باززایی گیاه ازمک (Cardaria draba L.) از طریق کشت بافت

باززایی گیاه ازمک (Cardaria draba L.) از طریق کشت بافت

سپیده قطب­زاده کرمانی[1]^*، شهرام پورسیدی²، غلامعباس محمدی³،  احمد معینی⁴، امین باقی­زاده⁵

¹ دانش آموخته دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته

² استادیار گروه بیوتکنولوژی، دانشگاه شهید باهنر کرمان

³ دانشیاردانشگاه علوم پزشکی کرمان

⁴ دانشیار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس

⁵ دانشیار گروه بیوتکنولوژی، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته

تاریخ دریافت: 20/01/1391، تاریخ پذیرش: 11/10/1391

چکیده

کشت بافت روشی مفید و کاربردی در جهت ریزازدیادی و تولید انبوه گیاهان در یک دوره کوتاه بدون در نظر گرفتن فصل کاشت و رویش می­باشد علاوه بر این کشت بافت روشی جدید و مؤثر برای اصلاح گیاهان از طریق انتقال ژن است. با این حال عدم وجود یک سیستم کشت بافت و باززایی مؤثر برای بسیاری از گیاهان احساس می­شود. ازمک با نام علمی Cardaria draba از جمله این گیاهان است، این گیاه با داشتن ترکیب شیمیایی سولفورافان جزو گیاهان دارویی محسوب می­شود که ضرورت دستیابی به دستورالعمل مناسب کشت بافت و باززایی مؤثر برای این گیاه به شدت احساس می­شود. در این پژوهش توانایی گیاه برای کال­زایی و شاخه­زایی مستقیم در محیط کشت بافت به صورت دو آزمایش فاکتوریل جداگانه در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی با دو فاکتور BAP در7 سطح و NAA در 4 سطح که در آزمایش اول بر روی نمونه­های برگ لپه و در آزمایش دوم روی محور زیر لپه در سه تکرار مورد مطالعه قرار گرفت. با توجه به آنالیز آماری در سطح 5 درصد، تیمار با غلظت هورمونی سه میلی­گرم در لیتر BAP به همراه نیم میلی­گرم در لیتر NAA و تیمار هورمونی با سه میلی­گرم در لیتر BAP و یک میلی­گرم در لیتر NAA به ترتیب بهترین کال­زایی در ریزنمونه­های برگ لپه­ای و مناسب­ترین تعداد شاخه در ریزنمونه­های محور زیر لپه را نشان دادند. بهترین ریشه­زایی برای ریزنمونه­های محور زیر لپه و برگ­های لپه­ای به ترتیب در تیمارهای با غلظت هورمونی نیم میلی­گرم در لیتر BAP به همراه یک میلی­گرم در لیتر NAA و تیمار هورمونی با غلظت یک میلی­گرم در لیتر NAA به تنهایی انجام گرفت. سپس گیاهان به مدت 2 هفته در محیط کشت پایه MS بدون هورمون و 4 هفته در گلدان­های حاوی پیت­ماس استریل در شرایط گلخانه نگهداری شدند و 90 درصد موفقیت در باززایی گیاهان مشاهده شد.

واژه­های کلیدی: ازمک، کشت بافت، کال­زایی و شاخه­زایی مستقیم

مقدمه

ازمک با نام علمی Cardaria draba گیاهی علفی، دو لپه از خانواده شب بو (Crucifereae) است. گیاهی چند ساله، پایا با ارتفاع متوسط 60 سانتیمتر می­باشد که توسط بذر و ریزوم تکثیر می­گردد. جوانه زنی بذور آن در پائیز صورت می­گیرد و زمستان و اوایل بهار را به صورت روزت سپری می­کند (Mozafarian, 2005). این گیاه در سال اول رویش قادر به تولید گل نیست و فقط به تقویت و گسترش ریشه­ای خود می­پردازد و در بهار مجدداً جوانه زده و در اردیبهشت تا اوایل مرداد ماه سال دوم به گل می­نشیند. ازمک اولین بار در سال 1862 از شمال آمریکا گزارش شد و اکنون در اکثر نقاط دنیا یافت می­شود (Gaskin et al., 2005).

ارزش معرفی و استفاده از این گیاه به علت داشتن دو ویژگی است ویژگی اول داشتن ترکیبی بسیار ارزشمند به نام سولفوروفان[2] از دسته گلوکوزینولات­ها[3] است. سولفوروفان عموماً بدلیل خاصیت ضد میکروبیش از ازمک جداسازی می­شود. سولفوروفان از رشد گروهی از میکرواورگانیسم­ها حتی برخی از پاتوژن­های انسانی جلوگیری می­کند. خواص توأم ضد باکتریایی[4] و ضد سرطانی[5] سولفوروفان باعث حذف هلیکوباکتر[6] شده و در نتیجه شیوع امراض گوارشی را کاهش می­دهد (Fahy et al., 2002). سولفوروفان با اثر بر روی آنزیم­های مختلف موجب کاهش فشار خون و کاهش ابتلا به سرطان می­شود (Powell et al., 2004). تحقیقات انجام شده در کانادا مشخص کرده است که می­توان سولفوروفان را با کیفیت و کمیت بالا از علف هرز ازمک استخراج کرد. یکی از مشکلات اصلی در استخراج سولفوروفان از گیاهان غنی از این ماده وجود انواع مختلف گلوکوزینولات­ها در گیاه و در نتیجه وجود مشکل جداسازی آنها از یکدیگر است در حالی که ازمک فقط شامل دو نوع گلوکوزینولات در مقدار زیاد است که یکی از آنها گلوکورافانین است و این موجب کاهش مشکلات وابسته به جداسازی گلوکورافانین از دیگر گلوکوزینولات­­ها می­شود. این پتانسیل می­تواند ازمک را از یک علف هرز مزاحم به گیاهی مفید تبدیل کند (Powell et al., 2005).

ویژگی دوم اینکه ازمک گیاهی با قابلیت انباشت فلزات سنگین است به طوری که بر اساس تحقیقی که نوری و همکاران در همدان انجام دادند مشخص شد که ازمک میزان جذب خوبی از نظر عناصر سرب، روی، منگنز و آهن دارد و به جز برای عنصر روی، بیشترین تجمع فلز در ساقه آن می­باشد (Nouri et al., 2011). چراغی و همکاران نشان دادند که ازمک مقدار غیر معمول و زیادی از فلز مس را می­تواند در اندام هوایی خود متجمع کند و می­تواند به عنوان یک فوق تجمع کننده این فلز معرفی شود (Cheraghi et al., 2011). در گزارشی دیگر نیز بیان شد که ازمک نسبت به 25 گونه مورد مطالعه قادر به جذب و تجمع مقدار بالایی از سرب در بافت­های خود است (Cheraghi et al., 2007). با توجه به فواید این گیاه تاکنون گزارشی در مورد کشت بافت آن ارائه نشده است بر این اساس آزمایشاتی جهت پیدا کردن سطوح هورمونی مناسب برای کشت بافت آن طراحی شد. تا پس از پیدا کردن دستورالعمل مناسب کشت بافت این گیاه بتوان با انتقال ژن از منابع دیگر به آن و افزایش مزایای آن، تنوع سوماکلونال و حتی استخراج سولفوروفان از بافت­ها در محیط کشت بافت بهره برد.

مواد و روش­ها

جمع­آوری و کشت بذور

بذرهای ازمک به صورت نمونه­های تصادفی از شهرستان کرمان جمع­آوری شد. بذور یک شکل و سالم انتخاب و در یک توری مناسب ریخته و با آب حاوی مایع ظرفشویی به میزان مناسب به مدت 5-3 دقیقه به خوبی شسته شد و پس از شستشوی اولیه، در هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد به مدت 15 دقیقه قرار گرفتند تا ضدعفونی بذور صورت گیرد. در پایان بذور سه مرتبه، هر بار به مدت 15 دقیقه با آب مقطر استریل شسته شدند. بذور ضدعفونی شده پس از خشک شدن بر روی کاغذ صافی استریل به تعداد 20 بذر در هر ظرف شیشه­ای حاوی محیط کشت پایه MS با غلظت یک­دوم که قبلاً اتوکلاو شده بود، کشت شده و در اتاقک رشد با 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و دمای 2±26 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند.

کشت ریزنمونه­ها در محیط­ با غلظت­های مختلف هورمونی

پس از 11 روز از گیاهچه­های جوان، ریز نمونه­های برگ لپه­ای و ‌محور زیر لپه تهیه شد به این صورت که ابتدا جوانه انتهایی از بین دو برگ لپه­ای جدا و محور زیر لپه نیز به قطعات 7 تا 10 میلی­متری تقسیم و سپس قطعات محور زیر لپه و هر برگ لپه­ای به محیط کشت حاوی سطوح هورمونی مختلف منتقل شدند. هورمون­های مورد استفاده نفتالین استیک اسید[7]به عنوان اکسین و 6-بنزیل آمینوپورین[8] به عنوان سیتوکینین بودند، غلظت­های انتخابی NAA 2/0، 5/0 و 1 میلی گرم در لیتر و برای BAP 5/0، 1، 2، 3، 4 و 5/4 میلی گرم در لیتر به تنهایی و یا در ترکیب با یکدیگر در محیط کشت پایه MS کامل به همراه ساکارز با غلظت 30 گرم در لیتر به عنوان منبع کربن و آگار با غلظت 8 گرم در لیتر به عنوان فاکتور منعقد کننده، بودند که با شاهد (محیط بدون هورمون) مقایسه شدند. پس از افزودن هورمون­ها pH محیط کشت روی 05/0± 8/5 تنظیم و عمل استریل کردن در دمای 121 درجه سانتیگراد و فشار یک اتمسفر به مدت 20 دقیقه انجام شد. 7 میلیمتر از هر محیط کشت در سه تکرار داخل پتری دیش­های یک بار مصرف استریل با ابعاد 2/1 × 8 سانتی­متر توزیع، و در هر پتری­دیش 8 ریزنمونه برگ لپه­ای و یا 8 ریزنمونه از محور زیر لپه به طور جداگانه کشت داده شد. نمونه­ها در اتاقک رشد در شرایط نوری 2400 لوکس با دوره 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای 2±26 درجه سانتی­گراد قرار گرفت البته لازم به ذکر است که هر دو هفته یک بار نمونه­ها به محیط کشت جدید با شرایط قبلی منتقل می­شدند.

اندازه­گیری صفات مورد نظر

پس از یک ماه نمونه­ها برای شمارش و محاسبه درصد پاسخ­دهی، شاخص کالوس­دهی،‌ شاخص شاخه­زایی و شاخص ریشه­زایی به زیر هود لامینار آزمایشگاه تحت شرایط استریل منتقل شدند. صفات مورد نظر با استفاده از فرمول­های زیر محاسبه شد و قابل ذکر است که برای محاسبه دو شاخص ریشه­زایی و شاخه­زایی سه ریز نمونه از هر پتری به طور تصادفی انتخاب و شمارش در آنها انجام شد.

تحریک ریشه­زایی بیشتر و تطابق سازی با محیط

ریز نمونه­هایی که اندام زایی داشتند به قطعات کوچکتر تقسیم و به مدت 2 ساعت در سطح محیط القا ریشه که محیط MS مایع با غلظت یک­دوم و هورمون IBA با غلظت 2 میلی گرم در لیتر بود، به مدت 2 ساعت قرار گرفتند. پس از آن نمونه­ها جهت توسعه ریشه و رشد بیشتر ساقه نوپدید خود به محیط بدون هورمون حاوی MS کامل، ساکارز و آگار با همان نسبت­های قبل منتقل شدند و به مدت 2 هفته در شرایط نوری و دمایی قبل قرار گرفتند. گیاهچه­هایی که در محیط توسعه قادر به تشکیل ریشه بودند و به خوبی بلند شده بودند به گلدان­های حاوی پیت ماس استریل منتقل شدند و در گلخانه قرار گرفتند. در ابتدا گلدان­ها با روکش پلاستیکی شفاف پوشیده و پس از یک هفته روکش پلاستیکی سوراخ شد. در طول این مدت گلدان­ها یک روز در میان با آب مقطر و هر سه روز یک بار با MS مایع با غلظت X 25/0 آبیاری شدند. هر هفته تعداد سوراخ­های بیشتری در پوشش پلاستیکی ایجاد شد تا پس از 4 هفته که پلاستیک کاملاً برداشته شد و درصد گیاهانی که سالم و زنده مانده بودند محاسبه شد.

آنالیز آماری

داده­های مربوط به هر ریز نمونه در دو آزمایش فاکتوریل در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی و در سه تکرار آنالیز شدند. سپس نرمال سازی در محیط نرم افزاری Minitab و تبدیل سینوسی انجام و در نهایت آنالیز داده­ها در محیط نرم افزاری SAS انجام پذیرفت. نمودارها در محیط Excel و با میانگین داده­های بدون تبدیل رسم شد.

نتایج و بحث

امروزه تکثیر درون شیشه­ای یکی از جنبه­های تجاری تکثیرخزانه­ای بسیاری از گیاهان بوده و روند رو به افزایشى دارد (Khoshkhoi, 1999). تاکنون در زمینه ریزازدیادی گیاهان دارویی متعددی مانند آلوئه­ورا (Garro-Monge et al., 2008; Hashemabadi et al., 2008)، استویا (Sivaram et al., 2003)، سیر (Khan et al., 2004)، یام (Kadota et al., 2004)، سرخدار (Chang et al., 2001)، بارهنگ (Barna et al., 1988) و مورد (Khosh-Khui et al., 1984) تحقیقات متعددی انجام شده و امکان تکثیر سریع و انبوه برخی از گونه­های آنها فراهم گردیده است. گیاهان خانواده براسیکاسه معمولاً در کشت درون شیشه استفاده می­شوند (Zhang et al., 2006) و گزارش­های متعددی برای استفاده از تکنیک­های کشت بافت مانند اندام­زایی و جنین­های سوماتیکی برای باززایی گونه­های مختلف براسیکا وجود دارد (Antonio et al., 1987; Jain et al., 1988; Ono et al., 1994; Koh et al., 2000; Khan et al., 2002). مؤثرترین فاکتورها در پاسخ­دهی ریزنمونه­ها به محیط کشت بافت ژنوتیپ، سن گیاه دهنده، نوع ریزنمونه و ترکیب محیط کشت است و می­توان گفت اولین مرحله برای پیدا کردن روش مناسب کشت بافت انتخاب ریزنمونه و ترکیب هورمونی مناسب است (Sanjida et al., 2011). تاکنون در کشت بافت و مهندسی ژنتیک بسیاری از گیاهان مانند کلزا از ریزنمونه­های مختلفی استفاده شده است که از مهمترین آنها می­توان برگ لپه و محور زیر لپه را نام برد، گزارش شده است که ریزنمونه برگ لپه­ای دارای بالاترین باززایی است (Kahrizi et al., 2010). اطلاعات موجود نشان می­دهد باززایی و اندام­زایی در بافت­های مختلفی مثل برگ لپه (Hachey et al., 1991; One et al., 1994) محور زیر لپه (Khehra et al., 1992; Phogat et al., 2000) ساقه اصلی (Eapen et al., 1997) برگ­ها (Radke et al., 1988) لایه نازکی از اپیدرم (Klimaszewska et al., 2002) پروتوپلاست (Hu et al., 1999) انجام شده است. در حالی که بر روی برخی گیاهان از جمله ازمک با وجود خاصیت دارویی مفید آن هیچ گونه تحقیقی در زمینه کشت بافت صورت نگرفته است. در تحقیق حاضر گیاه دارویی ازمک قابلیت جوانه زنی مستقیم و تولید کالوس خوبی در محیط کشت بافت از هر دو ریزنمونه کشت شده نشان داد به طوری که درصد پاسخ­دهی ریزنمونه­های محور زیر لپه بین 35 تا 100 و برای برگ­های لپه­ای 0 تا 100 درصد بوده است. در حالی که برای گیاه خردل که در خانواده براسیکاسه شبیه به ازمک است 31/22، 6/41، 9/67 درصد و در برخی از واریته­ها تا 83 درصد گزارش شده است (Guo et al., 2005; Bano et al., 2010; Sanjida et al., 2011) و همانطور که مشخص است پاسخ­دهی ازمک بسیار بالاتر است.

به طور معمول نوع ریزنمونه، ظرفیت شاخه­زایی و باززایی متفاوتی در محیط کشت دارد و برگ لپه در بیشتر موارد شاخه­زایی بیشتری نسبت به قطعات برگ نشان می­دهد (Guo et al., 2005) اما نتایج ما نشان داد که ظرفیت بالای تولید ساقه در هر دو ریزنمونه وجود دارد. کهریزی و همکاران نیز اعلام کردند که محور زیر لپه و برگ لپه­ای کلزا در محیط کشت بافت به ترتیب برای تولید کالوس و باززایی مستقیم مناسب هستند (Kahrizi et al., 2010)، اما در مطالعه حاضر نمی­توان چنین نتیجه­ای گرفت و قابل ذکر است که پاسخ­دهی ریزنمونه­ها در محیط کشت بافت بسیار به ژنوتیپ بستگی دارد، در خانواده براسیکاسه نیز این مسئله وجود دارد (Dietert et al., 1982; Fazekas et al., 1986; Khehra et al., 1992) و بیان شده است که پاسخ دهی به محیط کشت در این خانواده تحت کنترل ژنتیک است (Cardoza et al., 2004; Bano et al., 2010). در گروه شاهد پاسخ­دهی 35 و 54 درصد به ترتیب در ریزنمونه­های محور زیر لپه و برگ­های لپه­ای مشاهده شد (شکل­های 2 و 3) که این درصد بالای جوانه­زنی در محیط فاقد هورمون را می­توان به حضور مقادیر زیادی از کربن، عناصر معدنی و هورمون­های ذخیره شده در قسمت­های مختلف گیاه نسبت داد.

جوانه­های تشکیل شده رشد قابل ملاحظه­ای داشتند و در پایان یک ماه دارای برگ­های قابل شمارش بودند (شکل 1-ب)، که اندازه گیری شاخص تولید ساقه برای آنها امکان پذیر است. تجزیه واریانس این صفت معنی­دار بودن اثر هورمون­ها و اثر متقابل آنها را تائید نمود، بطوریکه بیشترین تعداد ساقه تولید شده در ریز نمونه­های محور زیر لپه و برگ لپه­ای به ترتیب در تیمارهای با غلظت 3 میلی گرم در لیتر و یک میلی گرم در لیتر BAP بدون حضور NAA مشاهده شد. گزارش شده است که تعداد شاخه جوانه زده در هر ریزنمونه و محتوای رنگیزه در هر ساقه تولید شده بیشتر تحت تأثیر مقادیر مختلف هورمون­های سیتوکینین و اکسین قرار می­گیرد. همانطور که Youssef (1994)، Mohamed-Yasseen (1995)، Mata-Rosas (2001) and Feng-Feng به ترتیب در گیاهان Acacia salicina، Stapela semota، Turbinicapus laui و Aloe barbebsis گزارش کردند. Sawsan et al. (2004) گزارش کردند که غلظت­های مختلف BAP و NAA اثرات معنی­داری بر سرعت شاخه­زایی ریز نمونه­ها دارد. آزمایشات نشان داده است که استفاده از مقدار کم NAA در محیط­های کشت برای القای نوساقه­ها مؤثر است و مانع از نکروزه شدن بافت­ها می­شود (Wahlroos et al., 2003; Guo et al., 2005; Ghasemi et al., 2007). به همین دلیل در آزمایش حاضر نیز برای کمک به اثر سیتوکینین از اکسین NAA در غلظت­های کمتر از BAP برای القا شاخه و در غلظت­های بالاتر آن برای القا کالوس استفاده شد. این نتایج با گزارشات قبلی در مورد اثر مثبت مقادیر جزئی NAA همراه با سیتوکینین­ها در محیط­های کشت تولید شاخه در گیاهان متعلق به تیره­های دیگری نظیر داتوره، بارهنگ و میخک مطابقت دارد (Debnath et al., 2006). حضور BAP شاخه­زایی و تشکیل ساقه­های متعدد را در تحقیق حاضر، تحریک نمود، این یافته­ها در مورد باززایی ساقه­ها، تحقیقات Nikolic et al. (1997) را تایید می­کند.

بیشترین درصد شاخه­زایی در ریز نمونه­های محور زیر لپه و برگ­های لپه­ای در تیمارهایی دیده شد که سطح متوسط از BAP بدون حضور NAA داشتند به طوری که تیمارهای یک و سه میلی­گرم در لیتر BAP بیشترین تعداد شاخه را به ترتیب در ریز نمونه­های برگ لپه و محور زیر لپه ایجاد کردند (شکل­های 4 و 5) و این حاکی از نقش زیاد BAP در شاخه­زایی است. در پژوهشی دیگر نیز بیشترین درصد باززایی نوساقه­ها در گیاه کلزا را در غلظت 4 میلی­گرم BAP بدون حضور اکسین مشاهده کردند (One et al., 1994).

اما Guo et al. (2005) معتقدند که حضور اکسین در کنار سیتوکینین باعث باززایی بهتر بر روی ریز نمونه­های برگ لپه­ای می­شود. Ghasemi et al. (2007) نیز بیان می­کنند که حضور NAA با غلظت یک میلی­گرم در لیتر در محیط کشت باعث اندام­زایی مؤثر کلزا می­شود. گونه­های مختلف براسیکا نیز با وجود مقدار بالای سیتوکینین و کم اکسین ساقه­زایی بهتری داشتند اما در گیاه Brassica juncea و Brassica campestris با وجود اکسین در محیط تعداد شاخه به شدت کاهش می­یافت (Jain et al., 1988) و ترکیب BAP و NAA باعث عدم شاخه­زایی و یا کم شدن تعداد نوساقه در محیط کشت می­شود (Fazekas et al., 1986). George et al. (1980) گزارش کرد که تولید نوساقه از برگ لپه خردل هندی در محیط کشت با ترکیب تیماری B₁N₁ خیلی کم بوده و این سطح هورمونی مانع ساقه­زایی می­شود.

شکل1- ساقه­زایی مستقیم و شکل گیری کالوس در گیاه ازمک Cardaria draba. الف) تشکیل کالوس از برگ­های لپه­ای در محیط کشت با غلظت 5/4 میلی­گرم BAP  و یک میلی­گرم NAA، ب) ساقه­زایی مستقیم از محور زیر لپه در محیط کشت با غلظت 1 میلی­گرم BAP  و 2/0 میلی­گرم NAA، ج) گیاه در محیط توسعه، د) گیاه کامل در محیط پیت ماس.

Figure 1- Shoot regeneration and callus induction in Cardaria draba. a) Callus formation of cotyledon in B_4.5N₁, b) Shoot regeneration of hypocotyl in B₁N_0.2, c) Elongation, d) Plant in peat moss.

شکل 2- نمودار درصد پاسخ­دهی در ریز نمونه­­های محور زیر لپه. B_i: غلظت هورمون BAP بر حسب میلی­گرم در لیتر، N_j: غلظت هورمون NAA بر حسب میلی­گرم در لیتر. حروف روی شکل برحسب آزمون LSD در سطح 5 درصد می­باشد.

Figure 2- Graph of Response percent in hypocotyls. B_i: Concentration of BAP (mg L^-1), N_j: Concentration of NAA (mg L^-1). The letters on columns are based on LSD test (p≤0.05)

شکل 3- نمودار درصد پاسخ­دهی در ریز نمونه­­های برگ لپه­ای. B_i: غلظت هورمون BAP بر حسب میلی­گرم در لیتر، N_j: غلظت هورمون NAA بر حسب میلی­گرم در لیتر. حروف روی شکل برحسب آزمون LSD در سطح 5 درصد می­باشد.

Figure 3- Graph of Response percent in cotyledons. B_i: Concentration of BAP (mg L^-1), N_j: Concentration of NAA (mg L^-1). The letters on columns are based on LSD test (p≤0.05).

شکل 4- نمودار میانگین تعداد ساقه نوپدید در ریز نمونه­­های محور زیر لپه. B_i: غلظت هورمون BAP بر حسب میلی­گرم در لیتر، N_j: غلظت هورمون NAA بر حسب میلی­گرم در لیتر. حروف روی شکل برحسب آزمون LSD در سطح 5 درصد می­باشد.

Figure 4- Graph of shoot generation in hypocotyls. B_i: Concentration of BAP (mg L^-1), N_j: Concentration of NAA (mg L^-1). The letters on columns are based on LSD test (p≤0.05).

شکل 5- نمودار میانگین تعداد ساقه نوپدید در ریز نمونه­های­ برگ لپه. B_i: غلظت هورمون BAP بر حسب میلی­گرم در لیتر، N_j: غلظت هورمون NAA بر حسب میلی­گرم در لیتر. حروف روی شکل برحسب آزمون LSD در سطح 5 درصد می­باشد.

Figure 5- Graph of shoot generation in cotyledons. B_i: Concentration of BAP (mg L^-1), N_j: Concentration of NAA (mg L^-1). The letters on columns are based on LSD test (p≤0.05).

در آزمایشات باززایی کشت بخش­های هوایی برای تولید شاخه­های نوپدید رایج­تر است و نتایج مطلوب­تری نیز دارد. در این میان قطعات هیپوکوتیل بدلیل قابلیت رشد سریع و عدم تمایزیابی شدید به سمت اندام­ها بیشتر مورد استفاده قرار می­گیرند (Dixon et al., 1996; Sama et al., 2012). اما در تحقیق حاضر ریزنمونه­های محور زیر لپه نتایج خوبی از نظر شاخه­زایی مستقیم (بدون ایجاد کالوس) نشان دادند، از طرف دیگر مزیت مهم باززایی گیاه از ریزنمونه­های محور زیر لپه، داشتن پتانسیل تولید انبوه گیاهچه می­باشد که هدف مذکور در انتقال ژن را به خوبی تأمین می­کند. در ریزنمونه محور زیر لپه تیمار سه میلی­گرم در لیتر BAP بدون حضور NAA بیشترین تعداد ساقه را تولید کرد اما اگر هدف باززایی کامل گیاه باشد تیمار سه میلی­گرم در لیتر BAP به همراه یک میلی­گرم NAA پیشنهاد می­شود زیرا علاوه بر شاخه­زایی خوب، ریشه­زایی قابل قبولی نیز داشت و در مورد ریزنمونه برگ لپه تیمار یک میلی­گرم در لیتر BAP بدون حضور NAA بیشترین تعداد ساقه را تولید کرد اما ریشه­زایی قابل قبولی نداشت بنابراین تیمار دو میلی­گرم در لیتر BAP بدون حضور NAA با هدف باززایی کامل گیاه پیشنهاد می­شود.

در بررسی اثر تنظیم کننده­های رشد بر شاخص کالوس­دهی، پس از گذشت دو هفته تشکیل کالوس بر روی برگ­های لپه­ای در کلیه محیط­های کشت به کار رفته بجز محیط­های شاهد فاقد هورمون و در تعداد زیادی از ریزنمونه­های محور زیر لپه قابل مشاهده بود. درصد بالایی از ریزنمونه­های مورد مطالعه در گیاه B. juncea نیز کال­زایی قابل قبولی نشان دادند (Muhammad et al., 2002; Moghaieb et al., 2006; Bano et al., 2010). در ریزنمونه­های محور زیر لپه ناحیه کالوس در دو سر برش یافته بود که به تدریج و طی چند روز سر تاسر ریزنمونه را فرا می­گرفت، برای ریزنمونه­های برگ لپه­ای در ابتدا کالوس در نزدیکی دمبرگ و در ادامه روی قسمت­هایی از برگ که در تماس با محیط کشت بود، دیده شد و در آخر تمامی برگ را پوشانید این یافته­ها با نتایج محققین دیگر بر روی گیاهانی چون Brassica napus، B. juncea و campestris B. هم­خوانی دارد (Jain et al., 1988; Guo et al., 2005; Bano et al., 2010). بیشترین کالوس­دهی در تیمارهای با غلظت 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP به همراه یک میلی­گرم در لیتر NAA و سه میلی­گرم در لیتر BAP و 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA به ترتیب در ریزنمونه­های محور زیر لپه و برگ لپه مشاهده شد (شکل­های 6 و 7)، اما شاداب­ترین کالوس­ها با رنگ سبز در محیط­های کشت دارای ترکیب تیماری 5/0 میلی گرم بر لیتر NAA و 4 میلی گرم در لیتر BAP در ریز نمونه­های برگ لپه تولید شد (شکل 1-الف). محاسبه درصد کال­زایی و تجزیه آماری داده­ها پس از یک ماه نشان داد که اثر تیمارهای NAA و BAP به تنهایی و همچنین اثرات متقابل آنها معنی­دار است بنابراین ترکیب مؤثر NAA و BAP در هر دو ریزنمونه موجب کال­زایی می­شود در دیگر اعضای خانواده براسیکاسه نیز این مسئله مشاهده شده است به طوری که تیمار هورمونی B₂N₂ برای محور زیر لپه کلزا (Kahrizi et al., 2010) و تیمار B₂N_0.2 برای برگ لپه B. juncea (Jain et al., 1988) تولید کالوس کردند. بیان شده است که B. juncea و B. campestris در محیط­های بدون اکسین کالزای کمی داشتند در نتیجه می­توان گفت اکسین برای کال زایی مفید است (Jain et al., 1988). در مطالعه حاضر ریزنمونه­های برگ لپه­ای از نظر بیشترین میزان کالوس­دهی به عنوان ریز نمونه بهتر پیشنهاد می­شوند. ساقه­زایی یا کال­زایی از ریزنمونه­های مختلف در گونه­های براسیکا تحت تأثیر تعادل هورمونی استفاده شده است که می­تواند ناشی از موقعیت متفاوت فیزیولوژیکی ریزنمونه (Dunwell et al., 1976) و یا تحت کنترل ژنتیکی باشد (Jain et al., 1988).

شکل 6- نمودار میانگین درصد کالوس دهی ریز نمونه­های محور زیر لپه. B_i: غلظت هورمون BAP بر حسب میلی­گرم در لیتر، N_j: غلظت هورمون NAA بر حسب میلی­گرم در لیتر. حروف روی شکل برحسب آزمون LSD در سطح 5 درصد می­باشد.

Figure 6- Graph of callus induction in hypocotyls. B_i: Concentration of BAP (mg L^-1), N_j: Concentration of NAA (mg L^-1). The letters on columns are based on LSD test (p≤0.05).

شکل 7- نمودار میانگین درصد کالوس دهی ریز نمونه­های برگ لپه. B_i: غلظت هورمون BAP بر حسب میلی­گرم در لیتر، N_j: غلظت هورمون NAA بر حسب میلی­گرم در لیتر. حروف روی شکل برحسب آزمون LSD در سطح 5 درصد می­باشد.

Figure 7- Graph of callus induction in cotyledons. B_i: Concentration of BAP (mg L^-1), N_j: Concentration of NAA (mg L^-1). The letters on columns are based on LSD test (p≤0.05)

در این گیاه ریز نمونه­های برگ پاسخ­دهی دیرتری به محیط کشت بافت داشتند برگ­های لپه در گیاه Coronopus navasii نیز در ابتدا فعالیت کمی داشتند و پس از گذشت 80 روز ساقه­زایی داشتند (Iriondo et al., 1990) اما در این گیاه پس از گذشت 10-7 روز کال­زایی در آنها مشاهده شد. گرچه باززایی از طریق کالوس در تولید انبوه گیاهان اهمیت قابل ملاحظه­ای دارد اما به دلیل بالا بودن احتمال وقوع تنوع سوماکلونی و صرف زمان نسبتاً طولانی­تر برای تکثیر رویشی با هدف حفظ ژنوتیپ­های معین چندان مناسب نیست. روش دیگر که انجام آن در شرایط آزمایشگاهی دشوارتر است، تشکیل مستقیم مریستم­های شاخه بر روی بافت­های جداکشت می­باشد. سرعت تولید شاخه مستقیم بالاتر بوده و در نتیجه با توجه به پایین بودن تغییرات سوماکلونال برای ریزازدیادی، بسیار با ارزش است (Debnath et al., 2006 Dixon et al., 1996;). قابل ذکر است که کالوس­های تولید شده در محیط کشت پس از گذشت زمان، تولید نوساقه­ می­کردند، همانطور که در نتایج مشخص است برخی از تیمارهای استفاده شده بر روی هر دو ریزنمونه کال­زایی و ساقه­زایی را با هم نشان دادند (شکل­های 4 تا 7) Singh et al. گزارش کردند که تمایز ساقه از کالوس­های تشکیل شده بر روی برگ لپه در اکثر گونه­های جنس براسیکا اتفاق می­افتد، این نتایج توسط محققین دیگر نیز تأئید شده است (Mathews et al., 1990; Guo et al., 2005; Bano et al., 2010). بالاترین کال­زایی 90 و 100 درصد به ترتیب در محور زیر لپه و برگ­های لپه است در حالی که بالاترین درصد کال­زایی در گیاه B. juncea 5/65 درصد از محور زیر لپه بوده است. از آنجا که تعداد تیمارهای بیشتری ساقه­زایی مستقیم را نشان داد و اکثر کالوس­های تولید شده به سمت تولید نوساقه پیش رفتند، می­توان نتیجه گرفت که گیاه ازمک با سطوح هورمونی آزمایش شده تمایل بیشتری برای تولید نوساقه در محیط کشت دارد و گزینه­ای مناسب برای استفاده در پروژه­های انتقال ژن می­باشد.

هدف از انتقال شاخه به محیط ریشه­زایی تحریک آنها به ایجاد ریشه و تبدیل به گیاه کامل و کسب شرایط لازم برای انتقال به محیط آزاد است تحریک ساقه به ایجاد ریشه در گونه­های علفی به سهولت انجام می­گیرد به همین دلیل در گیاه ازمک ریشه­زایی به راحتی انجام شد به طوری که در همان سطوح هورمونی قبل تعدادی از تیمارها در هر دو ریز نمونه مورد مطالعه ایجاد ریشه­های نوپدید کردند (شکل­های 8 و 9)، تولید ریشه­های نوپدید در محیط­های اولیه کشت بافت در گیاه آلوئه­ورا نیز مشاهده شد (Garro- Monge et al., 2008). در سه گونه B. juncea، B. campestris و B. carinata نوساقه­ها به آسانی در همان محیط­ها با طولانی کردن کشت ریشه­دار می­شدند (Jain et al., 1988).

با این وجود برای تولید ریشه­های قوی­تر تحریک قاعده گیاه توسط هورمون IBA انجام شد این هورمون در برخی از گونه­های براسیکا مانند کلزا تولید ریشه­های نوپدید می­کند (Mollika et al., 2001) و برای اینکه حیات ریشه و کارایی آن در شرایط آزاد تداوم داشته باشد باید محیط اطراف ریشه گیاهچه بطور تدریجی تغییر داده شود تا اینکه تنش وارده به گیاهچه غیر قابل تحمل نباشد بنابراین گیاهچه­ها به مدت دو هفته وارد محیط بدون هورمون با غلظت کامل عناصر معدنی شدند تا ریشه­ها ضمن تأمین نیاز غذایی خود یک دوره رشد بدون هورمون را نیز طی کنند پس از گذشت این مرحله ریشه­های رشد یافته به خوبی مشاهده می­شدند (شکل 1-ج).

شکل 8- نمودار میانگین تعداد ریشه نوپدید در ریز نمونه­های­ محور زیر لپه. B_i: غلظت هورمون BAP بر حسب میلی­گرم در لیتر، N_j: غلظت هورمون NAA بر حسب میلی­گرم در لیتر. حروف روی شکل برحسب آزمون LSD در سطح 5 درصد می­باشد.

Figure 8- Graph of root generation in hypocotyls. B_i: Concentration of BAP (mg L^-1), N_j: Concentration of NAA (mg L^-1). The letters on columns are based on LSD test (p≤0.05).

شکل 9- نمودار میانگین تعداد ریشه نوپدید در ریز نمونه­های­ برگ لپه. B_i: غلظت هورمون BAP بر حسب میلی­گرم در لیتر، N_j: غلظت هورمون NAA بر حسب میلی­گرم در لیتر. حروف روی شکل برحسب آزمون LSD در سطح 5 درصد می­باشد

Figure 9- Graph of root generation in cotyledons. B_i: Concentration of BAP (mg L^-1), N_j: Concentration of NAA (mg L^-1). The letters on columns are based on LSD test (p≤0.05).

محاسبات آماری نشان داد، اثر متقابل هورمو­ن­های مورد استفاده در کلیه ریز نمونه­ها بسیار معنی­دار است. بیشترین تعداد ریشه نوپدید در تیمارهای با غلظت 5/0 میلی گرم در لیتر BAP به همراه یک میلی گرم در لیتر NAA و یک میلی­گرم در لیتر NAA بدون حضور BAP به ترتیب در ریز نمونه­های محور زیر لپه و برگ­های لپه­ای مشاهده شد (شکل­های 8 و 9). در گیاه آرتمیزین بهترین درصد ریشه با تیمار یک هفته­ای 05/0 میلی­گرم بر لیتر NAA صورت گرفت (Chenshu et al., 2003). تیمارهای شاهد در هر دو ریزنمونه ریشه­زایی خوبی با میانگین تعداد ریشه 79/1 و 34/1 داشتند. در گیاه C. navasii نیز ریشه­زایی و توسعه ریشه در محیط بدون هورمون روی داد به طوریکه 52 درصد ریشه­زایی با میانگین تعداد ریشه 7/2 در محیط بدون هورمون بدست آمد (Iriondo 1990). دو ورایته مورد مطالعه از گیاه B. juncea ریشه­های مناسبی در محیط بدون هورمون تولید کردند، به طوریکه واریته BARI 11 90 درصد و واریته BARI16 80 درصد ریشه­زایی داشتند (Sanjida et al., 2011)

پس از انتقال به محیط بدون هورمون همزمان با رشد ریشه، طول شاخه­ها شدیداً افزایش یافت (شکل 1-ج). گاهی هنگام انتقال شاخه­های نوپدید به محیط­های کشت بدون سیتوکینین یا با مقدار کم سیتوکینین، استفاده از ژیبرلین­ها جهت افزایش رشد طولی ضروری است (Dixon et al., 1996). در مورد گیاه ازمک همزمان با رشد ریشه، شاخه­های نوپدید در محیط­های بدون هورمون رشد بسیار سریعی نشان دادند به طوریکه نیازی به کاربرد هورمون رشد ژیبرلین نبود. از این رو امکان انتقال سریع به محیط برون شیشه در مدت زمان کوتاهی پس از تشکیل ریشه­ها امکان پذیر شد. بعد از ریشه­دار شدن، گیاه برای تبدیل از حالت دگر غذایی به حالت خود غذایی و انتقال به شرایط آزاد خاک آماده می­شود به همین خاطر شاخه­های قوی دارای تعداد و سطح برگ کافی و جوانه انتهایی سالم وارد این مرحله شدند تا توانایی لازم برای سازگاری با محیط جدید را داشته باشند، نتایج نشان داد 90 درصد گیاهانی که به این محیط منتقل شده بودند زنده مانده و از رشد قابل قبولی برخوردار بودند (شکل 1-د). درصد بالای باززایی برای بسیاری از گیاهان موجود در این خانواده از جمله C. navasii،B. napus ، B. oleracea و B. juncea مشاهده شده است که بیانگر پتانسیل بالای این گیاهان برای تکثیر و ریزازدیادی از طریق کشت بافت است (Iriondo et al., 1990; Cheng et al., 2001; Khan et al., 2002; Guo et al., 2005; Bano et al., 2010).

با توجه به نتایج بدست آمده سعی شد تیمارهایی معرفی شود که علاوه بر میزان شاخه­دهی یا کالوس­دهی بالا، مقدار هورمون استفاده شده برای آنها کمتر باشد و ریشه­زایی قابل قبولی داشته باشند. از آنجا که بر روی کشت بافت گیاه ازمک تاکنون گزارشی ثبت نشده است و با توجه به پتانسیل بالای این گیاه برای باززایی و ساقه­زایی مستقیم در محیط کشت بافت امید است بتوان از این گیاه به عنوان گیاهی مدل در مهندسی ژنتیک و انتقال ژن استفاده کرد از طرف دیگر این گیاه دارای مقدار قابل توجهی سولفورافان است که تکثیر درون شیشه به عنوان روشی مفید برای بدست آوردن مقدار زیادی از این ماده در مدت زمان کوتاهی پیشنهاد می­شود.