بیان پروتئین نوترکیب اینترفرون گاما در بذر گیاه توتون

بیان پروتئین نوترکیب اینترفرون گاما در بذر گیاه توتون

صابر اصغر زاده*¹، خدیجه باقری²، مختار جلالی جواران³، فریدون مهبودی⁴

¹دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان.

²استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان.

³دانشیار گروه اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس.

⁴دانشیار بخش بیوتکنولوژی، انستیتو پاستور ایران.

تاریخ دریافت: 19/12/1391، تاریخ پذیرش: 22/12/1392

چکیده

از مهم­ترین عوامل موثر بر افزایش تولید پروتئین نوترکیب در گیاه، بیان آن در بافت مناسب و نیز افزایش پایداری و تجمع پروتئین با استفاده از عوامل هدف­گیری کننده به جایگاه­های مناسب سلول است. در این تحقیق برای بیان اینترفرون گامای انسانی در بذر توتون و هدایت آن به شبکه آندوپلاسمی از پیشبرنده اختصاصی بذر (Napin)، توالی کوزاک در انتهای '5 و توالی KDEL در انتهای '3 ژن IFNγ استفاده شد. ژن IFNγ ابتدا در ناقل pGEM®-T Easy همسانه­سازی و پس از تایید صحت آن با استفاده از روش PCR، هضم آنزیمی و توالی­یابی، در ناقل بیانی گیاهی pBI121 زیر­همسانه­سازی گردید. ناقل نوترکیب pBI IFNγ  به سویه LBA4404 اگرباکتریوم معرفی و این باکتری برای تراریختی ریزنمونه­های برگی توتون استفاده شد. نوساقه­های باززائی شده در محیط انتخابی حاوی کانامایسین گزینش شدند. آنالیز گیاهان تراریخت در سطح DNA و مشاهده قطعه 432 جفت بازی IFNγ)) و قطعه 795 جفت بازی (NPTII) در واکنش PCR و هضم آنزیمی بیانگر انتقال سازه مدنظر به ژنوم گیاه بود. همچنین رونویسی از ژن IFNγ با RT-PCR تائید شد.  بررسی­ها در سطح پروتئین با استفاده از SDS-PAGE بیان موفقیت آمیز ژن IFNγ را نشان داد. نتایج حاصل نشان می­دهد که بذور گیاهی پتانسیل بالایی برای تولید پروتئین­های نوترکیب دارند. 

کلمات کلیدی: پیش­بر ناپین، توالی KDEL، توالی Kozak، توتون تراریخت، ، ژن IFNγ .

مقدمه

نیاز روز افزون به داروهای بیولوژیک و ارزش اقتصادی بالای آنها از یک طرف و مزایای سیستم­های بیانی گیاهی از طرف دیگر موجب شده که استفاده از گیاهان به عنوان بیوراکتورهای طبیعی در تولید داروها مورد توجه ویژه قرار گیرد. ﻫﺰﻳﻨﻪ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﭘﺮوﺗﺌﻴﻦ‌ﻫﺎی ﻧﻮﺗﺮﻛﻴﺐ در ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺣﺪاﻛﺜﺮ ﻳﻚ­دﻫﻢ ﺳﻴﺴﺘﻢ ﺗﺨﻤﻴﺮی و ﻳﻚ­ﻫﺰارم ﺳﻠﻮل ﺟﺎﻧﻮری است (Ghislaine et al., 2008). تغییرات پس از ترجمه که برای فعالیت پروتئین­های نوترکیب لازم است، در گیاهان بهتر و مطلوب­تر از پروکاریوت­ها انجام می­شود (Fischer et al., 1999). خطرات ناشی از آلودگی با مواد سمی باکتریایی و عوامل بیماری­زای انسانی به حداقل می­رسد. از طرفی، امکان هدایت پروتئین­ سنتز شده به اجسام داخل سلولی با هدف پایداری بیشتر، وجود دارد (Daniell et al., 2001). ﺑﺬور ﮔﻴﺎﻫﻲ به دلایلی از جمله: افزایش پایداری پروتئین، تجمع بالای پروتئین در حجم کوچک و ذخیره­سازی راحت آن، استخراج نسبتا راحت به دلیل کم بودن ترکیبات فنولیک و ترکیبات پیچیده پروتئینی و محدود شدن بیان پروتئین به یک اندام ذخیره­ای و جلوگیری از اختلال در رشد بافت­های دیگر  بیشتر مورد توجه هستند (Boothe et al., 1997).

علاوه بر نوع بافت گیاه، با استفاده از توالی­های هدف­گیری کننده به جایگاه­های مناسب در سلول نیز می توان موجبات افزایش تجمع پروتئین نوترکیب را فراهم آورد (Droogenbroeck et al., 2006). شبکه آندوپلاسمی سلول (ER) حاوی پروتئینهای چپرونی[1]  مختلف است که موجب بسته­بندی صحیح پروتئین­ها شده و از تجمع و تشکیل ساختارهای 3 بعدی ناصحیح جلوگیری می­کند. بنابراین قرارگرفتن پروتئین نوترکیب در ER موجب بسته­بندی صحیح پروتئین شده و در نتیجه پایداری و تجمع آن افزایش می­یابد. توالی KDEL از جمله توالی­هایی است که برای قرارگرفتن پروتئین در شبکه آندوپلاسمی در مطالعات متعددی استفاده و کارایی آن به اثبات رسیده است (Conrad & Fiedler, 1998).

از جمله اهداف دیگر در انتقال ژن، افزایش کارایی ترجمه و بیان ترنس ژن است. براساس گزارش کوزاک، وجود توالی حفاظت شده ACCAUGG در اطراف ناحیه کدن شروع، اثر بسیار مطلوبی بر بیان ژن دارد (Kozak, 1986). به همین دلیل در تحقیق حاضر توالی  Kozakدر آغازگر پیشبر سازه pBI IFNγ استفاده شد. 

اینترفرون گاما (IFNγ) ارزش درمانی بالا و کاربردهای وسیع در پزشکی دارد. برای بیماران با نقص مادرزادی از جمله گرانولوماتوس مزمن[2] (Woodman et al., 1992)، سالمونلا تیفی موریوم (Nauciel & Espinasse, 1992)، سرطان­های مختلف از جمله نوروبلاستوما (Wandelt et al., 1992) و ملانوما (Abdel-wahab et al., 1997) استفاده می­شود.

تلاش­های زیادی در جهت تولید انبوه این پروتئین باارزش صورت گرفته اما پروتئین تولید شده در باکتری E. coli ساختار فضایی مناسب نداشته و بخش اعظم آن به فرم انکلوژن بادی در می­آید  (Wetzel et al., 1991). استفاده از سلول­های یوکاریوتی جهت تولید آنها نیز هزینه بسیار بالایی دارد. به نظر می­رسد که دستورزی ژنتیکی گیاهان برای تولید این گروه از پروتئین­های باارزش، یک روش جایگزین مناسب باشد. در این تحقیق سازه بیانی طوری طراحی و ساخته شد تا پروتئین IFNγ در شبکه آندوپلاسمی بذر گیاه توتون بیان شود. 

مواد و روش‌ها

ناقل­های ژنی و سویه­های باکتری

از باکتری E.coli سویه 'Top10 F و ناقل­های pGEM®-T Easy Vector و pBI121 برای همسانه­سازی استفاده شد. برای تراریختی گیاهان از باکتری اگروباکتریوم (Agrobacterium tumefaciens) سویه LBA4404 استفاده گردید.

تکثیر ژن IFNγ همراه توالی­های Kozak ,KEDL و همسانه­سازی آن­ها در ناقل T Easy vector

ژن اینترفرون گامای انسانی توسط معین رضاخانلو و همکاران در سال 2002 جداسازی و تعیین توالی شد و در بانک ژن با شماره  AF506749به ثبت رسیده است. تکثیر ژن IFNγ با استفاده از تکنیک PCR و آغازگرهای اختصاصی رفتی (5´-AGA GGA TCC ATG CAG GAC CCA TAT GTA AAA G-3´) با محل برشی BamHI و آغازگر معکوس (5´-GCAGAGCTCTTACAATTCGTCTTTCTGGGATGCTCTTCG-3´) با محل برشی SacI انجام شد. قابل ذکر است که توالی کوزاک در آغازگر رفتی و توالی KDEL در آغازگر معکوس تعبیه شد. در واکنش PCR از غلظت­های استاندارد اجزای مختلف استفاده شد و دمای اتصال آغازگر با رشته الگو °C 63 انتخاب گردید. پس از تکثیر و تخلیص، ژن موردنظر در ناقلpGEM^®-T Easy  همسانه­سازی گردید. سازه تهیه شده به سلول­های مستعد E.coli سویه 'TOP10F منتقل شد. بر روی کلنی­های سفید رشد کرده در محیط انتخابی حاوی آنتی­بیوتیک­های آمپی­سیلین و تتراسیکلین، IPTG و X-gal، کلنی-PCR با آغازگرهای اختصاصی ژن IFNγ انجام شد. سپس کلون­های PCR مثبت با هضم آنزیمی نیز تایید شدند و در نهایت کلون­های مثبت توالی­یابی شدند و نتایج توالی­یابی با نرم افزارBlast و برنامه Clustalw مورد بررسی قرار گرفت.­

تهیه سازه بیانی حاوی ژن IFNγ (pBI IFNγ)

ابتدا در ناقل بیانی pBI121، پیش­بر اختصاصی بذر Napin جایگزین پیش­بر CaMV35S شده و قطعه‌ی Kozak - IFNγ -KDEL با هضم آنزیمی از T-Vector جدا شده و واکنش اتصال قطعه جدا شده با ناقل pBI121 انجام شد و از PCR و هضم آنزیمی برای تایید صحیح بودن کلونینگ استفاده شد ناقل نوترکیبpBI IFNγ  به روش انجماد و ذوب به اگرباکتریوم منتقل (sambrook et al., 2001) و سپس انتقال آن با روش کلنی- PCR تایید شد و از این باکتری برای تراریزش ریزنمونه­های برگی استفاده شد. 

تراریزش ریزنمونه­های توتون و باززایی گیاهان تراریخت

ضدعفونی بذرهای توتون رقم Tobacco Xanthi  با استفاده از هیپوکلریت سدیم 5% به مدت 10 دقیقه و 5 بار شستشو با آب مقطر استریل هر بار به مدت 10 دقیقه انجام شد. ﺑﺮای ﺟﻮاﻧﻪ­زﻧﻲ ﺑﺬور از ﻣﺤﻴﻂ MS در دﻣﺎی°C 26 ﺑﺎ دوره ﻧﻮری 16 ﺳﺎﻋﺖ روﺷﻨﺎﻳﻲ و 8 ﺳﺎﻋﺖ ﺗﺎرﻳﻜﻲ اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ. بعد از ۲ هفته گیاهان رشد کرده و جوان­ترین برگ­ها با طول تقریبا ۴ سانتیمتر برای تراریخت نمودن انتخاب گشته (که هرکدام از آن‌ها به ۸ تا ۱۰ قطعه تقسیم شدند) و جهت تلقیح آماده شدند. ﻳﻚ روز ﻗﺒﻞ از اﻧﺠﺎم آﻟﻮدﮔﻲ، ﺗﻚ ﻛﻠﻨﻲ­ﻫﺎی اﮔﺮوﺑﺎﻛﺘﺮﻳﻮم ﺣﺎوی ﺳﺎزه ﻣﻮرد ﻧﻈﺮ در ﻣﺤﻴﻂ  (g/ml  + LBµ50) ﻛﺎﻧﺎﻣﺎﻳﺴﻴﻦ در دﻣﺎی°C 28 وﺗﺎرﻳﻜﻲ ﻛﺸﺖ داده ﺷﺪ، وﻗﺘﻲ ﻛﻪ OD ﺑﺎﻛﺘﺮی رﺷﺪ ﻛﺮده ﺑﻪ 5/0-1 رﺳﻴﺪ، در دﻣﺎی°C 4 و دور rpm 3500 ﺑﻪ ﻣﺪت 5 -8 دﻗﻴﻘﻪ ﺳﺎﻧﺘﺮﻳﻔﻮژ ﺷﺪ. ﭘﺲ از ﺧﺎرج ﻧﻤﻮدن ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ ﺑﺎﻛﺘﺮی (LB)، ﻣﺤﻴﻂ ﺗﻠﻘﻴﺢ (MS مایع و هورمون‌های BAP با غلظت mg/l3 و NAA به مقدارmg/l 1/0) ﺑﻪ ﺳﻠﻮﻟﻬﺎی ﺑﺎﻛﺘﺮی رﺳﻮب داده ﺷﺪه اﺿﺎﻓﻪ و ﺳﻠﻮل‌ﻫﺎ ﻛﺎﻣﻼ در آن ﺣﻞ ﺷﺪﻧﺪ. ﺑﻌﺪ ازآﻣﺎده ﻛﺮدن ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﻴﻮن ﺑﺎﻛﺘﺮی، رﻳﺰﻧﻤﻮﻧﻪ‌ﻫﺎ ﺑﻪ ﻣﺪت 20-30 دقیقه در ﺗﻤﺎس ﺑﺎ ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﻴﻮن اﮔﺮوﺑﺎﻛﺘﺮﻳﻮم ﺣﺎوی ناقل ﻣﻮرد ﻧﻈﺮ(pBI IFNγ) ﻗﺮار ﮔﺮﻓﺘﻪ و در ﭘﺘﺮی­دﻳﺶ­ﻫﺎی ﺣﺎوی ﻣﺤﻴﻂ ﻫﻢ ﻛﺸﺘﻲ (MS کامل و هورمون‌های BAP با غلظت mg/l3 و NAA به مقدارmg/l 1/0) ﺑﻪ ﻣﺪت48 اﻟﻲ 72 ﺳﺎﻋﺖ در دﻣﺎی°C 26 در ﺗﺎرﻳﻜﻲ ﻗﺮار داده ﺷﺪﻧﺪ. در ﻣﺮﺣﻠﻪ ﺑﻌﺪی اﻳﻦ رﻳﺰﻧﻤﻮﻧﻪ‌ﻫﺎ ﺑﺮ روی ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ اﻧﺘﺨﺎﺑﻲ(MS کامل، هورمون‌های BAP با غلظت mg/l3 و NAA به مقدارmg/l 1/0 و آنتی‌بیوتیک‌های کانامایسین با غلظت µg/ml100-25 و سفوتاکسیم با غلظت µg/ml200 ) (ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮر ﮔﺰﻳﻨﺶ ﮔﻴﺎﻫﭽﻪ­ﻫﺎی ﺗﺮارﻳﺨﺘﻪ) در دﻣﺎ و دوره ﻧﻮری ﻣﺸﺎﺑﻪ ﻣﺮﺣﻠﻪ ﻗﺒﻞ ﺑﻪ ﻣﺪت 4ﻫﻔﺘﻪ ﻧﮕﻬﺪاری ﺷﺪﻧﺪ. واﻛﺸﺖ ﻧﻤﻮﻧﻪ­ﻫﺎ ﺑﻪ ﻓﺎﺻﻠﻪ ﻫﺮ 15 روز ﻳﻚﺑﺎر اﻧﺠﺎم ﺷﺪ. ﺑﺮای ﻃﻮﻳﻞ ﺷﺪن ﺳﺎﻗﻪ از ﻣﺤﻴﻂ طویل شدن ساقه(MS کامل به‌همراه µg/ml100 آنتی­بیوتیک کانامایسین) و ﺑﺮای رﻳﺸﻪ­زاﺋﻲ ﻧﻮﺳﺎﻗﻪ­ﻫﺎی ﺑﺪﺳﺖ آﻣﺪه از ﻣﺤﻴﻂ ریشه­زایی (MS کامل به‌همراه µg/ml1/0 هورمون NAA) اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ. در ﻣﺮﺣﻠﻪ آﺧﺮ، ﮔﻴﺎﻫﺎن رﻳﺸﻪ­دار ﺷﺪه اﺑﺘﺪا ﺑﻪ ﮔﻠﺪان­ﻫﺎی ﺣﺎوی ﭘﺮﻟﻴﺖ (در دﻣﺎ و ﻧﻮر ﻣﺸﺎﺑﻪ ﻣﺮﺣﻠﻪ ﻗﺒﻞ) و ﺳﭙﺲ ﺑﻪ ﺧﺎک ﻣﻨﺘﻘﻞ ﺷﺪه و در ﺷﺮاﻳﻂ ﮔﻠﺨﺎﻧﻪ ﻧﮕﻬﺪاری ﺷﺪﻧﺪ. ﺑﺬور ﺟﻤﻊ­آوری ﺷﺪه از ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺗﺮارﻳﺨﺘﻪ ﺟﻬﺖ آﻧﺎﻟﻴﺰﻫﺎی ﺑﻌﺪی ﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده ﻗﺮارﮔﺮﻓﺖ. 

ﺑﺮرﺳﻲ ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺗﺮارﻳﺨﺘﻪ در ﺳﻄﺢ DNA

DNA ژنومی از ﺑﺮگ‌ﻫﺎی ﺟﻮان ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺗﺮارﻳﺨﺖ و ﺷﺎﻫﺪ (ﮔﻴﺎه ﻏﻴﺮﺗﺮارﻳﺨﺖ)، ﺑﺎ روش دلاپورتا اﺳﺘﺨﺮاج ﺷﺪ(Dellaporta et al., 1983).  ﺳﭙﺲ ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از آﻏﺎزﮔﺮﻫﺎی اﺧﺘﺼﺎﺻﻲ ژن nptII و ژن  IFNγ واﻛﻨﺶ PCR ﺑﺮ روی ﮔﻴﺎﻫﺎن ﮔﺰﻳﻨﺶ ﺷﺪه در ﻣﺤﻴﻂ اﻧﺘﺨﺎﺑﻲ اﻧﺠﺎم ﺷﺪ. واکنش هضم آنزیمی نیز با آنزیم XbaI بر روی محصول PCR انجام گرفت.

ﺑﺮرﺳﻲ ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺗﺮارﻳﺨﺘﻪ در ﺳﻄﺢ RNA

ﺑﺮای ﺑﺮرﺳﻲ  ﺑﻴﺎن ژن در ﺳﻄﺢ  RNA از روش RT-PCR اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ. استخراج RNA از بافت­های بذری نارس با استفاده از محلول استخراج RNA (RNX-Plus - 25ml RN7713C) تهیه شده از شرکت سیناژن، انجام گردید. ساخت cDNA از روی RNAی استخراج شده، بوسیله کیت دومرحله­ای RT-PCR (Vivantis,RTPL12) انجام گرفت. قابل ذکر است که برای استخراج RNA، برداشت بذر از گیاهان PCR مثبت، 20 روز پس از گلدهی انجام شد. برای انجام واکنش PCR از آغازگرهای مرحله قبل استفاده شد.

ﺑﺮرﺳﻲ ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺗﺮارﻳﺨﺘﻪ در ﺳﻄﺢ پروتئین

ﺑﺮای ﺑﺮرﺳﻲ  ﺑﻴﺎن ژن در ﺳﻄﺢ  پروتئین از روش الکتروفرزی SDS-PAGE  اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ و استخراج پروتئین کل نیز از بذور رسیده گیاهان تراریخت و شاهد (غیرتراریخت) انجام گرفت.

نتایج

جایگزینی پیشبرنده Napin به جای CaMV35S با استفاده از هضم آنزیمی ( HindIII و BamHI) تایید شد به این ترتیب که قطعه bp1140 (مربوط به Napin) به جای قطعه  bp835 (مربوط به (CaMV35S  قرار گرفت .

همان­طور که انتظار می­رفت تکثیر ژن IFNγ یک قطعه حدود bp432 تولید نمود(شکل a1).  پس از تایید همسانه­سازی این قطعه در ناقل TA برای توالی­یابی اقدام گردید. همسانه­سازی مجدد ژن IFNγ در ناقل بیانی گیاهی pBI121 با روش کلنی-PCR  و هضم آنزیمی تایید گردید (شکل b1) و نهایتا سازه pBI IFNγ  ساخته شد (شکل 2).

شکل1- تکثیر ژن IFNγ با   PCR (a) و تائید کلونینگ آن با هضم آنزیمی (b). A) خط 1: قطعه bp432 تکثیر شده، خط 2: نشانگر bp100 و خط3: کنترل منفی  b) خط 1: نشانگر bp100، خط 2: ناقلpBI IFNγ  برش داده شده با آنزیم  BamHIو SacI و قطعه bp432 آزاد شده.

Figure 1- Amplification of the IFNγ gene by PCR (a) and confirmation of cloning by restriction enzyme digestion(b). a) Lane 1: Amplified IFN_γ gene (500 bp); Lane 2: 100 bp ladder. Lane 3: Negative control. b) Lane 1: 100 bp ladder. Lane 2: digested recombinant pBI121 IFNγ plasmid by SacI and SmaI enzymes.

شکل2- تصویر ناحیه T-DNA وکتور دوگانهpBI121 IFNγ ، حاوی ژن nptII (مقاومت به کانامایسین)، پیشبرنده Napin، ژن IFNγ، توالی کزاک و توالی KDEL که در ناقل بیانی pBI121 در بین دو ناحیه LB و RB قرار گرفته است.

Figure 2- Schematic diagram of the T-DNA region in the binary vector pBI121 IFN_γ. Including npt II, coding sequence of the neomycin phosphotransferase II gene; napin promoter; IFNγ, human gamma interferon gene; kozak sequence; KDEL, ER retention signal; RB and LB, T-DNA right and left border, respectively.

آلوده­سازی ریز­نمونه­های توتون ورشد جوانه­های تراریخت در محیط گزینشگر

تراریختی ریز­نمونه­های برگی توتون در محیط تلقیح انجام شد. ریزنمونه­های آلوده شده با آگروباکتریوم، در قسمت حاشیه نسبت به عملکرد آگروباکتریوم واکنش نشان داده و به سمت بالا خم شدند.                           

پس از ۲ الی ۳ هفته، پیدایش جوانه­ها از حاشیه زخمی شدة ریزنمونه­های تلقیح شده با آگروباکتریوم تراریخت شده مشاهده گردید. ریزنمونه­های برگی که بعنوان شاهد (بدون تلقیح بواسطه آگروباکتریوم تراریخت)، بر روی محیط گزینشگر قرار داشتند، باززایی نشان ندادند و سفید رنگ شدند (شکل3).

شکل 3- باززایی نوساقه ها بعد از تلقیح  1. جوانه­های اولیه باززایی شده از ریزنمونه­های 2 الی3 هفته پس از تلقیح. 2. عدم بازایی در ریز­نمونه­های شاهد.

Figure 3- Regeneration of shoots after co-cultivation. 1: Regeneration of shoots from leaf  disk explants 2-3 weeks after co-cultivation. 2: non regeneration in control explants.

انتقال گیاهچه­ها به محیط طویل شدن ساقه و ریشه­زایی

گیاهچه­هایی که در مقابل کانامایسین مقاومت کرده و سبز باقی ماندند، پس از رشد مناسب و به منظور طویل شدن ساقه و ریشه­زایی، به محیط طویل شدن ساقه و پس از رسیدن گیاهچه­ها به ارتفاع تقریبا پنج سانتی­متر، به محیط ریشه­زائی و درون ظروف بزرگتر انتقال یافتند (شکل4).

گیاهان تراریخت ابتدا به پرلایت و سپس به خاک منتقل شدند. حدود یک ماه پس از مرحله گلدهی بذور گیاهان تراریخت رسیده و آماده برداشت شدند (شکل5).

شکل 4- انتقال گیاهچه­های باززایی شده از محیط گزینشگر به محیط طویل شدن ساقه (1) و ریشه زایی (2)

Figure 4- Regenerated plantlets transferred from selection medium to shoot elongation (1) and rooting  medium (2(.

شکل 5- انتقال گیاهچه­ها به خاک (1) و گلدهی آنها (2).

Figuew 5- Rooted plantlets transferred to soil (1) and flowered (2).

بررسی مولکولی گیاهان تراریخت در سطح DNA ، RNA و پروتئین

به منظور بررسی مولکولی گیاهان تراریخت در سطح  DNAو اطمینان از انتقال ژن هدف به گیاهان تراریخت، پس از استخراج DNA ژنومی از برگ گیاهان نسل اول (T0) و شاهد، واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای ژن nptII و آغازگرهای ژن IFNγ انجام شد، که نتیجه آن تکثیر قطعه bp432 مربوط به ژن IFNγ و تکثیر قطعه bp795 مربوط به ژن nptII بود (شکل6).

شکل 6- بررسی انتقال ژنهای IFNγ و nptII به گیاهچه های توتون با استفاده از تکنیک PCR 1- مارکر وزن مولکولی (1Kb DNA Ladder). 2 و 3: قطعه bp432 برای گیاهان تراریخت. 4: کنترل منفی (گیاه شاهد). 5: قطعه bp432 کنترل مثبت. 6 و 7: قطعه bp795 برای گیاهان تراریخت. 8: کنترل منفی. 9: قطعه bp795 کنترل مثبت.

Figure 6- PCR analysis of IFNγ and nptII gene transfer to tobacco seedlings. 1: 1kb ladder 2, 3: amplified IFN_γ gene (transformed seedlings) 4: negative control (wild type plant) 5: positive control (pBI IFNγ plasmid)  6,7: amplified nptII gene (transformed seedlings) 8: negative control (wild type plant) 9: positive control(pBI nptII plasmid).

همچنین واکنش PCR با استفاده از آغازگر اختصاصی رفتی ژن nptII و آغازگر معکوس ژن IFNγ انجام شد. تکثیر قطعه bp3743 حاوی ژن nptII ، پیش­بر napin و ژن IFNγ  تائید دیگری بود مبنی بر این که این قطعات بطور صحیح و در کنار هم (پیوسته) به گیاهچه­ها منتقل شده­اند.(شکلa7).

با توجه به اینکه در سازه IFNγ-121PBI بین پیش­بر ناپین و ژن IFNγ یک جایگاه برشی اختصاصی برای آنزیم XbaI وجود دارد، با واکنش هضم آنزیمی قطعه bp3743 (بدست آمده از واکنش PCR) دو قطعه bp432 (مربوط به IFNγ) و bp2311 (مربوط به پیشبرنده ناپین و ژن nptII) مشاهده شد که نشان می­دهد سازه منتقل شده به گیاه همان سازه مد نظر ما بوده است (شکلb7).

شکل 7- بررسی انتقال قطعه IFNγ-napin-nptII به گیاهچه های توتون با استفاده از PCR (a)و هضم آنزیمی (b). A )1: مارکر 1Kb. 2،3،4،5:قطعه 3743 جفت بازی تکثیر شده (گیاهان باززایی شده). 6: کنترل منفی (گیاهچه­های شاهد). 7: کنترل مثبت (پلاسمید IFNγ-121PBI). b: هضم آنزیمی قطعه 3743 جفت بازی (IFNγ-napin-nptII). 1: قطعه 3743 جفت بازی بدون تیمار با آنزیم برشی. 2: مارکر 1Kb. 3: قطعه­های 2311 و 432 جفت بازی ایجاد شده پس از هضم آنزیمی.

Figure 7- Analysis of IFNγ-napin-nptII fragment transfer to tobacco seedlings by PCR (a)  and digestion (b). a)1: 1kb ladder 2, 3,4,5 amplified 3742bp IFNγ-napin-nptII  fragment (transformed seedlings) 6: negative control (wild type plant) 7: positive control (pBI IFNγ plasmid)  b) 1: undigested  IFNγ-napin-nptII   fragment 2: 1kb ladder 3: digested  IFNγ-napin-nptII   fragment.

گیاهانی که نتیجه PCR آنها مثبت بود برای استخراج RNA انتخاب و cDNA ساخته شده، بعنوان الگو برای انجام RT-PCR مورد استفاده قرار گرفت. برای انجام RT-PCR از آغازگرهای اختصاصی IFNγ  (که قطعه bp432 را تکثیر می­کنند) استفاده شد. در مرحله انجام PCR، علاوه بر cDNA سنتز شده،  از RNA استخراج شده هم بعنوان الگو (کنترل منفی) استفاده شد، این کار بمنظور اطمینان از خلوص RNA استخراج شده (عدم حضور DNA ژنومی) انجام شد. وجود قطعه bp432 در واکنش RT-PCR، سنتز mRNA از روی ژن IFNγ انتقال یافته به گیاهان توتون را تایید کرد. عدم وجود قطعه مشابه در محصول PCR با الگوی RNA استخراج شده عدم وجود هرگونه آلودگی DNA ژنومی را تایید کرد (شکل8).

شکل 8- تایید سنتز mRNA ژن IFNγ با واکنش  RT-PCR. 1: قطعه bp432 محصول واکنش RT-PCR  (گیاه تراریخت) 2: کنترل منفی (cDNAگیاه شاهد) 3و4: کنترل منفی (RNA کل بذرهای نارس گیاهان تراریخت  و شاهد، بعنوان الگو در PCR استفاده شده است). 5. مارکر 1Kb.

Figure 8- RT-PCR analysis of IFNγ gene transcription in tobacco seeds plants. 1: amplified IFN_γ gene in RT-PCR (transformed seedlings) 2: negative control (wild type plant) 3, 4 : negative control (RNA extracted from transgenic and control seeds was used as a template in PCR) 5: 1kb ladder.

آنالیز SDS-PAGE بر روی پروتئین­های استخراج شده از گیاهان تراریخت وجود قطعه اضافی مشخص با وزن حدود Kda36  را در مقایسه با گیاهان شاهد را نشان داد که دوبرابر وزن مولکولی پروتئین IFNγ (Kda 36=2* Kda18) می­باشد (شکل 9).

بحث

این تحقیق با هدف استفاده از پتانسیل بالای گیاهان جهت تولید پروتئین اینترفرون گامای انسانی طراحی و اجرا گردید. بمنظور بیان ژن IFNγ در بذر گیاه، پیش­بر ناپین (پیش­بر اختصاصی بذر) بجای پیش­بر CaMV 35S جایگزین شد. در بذور رسیده کلزا، پروتئین Napin، 30-20% پروتئین کل بذر را تشکیل می­دهد (Crouch et al., 1981). 

شکل 9- بررسی بیان پروتئین IFNγ با SDS-PAGE. 1. نشانگر پروتئین. 2،3. پروتئین کل استخراج شده از بذر گیاهان تراریخت 4. پروتئین استخراج شده از بذر گیاه شاهد.

Figure 9- SDS-PAGE analysis of IFNγ gene expression in tobacco seeds. 1: protein ladder 2,3 total protein extracted from transgenic tobacco seeds 4: total protein extracted from wild type tobacco seeds.

در مطالعات مختلف به منظور افزایش پایداری پروتئین تولید شده در داخل سلول با استفاده از توالی 4 آسیدآمینه (KDEL) آن را به شبکه آندوپلاسمی هدف­گیری نموده­اند.  با اینکه نتایج این مطالعات تا حدی باهم متفاوت است اما تقریبا در تمام آنها یک نکته مشترک وجود دارد و آن اینکه این توالی موجب افزایش بیان پروتئین نوترکیب می­شود.  Schouten et al (1997) گزارش کردند که این توالی به خوبی توسط گیرنده­های مربوطه شناسایی شده و موجب نگهداری آنتی­بادی تولید شده در ER می­شود.  این مقدار افزایش تولید (تا 100 برابر حالتی که از توالی KDEL استفاده نشود) به دلیل قرار گرفتن آنتی­بادی درER  و در امان ماندن آن از تجزیه توسط پروتئازها است. هدف دیگر از اضافه کردن توالی KDEL، ممانعت از ورود پروتئین تولید شده به دستگاه گلژی گیاه است.  در غشای سیسترون گلژی، گلیکان­های گیاهی به پروتئین نوترکیب اضافه می­شود که این گلیکانها در بدن انسان پاسخ­های ایمنی را موجب می­شوند، در حالی­ که حضور توالی KDEL از وارد شدن پروتئین به دستگاه گلژی ممانعت بعمل می­آورد.  نتایج کار (Frigerio et al (2001 نشان داده که توالی KDEL با کارایی بالایی از قرار گرفتن پروتئین در دستگاه گلژی ممانعت بعمل می­آورد از طرف دیگر نتایج مطالعات جدیدتر بیانگر این است که اگر در سازه هدف، از پیشبرنده اختصاصی بذر و توالی KDEL به طور همزمان استفاده شود، میزان بیان پروتئین به طور چشم­گیری بالا می­رود. در تحقیقی Droogenbroeck et al (2006) گزارش کردند که با استفاده از سازه بیانی اختصاصی بذر و هدف­گیری پروتئین نوترکیب به شبکه آندوپلاسمی بالاترین میزان بیان ScFv (بیش از 36% پروتئین محلول کل در بذور آرابیدوپسیس) بدست آمد. نتایج این تحقیق نیز نشان داد که ژن IFNγ با موفقیت به گیاه توتون منتقل شده و در دو سطح رونویسی و ترجمه بخوبی بیان می­شود. جهت انتقال ژن به گیاه توتون از روش آگروباکتریوم استفاده گردید که امروزه به طور گسترده­ای جهت تراریختی گیاهان )خصوصا دولپه­ای­ها (مورد استفاده قرار می­گیرد. در تراریختی توتون این روش مزایای زیادی نسبت به سایر روش­های انتقال ژن دارد که از آن جمله عبارتند از: گیاه توتون به تلقیح با نژادهای آگروباکتریوم (مانند LBA4404) فوق العاده حساس است، گیاهچه­ها مستقیما و بدون نیاز به تشکیل کالوس باززایی می­شوند، گیاهچه­ها به آسانی از محل لبه­ای بریده شده ریزنمونه (برگ) که بوسیله آگروباکتریوم حاوی ناقل تلقیح شده است رشد می­کنند و کارایی باززایی از بافت­های گیاهی از این طریق نسبت به سایر روش­ها بسیار بالاست (Fischer, 2003). بررسی­های مولکولی با تکنیک PCR بر روی گیاهان تراریخت، انتقال ژن IFNγ به گیاهان باززایی شده را تایید کرد. رونویسی از روی ژن IFNγ با تکنیک RT-PCR تایید شد. بیان ژن در سطح رونویسی تاییدی بر عملکرد پیش­بر ناپین در گیاه توتون بود. وجود قطعه اضافی مشخص با وزن حدود Kda36  در مقایسه با گیاهان شاهد برروی ژل پلی­ اکریل­آمید، تایید کننده بیان ژن IFNγ در مرحله ترجمه می­باشد. قطعه مورد نظر دوبرابر وزن مولکولی پروتئین IFNγ (Kda 36=2* Kda18) می­باشد که نشان دهنده ایجاد دایمر در پروتئین IFNγ می­باشد. انتهای کربوکسیل یک مونومر IFNγ (Ala-123 to Met-134) بطور کوالانسی می­تواند به انتهای آمینی یک منومر IFNγ دیگر متصل شود. بین منومرهای IFNγ وCu,Zn-superoxide  dismutase در شرایط سلولی دایمر IFNγ تشکیل می­شود. دایمرهای IFNγ از نظر اندازه، عملکرد وساختار، در شرایط مشابه سلول، رفتار مشابهی با منومر IFNγ دارند (Charles A. LunnS, 1992). امید است با تکمیل بررسی­های بعدی در زمینه استخراج و استحصال و افزایش بیان این پروتئین، امکان تولید انبوه و ارزان یک پروتئین نوترکیب با ارزش را فراهم کرد.

سپاسگزاری

با تشکر از راهنمایی­های زنده­یاد دکتر علی حق­نظری که در مراحل مختلف انجام این پروژه با ما همکاری نمودند.