ranged from 0.18 to 0.76 with mean of 0.49. To identify positive markers associated with studied traits, step wise regression was done among marker data as independent variables and studied traits as dependent variables. Results revealed that there is not any linked marker for traits including chlorophyll index, angle of branch and trunk cross sectional area. Considering to association analysis, thirteen traits include fruit volume, fruit diameter, fruit weight, fruit length, fruit firmness, days to ripening, organic acid content, total soluble solids, vitamin C, pH, leaf size, internodes length and tree height had linked SSR markers. The maximum number of allele (6 alleles) was seen for days to ripening and minimum number of allele (1 allele) was seen for traits including PH, fruit weight, fruit firmness and tree height. Regarding linkage between some SSR alleles with some traits, this is possible to use these markers in apple breeding programs effectively.
Keywords: Apple, Genetic fingerprinting, microsatellite marker, Association analysis
)