جداسازی، بیان ژن و تولید پروتئین افکتور PthA باکتری Xanthomonas citri subsp citri عامل بیماری شانکر مرکبات

جداسازی، بیان ژن و تولید پروتئین افکتور PthA  باکتری Xanthomonas citri subsp citri  عامل بیماری شانکر مرکبات

مریم مختاری ¹، محمدرضا صفرنژاد*²، سید مهدی علوی³، آدم ترکمن زهی¹

¹بخش زیست شناسی، دانشگاه سیستان و بلوچستان، زاهدان

²بخش ویروس شناسی گیاهی موسسه تحقیقات گیاه پزشکی کشور، تهران

³بخش بیوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فن آوری، تهران

تاریخ دریافت: 26/07/1393، تاریخ پذیرش: 17/09/1393

چکیده

بیماری شانکر باکتریایی مرکبات از جمله مهمترین بیماری های باغات لیموی مکزیکی در جنوب کشور می باشد که توسط باکتری Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ایجاد می‌شود. پروتئین PthA باکتری عامل شانکر مرکبات، به عنوان پروتئین افکتور، نقش اساسی در فرایند بیماری زایی دارد و لذا غیر فعال سازی آن با استفاده از آنتی بادی می تواند منجر به ایجاد مقاومت بر علیه بیماری شود. در این تحقیق جداسازی و بیان ژن pthA و خالص­سازی پروتئین حاصل از آن صورت پذیرفته است. برای این منظور با استفاده از منابع اطلاعاتی بانک ژن، آغازگرهای اختصاصی برای جداسازی ژن pthA  طراحی شد و سپس قطعه ژنی مربوطه در ناقلpTZ57R/T همسانه سازی گردید. ژن مزبور سپس به صورت متصل به دنباله شش تایی هیستیدین در ناقل بیانی باکتریایی pET28a همسانه سازی گردیده و بیان آن به صورت نوترکیب در سویه BL21(DE3)  باکتری Escherichia coli صورت پذیرفت. خالص­سازی پروتئین نوترکیب PthA در شرایط طبیعی غیر واسرشتی و با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی  بر روی ستون نیکل صورت پذیرفت. صحت بیان پروتئین مذکور با روش های الکتروفورز پروتئین و وسترن بلاتینگ با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی توالی شش تایی هیستیدین مورد بررسی و تایید قرار گرفت. پروتئین نوترکیب خالص بدست آمده می تواند به عنوان آنتی ژن برای تولید آنتی بادی های نوترکیب مونوکلونال مورد استفاده قرار گیرد.

کلید واژه­ها: شانکر مرکبات، پروتئین نوترکیب، افکتور پروتئین PthA، Xanthomonas citri subsp.citri.

مقدمه

مرکبات یکی از محصولات مهم باغی در ایران است. سطح زیر کشت مرکبات در دنیا در حدود نه میلیون هکتار می باشد که از این مقدار سهم ایران در حدود 268 هزار هکتار می باشد. میزان تولید مرکبات کشور حدود 29/4 میلیون تن می­باشد.ایران به دلیل قرار‌گرفتن در شرایط جغرافیایى مناسب از لحاظ تولید مرکبات مقام هفتم را در بین تولید‌کنندگان عمده مرکبات جهان به خود اختصاص داده ‌است (Ebrahimi, 2009). از مهمترین بیماری­های درختان لیموترش در مناطق جنوبی کشور بیماری شانکر مرکبات می باشد (Khodakaramian et al. 1999)که توسط باکتری(Xcc) Xanthomonas citri subsp. citri (Schaad et al., 2006) ایجاد می‌شود. مبارزه با این بیماری عمدتا به روش های شیمیایی و با استفاده از ترکیبات مسی می باشد. دستیابی به منابع مقاومت ژنتیکی از مهمترین راهکار ها در تولید ارقام مقاوم به بیماری می‌باشد که در این خصوص استفاده از ژن آنتی بادی های اختصاصی راهکاری نوین در این حوزه می باشد (Safarnejad et al. 2011).

علایم این بیماری در اندام­های هوایی گیاه شامل برگ‌ها، ساقه‌ها و میوه‌ها مشاهده می­گردد. در برگ‌ها باکتری از طریق روزنه‌ها وارد می‌شود. آلودگی به‌صورت یک سری نقاط دایره‌ای در سطح پشتی برگ دیده می‌شود. باکتری سپس در فضای آزاد بین سلولی[1] جای­گیری می‌کند و کلنی تشکیل می‌دهد.( Duan et al., 1999) اپیدرم برگ در نتیجه افزایش آلودگی به‌هم می‌ریزد و تکه‌تکه می‌شود. در برگ‌ها، ساقه‌ها و میوه‌ها زخم‌ها زیادتر شده و سپس حالت شانکر در محل­های آلوده ایجاد می­گردد(Dunger et al., 2005; Brunings and Gabriel, 2003). سویه­های مختلف گونه X. citri بر مبنای دامنه میزبانی به پاتوتیپ­های مختلفی تعلق دارند که به صورت فرم ها (پاتوتیپ­ها)ی مختلف بیماری شناخته می شوند. فرمهای مختلف بیماری در دنیا شامل  A، B، C، D،  Eو A* می باشند. این بیماری در ایران برای اولین بار در سال 1368 در منطقه کهنوج کرمان روی لیمو مکزیکی توسط علیزاده و رحیمیان مشاهده گردید (Alizadeh and Rahimian 1989). نتایج تحقیقات اخیر نشان داده است که تمامی انواع شناخته شده بیماری شانکر مرکبات در ایران از  نوع A* می باشد     (Pruvost et al. 2014).

ارتباط بین باکتری‌های گرم‌منفی بیماری‌زای حیوانی و گیاهی با میزبانشان بستگی به یک نوع سیستم محافظت‌شده به نام سیستم ترشح نوع سه[2] دارد، که باعث انتقال فاکتورهای بیماری­زایی و هارپین­ها به درون سلول میزبان می شود  (Büttner et al., 2002; Cornelis & Van Gijsegem, 2000; Hueck, 1998). سیستم ترشحی نوع سه  به ‌وسیله یک توالی به طول  23 کیلو جفت باز از مجموعه ژن‌های hrp کروموزومی یعنی از hrpA تا hrpF کد می‌شود که داخل شش اپران سازمان یافته ‌است (Bonas et al., 1991; Büttner et al, 2002).

ژن pthA از جمله مهمترین ژن­ها در بیماری­زایی باکتری عامل بیماری شانکر می­باشد (Shiotani et al., 2007). همولوگ های این ژن شامل pthB  و pthC  در سویه های باکتری عامل شانکر مرکبات که باعث ایجاد فرم های B و C می شوند وجود دارند (Al-Saadi et al. 2007). این ژن درون خانواده ژنی به‌نام avrBs3/pthA (خانواده عفونت‌زایی و عدم‌ بیماری‌زایی) (افکتورهای TAL[3]) قرار دارد. این خانواده به‌طور گسترده در گونه‌های زانتوموناس وجود دارند (Vauterin et al. 1995; Shiotani et al., 2007). ژن  pthA در تمامی باکتری­های عامل شانکر مرکبات در حدود سه تا چهار کیلو جفت باز طول دارد. این ژن دارای نواحی تکراری پشت سرهم به تعداد 5/17 عدد می باشد که هر کدام از این تکرار‌ها 102 جفت باز مى‌باشد‌‌ و در قسمت مرکزی ژن وجود دارند. این ناحیه تکراری برای تعیین اختصاصیت میزبان و همچنین عفونت‌زایی لازم می‌باشد (Al-Saadi et al., 2007).  پروتئین PthA از 1163 آمینو اسید تشکیل گردیده است. قسمت میانی پروتئین PthA دارای 5/17 تکرار یکسان از 34 اسید‌آمینه می‌باشند که تعداد دقیق و آرایش واحد‌های تکراری در باکتری های مختلف متفاوت است. این تفاوت باعث عملکرد و اختصاصیت در هنگام ایجاد مقاومت و یا عفونت‌زایی در گونه‌های میزبان مربوطه در عدم حضور ژن‌های مقاومت می‌شود (Shiotani et al., 2007; Ponciano et al., 2003).

تولید گیاهان مقاوم به بیماری مهمترین راهکار در مبارزه با بیماری شانکر مرکبات می باشد. عدم دسترسی به گیاهان مقاوم و محدودیت وجود ژن­های طبیعی مقاومت بر علیه بیماری سبب گردیده تا استفاده از سایر منابع مقاومت با روش های مبتنی بر مهندسی ژنتیک مورد توجه قرار گیرد. یکی از راه کار های نوین در ایجاد گیاهان مقاوم به بیماری، استفاده از مکانیسم مقاومت حاصل از بیان آنتی بادی در گیاه[4] می باشد. استفاده از این مکانیسم تاکنون منجر به ایجاد مقاومت بر علیه تعداد زیادی از بیماری های ویروسی، باکتریایی و قارچی شده است (Safarnejad et al. 2011, Malembic-Maher et al. 2005; Li et al. 2008 , Cervera et al. 2010, Yajima, et al. 2010). در مکانیسم اخیر، مختل نمودن فرایند بیماری زایی با هدف قرار دادن پروتئین های ضروری پاتوژن توسط اتصال اختصاصی آنتی بادی-آنتی‌ژن صورت می‌پذیرد. بر این اساس پروتئین PthA با دارا بودن وظایف ضروری در ایجاد بیماری می تواند  یکی از بهترین کاندید ها در ایجاد مقاومت محسوب گردد. در تحقیقات قبلی آپتامر های اختصاصی با قابیلت اتصال به پروتئین PthA را در مورد سویه ایجاد کننده فرم A بیماری شانکر مرکبات ایجاد گردیده است (Zhao 2001). هدف نهایی از این تحقیق تولید گیاهان مقاوم به بیماری شانکر با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی پروتئین افکتور می باشد.

در ابتدا لازمه ایجاد گیاه مقاوم به بیمارگر با کمک آنتی بادی، خالص­سازی مهم­ترین پروتئین بیمارگر می­باشد که نقش اساسی در ایجاد بیماری دارد. لذا هدف از اجرای تحقیق حاضر، جداسازی، بیان ژن pthA، خالص­سازی و تولید انبوه پروتئین ژن مذکور می باشد که در ادامه به منظور تولید آنتی­بادی اختصاصی مونوکلونال در جهت ایجاد مقاومت به این بیمارگر با ایجاد گیاهان تراریخته مورد استفاده قرار می‌گیرد. 

مواد و روش ها

در این تحقیق از سویه شماره 88  باکتری X. citri subsp citri  (تهیه شده از کلکسیون موجود در پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فن آوری) که قبلاً از باغات مرکبات منطقه رودان استان هرمزگان جدا‌سازی شده بود، استفاده شد  (Pruvost et al. 2014). کشت باکتری بر روی محیط LB [5] جامد صورت گرفت و از تک کلون باکتری برای کشت انبوه در محیط مایع LB استفاده گردید.

جهت استخراج DNA از باکتری، ابتدا باکتری در 10 میلی‌لیتر محیط مایع LB به مدت یک شب در شیکر انکوباتور با دمای 28 درجه سلسیوس و دور دورانی 200 دور در دقیقه کشت شد. از کشت شبانه برای استخراج DNA باکتری استفاده شد. برای این منظور کیت استخراج (ExiProgen™ Bacteria Genomic DNA Kit, Cat No K-4314, South Korea) مطابق دستورالعمل مربوطه استفاده گردید.

مشاهده  DNA استخراج شده با استفاده از ژل آگاروز صورت پذیرفت و برای تعیین غلظت DNA استخراجی از نانودراپ اسپکتوفتومتر با جذب نوری  260  و 280 نانومتر استفاده شد. نمونه در دمای 80- درجه سلسیوس نگهداری گردید.

در این تحقیق قسمت یک چهارم انتهایی 3 پریم ژن pthA، با اندازه 606 جفت باز، به منظور جداسازی مورد استفاده قرار گرفت. طراحی آغازگر با استفاده از ترادف کامل ژن pthA موجود در بانک ژن (accession Nr. EF473086.1) صورت گرفت. جهت تسهیل در فرایند همسانه­سازی در ناقل بیانی ترادف­های مربوط به هضم آنزیمهای XhoI/SalI در انتهای 5 پریم آغازگر در نظر گرفته شدند.

واکنش PCR در حجم 15 میکرولیتر شامل 5/1 میکرولیتر بافر (10X) PCR، 75/0 میکرولیتر کلرید منیزیوم 50 میلی مولار MgCl₂، 3/. میکرولیتر از  dNTPs (10 میلی مولار)، 5/1 میکرولیتر آغازگر پیش رو (5΄ TAAAATGTCGACAATGCCACTCCCACCC 3΄  ) و 5/1 میکرولیتر آغازگر پس رو (5΄  TAAAATCTCGAGTTACTGAGGCAATAGCTC3΄)، 2/0 میکرولیتر (Unit/µl 5) از آنزیم Taq DNA Polymerase (Fermentas, Pittsburgh PA, USA) 1 میکرولیتر DNA قالب و 3/8 میکرولیتر آب دو بار تقطیر تهیه شد. واکنش در دستگاه ترموسایکلر با برنامه دمایی شامل 5 دقیقه در 94 درجه سیلسیوس و 35 چرخه، 94 درجه سیلسیوس به مدت یک دقیقه، 60 درجه سیلسیوس به مدت یک دقیقه، 72 درجه سیلسیوس به مدت یک دقیقه و 30 ثانیه و مرحله گسترش نهایی در 72 درجه سیلسیوس به مدت 10 دقیقه انجام شد. محصول PCR  روی ژل آگاروز 1% همراه با بافر TAE(1X)    (40 mM Tris-acetate , 10 mM EDTA) و با ولتاژ 100 الکتروفورز شد. استحصال باند مورد نظر از روی ژل با استفاده از کیت [6]MBST طبق دستور­العمل شرکت مربوطه صورت پذیرفت.

همسانه­سازی قطعه تکثیر شده ژن pthA در ناقل pTZ57R/T  به روش T/A کلونینگ و طبق دستورالعمل شرکت سازنده (Fermentas, Pittsburgh PA, USA) صورت پذیرفت.  تأیید همسانه­سازی در کلون­های حاصله به روش غربال کلنی سفید-آبی، کلنی PCR، هضم آنزیمی و همچنین تعیین ترادف توسط پرایمر های یونیورسال به روش اتوماتیک توسط شرکت ژن فن آوران صورت گرفت. استخراج پلاسمید بر مبنای تخریب قلیایی باکتری‌ها (Sambrook et al., 1996) انجام پذیرفت.

پس از اطمینان از صحت قطعه همسانه­سازی شده در کلون منتخب، انتقال قطعه ژنی pthA به پلاسمید بیانی pET28a با هضم آنزیمی صورت پذیرفت. برای این منظور سازه های-pthA  pTZ57R/T و پلاسمید بیانی به صورت جداگانه با آنزیم های XhoI/SalI واکنش داده شده و پس از جداسازی و خالص­سازی قطعات مربوطه از روی ژل آگاروز، الحاق قطعه ژنی pthA در ناحیه پایینی توالی تکرار شش تایی هیستیدین ناقل بیانی با استفاده از واکنش آنزیمی T4 DNA ligase صورت پذیرفت و سازه حاصله به روش شوک حرارتی(Sambrook et al., 1996) در سویه DH5α باکتری E.coli وارد گردید.

به منظور بیان ژن تولید کننده پروتئین افکتور، سازه بیانی حاوی ژن مربوطه، pET28a-pthA، با روش شوک حرارتی به سلول­های مستعد  سویه BL21(DE3)  باکتری E. coli منتقل شد. جهت بهینه­سازی تولید پروتئین در میزبان باکتریایی، بیان ژن در شرایط مختلف دمایی، تحت تاثیر غلظت­های مختلف 5/0 و 1 میلی مولار [7]IPTG و در زمان های متغیر (3، 6 و 16 ساعت) مورد بررسی قرار گرفت (Sadeghi et al., 2011). به منظور ارزیابی میزان بیان ژن pthA در باکتری در حالات مختلف بیانی، نمونه­هایی برداشت شد و بر روی ژل پلی­اکریل آمید حاوی سدیم دو دسیل سولفات[8] مورد بررسی قرار گرفت.

پس از بهینه­سازی شرایط بیان، خالص­سازی پروتئین نوترکیب افکتور تحت شرایط طبیعی با استفاده از ستون آگاروز حاوی یون­های نیکل صورت پذیرفت. برای این منظور ابتدا یک کلنی باکتری E. coli سویه BL21(DE3)  حاوی سازه pET28a-pthA در محیط کشت مایع LB  دارای آنتی­بیوتیک کانامایسین (50 میکروگرم در میلی لیتر)  به مدت 4-2 ساعت کشت شد تا جذب نوری  (OD _600nm) آن به 4/0 برسد. به منظور القاء باکتری برای تولید پروتئین نوترکیب افکتور، IPTG با غلظت 5/0 میلی مولار در حجم نهایی افزوده گردید و محیط کشت به مدت 16 ساعت در دمای 30 درجه سیلسیوس در انکوباتور شیکر‌دار با دمای 30 درجه سیلسیوس و با دور همزن 250 دور در دقیقه قرار داده ‌شد.

به منظور خالص­سازی پروتئین نوترکیب، ابتدا جداسازی سلول های باکتریای با انجام سانتریفیوژ در 4000 دور در دقیقه به مدت  20 دقیقه صورت پذیرفت. ته نشین[9] به صورت شبانه در 20- درجه سلسیوس نگهداری شد. معلق سازی رسوب با استفاده از بافر لیز کننده صورت گرفت و تخریب دیواره سلولی باکتری با استفاده از اموج صوتی اولتراسونیک با توان 150 وات به تعداد پنج دوره 30 ثانیه­ای با فواصل میانی 30 ثانیه بر روی یخ صورت گرفت. سلول­های تخریب شده به­مدت 30 دقیقه در سانتریفیوژ یخچال­دار با دمای چهار درجه سیلسیوس و با 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی جهت خالص­سازی جداسازی شد. خالص­سازی با روش کروماتوگرافی میل ترکیبی نیکل[10] انجام پذیرفت (Shahriyari et al., 2013). تایید مرحله بیان و خالص­سازی پروتئین توسط ژل پلی­اکریل آمید و همچنین آزمون وسترن بلاتینگ انجام گرفت (Ausubel et al., 1995). به منظور شناسایی پروتئین نوترکیب بر روی غشا پلی وینیلیدن دیفلوراید[11] از آنتی­بادی­های اختصاصی دنباله شش تایی هیستیدین[12] (Abcam, Cambridge, USA)  استفاده گردید. ظهور باندهای اختصاصی مربوط به پروتئین نوترکیب متصل به ترادف شش تایی هیستیدین با افزودن عامل اکسید کنندهNBT [13]و سابسترات [14]BCIP  ، صورت پذیرفت.

نتایج و بحث

استخراج DNA تحت شرایط لیز قلیایی صورت پذیرفت و محصول فرایند استخراج بر روی ژل آگاروز (شکل  1-الف) حاکی از خلوص بالای اسید نوکلئیک حاصله می باشد. غلظت DNA  بدست آمده توسط طیف­سنجی در حدود  70 نانوگرم بر میکرولیتر  محاسبه گردید.

به منظور جداسازی قطعه ژنی pthA، واکنش PCR انجام گرفت و سپس DNA تکثیر یافته بر روی ژل آگارز بررسی شد. نتایج حاصله حاکی از جداسازی و تکثیر  قطعه­ای در حدود 600 جفت باز بود (شکل1- ب).

به منظور تایید ماهیت قطعه تکثیر شده، با توجه به وجود سایت برشی آنزیم BamHI  در محل نوکلئوتید شماره 459 قطعه ژنی، محصول پی سی ار  با آنزیم برشی مذکور واکنش داده شد. محصول هضم آنزیمی بر روی ژل الکتروفورز حاکی از وجود  دو قطعه DNA به طول­های  459 و  147 جفت باز می باشد که موید صحت اندازه قطعه تکثیر شده می باشد (شکل1- ج).

شکل 1-  الف: استخراج دی‌ان‌ای ژنومی سویه 88 باکتری Xanthomonas citri subsp. citri چاهک 1:  دی‌ان‌ای استخراج شده باکتری. چاهک 2: نشانگر مولکولی 100 جفت بازی محصول شرکت  .Fermentas ب: محصول واکنش پی سی ار  بر روی ژل الکتروفورز. چاهک 1: نشانگر 100 جفت بازی. چاهک 2: ژن pthA با طول تقریبی  606 جفت باز. ج: برش قطعه ژنی pthA با آنزیم BamHI. چاهک1: قطعه ژنی pthAبریده شده با BamHI. چاهک 2: Ladder 100 bp. چاهک 3: محصول پی سی ار  قطعه ژنی pthA بریده نشده.

Figure 1- A: Extraction of DNA from strain 88 Xanthomonas citri subsp. citri, lane1: DNA extracted from bacteria. Lane 2: 100 bp molecular ladder. B: PCR product on agarose gel. Lane 1: 100 bp molecular ladder, lane 2: PthA gene with length around 606 bp. C: Digestion of pthA amplified fragment with BamHI enzyme. Lane 1: pthA fragment digested with BamHI, lane2: 100 bp ladder, lane 3: undigested pthA fragment.

پس از تکثیر و جداسازی قطعه ژنی pthA، باند مربوطه از روی ژل آگاروز جداسازی و خالص گردیده و در ناقل pTZ57R/T  همسانه سازی گردید. به منظور بررسی صحت فرایند همسانه سازی، آزمون کلنی PCR در مورد تعدادی از کلنی های انتخاب شده صورت پذیرفت که نتیجه حاصله حاکی از وجود قطعه ژنی مربوطه در تعدادی از نمونه های انتخاب گردیده می باشد (شکل 2-الف). صحت وجود قطعه مورد نظر در کلون های انتخاب شده با انجام آزمون های تکمیلی هضم آنزیمی (شکل 2-ب) و همچنین تعیین ترادف مورد تایید قرار گرفت. همترازی ترادف منبع اطلاعاتی NCBI، حاکی از وجود تشابه بسیار بالا (100-95 درصد) در ترادف این قطعه ژنی در سویه ها و یا حتی گونه های مختلف زانتاموناس می باشد. این تشابه به دلیل اهمیت وجود ساختار محافظت شده این پروتئین برای ایفای نقش اساسی آن در فرایند بیماری زایی به عنوان پروتئین افکتور می باشد  (Shiotani  et al., 2007, Nino-Liu et al., 2006). این ساختار به نحوی در بین باکتری های گرام منفی محافظت شده می باشد که گاها پروتئین PthA باکتری های بیماری‌زای گیاهی می توانند در سلول‌های جانوری نیز ایفای نقش نمایند (Mudgett 2005).

انتقال قطعه ژنی pthA   به ناقل بیانی pET28a با انجام هضم آنزیمی (شکل 2-ج) و الحاق مجدد صورت پذیرفت. تایید فرایند همسانه سازی با انجام آزمون های کلنی PCR و هضم آنزیمی مجدد صورت پذیرفت. ناقل بیانی pET28 به منظور تولید پروتئین های نوترکیب در میزبان باکتریایی مورد استفاده قرار می‌گیرد. این پلاسمید دارای ترادف های کد کننده دنباله هیستیدین[15]  می باشد که می تواند به صورت متصل به نواحی 5 پریم و یا 3 پریم ژن خارجی باشد. وجود این ترادف باعث تسهیل فرایند خالص سازی پروتئین نوترکیب با استفاده از ستون های حاوی یون نیکل می گردد (Berlec et al., 2006).

شکل 2- الف: نتایج آزمون کلونی پی‌سی‌ار جهت جداسازی کلون های حاوی قطعه ژنی pthA. چاهک های 1، 2 و 3 : کلون‌های دارای قطعه ژنی pthA. چاهک 4: کلون فاقد قطعه ژنی pthA. چاهک 5: نشانگر 100 جفت بازی. ب:  هضم آنزیمی به منظور جداسازی قطعه ژنی pthA از پلاسمید pTZ57R/T دارای این قطعه ژنی. چاهک 1: نشانگر 100 جفت بازی. چاهک 2: واکنش هضم آنزیمی پلاسمید pTZ57R/T دارای قطعه ژنی pthA و جدا‌سازی قطعه ژنی pthA، ج: جدا شدن قطعه ژنی pthA در اثر هضم آنزیمی پلاسمید pET28a-pthA. چاهک 1: نشانگر 1000 جفت بازی. چاهک 2: نشانگر 100 جفت بازی. چاهک 3: قطعه ژنی جدا شده pthA و پلاسمید pET28a. چاهک 4: پلاسمید نوترکیب هضم نشده

Figure 2- A: The product of colony PCR for selection of clonies harbouring pthA gene. Lanes 1, 2 and 3: positive clonies harbouring pthA gene, lane 4: empty clone, lane 5: 100 bp molecular ladder. B: Double digestion of pTZ57R/T-pthA construct for isolation of pthA gene. Lane 1: 100 bp molecular ladder, lane 2: Isolation of pthA gene from pTZ57R/T-pthA by double digestion of construct. B: Double digestion of pET28a-pthA for isolation of pthA gene, lane 1: 1000bp molecular ladder, lane2: 100 bp molecular ladder, lane 3: isolated fragment of pthA from pET28a-pthA, lane 4: undigested pET28a-pthA construct.

پلاسمید نوترکیب  pET28-pthA به سویه بیانی BL21(DE3)  باکتری E. coli منتقل شد و تولید پروتئین افکتور توسط IPTG تحت راه­انداز lac صورت پذیرفت. در طی مراحل مختلف بیان و خالص سازی پروتئین، نمونه­هایی برداشت گردیده و این روند با انجام الکتروفورز پروتئین مورد ارزیابی قرار گرفتند (شکل 3-الف). نتایج مربوطه نشان می دهد که تولید پروتئین PthA تحت تاثیر تیماری های مربوطه تغییر قابل توجهی نشان نداده است. نتایج تحقیقات قبلی بر روی پروتئین مشابه در شرایط مختلف متفاوت بوده است به نحوی که گاها میزان تولید تحت تاثیر تیمار های مشابه متغیر و یا یکسان بوده است (Zhao et al.,2001). تولید پروتئین در میزبان های خارجی به صورت نوترکیب از مهمترین راهکارها در مطالعات مربوط به بررسی نقش پروتئین و سایر موارد از قبیل تولید آنتی بادی های اختصاصی می باشد (Ariannejad etal., 2012; Papzan and Shahpiri 2012). عموما بیان پروتئین‌های نوترکیب در میزبان های خارجی با چالش‌هایی همراه می باشد. این مشکلات به دلیل عدم تطابق کامل بیان و یا فولدینگ پروتئین خارجی در سیستم بیانی میزبان جدید می باشد (Rosano & Ceccarelli, 2014). در خصوص تولید پروتئین PthA در باکتری E. coli به نظر می رسد که با توجه به تشابه نوع میزبان، که هر دو پروکاریوتیک می باشند، مشکل خاصی در بیان ژن مربوطه ایجاد نگردیده است ولی با توجه به اینکه پروتئین مذکور در حالت اصلی از سلول باکتری خارج می گردد، تولید آن تحت شرایط پری‌پلاسمیک بهتر انجام خواهد گردید.

در این تحقیق ناحیه یک چهارم انتهایی پروتئین PthA برای جدا سازی ژن مربوطه و تولید پروتئین در نظر گرفته شد. تحقیقات قبلی نشان داده است که این قسمت دارای نواحی لوسین زیپر[16] می باشد که باعث اتصال پروتئین به مولکول های DNA می گردد. همچنین این قسمت  دارای ترادف های جاگیری در هسته[17] و ناحیه فعال کننده رونویسی[18] می‌باشند که منجر به ایفای وظایف مهمی در فرایند بیماری زایی می گردند ((Shiotani et al., 2007, Yang and Gabriel, 1995). مشخص شده که ناحیه انتهایی کربوکسیل PthA بیشترین شانس را برای قرارگرفتن در سطح پروتئین دارد و بنابراین نقش مهمی را در اتصالات پروتئین-پروتئین دارا می باشد. این پروتئین در القاء واکنش فوق حساسیت در مرکبات نقش اساسی دارد (Zhao et al, 2001). بنابراین با توجه به نقش های حیاتی این قسمت از پروتئین در فرایند بیماری زایی، تولید و خالص سازی این قسمت به منظور تهیه آنتی‌بادی های اختصاصی  صورت پذیرفت.

پس از تخریب سلول­های باکتری و آزاد سازی پروتئین­های سلولی، جداسازی و خالص سازی پروتئین نوترکیب متصل به دنباله هیستیدین با استفاده از ستون آگاروز حاوی ذرات نیکل صورت پذیرفت.  نتایج بیان و خالص سازی پروتئین نوترکیب افکتور، حاکی از بیان مناسب این پروتئین در میزبان باکتریایی و خلوص بالای آن در نمونه خالص شده می­باشد (شکل 4).

شکل 3- الف: بررسی بیان ژن pthA در شرایط مختلف القایی بر روی ژل SDS- PAGE. چاهک 1: نشانگر پروتئینی 170 کیلودالتون. چاهک 2: نمونه قبل از القاء. چاهک 3: میزان بیان سه ساعت پس از القاء با IPTG،  5/0 میلی مولار. چاهک 4: بیان 3 ساعت پس از القاء با IPTG، 1میلی مولار. چاهک 5: بیان 6 ساعت پس از القاء با IPTG،  5/0 میلی مولار. چاهک 6: بیان 6 ساعت پس از القاء با IPTG، 1 میلی مولار. چاهک 7: بیان 16 ساعت پس از القاء با IPTG، 5/0 میلی مولار. چاهک 8: بیان 16 ساعت پس از القاء با IPTG 1 میلی مولار.

ب: آزمون وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی اختصاصی دنباله هیستیدین. چاهک 1: نشانگر پروتئینی. چاهک 2: بیان قطعه ژنی pthA  بعد القاء با IPTG 1 میلی مولار  به مدت شش ساعت و تولید پروتئین مربوطه به طول  26 کیلودالتون. چاهک 3: قبل از افزودن IPTG.

Figure 3- A: Assessment of expression of pthA gene in different inducing environments. Proteins were analyzed by SDS-PAGE. Lane 1: 170 kDa protein marker.  Lane 2: non-induced cells, lane 3: expression 3 hour after induction by 0.5 mM IPTG, lane 4: expression 3 hour after induction by 1 mM IPTG, lane 5: expression 6 hour after induction by 0.5 mM IPTG, lane 6: expression 6 hour after induction by 1 mM IPTG, expression 16 hour after induction by 0.5 mM IPTG, lane 8: expression 16 hour after induction by 1 mM IPTG. B: western blot analysis by applying anti his tag antibody. Lane 1: prestained marker, lane 2: expression 6 hour after induction by 1 mM IPTG, Lane 3: non-induced cells.

با مقایسه باند پروتئین خالص با باندهای موجود در نشانگر پروتئین، وزن پروتئین نوترکیب افکتور در حدود 26 کیلو دالتون تعیین گردید که از این مقدار 2/22 مربوط به پروتئین اصلی و مابقی مربوط به دنباله متصل به پروتئین ناشی از پلاسمید بیانی می باشد. میزان پروتئین حاصله با انجام مقایسه با پروتئین استاندارد آلبومین سرم خون[19] در حدود 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر تخمین زده شد. تولید پروتئین بصورت نوترکیب در سلول باکتری از جمله مرسوم ترین روش­ها برای تولید مقادیر مورد نیاز در امور تحقیقاتی و یا تجاری می باشد (Rosano & Ceccarelli, 2014). استفاده از این سیستم جهت بیان ژن­های خارجی در میزبان باکتری استفاده موارد متعدد برای تولید پروتئین نوترکیب استفاده گردیده است (Safarpur et al., 2012  , Shahriari et al., 2013 ).  ژائو[20] و همکاران در سال 2001 به منظور تولید آپتامر های اختصاصی بر علیهPthA، این پروتئین را به صورت کامل و همچنین ناحیه انتهایی کربوکسیل (100 آمینواسد انتهایی) را در میزبان باکتریایی بیان و خالص سازی نمودند. استفاده از این پروتئین ها منجر به تولید آپتامرهایی پروتئینی با طول 7 آمینواسید گردید که در آزمایشات in vivo، توانست باعث جلوگیری از فعالیت پروتئین افکتور گردد(Zhao et al., 2001). این تحقیق برای اولین بار ژن pthA از سویه ایجاد کننده فرم A* بیماری شانکر مرکبات جداسازی و بیان گردیده و خالص سازی پروتئین مربوطه به صورت نوترکیب صورت پذیرفت. تولید پروتئین نوترکیب PthA می تواند به منظور انجام واکنش های تداخل میزبان-پاتوژن[21] و همچنین برای تولید آنتی بادی های مونوکلونال نوترکیب و به منظور ایجاد مقاومت بر علیه بیماری با استراتژی مقاومت وابسته به پلانتی بادی[22] مورد استفاده قرار گیرد.

 شکل 4-  خالص­سازی پروتئین افکتور به صورت نوترکیب متصل به دنباله شش تایی هیستیدین بر روی ستون نیکل. چاهک 1: پروتئین تخلیص شده  PthA با وزن 26 کیلو دالتون. چاهک 2: نشانگر وزن مولکولی پروتئین.

Figure 4- Purification of efector protein as fussed to 6His tag on nickel column. Lane 1: Purified pthA protein with molecular weight around 26 kDa. Lane 2: protein molecular ladder.

سپاسگزاری:

نویسندگان مقاله بر خود لازم می دانند از همکاری صمیمانه دانشجویان و کارشناسان محترم بخش بیوتکنولوژی گیاهی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فن آوری تشکر و قدردانی نمایند.