بهینه سازی محیط کشت اقتصادی و فرمنتاسیون برای تولید اسپور و کریستال های یک سویه بومی Bacillus thuringiensis موثر بر آفات پروانه ای

بهینه سازی محیط کشت اقتصادی و فرمنتاسیون برای تولید اسپور و کریستال­های یک سویه بومی   Bacillus thuringiensis   موثر بر آفات پروانه­ای

غلامرضا صالحی جوزانی*¹، محمدفتی مرادعلی²، سعید عباسعلیزاده²

¹دانشیار بخش تحقیقات ییوتکنولوژی میکروبی و ایمنی زیستی پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران (ABRII).

² کارشناسان ارشد بخش تحقیقات ییوتکنولوژی میکروبی و ایمنی زیستی پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران.

تاریخ دریافت: 14/12/1392، تاریخ پذیرش: 15/09/1393

چکیده

هدف از تحقیق حاضر،  بهینه سازی محیط کشت اقتصادی و فرایند فرمنتاسیون برای یک سویه بومی باکتری Bacillus thuringiensis  (سویه YD5) موثر بر آفات پروانه­ای بود. در ابتدا pH و دمای بهینه رشد سویه در شرایط ارلن مورد بررسی قرار گرفت که نتایج نشان داد pH بهینه آن 7 و دمای بهینه برای رشد آن 30 درجه سلسیوس می باشد. بمنظور بهینه­سازی محیط کشت از پسماندهای ارزان قیمت کشاورزی شامل ملاس (ساکارز)، پرمیت شیر (لاکتوز) و پسماند نشاسته (پلی‌ساکارید) به عنوان منبع کربن، آب استیپ (خیسانده) ذرت به عنوان منبع ازت٬ و آب دریا به عنوان منبع نمک­های معدنی استفاده شد. میزان رشد و  تولید اسپور و کریستال (دلتا اندوتوکسین) سویه در محیط های حاوی مواد اشاره شده در شرایط ارلن مورد ارزیابی قرار گرفت. بالاترین میزان رشد و تولید اسپور و کریستال زمانی بدست آمد که از ترکیب نشاسته هیدرولیز شده (3 درصد)، آب استیپ ذرت (3 درصد) و نمک دریا با غلظت 003/0 درصد استفاده شد.  در ادامه تاثیر فاکتورهای محیطی  از قبیل pH، میزان تلقیح اولیه، غلظت اکسیژن بر سینتیک رشد و تولید اسپور و کریستال سویه در شرایط فرمانتور غیر پیوسته آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان تلقیح اولیه 2 درصد و غلظت اکسیژن اشباع 90%  موجب تولید بالاترین میزان اسپور و اندوتوکسین شدند. نهایتاً در نتیجه فرایندهای بهینه شده در این تحقیق میزان اسپور و کریستال نهایی تولید شده برابر  10⁹ × 5/5 اسپور ((CFU/ml و 740 میلی‌گرم پروتئین در میلی‌لیتر بود.

واژه‌های کلیدی: محیط کشت اقتصادی،  بهینه ­سازی رشد، آفات پروانه­ای، فرمانتور، Bacillus thuringiensis.

مقدمه

کاربرد سموم شیمیایی برای کنترل آفات کشاورزی٬ موجب خسارات جبران ناپذیری بر سلامت انسان، سایر موجودات زنده و محیط زیست می شود. در همین راستا طی دو ده اخیر استفاده از عوامل میکروبی کنترل کننده آفات که زیان های کمتری داشته و دامنه اثر محدود و اختصاصی‌تری بر روی حشرات هدف دارند،  بسیار مورد توجه واقع شده اند. از میان عوامل کنترل کننده میکروبی، باکتریBacillus thuringiensis  (Bt) از دهه 1920، به علت تنوع گونه ای زیاد و دامنه اثر اختصاصی تر بر آفات مختلف و همچنین ایمنی زیستی بالا جایگاه ویژه ای پیدا کرد و همچنان 90% سموم بیولوژیک مورد کاربرد در دنیا را شامل می شود (Schnepf et al., 1998; Salehi Jouzani et al., 2008 a, b).  این باکتری در طول مرحله‌ی اسپورزایی، پروتئین های کریستالی حاوی دلتا اندوتوکسین های حشره کش تولید می کنند. پروتئین­های کریستالی سویه­های مختلف این باکتری به شکل اختصاصی تنها بر گروه های خاصی از حشرات موثر می­باشند و بطور معمول هر کدام از سویه های Bt بر روی یک راسته از حشرات موثر می­باشد  (Seifinejad et al., 2007).

پس از دست یابی به بهترین سویه­های باکتری Bt با قدرت کشندگی  بالا و همچنین دامنه میزبانی مناسب، تلاش برای تولید انبوه و مقرون به صرفه آنها صورت می گیرد. اکثر انواع سلول های میکروبی جهت فرایندهای بیوسنتز و تامین انرژی خود به آب، کربن، ازت مواد غیر آلی و فاکتورهای رشد نیازمندند و میزان دقیق و متعادل بین این مواد بسته به نوع ریزسازواره و شرایط فیزیولوژیک مورد نظر تنظیم می­شود (Capalbo, 1995; Huang et al., 2007). تاکنون تحقیقات متعددی در خصوص بهینه­سازی  محیط های  کشت  بویژه منابع کربن و ازت و یافتن محیط­های کشت ارزان قیمت و قابل دسترس بمنظور افزایش تولید اسپور و کریستال Bt انجام گرفته است. باید توجه نمود که بر حسب نوع سویه و مواد اولیه به کار رفته در هر محیط کشت نتایج متفاوتی حاصل می شود (Brar et al., 2005a,b; Ouhib et al., 2006; Rao et al., 2007; Amin et al., 2008; Berbert-Molina et al., 2008).  تاکنون پساب­های صنایع غذایی (مانند آب پنیر و پرمیت)، انواع پساب­های شهری و خانگی و دکستروز به عنوان منابع کربن و ازت  در محیط های کشت به کار برده شده اند. علاوه بر این رشد باکتری و تولید کریستال نیاز به برخی املاح معدنی با غلظت خاص دارد  که می توان این نیاز را نیز از طریق منابع ارزان قیمت معدنی تامین نمود.  در انتخاب نوع منبع کربن،  ازت و نمک­های معدنی  در دسترس بودن، ارزان بودن و غنی بودن آن بسیار حائز اهمیت می‌باشد (Anderson and Jayaraman, 2003; Brar et al., 2005a,b; Berbert-Molina  et al., 2008; Wu et al., 2014). همچنین باید توجه نمود که تعادل در میزان ترکیبات مورد استفاده به عنوان منابع کربن، ازت و مواد معدنی بر روی تولید اندوتوکسین و همچنین میزان تولید پروتئازها که اثر منفی بر میزان اندوتوکسین تولیدی دارند، دارد (Ennouri et al., 2013).

علی رغم اهمیت بسیار زیاد باکتری Bt به عنوان سم حشره کش زیستی، متاسفانه در کشور ما در زمینه فرایند اقتصادی تولید این باکتری تحقیقات بسیار اندکی صورت گرفته است (Keshavarzi et al., 2005; Shojaaedini et al., 2010). در تحقیقات قبلی ما، تعداد 70 سویه بومی Bt که از مزارع مناطق مختلف کشور جداسازی شده بودند، از نظر ژنتیکی و خصوصیات حشره کشی مورد بررسی قرار گرفتند. شناسایی سویه ها بر اساس محتویات ژنی و نوع پروتئین­های کریستالی موجود در آنها صورت پذیرفت. همچنین احتمال وجود ژن ها و توالی های جدید در سویه ها بررسی گردید.  سپس بر اساس طبقه بندی ژنی و پروتئینی برای راسته پروانه­ای، سخت بال پوش و دوبالان دسته بندی شدند و زیست سنجی بر علیه حشراتی از قبیل سوسک برگخوار نارون، کرم غوزه پنبه و نماتدها صورت پذیرفت.  نهایتا از بین سویه های مورد مطالعه سه سویه موثر بر آفات به ترتیب پروانه ای، سخت بال پوش و نماتد ها انتخاب شدند (Salehi Jouzani et al., 2008 a,b; Nazarian et al., 2009; Seifinejad et al., 2008; Marzban and Salehi Jouzani, 2006). یکی از سویه­های منتخب، سویه YD5 بود که دارای محتویات ژنی متنوعی برای کنترل آفات پروانه­ای بود. این سویه حاوی ژن­هایی از قبیل  cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1C, cry1D, cry1F, cry1I, cry2Aa, vip3Aa بود که اکثریت آنها بر آفات پروانه ای موثر می باشند. همچنین این سویه در آزمایشات زیست سنجی در سطح آزمایشگاه اثرات آفت کشی بسیار خوبی بر علیه کرم غوزه پنبه نشان داده بود (کشندگی 100 درصد با LC50 حدود 141 نانوگرم بر سانتی متر مربع برگ پنبه) (Seifinejad et al., 2008).   در این راستا در تحقیق حاضر سعی شده است تا شرایط رشد یک سویه بومی موثر بر آفات پروانه­ای (YD5) بهینه­ سازی شود. بهینه­ سازی با استفاده از پسماندهای کشاورزی و غذایی ارزان قیمت و قابل دسترس در کشور و در سطح ارلن و فرمانتور انجام شد.

مواد و روشها

سویه  مورد استفاده

در این تحقیق، سویه بومیBt   به نام  YD5 که در تحقیقات قبلی تاثیر کشندگی آن بر آفات پروانه­ای مشخص شده بود، استفاده شد  (Salehi Jouzani et al., 2008a; Seifinejad et al., 2008). سویه‌ مورد استفاده در محیط کشت تجاری LB  حاوی 20٪ گلیسرول در دمای °C80 - نگهداری شد.

آزمون تعیین دما و اسیدیته بهینه سویه

دما و اسیدیته سویه نامبرده در محیط کشت مایع PGSM  تعیین شد. در آزمون­های مجزا میزان 200 میلی لیتر از محیط کشت استریل شده در سه تکرار و تلقیح شده به میزان 3 درصد حجمی با  محیط کشت حاوی مایه تلقیح باکتری تهیه شد. در بررسی دمای اپتیمم سه دمای 25، 30 و 35 درجه سلسیوس  در نظر گرفته شد. همچنین در بررسی اسیدیته بهینه، اسیدیته محیط­ها در دامنه 5/6، 7 و 5/7 تنظیم و مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان رشد باکتری در مدت 16 ساعت انکوباسیون بر روی شیکر 150 دور در دقیقه ارزیابی شد.      

بهینه سازی منبع کربن در بررسی کینتیک رشد سویه

از کربوهیدرات­های  گلوکز (به عنوان شاهد)٬ نشاسته (هیدرولیز شده بوسیله اسید کلریدریک در pH  2 و دمای  121 درجه سلسیوس به مدت 15 دقیقه)، ملاس (بریکس 66 و pH 9/4 ) و پرمیت شیر (لاکتوز حاصل از اولترافیلتراسیون شیر با بریکس 15،  لاکتوز 15% و pH 4/6) به عنوان منبع کربن  استفاده شد.  آماده سازی محیط کشت با توجه به میزان قند موجود در پساب و رقیق ‌سازی آن جهت تنظیم میزان درصد منبع کربن 5/1 درصد انجام شد. دیگر اجزای محیط کشت شامل عصاره مخمر به عنوان منبع ازت به میزان (2٪) و املاح معدنی بودند.

محیط‌های کشت به میزان 200 میلی لیتر درون ارلن مایر با 3 تکرار تهیه شدند. pH هر محیط بر اساس اسیدیته مناسب سویه (7) تنظیم شد و نمونه ها پس از استریل کردن در دمای 121 درجه و خنک شدن در دمای محیط به میزان 3 درصد از حجم کل محیط (6 میلی لیتر) با پیش کشت (دارای شرایط یکسان تلقیح شده) و سپس در دمای30 درجه سلسیوس درون شیکر انکوباتور با دور rpm 200 کشت داده شدند. در طی کشت سینتیک رشد باکتری در فواصل زمانی معین با برداشت میزان 10 میلی لیتر از محیط کشت بررسی شد. جهت اندازه‌گیری میزان رشد از تعیین دانسیته نوری بوسیله دستگاه اسپکتروفوتومتر در 600 نانومتر استفاده شد. بررسی میزان اسپور و پروتئین کل نیز پس از 72 ساعت انجام شد(Kraemer-Schafhalter and Moser, 1996).

بهینه سازی منبع ازت در بررسی کینتیک رشد سویه

از آب استیپ ذرت (Corn Steep Liquor) که یک منبع نیتروژنی بسیار ارزان و قابل دسترس می باشد به عنوان منبع ازت برای رشد سویه مورد مطالعه استفاده شد. بهترین منابع کربن شامل گلوکز و نشاسته هیدرولیز شده برای باکتری انتخاب شدند و آب استیپ ذرت به میزان 1، 2 و 3  درصد حجمی به آنها اضافه شد. میزان قند نیز با توجه به نتایج بهینه سازی منبع کربن و میزان املاح بر اساس مقدار مصرف قبلی در لیتر در نظر گرفته شد. هر تیمار در 3 تکرار انجام شد. بررسی کینتیک رشد باکتری طبق روش گفته شده در بالا انجام شد.  

استفاده از نمک دریا به عنوان منبع املاح جایگزین و بهینه سازی میزان آن

از نمک آب دریا (نمک مارین سالت، شرکت سرا (Sera)،  هینزبرگ، آلمان) به عنوان جایگزین املاح جهت کشت سویه مورد نظر به عنوان منبع املاح برای رشد Bt استفاده شد. به این منظور ابتدا نمک آب دریا به میزان 30 گرم  در لیتر در آب حل گردید (مشابه آب دریا) و کارایی غلظت­های مختلف آن شامل 3/0 ، 03/0 و 003/0 درصد  جهت رشد و تولید کریستال با نمک­هایی (محیط کشت GYS) که به طور معمول جهت کشت مورد استفاده قرار می گیرند مقایسه شد.  میزان قند 5/1 درصد و میزان عصاره مخمر 2 درصد در نظر گرفته شد و هر تیمار در 3 تکرار انجام شد. بررسی کینتیک رشد باکتری طبق روش های قبلی انجام شد.  

تعیین تعداد اسپور و میزان دلتا اندوتوکسین

جهت تعیین میزان اسپور از روش شمارش کلنی (CFU)  استفاده شد. ابتدا نمونه ها در دمای 80  درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه حرارت داده شدند و پس تهیه رقت های مناسب بر روی محیط کشت LB در دمای 30 درجه سلسیوس  به مدت16 ساعت کشت داده شدند. پس از پایان مدت انکوباسیون، تعداد کلنی تشکیل شده شمارش و میزان تولید اسپور با واحد CFU گزارش شد. جهت تعیین میزان تولید دلتا اندوتوکسین، ابتدا 1 میلی لیتر از محیط کشت حاوی اسپور و کریستال به مدت 10 دقیقه در 10000 دور در دقیقه سانتریوفیوژ شد و پلت تشکیل شده دو بار با محلول نمک 1 مولار و دو بار با آب مقطر شستشو داده شد. سپس پلت در 1 میلی لیتر محلول 50 میلی مولار هیدروکسید سدیم(5/12 pH=) سوسپانسیون شد و به مدت 2 ساعت  در دمای 30 درجه سلسیوس قرار داده شد. سپس میزان پروتئین کل سوپرناتانت به روش برادفورد اندازه‌گیری شد (Zouari et al., 2002).   

بهینه سازی شرایط رشد در فرمانتور غیر پیوسته

ترکیب نشاسته هیدرولیز شده (3 درصد)، آب استیپ ذرت (3 درصد حجمی) و نمک دریا با غلظت 003/0 درصد   برای رشد بهینه سویه در مراحل پیش کشت و کشت نهایی در فرمانتور مورد استفاده قرار گرفتند. برای هر فرمانتاسیون، 5/1 میلی لیتر از کشت فعال باکتری به 150 میلی لیتر محیط کشت تلقیح اضافه گردید. جهت تلقیح هر فرمانتاسیون از محیط کشت یکسان با محیط کشت اصلی فرمانتاسیون استفاده شد و به مدت 12 ساعت در گرمخانه همزن‌دار با دمای 30 درجه سلسیوس و سرعت چرخشی 200 دور بر دقیقه نگهداری ‌شد. کلیه فرایندهای فرمانتاسیون انجام شده جهت بررسی تاثیر پارامترهای رشد به حجم 5/1 لیتر، درون فرمانتور 2 لیتری(BIOFLO 2000, Newbruwnswick Scientific, USA)   بصورت ناپیوسته (بچ)، هوازی و با 3 بار تکرار انجام شدند. به این منظور٬ محیط کشت‌ در دمای ˚C121 به مدت 15 دقیقه درون مخزن  بیوراکتور تیمار حرارتی شدند. جهت تلقیح فرمانتاسیون 15، 30 و 45 میلی لیتر (درصدهای مختلف) از محیط کشت تلقیح به محیط درون فرمانتور (حجم نهایی 5/1 لیتر) اضافه شد. کلیه مراحل انتقال محیط کشت و تلقیح تحت شرایط استریل انجام شدند.

فرمانتاسیون برای سویه  در دمای 30 درجه سلسیوس٬ pH های مختلف ( 5/6، 7 و 5/7) و میزان اکسیژن مختلف 50، 70 و 90 درصد اشباع انجام شد. سرعت همزدن  نیز بصورت اتوماتیک بر اساس میزان اکسیژن تعیین شده بوسیله کنترل کننده اکسیژن بیوراکتور متغیر بود. کنترل دما نیز بصورت خودکار انجام شد و جهت کنترلpH  از اضافه کردن خودکار هیدروکسیدسدیم و اسید کلریدریک 2 نرمال استریل بوسیله پمپ­های پریستالتیک فرمانتور استفاده شد. همچنین کف تولیدی نیز از طریق افزودن اتوماتیک ضد کف سیلیکونی به محیط کشت کنترل شد و سرعت هوادهی نیز برابر VVM 1 در نظر گرفته شد. نمونه برداری نیز به صورت استریل و  در ساعت­های 2، 4، 6، 8، 12، 16، 20، 24، 48 و 72  انجام شد. سینتیک رشد باکتری در هر نمونه برداری و بررسی میزان تولید اسپور و اندوتوکسین نیز به روش اشاره شده در مراحل قبل انجام شد.

بررسی میزان درصد تلقیح و اثر غلظت اکسیژن

جهت بررسی تاثیر میزان درصد تلقیح برسینتیک رشد، میزان تلقیح اولیه  سویه 1، 2 و 3 درصد حجمی محیط کشت فرمانتور در نظر گرفته شد و تاثیر این میزان بر روی سینتیک رشد  سویه بررسی شد. جهت بررسی تاثیر غلظت اکسیژن محلول، غلظت اکسیژن محلول در سه سطح 50، 70 و 90٪  اشباع بر رشد و تولید  اسپور و کریستال مورد مطالعه قرار گرفت. به این منظور میزان هوای وروردی به بیوراکتور در VVM 1 ثابت در نظر گرفته شد و  میزان غلظت اکسیژن بوسیله تغییر دور همزدن در محدوده 100 الی 700 دور  بر دقیقه بصورت اتوماتیک تنظیم شد.

ارزیابی کینتیک رشد براساس Online OD در فرمانتور

جهت ارزیابی سینتیک رشد در  فرمانتور از اندازه گیری پیوسته و همزمان  OD660 محیط کشت بوسیله سنسور کدورت سنج مجهز به فیبر نوری (Turbidity transmitter, Trb 8300, Mettler-toledo) که درون محفظه بیوراکتور قرار داده شد، استفاده شد. داده­های حاصل از ترانسمیتر از طریق نرم افزار دستگاه ثبت و  جهت مشخص نمودن کینتیک رشد باکتری مورد استفاده قرار گرفتند. تجزیه تحلیل نتایج تحقیق از طریق مقایسه میانگین بر اساس آزمون دانکن (در سطح ا% و 5%) صورت پذیرفت.

نتایج و بحث

بر اساس آزمایشات تعیین دما و اسیدیته بهینه  رشد سویه YD5 ٬ دمای  مطلوب رشد  30 درجه سلسیوس  (شکل ا- الف) و اسیدیته مطلوب 7 بود (شکل 1- ب).  شکل 2 مقایسه سینتیک رشد سویه مورد مطالعه را در منابع کربنی مختلف و گلوکز به عنوان منبع شاهد ( محیط بهینه GYS) نشان می‌دهد. همانطور که در شکل نشان داده شده است کارایی منابع مختلف در رشد سویه متفاوت بوده است.

                                       الف                                   ب

شکل 1- میزان  رشد سویه YD5 در دما (الف) و اسیدیته های  (ب) مختلف.

Figure 1- The growth rate of the strain YD5 in different temperatures and pH.

شکل 2- سینتیک رشد سویه‌ YD5 در منابع کربنی مختلف.

Figure 2- The growth kinetics of the strain YD5 in different carbon sources.

نتایج آزمایشات نشان داد که سویه YD5 رشد خوبی را در منابع کربنی حاوی ساکارز (ملاس) و لاکتوز (پرمیت) ندارد ولی در محیط حاوی نشاسته هیدرولیز شده و گلوکز به خوبی رشد نمود. میزان تولید اسپور و اندوتوکسین  سویه مورد آزمون در منابع کربنی مختلف نیز در شکل 3 ارائه شده است. بیشترین میزان تولید اسپور و اندوتوکسین کاملاً با سینتیک رشد مطابق بوده و بهترین منبع کربنی اقتصادی برای سویه مذکور نشاسته هیدرولیز شده بوده است. نتایج بدست آمده  نشان می دهند که سویه مذکور  احتمالا  قادر است از منابع مختلف کربنی شامل منوساکارید، دی ساکارید و پلی‌ساکارید جهت رشد و تکثیر استفاده نماید  (Avignone-Rossa and Mignone, 1995).  بررسی مطالعات مشابه نیز نشان می‌دهد که  بطور کلی در مراحل اولیه بسیاری از آزمون های بهینه سازی قند گلوکز و عصاره مخمر به ترتیب به عنوان منابع تامین کربن و نیتروژن مورد استفاده قرار گرفته اند. ولی از آنجایی که هدف تولید انبوه بر اساس استفاده از ترکیبات ارزان قیمت تر می باشد، مطالعات گسترده‌ای جهت توسعه منابع جایگزین صورت گرفته است (Amin et al., 2008). به عنوان مثال در تحقیقی دو منبع کربن و ازت از طریق استفاده از نشاسته و سویا تامین شد.  نتایج تحقیق مذکور نشان داد که نشاسته به میزان 15 گرم در لیتر و سویا به مقدار 30 گرم در لیتر به میزان قابل توجهی تولید سلول زنده، میزان اسپور و پروتئین کریستال را افزایش داد (Ghribi et al., 2007a,b).

همانطور که در شکل 4 مشاهده می شود٬ میزان تولید اندوتوکسین و اسپور در سویه مورد مطالعه تحت تاثیر غلطت منبع کربنی بوده و بهترین درصد نشاسته هیدرولیز شده برای سویه  3 درصد شناخته شد. مطالعات دیگر نشان می‌دهند که این تاثیر با توجه به منابع کربنی مختلف متفاوت است. به عنوان مثال استفاده از غلظت­های بالای گلوکز و پوره جو باعث ایجاد محدودیت­ها در تولید این توکسین شده ولی هنگامیکه که از نشاسته به عنوان منبع کربنی استفاده شده است، غلظت­های بالای آن محدودیتی در تولید دلتا اندوتوکسین ایجاد نکرده است (Ghribi et al., 2007a).  همچنین منابع مختلف نشاسته، گلوکز، گلیسرول، لاکتوز، مالتوز، ساکارز، آرد ارزن، آرد نیشکر و کربوهیدرات­های فاضلاب­های شهری از دیگر منابع کربنی هستند که در بهینه سازی تولید Bt، اسپور و توکسین و نیز ارزیابی تولید آنزیم های مختلف آن در آزمون­های مجزا مورد استفاده قرار گرفته­اند (Avignone-Rossa et al., 1992; Ouhib et al., 2006; Adjalle et al., 2007; Rao et al., 2007; Amin et al., 2008; Khodair et al., 2008).

به­منظور بهینه سازی منبع ازت برای رشد سویه اشاره شده از آب استیپ ذرت استفاده گردید. با توجه به نتایج آزمون بهینه سازی منبع کربن، در این آزمون سینتیک رشد و کارایی ترکیب آب استیپ ذرت با  بهترین منبع کربن (نشاسته هیدرولیز شده)  با عصاره مخمر  مقایسه گردید (شکل 5). بررسی سینتیک رشد باکتری در محیط کشت حاوی آب استیپ ذرت نشان داد که سویه YD5 به  خوبی قادر است که از آب استیپ ذرت به عنوان منبع نیتروژن استفاده کند و نتایج سینتیک رشد در محیط حاوی این منبع ازتی در تطابق با منبع عصاره مخمر می باشد. احتمالا علت این امر غنی بودن آب استیپ از منابع نیتروژنی مانند اسیدهای آمینه و پروتئین های محلول می‌باشد (Liggett and Koffler, 1948). میزان تولید اسپور و همچنین اندوتوکسین توسط سویه مورد مطالعه در محیط حاوی آب استیپ و عصاره مخمر نیز تفاوت معنی داری نشان نداد (05/0 p≤ ) و میزان آنها به ترتیب 10⁹ ×5 اسپور در میلی لیتر و  700 میلی گرم در لیتر اندوتوکسین بود (داده ها نشان داده نشده است). سالاما و همکاران نیز نتایج مشابهی را گزارش کرده‌اند و آب استیپ ذرت به عنوان منبع مناسب نیتروژن جهت کشت باکتری Bt معرفی شده است  (Salama et al., 1983).

الف (A)

ب (B)

شکل 3- میزان تولید اسپور (الف) و اندوتوکسین  (ب) سویه  YD5در منابع کربنی مختلف.

Figure 3- The spore (A) and endotoxin (B) production of the strain in different carbon sources.

شکل 4- تاثیر غلظت های مختلف نشاسته هیدرولیز شده (منبع کربن) بر میزان تولید اسپور و توکسین توسط  سویه‌ مورد مطالعه

Figure 4- The effect of different concentrations of hydrolyzed starch (carbon source) on spore and endotoxin production rate of the strain.

شکل 5- مقایسه سینتیک رشد سویه در منبع آب استیپ ذرت و عصاره مخمر به عنوان منبع ازت.

Figure 5- Comparison of the growth kinetics of the strain in corn liquor and yeasts extract as nitrogen source.

همچنین با توجه به تاثیر غلظت منبع ازت بر روی رشد و تولید کریستال و اسپور، تاثیر غلظت درصد آب استیپ ذرت بر روی  فاکتورهای ذکر شده مورد بررسی قرار گرفت (شکل 6). با توجه به نتایج بدست آمده بهترین میزان آب استیپ ذرت برای سویه 3 درصد حجمی شناخته شد.  بطور کلی استفاده از عصاره مخمر به عنوان منبع ازت دارای بیشترین کاربرد در تحقیقات آزمایشگاهی بوده است ولی بدلیل گران بودن این منبع می بایست آن را با منابع ارزانتر مانند ضایعات کشاورزی و پساب­های صنعتی جایگزین کرد (Prabakaran et al., 2009). در تحقیقی، استفاده از ترکیب گلوکز ذرت 1 درصد به عنوان منبع کربن و آرد سویا 3 درصد به عنوان منبع ازت، منجر به تولید بیشترین مقدار اسپور و پروتئین کریستالی شد (Valicente and Mourao, 2008). پپتون، پودر سویا، پروتئین سویا  نیز به عنوان منابع ازت در تولید انبوه این باکتری مورد ارزیابی قرار گرفته اند. با توجه به اینکه در کشور ما سویا در سطح وسیع کشت نشده و وارداتی است دسترسی به آن مشکل بوده و فرآورده ها و ضایعات ذرت منابع مناسب تری به نظر می رسند.

به منظور بررسی امکان استفاده از نمک دریا به عنوان جایگزین نمک های معدنی تجاری مورد استفاده در تولید انبوه سویه های Bt، در این بررسی  از نمک آب دریا  با رقت های متفاوت به عنوان منبع املاح برای رشد سویه استفاده شد. آب دریا به طور  طبیعی و متوسط به میزان 30 گرم در لیتر از املاح معدنی تشکیل شده است و در این آزمون کارایی غلظت­های مختلف آن شامل 3/0، 03/0 و 003/0 درصد  با املاح معدنی بهینه که در سطح آزمایشگاهی و صنعتی جهت کشت باکتری Bt مورد استفاده قرار می گیرند٬ مقایسه شد.  در این آزمون نشاسته هیدرولیز شده (3 درصد) و آب استیپ 3 درصد به عنوان منابع کربن و نیتروژن استفاده شدند. جهت بررسی کارایی املاح آب دریا جهت رشد سویه­های مورد نظر، سینتیک رشد در محیط های ذکر شده بررسی شد.   نتایج حاصل این آزمون نشان داد که رقت 4 برابر برای سویه مورد مطالعه بیشترین میزان رشد را حاصل می کند اما در مقایسه با نمک های معدنی میزان رشد سویه مورد مطالعه کمتر بود (شکل 7).

شکل 6- تاثیر غلظت های مختلف آب استیپ ذرت بر میزان تولید اسپور و توکسین توسط  سویه‌ مورد مطالعه.

Figure 6- The effects of different concentrations of corn liquor on spore and endotoxin production rate of the strain.

شکل 7-  سینتیک رشد سویه در محیط کشت حاوی نمک دریا به عنوان منبع املاح معدنی.

Figure  7- The growth kinetics of the strain in the medium containing sea salt as mineral salt source.

مقایسه میزان تولید اسپور و اندوتوکسین سویه  YD5  در غلظت 003/0 درصد  نمک دریا به عنوان منبع با نمک­های معدنی نشان داد که میزان تولید اندو توکسین توسط سویه در دو محیط کشت حاوی آب دریا (550 میلی گرم در لیتر) و نمک­های معدنی (560 میلی گرم در لیتر) معنی دار نبود در حالیکه  میزان تولید اسپور در دو محیط معنی دار  بود (05/0 p≤ ) و میزان آن در محیط حاوی نمک دریا  10⁹ ×2/2   ولی در محیط حاوی نمک­های معدنی 10⁹ ×6/2 بود. در مطالعات دیگر نیز نتایج مشابهی ارائه شده است. به عنوان مثال در دو تحقیق مختلف ترکیبی از املاح معدنی مختلف به عنوان منبع املاح مورد استفاده قرار گرفتند (Zouri et al., 2002; Ghribi et al., 2007;). نمک دریا یکی از منابعی بود که برای تامین املاح در تولید انبوه این باکتری به عنوان منبعی ارزان قیمت مورد استفاده قرار گرفت و کارایی بالایی را در رشد و تولید توکسین نشان داد. جالب توجه آن  است که نمک دریا توانست فعالیت آنزیم­های پروتئولیتیک در محیط کشت را که باعث ناپایدار شدن توکسین تولید شده توسط باکتری می‌گردد کاهش دهد (Ghribi et al., 2007a). این تحقیق نشان داد نمک دریا تاثیر معنی داری در تولید توکسین این باکتری داشته است و می تواند به عنوان یک منبع بسیار ارزان قیمت در تولید انبوه Bt مورد استفاده قرار گیرد. همچنین نمک دریا در ترکیب با نشاسته باعث افزایش میزان CFU شد که نشان دهنده این است که حضور نمک دریا منجر به تحریک رشد یاکتری مورد مطالعه شده است. افزایش درصد نشاسته تا 10 درصد و نمک دریا تا 7 درصد باعث بالا رفتن کیفیت محصول تولید شده شد. لذا  آنها نتیجه گیری نمودند که ترکیب نشاسته، سویا و نمک دریا می تواند به شکل کارایی برای  تولید انبوه و ارزان قیمت اسپور و کریستال سویه­های  Bt  موثر بر دوبالان و پروانه ها استفاده شود (Ghribi et al., 2007a).

جهت بررسی تاثیر میزان درصد تلقیح برسینتیک رشد سویه در شرایط فرمانتور، میزان مایه تلقیح سویه به میزان 1، 2 و 3 درصد حجمی محیط کشت فرمانتور در نظر گرفته شد و تاثیر این میزان بر روی سینتیک رشد سویه بررسی شد. همانطور که در شکل 8 مشاهده می شود با افزایش درصد تلقیح، فاز تاخیری رشد سویه مورد مطالعه کاهش یافته ولی  میزان رشد افزایش پیدا کرده است.

شکل 8- سینتیک رشد سویه‌ در میزان تلقیح مختلف درون فرمانتور.

Figure 8- The growth kinetics of the strain in different preculture concentrations in the fermentor.

علاوه‌ براین، افزایش میزان مایه تلقیح از 2 به 3 درصد باعث تاثیر مثبت ناچیزی در رشد شده است (05/0≤ P). عموماً افزایش درصد مایه تلقیح تا حدی موجب ارتقاء رشد میکروارگانیسم می‌شود، به عبارتی دیگر مقدار کم مایه تلقیح منجر به تعداد کم سلول‌ها در محیط کشت می‌شود. درحالی که افزایش بیشتر نیز به دلیل محدودیت منابع غذایی باعث کاهش فعالیت ریزسازواره‌ها خواهد شد. گزارش‌های مختلفی بر تأثیر بسیار مهم عوامل محیطی ازجمله درصد مایه تلقیح در تولید اسپور و کریستال تأکید دارند (Kraemer-Schafhalter and Moser, 1996; Yezza et al., 2004) .

شکل 9 تاثیر درصد تلقیح بر تولید اسپور و اندوتوکسین را نشان می دهد. همانطور که مشاهده می‌شود در مورد سویه افزایش درصد تلقیح از 2 به 3 درصد تأثیر معنی‌داری را بر تولید اسپور و اندوتوکسین نشان نمی دهد( 05/0≤ P). لذا با ملاحظه عامل صرفه اقتصادی مقدار 2٪ تلقیح به عنوان درصد بهینه مایه تلقیح جهت هر دو سویه درنظر‌گرفته شد.

در بررسی pH  بهینه، pH  محیط­ها در دامنه 5/6، 7 و 5/7  به طور اتوماتیک تنظیم و تاثیر آن بر میزان رشد و سینتیک رشد سویه مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که pH بهینه محیط کشت برای رشد سویه  7 می باشد (شکل 10). نتایج بدست آمده در این تحقیق با نتایج محققین دیگر که نشان دادند در شرایط فرمنتاسیون جامد (Solid state) برای تولید مناسب اسپور و کریستال سویه Bt مورد تحقیق، بهترین pH  در شروع کشت بین 5 تا 7/5 می باشد و با افزایش pH  میزان رشد سویه مذکور کاهش می یابد تا حدودی اختلاف دارد (Foda et al., 2002). شاید این موضوع به ماهیت و نوع سویه  بر می گردد. 

همچنین نتایج حاصل از تولید اسپور و اندوتوکسین پیش از پایان فرمانتاسیون نیز با نتایج حاصل از رشد همخوانی داشت و بیشترین میزان تولید اسپور و کریستال در pH بهینه رشد بدست آمد (شکل 11). علاوه­ بر این بررسی روند تغییرات pH و مصرف اسید و باز نشان داد که در ابتدای فرمانتاسیون و همراه با آغاز رشد pH محیط کاهش یافته و پس از فاز لگاریتمی رشد pH افزایش می‌یابد.

الف (A)

ب (B)

       شکل 9- میزان تولید اسپور (الف) و توکسین (ب) توسط  سویه‌ در میزان تلقیح مختلف.

Figure 9- The spore (A) and endotoxin (B) production by the strain when at different preculture concentrations. 

شکل 10- سینتیک رشد سویه‌ در pH های مختلف درون فرمانتور.

Figure 10- The growth kinetics of the strain in different pHs at fermentor level.

                            الف (A)                                           ب (B)

  شکل 11- میزان تولید توکسین (الف) و اسپور (ب) توسط  سویه‌ مورد مطالعه در میزان pH های مختلف.

Figure 11- The endotoxin (A) and spore (B) production rate by the strain in different pHs at fermentor level.

با توجه به اینکه رشد و تولید اسپور و کریستال در باکتری Bt طی یک فرآیند تخمیر هوازی صورت می‌گیرد، تأمین مقدار کافی اکسیژن محلول طی فرآیند تولید اهمیت دارد. از جمله عملکردهای مهم  بیوراکتور تأمین مقدار کافی اکسیژن محلول برای رفع نیاز ریزسازواره می‌باشد. با توجه به اینکه درصد اکسیژن محلول طی فرآیند به‌ واسطه تنظیم سرعت هم‌زن کنترل می‌شود و شدت هوادهی در طی دوره تخمیر ثابت بود، الگوی مصرف اکسیژن به صورت سرعت هم‌زن نشان داد که افزایش تقاضای اکسیژن طی 4 تا 8 ساعت پس از تلقیح در دو تیمار 50 و 70٪ اکسیژن محلول و 2 تا 12 ساعت در مورد تیمار سوم (90٪) رخ داد و به هنگام تولید اسپور و اندوتوکسین  سرعت هم‌زن در تمامی سطوح اکسیژن روند کاهشی را پشت‌ سر گذاشت. اگرچه شدت کاهش در طی زمان و البته در سطوح مختلف اکسیژن محلول متفاوت بود.

شکل 12 سینتیک رشد سویه را تحت غلظت­های مختلف اکسیژن نشان می دهد. با افزایش میزان غلظت اکسیژن میزان رشد نیز افزایش می‌یابد که با توجه به ماهیت فیزیولوژیک  باکتری باسیلوس افزایش رشد کاملاً توجیه پذیر است (Holmberg et al., 1980; Avignone-Rossa and Mignone, 1995; Kraemer-Schafhalter and Moser, 1996).

مقایسه بین میزان تولید اسپور و اندوتوکسین سویه بین سه سطح اکسیژن محلول مورد بررسی در این مطالعه در شکل 13 ارائه شده است. افزایش غلظت اکسیژن در کشت سویه YD5 باعث افزایش تولید اسپور و پروتئین شده است. مطالعات گذشته نیز نشان داده است  که میزان اشباع اکسیژن در طول فرآیند بر میزان رشد و نمو سلولی و همچنین تولید نهایی اسپور و کریستال نقش بسزایی دارد و بسته به نوع محتویات محیط کشت میزان مطلوب اکسیژن دهی متفاوت می باشد. از طرف دیگر میزان تاثیر اکسیژن بر حسب نوع سویه و محیط کشت مورد استفاده متفاوت بوده و میزان مصرف اکسیژن در حین تولید اسپور و اندوتوکسین کاهش  می­یابد (Wu et al., 2002; Ghribi et al., 2007b).

در نهایت می توان نتیجه گیری نمود که در تحقیق حاضر شرایط رشد یک سویه بومی شامل  اسیدیته (pH 7)٬  دما (30 درجه سلسیوس)٬ محیط کشت اقتصادی مبتنی بر ترکیبات ارزان قیمت (شامل  ترکیب نشاسته هیدرولیز شده (3 درصد)، آب استیپ ذرت (3 درصد) و نمک دریا (003/0 درصد) و شرایط فرمنتاسیون (شامل میزان تلقیح اولیه (2 درصد) و غلظت اکسیژن اشباع (90 درصد) بهینه سازی شد که منجر به تولید بالاترین میزان  اسپور (10⁹ × 5/5 اسپور در میلی لیتر) و دلتا اندوتوکسین (740 میلی‌گرم پروتئین در میلی‌لیتر)  شد.  

سپاسگزاری

این تحقیق در قالب یک پروژه تحقیقاتی مورد حمایت پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران به شماره 85004-8512-05-140000-013-2 انجام شد. نویسندگان مقاله از کلیه همکاران بخش تحقیقات بیوتکنولوژی میکروبی و ایمنی زیستی پژوهشکده بخاطر همکاری های فنی طی اجرای تحقیق تشکر و قدردانی می نمایند.