تعیین تنوع ژنتیکی ارقام گلابی با استفاده از نشانگرهای ISSR

تعیین تنوع ژنتیکی ارقام گلابی با استفاده از نشانگرهای ISSR

مریم صفرپور شورباخلو¹، روح اله حسینی منفرد² سولماز پایدار¹، مستانه شریفی*[1]

¹ کارشناس مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی فارس

² دانشجوی کارشناس ارشد دانشگاه آزاد اسلامی واحد ارسنجان

تاریخ دریافت: 03/12/1392، تاریخ پذیرش: 16/04/1393

چکیده

ایران با نزدیکی به مراکز تنوع گلابی و نیز دارا بودن بیش از ده گونه از جنس Pyrus به عنوان یکی از مهم‌ترین منابع ژنتیکی گلابی در دنیا شناخته‌شده است. از طرف دیگر، کشور ایران با 17000 هکتار سطح  زیر کشت، یکی از مراکز تولید گلابی محسوب می شود. با وجود موقعیت ممتاز جغرافیایی، هنوز اطلاعات دقیقی از روابط بین ژنوتیپ‌های مختلف گلابی در ایران وجود ندارد و مشخص نیست چه نسبت ژنتیکی بین  ارقام بومی ایرانی با ارقام تجارتی وارداتی وجود دارد. در این تحقیق به منظور گروه‌بندی 10 ژنوتیپ گلابی ایرانی و تعیین موقعیت ژنتیکی آن ها در بین13 رقم وارداتی، از تکنیک مبتنی بر ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) استفاده شد. پانزده آغازگر ISSR به کار رفته، در مجموع 257 باند تکثیر نمود که 213 باند دارای چندشکلی (سطح چندشکلی 6/81 درصد) بود. دندروگرام ژنوتیپ های گلابی مورد استفاده در این تحقیق با الگوهای باندی ISSR با استفاده از ضریب تشابه دایس و روش UPGMA با نرم افزار NTSYS V. Pc-2.02e، ‌رسم شد. گلابی های مورد بررسی در سه دسته مجزا قرار گرفتند. در گروه اول کنفرنس، محمدعلی، سردرودی، بارتلت، ردبارتلت، هراسویت، پاس‌کراسان، دوین دوکومیس، آنجو، فلسطینی، لوئیس‌بن، دوشس و دره‌گزی، در گروه دوم کولی خوج، خوج لب ترش، خوج کته سر، دم کج، سبری، خوج مرداب انزلی و شاه‌میوه و در گروه سومSK10 و SK13 قرار گرفتند. ارقام براساس خاستگاه جغرافیایی طبقه بندی گردید و ارقام متعلق به P. communis و P. pyrifolia کاملاً از هم جدا شدند. ارقام ایرانی تجارتی دم کج، شاه میوه و سبری همراه با خوج‌ها در یک دسته قرار گرفتند که به نظر می‌رسد از خوج‌ها منشأ گرفته باشند در حالی که سه رقم محمدعلی، دره گزی و سردرودی نزدیکی بیشتری به ارقام اروپایی نشان دادند و احتمالاً منشأ متفاوتی از خوج ها داشته و با ارقام اروپایی اجداد مشترکی دارند. نتایج این بررسی کارامد بودن نشانگر ISSR برای انگشت‌نگاری ارقام گلابی را اثبات می نماید.

کلمات کلیدی: گلابی، تنوع ژنتیکی،  نشانگر ISSR.

مقدمه

در دهه های اخیر تنوع زیستی، به عنوان ماده خام و دستمایه اصلی اصلاح گران برای تولید فرآورده های زیستی، توجه پژوهشگران زیادی را به خود جلب کرده است. بنابراین، به موازات گسترش فنون روش های زیست فن آوری به عنوان سرمایه و ثروتی که روز به روز ارزش بیشتری می یابد، باید در رأس اولویت های تحقیقات قرار گیرد (Vejdani,1997).

درخت گلابی که از دوران قبل از تاریخ به سبب حضور طبیعی در فلات ایران مورد توجه مردم این سرزمین قرار گرفته است، از جنس Pyrus، عضوی از زیرخانواده Pomoideae و خانواده Rosaceae است. در این جنس 22 گونه اولیه بومی اروپا، آسیا و مناطق کوهستانی شمال آفریقا، شش هیبرید بین گونه ای طبیعی و حداقل سه هیبرید مصنوعی قرار دارند (Bell, 1990). تقریباً همه گونه‌های Pyrus دیپلوییدهایی با 17 جفت کروموزوم (342n=) هستند و به دلیل آن که به طور گامتوفیتی خودناسازگار[2] می باشند، تنوع بالایی در این جنس وجود دارد
 (Bell & Hought, 1986).

ارقام گلابی را به دو تیپ شرقی[3] (شرق دور) و اروپایی تقسیم می کنند. ارقام شرقی که با نام گلابی آسیایی یا با اسم ژاپنی nashi شناخته شده­اند، در چین و ژاپن کشت می­گردند و در بیرون از آسیا به ندرت دیده می­شوند. مشخصه عمده آنها بافت ترد و مزه شیرین است و مانند سیب روی شاخه می رسند. گونه مهم اقتصادی این دسته P. pyrifolia می­باشد (Bell, 1990). تیپ دوم گلابی‌های اروپایی هستند. ترکیب بافت کره مانند با مزه و عطر خوشایند از خصوصیات این دسته می‌باشد. گونه مهم اقتصادی این گروه P. communis می­باشد که تقریباً %90 واریته های گلابی کشت شده در دنیا را شامل می‌شود
(Atar, 2001)

کمبود جمعیت های وحشی اجدادی به خصوص در گونه های بسیار کشت شده امروزی، محدود بودن تنوع مورفولوژیکی بین ارقام و گونه‌ها، نبود خصوصیات متمایز کننده بین گونه ها و نیز تلاقی وسیع بین گونه ای[4] که سبب بوجود آمدن ارقام و حتی گونه های وحشی با خصوصیات بینابینی شده است، عواملی هستند که دسته بندی گلابی ها را مشکل ساخته‌اند
 (Iketani et al., 1998). گرچه خصوصیات مورفولوژیکی و تجزیه تحلیل‌های آیزوزایمی دو روش مهم برای بررسی تنوع ژنتیکی داخل جنس Pyrus بوده است، ولی به دلیل محدودیت نشانگرهای مورفولوژیکی و آیزوزایمی، اعتبار دسته بندی ارقام گلابی با چنین روش‌هایی مورد تردید می­باشد. به همین جهت در سال‌های اخیر استفاده از روش‌های ملکولی برای تعیین مشخصات ژنتیکی گونه و ارقام گلابی توجه بیشتری را جلب کرده است
 (Yamamoto et al., 2001 a,b; Wünsch & Hormaza, 2007) در ارزیابی تنوع ژنتیکی گلابی به طور وسیعی نشانگرهای RAPD (JianXin et al., 2004; Sharifani & Jackson, 2000; Ye et al, 1996 ;Wang & Dolatowski et al 2004.)، AFLP (Monta–Corvo et al., 2000)، SSR (Inoue et al., 2007; Ghosh et al., 2006; Fernández-Fernandez et al., 2006; Bassil, et al,. 2005 & 2004) و ISSR (Monte-Corro et al., 2002 &2001) مورد استفاده قرار گرفته­اند. در میان این نشانگرها، استفاده از نشانگر ISSR به چندین دلیل توصیه می­شود. تکنیک ISSR برخلاف SSR، به اطلاعات قبلی از توالی DNA نیاز ندارد و آغازگرهای طراحی شده دارای حقوق انحصاری نیستند. به همین دلیل هزینه اولیه برای تعیین توالی آغازگرهای ISSR پایین است (Chenneaui-Kourda et al., 2007). کار با ISSR آسان و سریع می باشد و چندشکلی بالایی نشان می­دهد (Wünsch & Hormaza 2002). محصولات تکثیر شده معمولاً 200 تا 2000 جفت باز طول دارند و با دو روش الکتروفورز آگاروز و اکریل‌آمید قابل بررسی هستند و نیاز به استفاده از مواد رادیواکتیو ندارد
((Branchard & Bornat, 2001. به سبب استفاده از آغازگرهای بلند (16 تا 25 مری) در مقایسه با آغازگرهای RAPD (10 مری)، تکرارپذیری ISSR بسیار بالا است (Wünsch & Hormaza, 2007).

برتری ISSR  نسبت به برخی تکنیک­های مولکولی دیگر در دامنه وسیعی از گونه­های گیاهی مانند برنج، گندم و سیب زمینی شیرین[5] گزارش شده است et al., 2002) .(Reddy در بررسی تنوع ژرم پلاسم Poncirus trifoliata  مزیت ISSR نسبت به RFLP و RAPD مشخص شد و همچنین در جنس Eleusine کیفیت و کمیت داده های بدست آمده از ISSR به RFLP و RAPD ارجحیت داشت (Reddy et al., 2002).

شناسایی ارقام Eucalyptus grandis توسط ISSR نشان داد که این نشانگر یک روش ارزان و سریع برای دسته بندی مناسب ارقام است (Mezzena et al., 2001). کارایی نشانگر ISSR در ژنوتیب های مهم سپیدار Jianming et al.,) 2006 (، سیب ( (Goulão & Oliveira, 2001 و Bitter gourd (Momordica charantia) (Singh et al., 2007) نیز نشان داده شده است.

در پژوهشی که با 30 واریته توت فرنگی از مناطق جغرافیایی مختلف انجام شد، نشان داده شد که این تکنیک نیاز به DNA با کیفیت بالا ندارد و در مقایسه با نتایج حاصل از AFLP، ارزان­تر، سریع­تر و قابل اعتمادتر می­باشد (Arnaud et al., 2000).

استفاده از نشانگر ISSR در گونه های Pyrus هم گزارش شده است. در یک تحقیق که از نتایج RAPD، AFLP و ISSR در شناسایی ارقام  P. communis استفاده شده بود، شاخص مرغوبیت[6] در ISSR (81/8) خیلی بالاتر از RAPD (06/2) بود و بیست و چهار رقم مورد آزمون را به خوبی دسته بندی کرد (Monte-Corro et al., 2002).

هشت آغازگر ISSR برای شناسایی ارقام گلابی اروپایی به کار رفته است. از 337 باند تولید شده %5/79 چندشکلی داشت Monte-Corro et al., 2001)). در تحقیقی برای شناسایی ارقام گلابی آسیایی از 16 آغازگر ISSR استفاده شد. چهل و چهار قطعه حاصل شد که ارقام مورد نظر را به خوبی از هم جدا می کرد. نتایج این تحقیق نشان داد، نشانگر ISSR در مقایسه با نشانگر RAPD چندشکلی بالاتری ایجاد می­کند .(Wang & Shih 2004)

مطالعه ژرم‌پلاسم گلابی با آگاهی از این که این میوه از نظر اقتصادی سومین میوه مهم منطقه معتدله پس از سیب و انگور است، ضروری به نظر می رسد. در سال های گذشته میراث ژنتیکی این جنس به سبب نابودی ارقام محلی، رو به فرسایش گذاشته است (Olivera et al., 1999). تولید گلابی دنیای امروز به تعداد محدودی از ارقام مانند ویلیامز، آنجو، بوره بوسک، کنفرنس و پاس کراسان وابسته است، که همگی در قرن 18 و 19 انتخاب شده اند. به همین دلیل نیاز مبرمی به مدیریت ژرم‌پلاسم و شناسایی واریته­های حفاظت شده گلابی برای بدست آوردن سطح کافی سرمایه ژنتیکی در برنامه‌های اصلاحی وجود دارد Wünsch & Hormaza 2007)).

کشور ما با سطح کشتی معادل 17000 هکتار و با عملکرد 114706 کیلوگرم در هکتار یکی از مراکز تولید گلابی محسوب می‌شود. ضمنا این کشور به سبب نزدیکی به مراکز تنوع گلابی و دارا بودن بیش از ده گونه از جنس Pyrus، به عنوان یکی از مهم‌ترین منابع ژنتیکی گلابی دنیا شناخته شده است .(Maniee, 1995) گونه‌های متعدد گلابی در دامنه های البرز و زاگرس، جلگه‌های پست ساحلی کنار دریای خزر، در استان های آذربایجان شرقی و غربی، کردستان، لرستان، کوه های بختیاری، منطقه طوالیش گیلان، مازندران، گرگان و همچنین در کوهستان های استان فارس پراکنده هستند (Sabeti, 2002). علی­رغم این موقعیت ممتاز جغرافیایی برای گلابی در ایران، هنوز اطلاعات دقیقی از روابط ژنتیکی بین ژنوتیپ‌های مختلف گلابی در ایران وجود ندارد و مشخص نیست ارقام بومی ایرانی چه نسبت شجره‌ای با ارقام تجارتی وارداتی دارند. کسب اطلاعات کافی در این زمینه می‌تواند به مدیریت صحیح این منابع ارزشمند ژنتیکی برای جلوگیری از انقراض ژرم‌پلاسم‌ها و بهره‌برداری مناسب از ژنوتیپ‌های محلی برای اهداف اصلاحی گلابی کمک نماید.

کسب اطلاعات کافی در این زمینه می‌تواند به بهره‌برداری مناسب از ژنوتیپ‌های محلی برای اهداف اصلاحی گلابی منجر شود. به علاوه، این اطلاعات به یافتن منشأ جغرافیایی برخی ارقام تجاری کشور که نیای ژنتیکی آنها مشخص نیست، کمک می کند. در هر حال برای برنامه ریزی در اصلاح ژنوتیپ‌های گلابی، داشتن اطلاعات کافی از زمینه ژنتیکی هر رقم و تعیین موقعیت فیلوژنتیکی ارقام نسبت به یکدیگر اهمیت اساسی دارد. ضمنا گاهی ارقامی مشابه با نام­های محلی متفاوت خوانده می شوند. مقایسه ارقام ایرانی با ارقام خارجی امکان شناسایی چنین اشتباهاتی را فراهم می کند. ضمن این که مشخص می­کند ارقام ایرانی چه نسبت ژنتیکی با ارقام تجارتی وارداتی دارند و آیا آنقدر زمینه ژنتیکی متفاوتی دارند که ارزش بررسی برای ژن های جدید (ژن های مقاومت به بیماری­ها و یا تنش­ها) در برنامه های اصلاحی را داشته باشند.

چون در مطالعات ژنتیکی انجام شده روی گلابی و سایر گیاهان توسط پژوهش‌گران دیگر، کارایی نشانگرهای ISSR به اثبات رسیده بود، لذا این نشانگرها برای تأمین اهداف این پژوهش، تعیین روابط فیلوژنتیکی ارقام گلابی ایران و مقایسه آنها با ارقام خارجی، انتخاب گردیدند.

مواد و روش‌ها

نمونه های برگ گلابی شامل 13 رقم خارجی و 10 رقم ایرانی (جدول 1)، از مؤسسه اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج جمع آوری شدند. نمونه­های انتخابی از میان ژنوتیپ هایی بود که کشت آنها مرسوم است. به علاوه چند ژنوتیپ وحشی جهت بررسی منشا ارقام تجاری استفاده گردید. نمونه های برگی بعد از انجماد سریع با نیتروژن مایع، تا زمان انجام استخراج DNA ژنومی در فریزر 80- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

استخراج DNA از برگ های جوان گلابی با روش  Murray and Thompson, 1980) ) انجام گرفت. برای تعیین کمیت و کیفیت DNA از روش الکتروفورز پنج میکرولیتر از  DNA‌به دست آمده در ژل آگاروز %7/0 در بافر TAE[7] (حاوی 10 میلی مولار تریس، 5/0 میلی مولار اتیلن دی آمین تترا استیک اسید و 5 میلی مولار استات سدیم) و مقایسه تراکم باند آن با مقدار استاندارد قطعات نشانگر III (λDNA برش یافته با آنزیم‌‌های برشی EcoRI و Hind III) استفاده شد.

آغازگرهای ISSR مورد استفاده در این تحقیق توسط شرکت Metabion International (Germany) سنتز شد. در جدول 2 توالی این آغازگرها به همراه دمای اتصال مناسب برای هر آغازگر آورده شده است. آغازگرها طبق دستور شرکت تولیدکننده تا غلظت pmol/µL10 رقیق گردید. با استفاده از PCR گرادیانت تکثیر آغازگرها در سه دمای اتصال مختلف بررسی گردید و دمای مناسب انتخاب شد که در جدول 2 مشاهده می­شود.

واکنش PCR برای نمونه‌ها در حجم 15 میکرولیتر شامل 5/1 میکرولیتر بافر X10 (حاوی کلریدمنیزیم 5/1 میلی مولار)، 3/0 میکرولیتر  Taq DNA Polymerase (1 واحد)، 5/1 میکرولیتر از هر آغازگر (با غلظت pmol/µL10)، 3/0 میکرولیتر dNTPs (2/0 میلی مولار) و 75 نانوگرم DNA ژنومی از هر نمونه تهیه شد.

جدول 1- ارقام گلابی مورد استفاده در تحقیق (ارقام خوج کته سر، خوج مرداب انزلی، کولی خوج وخوج لب ترش جزو ارقام وحشی می باشند. سایر ارقام تجاری هستند).

Table 1- Pear varieties used in study (Khuj katesar, KoliKhuj, Khuj mordab anzali and Khuj labtorsh accessions are Wild genotypes and other cultivars are commercial).

جدول 2- آغازگرهای ISSR استفاده شده در تحقیق.

Table 2- ISSR primers used in study.

Y = T یا C                       D = A یا G یا T                               H = A یا C یا T

R = A یا G                      B = G یا C یا T                                 V = A یا C یا G

پس از اضافه کردن یک قطره روغن معدنی استریل به هر نمونه، لوله‌ها در دستگاه ترموسایکلر (gradient-Maste cycler Eppendorf) قرار گرفتند که در آن آنجام واکنش PCR به صورت یک چرخه واسرشت سازی[8] اولیه در 94 درجه سانتی گراد به مدت دو دقیقه، 33 چرخه شامل واسرشت سازی ثانویه در 94 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگرها[9] به رشته DNA در دمای بهینه شده برای هر آغازگر (جدول 2) به مدت 45 ثانیه و تکثیر قطعات[10] DNA در دمای 72  درجه سانتی گراد به مدت 100 ثانیه و نیز یک چرخه تکثیر نهایی در 72 درجه سانتی گراد به مدت پنج دقیقه، برنامه ریزی شد.

مقدار 6 میکرولیتر از محصول PCR با مقدار 2 میکرولیتر از بافر بارگذاری[11] مخلوط شد. مقدار پنج میکرولیتر از آن در یک چاهک ژل آگارز 2 درصد در بافر TBE (حاوی 90 میلی مولار تریس، 90 میلی مولار اسید بوریک و دو میلی مولار اتیلن دی آمین تترااستیک اسید) بار گذاری شد. سه میکرولیتر نشانگر اندازه 50 (از شرکت Fermentas) نیز به عنوان نشانگر جهت تخمین اندازه قطعات DNA تکثیر شده تزریق شد و به مدت 8 ساعت با ولتاژ 80 الکتروفورز گردید. جهت نمایان کردن قطعات DNA در ژل، از رنگ آمیزی به روش اتیدیوم بروماید[12] (mg/L 5/0) استفاده شد.

وجود یا عدم وجود باندها با اعداد یک و صفر برای هر رقم مشخص شد. داده های گم شده با عدد 9 رتبه­دهی گردید. به دلیل ماهیت غالب نشانگرهای ISSR از نرم افزار V.Pc-2.02e NTSYS برای رسم درخت فیلوژنتیکی استفاده گردید. تجزیه و تحلیل داده ها شامل تشکیل ماتریس تشابه، تجزیه خوشه انجام شد. همچنین با استفاده از این نرم افزاز پارامتر محتوای اطلاعات چندشکلی[13](PIC) محاسبه شد. مقادیر  PIC  بر پایه رابطه PIC = 1-∑ⁿ_j P_ij ² محاسبه گردید (Roldan-Ruize et al., 2000)، که در آن pij فراوانی الگوی j برای نشانگر i است که برای n الگو جمع زده می­شود. همچنین ضریب همبستگی کوفنتیک محاسبه و آزمون مانتل (Mantel, 1967) برای ارزیابی همبستگی بین ماتریسهای تشابه و دندروگرام نهایی، بر پایه ضریب تشابه جاکارد، دایس و تطابق ساده انجام شد. درنهایت دندروگرام به دست آمده از گروه­بندی نمونه ها، بر اساس روش دایس و  روش اتصال میانگین[14] (UPGMA) تهیه شد.

نتایج و بحث

پانزده آغازگر ISSR به کار رفته توانستند در همه 23 رقم گلابی مطالعه شده، به جز موتانت­ها، تکثیر قابل تشخیصی داشته باشند. در کل 257 باند مشاهده شد که 6/81 درصد آن­ها، یعنی 213 باند، چند شکلی نشان دادند. درجه چند شکلی به دست آمده بالاتر از درصد چند شکلی حاصل از RAPD (%74) و AFLP (%75) در مطالعه 25 رقم گلابی بود et al., 2000)  (Monta–Corvo. چنین به نظر می‌رسد نشانگر ISSR‌ چندشکلی بالاتری از این دو نشانگر ایجاد می‌کند. به علاوه، چندشکلی حاصل طبیعت خود ناسازگار گلابی را نیز اثبات می‌نماید.

نتایج به دست آمده از هر آغازگر در جدول 3 خلاصه شده است. تعداد باندهای چند شکلی از 5 باند در نشانگر 5(GATA) تا 21 باند چندشکل در نشانگرهای 8YA(AC) و HBH(CT)7 متغیر بود. به این ترتیب متوسط آلل‌های تولیدشده برای هر آغازگر 2/14 باند چندشکل بود. محدوده قطعات تکثیر شده از 200 تا 1400 جفت باز بود. الگوی تکثیر دو آغازگر (GA)8YC و (CA)8GT به عنوان مثال در شکل‌های 1 و 2 نشان داده شده است.

جدول 3- لیست آغازگرهای ISSR مورد استفاده در این تحقیق.

Table 3- The name of ISSR primers used in study.

شکل 1- الگوی باندی ISSR حاصل از تکثیرآغازگر (CA)8GT روی ارقام مختلف گلابی )ژل آگاروز دو درصد، رنگ آمیزی اتیدیوم برماید).

Figure 1- ISSR band- pattern of pear genotypes analyzed with the (CA)8GT marker (Ethidium bromide-stained  2% agarose gel).

شکل 2- الگوی باندی ISSR حاصل از تکثیر آغازگر(GA)8YC  روی ارقام مختلف گلابی (ژل آگارز 2 درصد، رنگ آمیزی اتیدیوم برماید).

M: نشانگر اندازه جفت بازی100، 1-کنفرنس، 2-دوشس، 3-لوئیس بن، 4-SK10، 5-آبت فتال، 6-بارتلت، 7-ردبارتلت، 8-پاس‌کراسان، 9-دوین دوکومیس، 10-آنجو، 11-SK13 ، 12-هراسویت، 13- فلسطینی، 14-سردرودی، 15-محمدعلی، 16-دره‌گزی، 17-سبری، 18-دم کج، 19-خوج مرداب انزلی، 20-خوج لب ترش، 21-شاه میوه، 22-خوج کته‌سر، 23-کولی‌خوج.

Figure 1- ISSR band- pattern of pear genotypes analyzed with the (GA)8YC marker (Ethidium bromide-stained  2% agarose gel).

M: 100 bp DNA Ladder. 1—Conference, 2- Duchesse, 3- Lies Bonne, 4- SK10-4, 5- Abate Fetel, 6- Bartlett,7- Red Bartlett, 8- Pass Crassane, 9- Doyenneducomice, 10- Anjou, 11- SK13, 12- Harrow Sweet, 13- Palestine, 14- Sardrood, 15- Mohammad Ali, 16- Daregazi, 17- Sebri, 18- Dom Kaj, 19- Khuj mordab anzali, 20- Khuj labtorsh, 21- Shah miveh, 22- Khuj katesar, 23- KoliKhuj.   

مطالعات نشان می‌دهد آغازگر های ISSR دارای تکرار های AG ،GA ،CT ،TC ،AC ،CA چند شکلی بالاتری از سایر تکرار های دی، تری و تترانوکلئوتیدی نشان می­دهند
et al., 2002) (Reddy. نتایج به دست آمده در این تحقیق نیز با این فرضیه مطابقت داشت. به طوری که آغازگرهای (AC)8YA و HBH(CT)7 با تولید 21 باند چندشکل بیشترین چندشکلی را نشان دادند. همان طور که انتظار می‌رفت، آغازگرهای فاقد باز اضافی تری و تترا نوکلئوتیدی (TCT)6، (GATA)5 و (AGTG)4 کمترین میزان باندهای چند شکل (متوسط هفت) را تولید نمودند. زیرا این تکرار ها در طول ژنوم به نسبت تکرار های دی نوکلئوتیدی کمتر دیده می‌شوند و استفاده از آنها در نشانگرهایISSR  کم اهمیت تر از دی نوکلئوتید ها است (Katti et al., 2001). در مطالعه دیگری که روی 24 رقم گلابی با استفاده از نشانگر ISSR انجام شده بود، ثابت شد که آغازگرهای حاوی تکرارهای دی نوکلئوتیدی از آغازگرهای حاوی تکرارهای تری، تترا و پنتانوکلئوتیدی بازده بیشتری دارند و استفاده از آنها بیشتر توصیه شده است
et al., 2001) (Monte-corvo. مطالعه ای هم که روی برنج (Oryza sative) انجام گرفت همین نتایج را اثبات نمود
 et al ., 2001) (Monte-corvo. در نتایج حاصل از تحقیق حاضر معمولاً بیشترین تعداد باندهای مشاهده شده به آغازگرهایی که حاوی تکرار دی نوکلئوتیدی AC هستند مربوط می‌شود. بر این اساس، به نظر می‌رسد که تکرار دی نوکلئوتیدی AC در ژنوم گلابی بیشتر وجود دارد. از این نتایج می توان در طراحی آغازگرهای ریزماهواره برای گلابی استفاده نمود. در مطالعات مربوط به تنوع ژنتیکی گندم نانوایی و سیب زمینی هم نشان داده شد آغازگرهای حاوی تکرارAC در مقایسه با سایر آغازگرهای ISSR، بازده بیشتری دارند (Reddy et al., 2002). بررسی ژنوم گندم ماکارونی با نشانگر ISSR هم حضور بالای تکرارهای AC را تأیید می­کند (Reddy et al., 2002).

در میان آغازگرهای دارای باز اضافی در جهت '5، آغازگرهای  BDB(CAC)5 و HVH(TGT)5 باندهایی با وزن مولکولی بالا (بالاتر از 1000 جفت باز) تکثیر کردند که امتیازدهی آنها مشکل بود. قبلاً هم در مطالعه ژنوم جو، فشردگی باندها در قسمت بالای ژل آغازگرهای دارای باز اضافی در جهت '5 گزارش داده شده بود (Monte-corvo et al., 2002). در تحقیقی که برای تعیین تنوع ژنتیکی 20 رقم گلابی با استفاده از آغازگرهای ISSR صورت گرفت، حضور باندهایی با طول بالای 800 جفت باز در مورد آغازگرهای HVH(TG)7، DBD(AC)7، DBD(AC)7  و HVH(CA)7 مشاهده شد (Reddy et al., 2002). از آنجایی که نواحی تکثیر شده توسط آغازگرهای لنگرشده در جهت '5 شامل مناطق بین ریزماهواره ها و توالی‌های ریزماهواره‌ای هستند، ایجاد محصولات با طول بزرگ تر از محصولات سایر آغازگرها که شامل مناطق بین ریزماهواره‌ای هستند، منطقی به نظر می‌رسد(Reddy et al., 2002).

ضریب تشابه از صفر تا یک متغیر است. زمانی که نشانگرها برای دو رقم کاملاً یکسان باشند، ضریب تشابه یک می‌شود و صفر حالتی است که تمام نشانگرها برای دو ژنوتیپ کاملاً متفاوت باشند. دامنه ضریب تشابه به دست آمده از نشانگرهای ISSR در این تحقیق از 05/0 بین ارقام دره گزی و SK13 تا یک بین دو رقم ردبارتلت و بارتلت متغیر بود.

برای انتخاب مناسب ترین الگوریتم جهت دسته‌بندی ارقام از ضریب همبستگی کوفنتیک (824/0=r) استفاده شد. بهترین روش انتخاب شده روش UPGMA بود و دندروگرام بر اساس این روش ترسیم گردید (شکل 3).  براساس دندروگرام حاصله در شباهت ژنتیکی 36/0 نمونه­های مورد بررسی،  به سه دسته و یک ژنوتیپ مستقل تقسیم شد. در گروه اول کنفرنس، محمدعلی، سردرودی، بارتلت، ردبارتلت، هراسویت، پاس‌کراسان، دوین دوکومیس، آنجو، فلسطینی، لوئیس‌بن، دوشس و دره‌گزی، در گروه دوم کولی خوج، خوج لب ترش، خوج کته سر، دم کج، سبری، خوج مرداب انزلی و شاه‌میوه و در گروه سوم SK10 و SK13 قرار گرفتند. ژنوتیپ آبت فتال به صورت مستقل از بقیه گلابی‌ها قرار گرفت.

همه ارقام غرب اروپا در دسته اول قرار گرفتند. حضور سه رقم ایرانی محمدعلی، سردرودی و دره‌گزی در این دسته نشان می‌دهد که این سه رقم نزدیکی زیادی با ارقام اروپایی دارند و به احتمال زیاد از اجداد مشترکی اشتقاق پیدا کرده اند. در این دسته بارتلت و ردبارتلت با شباهت کامل (ضریب تشابه یک) از هم تفکیک نشدند. رقم گلابی هراسویت نیز با اجداد خود بارتلت و ردبارتلت در یک زیردسته قرار گرفت. ژنوتیپ گلابی ایرانی دره‌گزی همراه با لوئیس بن و دوشس که ارقامی از فرانسه هستند به یک زیر دسته دیگر تعلق یافتند. ارقام محمدعلی و سردرودی نیز در مقایسه با دره‌گزی شباهت بیشتری به هم نشان دادند که به تأیید این فرضیه کمک می‌کند که آنها جد مشترکی دارند.

در دسته دوم ژنوتیپ‌های کولی خوج و خوج لب ترش از سایر ارقام ایرانی جدا شدند که شاید دلیلی بر زمینه ژنتیکی متنوع تر این دو رقم باشد. سایر خوج ها و ارقام تجارتی سبری، شاه‌میوه و دم کج فاصله ژنتیکی کمتری از هم داشتند. سبری که به نظر عده‌ای جزو ارقام گلابی‌های آسیایی است (Sabeti, 2002; Maniee, 1995)، در دسته خوج ها قرار گرفته بود و به احتمال قوی متعلق به گونه P. communis است.

دسته سوم شامل دو رقم ژاپنی SK10 و SK13 از گونه P. pyrifolia بود. این دو رقم کاملاً از سایر ارقام که همگی متعلق به گونه P. communis هستند جدا شده اند. اگر رقم سبری متعلق به گلابی های ژاپنی بود، انتظار می‌رفت در این دسته قرار گیرد در حالی که چنین اتفاقی نیفتاد.

در دندروگرام حاصل، رقم آبت فتال از سایر ارقام فرانسوی جدا شد و به صورت یک شاخه تنها قرار گرفت. قرارگیری دور از انتظار آبت فتال شاید به ماهیت نشانگرهای ISSR مربوط باشد لذا این نتیجه دور از انتظار باید مورد بررسی مجدد قرار گیرد.

ارقام شاه‌میوه، دم کج و سبری با ارقام وحشی خوج (خوج لب ترش، کولی خوج، خوج مرداب انزلی و خوج کته سر) در یک دسته قرار گرفتند که نشان داد احتمالاٌ این سه رقم تجارتی از ژنوتیپ‌های خوج‌ها، که در مناطق شمالی کشور پراکنده‌اند، مشتق شده‌اند و بعداً به قسمت مرکزی ایران وارد شده‌اند. سه رقم محمدعلی، سردرودی و دره‌گزی نزدیکی زیادی با ارقام اروپایی نشان دادند و در گروهی متفاوت از ارقام ایرانی قرار گرفتند. این یافته به تأیید این فرضیه کمک می‌کند که ارقام مزبور به احتمال زیاد با ارقام اروپایی اجداد مشترکی دارند. به علاوه ارقام محمدعلی و سردرودی نزدیکی قابل توجهی نشان دادند. با توجه به این که منشأ رقم سردرودی آذربایجان است، می‌توان احتمال داد رقم محمدعلی و سردرودی هر دو جزو ارقامی باشند که از ناحیه قفقاز وارد ایران شده اند.