بهینه سازی القاء و شرایط کشت ریشه‌های مویین تراریخته در گیاه دارویی گل میمونی بیابانی (Scrophularia deserti)

بهینه­سازی القاء و شرایط کشت ریشه­های مویین تراریخته در گیاه دارویی گل میمونی بیابانی (Scrophularia deserti)

راحله ابراهیمی¹، مراد جعفری*²، مرتضی قدیم­زاده²، بابک عبدالهی مندولکانی²

¹به ترتیب دانش آموخته کارشناسی ارشد رشته اصلاح نباتات، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه.

²دانشیار، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه.

تاریخ دریافت: 24/07/1393، تاریخ پذیرش: 29/03/1394

چکیده

گل میمونی بیابانی یک دارویی مهم متعلق به خانواده Scrophulariaceae است. تحقیقات نشان داده است که عصاره این گیاه دارای خواص ضد دیابتی و ضد سرطانی است. این گونه منبع با ارزشی از ترکیبات فعال بیولوژیکی مخصوصا گلیکوزیدهای ایروئیدی و فلاونوﺋﻴﺪها است. سیستم ریشه مویین می­تواند برای تولید درون شیشه­ای ترکیبات با ارزش دارویی استفاده شود. در این تحقیق، ریشه­های مویین تراریخته در گل میمونی بیابانی بواسطه تلقیح با باکتری Agrobacterium rhizogenes سویه A13 تولید شدند. تأثیر ریزنمونه­های مختلف (گیاهچه بدون ریشه­چه، کوتیلدون و برگ) تهیه شده از گیاهچه­های درون شیشه­ای با سنین مختلف (10، 18، 25، 50 و 72 روزه) در 3 زمان مختلف تلقیح (5، 15 و 30 دقیقه) بر کارآیی القاء ریشه مویین مورد بررسی قرار گرفت. حداکثر تعداد ریشه­های مویین (33/22 ریشه در هر ریزنمونه) در ریزنمونه­های گیاهچه­ای 18 روزه تلقیح شده با باکتری به مدت 5 دقیقه حاصل شد. تأیید تراریختی ریشه­های مویین بوسیله PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن­های rolA و rolB انجام گرفت. برای تعیین محیط کشت مناسب برای رشد بهینه ریشه­های مویین، دو لاین G و H در چهار محیط کشت مختلف(MS،MS  ½، B5 و PG_oB) کشت شدند. نتایج نشان داد که MS بهترین محیط کشت برای افزایش زیست توده ریشه­های مویین است. لاین H بیشترین زیست­توده (33/16میلی­گرم در 30 میلی­لیتر محیط کشت) را بعد از 4 هفته کشت تولید کرد. سیستم ریشه مویین ایجاد شده در این مطالعه می­تواند برای بررسی تولید متابولیت­های مهم دارویی گل میمونی بیابانی استفاده گردد.

واژه­های کلیدی: گل میمونی بیابانی، ریشه مویین تراریخته، ریزنمونه، محیط کشت.

مقدمه

گل میمونی بیابانی در کشورهای عربی حاشیه خلیج فارس و همچنین در ایران در بیشتر نواحی، بخصوص در نواحی غربی و جنوبی کشور از جمله در شهرهایی چون ایلام، کرمانشاه، همدان، خوزستان، اهواز، لرستان، بوشهر، هرمزگان و یزد یافت می­شود (Ghahreman, 2002). گل میمونی بیابانی دارای خواص ضد التهابی، ضد دیابتی، ضد سرطانی (Ahmed et al., 2003)، ضد باکتریایی و ضد قارچی (Bahmani et al., 2010) است. از مهمترین ترکیبات شیمیایی مهم آن می­توان به scropolioside-D2 و harpagosside B، از دسته گلیکوزیدهای ایروئیدی، اشاره نمود (Ahmed et al., 2003). گیاهان دارویی زیستگاه طبیعی محدودی داشته و بسته به شرایط محیطی و جغرافیایی محل رویش گیاه، جمع­آوری آنها با مشکلاتی همراه است. از طرفی مشکلات مربوط به اهلی نمودن، برداشت­های بی­رویه افراد بومی و چرای مفرط، آنها را در معرض خطر انقراض قرار داده است که گل میمونی بیابانی هم از این خطر در امان نیست. در سال­های اخیر کشت بافت و ریزازدیادی گیاهان، به عنوان تکنیکی پر سرعت در جهت باززایی سریع و تکثیر انبوه مواد گیاهی خارج از فصل و ایجاد گیاهان یکنواخت ژنتیکی بسیار مورد توجه بوده است (et al., 2011 Maleki). بررسی­ها نشان داده است که میزان متابولیت‌های ثانویه موجود در گیاهان کشت بافت شده خیلی بیشتر از میزان آن در گیاه طبیعی است و حتی سلول‌های گیاهان کشت بافت شده، متابولیت­هایی تولید می­کنند که در گیاه اولیه تولید نمی­شود (Hasanlu et al., 2008). با توجه به اینکه در طبیعت سرعت تولید متابولیت­های ثانویه آهسته بوده و مدت زمان طولانی برای تولید لازم است، بنابراین تولید متابولیت­های دارویی با استفاده از گیاهان وحشی اقتصادی نبوده و به نظر می­رسد که برای تولید سریع و انبوه آنها از فنون کشت سلول و بافت گیاهی به طور بهینه استفاده شود (Ionkova, 2007). پیشرفت در کشت بافت همراه با تکنیک­های مهندسی ژنتیک بویژه تکنیک تراریخته کردن، رویه جدیدی برای تولید مقدار بالای متابولیت­های ثانویه و سایر ترکیبات دارویی فراهم کرده است. از طرفی فناوری DNA نوترکیب و انتقال ژن بواسطه Agrobacterium برای مهندسی متابولیک گیاهان دارویی جهت تولید ترکیبات دارویی استفاده می­شوند.

باکتری Agrobacterium rhizogenes یک باکتری خاکزی است که موجب تولید ریشه مویین در محل زخم می­شود. انتقال T-DNAی پلاسمید Ri از این باکتری به سلول­های گیاهی باعث تولید ریشه­های مویین می­شود (Hasanlu et al., 2008). A. rhizogenes قادر است علاوه بر T-DNA پلاسمید Ri خود، T-DNAی موجود بر روی هر ناقل دوگانه دیگری را که در این باکتری حضور داشته باشد، به طور همزمان به سلول گیاه هدف منتقل نماید. بدین ترتیب در طی یک فرایند تراریزش مضاعف، باعث القای ریشه­های مویین تراریخته می‌گردد (Tomilov et al., 2007; Lee at al., 2004). امروزه استفاده از کشت ریشه­های مویین تراریخته به منظور تولید متابولیت­های ثانویه با ارزش از گیاهان دارویی بسیار گسترش یافته است (Giri & Narasu, 2000; Srivastava & Srivastava, 2007). بزرگترین مزیت ریشه­های مویین در مقایسه با گیاهان مادری، توان تولید بالای متابولیت­های ثانویه و ثبات ژنتیکی آن­ها می­باشد (Hasanlu, 2008). ریشه­های مویین تراریخته در گیاهان دارویی مختلف از جمله Salvia miltiorrhiza (Yan et al., 2005)، Cichorium intybus (Kabirnetaj et al., 2012)، Linum mucronatum ssp (Samadi et al., 2012)، Atropa belladonna (Zarei et al., 2013) و در جنس Scrophularia هم در گونه­های striata (Avish et al., 2014) و buergeriana (Park et al., 2010) تولید شده است. کارآیی تراریختی با A. rhizogenes و میزان القای ریشه مویین به عوامل مختلفی بستگی دارد. از فاکتور مهم و موثر می­توان به سویه باکتری و مدت زمان تلقیح (Cao et al. 2009; Weber et al., 2011) و نوع و سن ریزنمونه (Kabirnetaj et al., 2012; Reddy et al., 2012) اشاره نمود. همچنین بهینه سازی محیط رشد ریشه­های مویین از نظر ترکیبات و نوع مواد تشیکل دهنده محیط کشت جهت رشد مناسب و تولید بهینه زیست توده ضروری است (Shinde et al., 2010). بر اساس منابع علمی قابل دسترس، تاکنون مطالعات زیست­فناورانه روی گیاه گل میمونی بیابانی انجام نشده است. لذا با توجه به اهمیت دارویی این گیاه، در این تحقیق برای اولین بار تولید سیستم ریشه مویین در آن گزارش می­شود. در این تحقیق، اثر نوع و سن ریزنمونه­ها و نیز مدت زمان تلقیح با باکتری A. rhizogenes برای بهینه­سازی القاء ریشه­های مویین تراریخته و همچنین تعیین بهترین محیط کشت برای رشد بهینه ریشه­های مویین بررسی شده است.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی و تهیه ریزنمونه

بوته­های گیاه گل میمونی بیابانی همراه با بذور از دامنه کوه مانشت در شمال شرقی شهرستان ایلام جمع­آوری شدند و نمونه­های گیاهی توسط محققین مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان ایلام شناسایی و تایید شدند. بذور ابتدا در اسید سولفوریک 10 درصد به مدت 5 دقیقه تیمار شدند و پس از شستشو با آب مقطر جهت حذف اثر اسید، به مدت 72 ساعت با غلظت بهینۀ اسید جیبرلیک (ppm 1000، داده­ها نشان داده نشدند) در دمای C° 4 برای شکستن خواب بذر تیمار شدند. سپس بذور تیمار شده، در زیر هود لامینار به مدت 1 دقیقه در اتانول 70 درصد و سپس به مدت 5 دقیقه در هیپوکلریت سدیم تجاری 5/1 درصد (دارای 5 درصد کلر فعال) ضد عفونی شدند. در نهایت، بذور پس از سه بار آبکشی با آب مقطر استریل هر بار به مدت 5 دقیقه، در محیط کشت MS (Murashige & Skoog, 1962) با ویتامین­های B5 (Gamborg et al., 1968) حاوی 3 درصد ساکارز، 7/0 درصد آگار و بدون تنظیم­کننده رشد کشت شدند و کشت­ها در دمای ºC 2±24 درجه سانتی­گراد و شرایط نوری 16 ساعت روشنایی 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. گیاهچه­های درون شیشه­ای تولید شده به عنوان منبعی برای تهیه ریزنمونه جهت القاء ریشه مویین مورد استفاده قرار گرفتند.

آماده­سازی باکتری و تلقیح ریزنمونه­ها با باکتری

به منظور القاء ریشه مویین، از یک سویه وحشی باکتری A. rhizogenes یعنی "A13" که از دسته میکیموپین[1] است، استفاده شد. تهیه سوسپانسیون باکتری به روش Jafari و همکاران (2009) به شرح زیر انجام گرفت. یک کلونی از باکتری در محیط کشت مایع LB (Bertani, 1952) حاوی mg/l 50 آنتی­بیوتیک ریفامپیسین (Sigma، آمریکا) کشت گردید و کشت باکتری بر روی شیکر انکوباتور با دمای ºC 28 و با تکانش rpm 180 به مدت 48 ساعت قرار گرفت، سپس سوسپانسیون باکتری با سرعت rpm 3500 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شده و رسوب حاصل دوباره در محیط MS که pH آن روی 5/5 تنظیم شده بود، حل گردید. OD₆₀₀ سوسپانسیون باکتری برای تلقیح در محیط کشت LB بین 4/0 تا 6/0 تنظیم شد. ریزنمونه­های گیاهچه بذری (پس از حذف ریشه­چه)، کوتیلدون و برگ از گیاهچه­های بذری درون شیشه­ای با سنین مختلف 10، 18، 25، 50 و 72 روزه تهیه شده و در شرایط استریل در سوسپانسیون باکتری با در نظر گرفتن مدت زمان­های مختلف تلقیح (5، 10 و 30 دقیقه) غوطه­ور شدند. ریزنمونه­های تلقیح شده در روی کاغذ صافی، برای حذف باکتری اضافی، نسبتا خشک شدند و سپس روی محیط کشت MS حاوی g/l 7 آگار کشت و به مدت 4 روز در دمای ºC2±24 و شرایط تاریکی نگهداری شدند. پس از 4 روز کشت توام[2]، ریزنمونه­ها در محیط ½ MS  حاوی mg/l250 آنتی بیوتیک سفوتاکسیم (Duchefa، هلند) شستشو داده شده و در نهایت بر روی محیط کشت MS جامد حاوی mg/l 250 سفوتاکسیم و فاقد تنظیم­کننده رشد منتقل شدند. هر دو هفته یکبار واکشت ریزنمونه­ها انجام گرفت و در هر دوره واکشت، غلظت سفوتاکسیم به میزان mg/l 50 کاهش داده شد تا در نهایت از محیط کشت حذف گردید. در نهایت ریشه­های القا شده از ریزنمونه­ها جدا و برای رشد بیشتر در محیط کشت MS جامد بدون تنظیم­کننده رشد کشت شده و در اتاقک رشد با دمای ºC2±24 در تاریکی نگهداری شدند.

تایید مولکولی ریشه­های مویین

برای تایید مولکولی ریشه­های مویین، استخراج DNA از ریشه­های مویین احتمالی بدست آمده در محیط جامد و ریشه حاصل از ریزنمونه تلقیح نیافته (به عنوان شاهد) به روش CTAB (Khan et al., 2007) انجام گرفت. کمّیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از روش اسپکتروفتومتری و همچنین الکتروفورز روی ژل آگارز 8/0 درصد تعیین شد. جهت تایید وضعیت تراریختی ریشه­های مویین احتمالی، از روش PCR با آغازگرهای اختصاصی ژن­های rolA و rolB استفاده شد. آغازگر­ها برای تکثیر همزمان بخش­هایی از هر دو ژن مذکور طراحی شدند. توالی آغازگرها به صورت زیر بود: ʹ5-ATGGATCCCAAATTACTAATCCCCACGA-ʹ5 (آغازگر مستقیم) و ʹ3-TAAGGCTTCAGTCATACGGTCTACTGCAGC-ʹ3 (آغازگر معکوس). برنامه PCR شامل یک چرخه واسرشت­سازی اولیه در دمای C° 94 به مدت 5 دقیقه، 35 چرخه شامل واسرشت­سازی در دمای C° 94 به مدت 5 دقیقه، اتصال آغازگرها C° 5/55 به مدت 1 دقیقه و 20 ثانیه، بسط در دمای C° 72 به مدت 1 دقیقه و 30 ثانیه یک چرخه بسط نهایی در دمای C° 72 به مدت زمان 7 دقیقه بود. PCR در دستگاه ترموسایکلر مدل Veriti® 60-well Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific، آمریکا) انجام شد. محصولات PCR پس از الکتروفورز در ژل آگارز 8/0 درصد در دستگاه ژل داک مدل Gel Logic 212 Pro (Carestream Health، آمریکا) مورد مشاهده و عکسبرداری قرار گرفتند.

استقرار ریشه­های مویین در محیط مایع و انتخاب اولیه لاین­ها

پس از رشد مناسب ریشه­ها در محیط جامد و تایید تراریختی آنها بوسیله PCR، پنج لاین تراریخته مستقل از هم (A, G, V, H, M) یا رخدادهای تراریخته مستقل از هم[3] (یعنی هر کدام از این لاین­ها از یک تک سلول تراریخته مستقل حاصل شده­اند) که در محیط جامد بیشترین انشعابات و رشد ریشه را نشان داده بودند انتخاب و به منظور استقرار در محیط مایع و همچنین مقایسه میزان رشد آنها، در محیط مایع کشت شدند. بدین منظور، قطعات حاوی مریستم راسی (cm 3-4) از لاین­های انتخابی در محیط کشت MS مایع حاوی g/l 30 ساکارز در ارلن­های ml 100 منتقل و بر روی شیکر با دور rpm 100 و دمای ºC2±24 در تاریکی قرار گرفتند و هر دو هفته یکبار واکشت ریشه­ها انجام گردید. کشت­ها در همین شرایط نگهداری شدند. میزان تجمع زیست­توده تر^[4] ریشه­ها بر حسب گرم در 30 میلی­لیتر محیط کشت پس از 4 هفته یعنی در فاز ایستایی[5] تعیین شد.

مقایسه میزان رشد لاین­های ریشه مویین انتخابی در محیط کشت­های مختلف

بر اساس نتایج حاصل از مقایسه میزان رشد لاین­های انتخابی در مرحله اول در محیط کشت پایه MS (محیط کشت استفاده شده در طی فرآیند تراریختی)، دو لاین G و H به عنوان بهترین لاین انتخاب و اثر محیط کشت­های دیگر شامل B5، ½ MS و PG_oB (De Greef & Jacobs, 1979) بر میزان رشد ریشه­های مویین در مقایسه با محیط کشت اولیه مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور، mg 20±300 ریشه مویین وزن گردیده و در ارلن­های 100 میلی­لیتری حاوی ml 30 محیط کشت، کشت شدند و سپس بر روی شیکر با سرعت rpm 100 تحت شرایط تاریکی و دمای C° 2±24 نگهداری شدند. وزن تر ریشه­ها (گرم در 30 میلی­لیتر محیط کشت) هر هفته و طی 4 هفته متوالی پس از کشت اندازه­گیری و یادداشت برداری شد.

آنالیز آماری داده­ها

آزمایشات مربوط به تاثیر مدت زمان تلقیح و سن ریزنمونه (در هر ریزنمونه به طور جداگانه) بر میزان القاء ریشه مویین در قالب آزمایش فاکتوریل دو عاملی بر پایه طرح کاملا تصادفی و آزمایشات مربوط به تاثیر نوع محیط کشت بر رشد ریشه­های مویین در قالب طرح کاملا تصادفی در 3 تکرار انجام گردید. آزمایشات مربوط به انتخاب لاین برتر و تاثیر محیط کشت بر رشد لاین­ها دوبار تکرار شدند. آنالیز آماری داده­ها توسط نرم­افزار SAS 9.1 انجام گرفت. قبل از آنالیزهای آماری، آزمون نرمالیتی داده­ها انجام گردید و برای داده­های تعداد ریشه­های القاء شده تبدیل جذری انجام شد. مقایسه میانگین داده­ها با استفاده از آزمون حداقل تفاوت معنی­دار فیشر (FLSD[6]) محاسبه گردید و نمودارها توسط نرم­افزار Excel ترسیم شدند.

نتایج و بحث

تاثیر مدت زمان تلقیح، نوع و سن ریزنمونه بر القاء ریشه مویین

زمان ظهور ریشه­ها بر حسب سن ریزنمونه­ها متفاوت بوده بدین صورت که در ریزنمونه­های با سن پایین (گیاهچه­های 10 تا 25 روزه) اولین ریشه­ها پس از گذشت 9 روز، ولی در ریزنمونه­های با سن بالا (50 و 72 روزه) ریشه­ها بعد از 2 هفته ظاهر شدند و تا یک ماه پس از تلقیح، القاء ریشه مویین احتمالی از ریزنمونه­ها مشاهده گردید (شکل 1). همچنین در ریزنمونه­های بدون تلقیح با باکتری (شاهد) نیز القاء ریشه مشاهده شد. بدلیل القاء ریشه در ریزنمونه­های تلقیح نشده، دقت لازم برای گزینش ریشه­های مویین تراریخته از ریشه­های غیرتراریخته انجام شد که بدین منظور، قبل از آنالیز PCR، گزینش ریشه­ها بر مبنای سرعت رشد بالا و همچنین محل ظهور ریشه­ها انجام گرفت. در ریزنمونه­های تلقیح شده، ریشه­ها از مکان­های غیرمتعارف مانند اطراف گره کوتیلدونی (شکل 1، A)، از وسط و نزدیک به انتهای هیپوکوتیل گیاهچه بذری (شکل 1، E و F)، زیر برگ و کوتیلدون گیاهچه­های حقیقی (شکل 1، G و H) القاء شدند، ولی در ریزنمونه­های تلقیح نشده ریشه­های نابجا عمدتا از انتهای هیپوکوتیل گیاهچه­ها، احتمالا به دلیل بقایای مریستم ریشه در اثر برش نادرست، القا گردید (شکل 1، I). لذا ریشه­های القا شده از وسط برگ، کوتیلدون و هیپوکوتیل که از رشد سریع و بیشتری هم برخوردار بودند، بوسیله PCR مورد بررسی قرار گرفتند.

شکل 1- القاء ریشه­های مویین احتمالی در ریزنمونه­های مختلف گیاه گل میمونی بیابانی بواسطه A. rhizogenes. A: کوتیلدون، B و C: برگ، D، E و F: گیاهچه­های بذری ۱۸-۱۰ روزه (پس از حذف ریشه­چه)، G و H: گیاهچه­های 25 روزه، I: گیاهچه بذری ۱۰ روزه بدون تلقیح با باکتری (شاهد).

Figure 1- Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root induction from different explants of Scropholaria deserti. A: Cotyledon; B and C: Leaf; D, E and F: 10-18 day-old seedlings (after cutting off radicle); G and H: 25-day old seedlings; I: 10-day-old non-transformed seedling (control).

نتایج حاصل از تجزیه واریانس اختلاف آماری معنی­دار (01/0 > P) بین سن ریزنمونه­ها، زمان تلقیح و برهمکنش ریزنمونه با زمان تلقیح از نظر تعداد ریشه مویین القاء را نشان داد. بر اساس نتایج مقایسات میانگین، در ریزنمونه برگ (شکل 2، A) بیشترین تعداد ریشه مویین تراریخته در برگ­های تلقیح شده با سن 72 روزه (22/10 ریشه در هر ریزنمونه) و کمترین تعداد ریشه در برگ­های تلقیح شده با سن 18 روزه (92/4 ریشه در هر ریزنمونه) مشاهده گردید و در ریزنمونه­های 10 روزه ریشه­ای القا نشد. در ریزنمونه کوتیلدون (شکل 2، B)، بیشترین تعداد ریشه مویین تراریخته در کوتیلدون­های تلقیح شده 18 روزه (16/7 ریشه در هر ریزنمونه) و کمترین تعداد ریشه در ریزنمونه با سن 10 روز (03/4 ریشه در هر ریزنمونه) مشاهده گردید و در ریزنمونه­های 50 و 72 روزه ریشه­ای القا نشد. در ریزنمونه­های گیاهچه­ای (شکل 2، C)، بیشترین تعداد ریشه مویین در ریزنمونه­های تلقیح شده دارای سن 18 روزه (33/16 ریشه در هر ریزنمونه) و کمترین تعداد ریشه در ریزنمونه­های 25 روزه (8 ریشه در هر ریزنمونه) مشاهده شد و در ریزنمونه­های 50 و 72 روزه ریشه­ای القا نگردید. به طور کلی با مقایسه نوع ریزنمونه، بیشترین تعداد ریشه مویین تراریخته در ریزنمونه­های گیاهچه­ای با سن پایین (18 روزه) مشاهده گردید (شکل 2، C) و از نظر سن ریزنمونه، با افزایش سن ریزنمونه­های برگی، تعداد ریشه القاء افزایش نشان داد ولی در ریزنمونه گیاهچه­ای و کوتیلدونی این روند برعکس بود. اگرچه در ریزنمونه­های گیاهچه بدون ریشه­چه تلقیح نشده هم ریشه­های نابجا القا شدند با اینحال فراوانی چنین ریشه­هایی بسیار کمتر از ریشه­های القا شده از ریزنمونه­های تلقیح شده بود (شکل 2، D) که بیانگر فراوانی بالای ریشه مویین تراریخته در ریزنمونه­های تلقیح شده در مقابل القاء خود بخودی ریشه نابجا در ریزنمونه­های تلقیح نشده است.

نوع و سن ریزنمونه گیاهی تاثیر بسیار مهمی بر توانایی تولید ریشه مویین دارد، زیرا سن سلول گیاهی تعیین کننده ویژگی­های فیزیولوژیکی آن است (Kabirnetaj et al., 2012). در تحقیق حاضر زمان القاء ریشه­های مویین بسته به سن ریزنمونه­ها متفاوت بود، در ریزنمونه­های با سن 10 تا 18 روزه در کوتاهترین زمان (پس از 9 روز) ریشه­ها ظاهر شدند ولی در ریزنمونه­های 50 و 72 روزه ریشه­های مویین احتمالی دیرتر (2 الی 4 هفته ماه بعد از تلقیح) القا شدند. هر چه تعداد روزهای لازم جهت ظهور ریشه­های مویین کمتر باشد از نظر صرفه­جویی در وقت بسیار مطلوب می­باشد (Cao et al., 2009; Weber et al., 2011). پاسخ وابسته به ریزنمونه از نظر زمان القاء ریشه مویین در گیاهان دارویی دیگر نیز گزارش شده است، به عنوان مثال در ریزنمونه­های برگی درمنه خزری Soleimani et al., 2012))، خرفه (Pirian & Piri, 2012) و Coleus forskohlii Briq (Reddy et al., 2012) به ترتیب 7 تا 10 روز، 10 روز و 4-1 هفته پس از تلقیح و در ریزنمونه­های کوتیلدونی کاسنی، 8 روز پس از تلقیح اولین ریشه­های مویین ظاهر شدند (Kabirnetaj et al., 2012).

شکل 2- تاثیر نوع و سن ریزنمونه بر میزان القاء ریشه‌های مویین تراریخته. A: ریزنمونه برگی، B: ریزنمونه کوتیلدونی، C: ریزنمونه گیاهچه­ای بدون ریشچه. D: میانگین تعداد ریشه­های مویین تراریخته (میانگین تمام ریزنمونه­ها) در مقایسه با ریشه­های مویین نابجا (ریشه­های غیرترایخته) حاصل از ریزنمونه­های تلقیح نیافته. حروف غیریکسان در بالای هر ستون نشان دهنده اختلاف آماری معنی‌دار (01/0 > P) بر اساس آزمون FLSD است.

Figure 2- The effects of type of explant and age on induction of transgenic hairy roots. A: Leaf explant; B: Cotyledon explant; C: Seedling explant without radicle; D: Mean number of transgenic hairy root versus adventitious hairy root (non-transgenic roots) raised from nontransformed explants. Bars followed by the different letters are significantly different (P < 0.01) according to FLSD test.

تاثیر مدت زمان تلقیح بر القاء ریشه مویین

نتایج مقایسات میانگین (شکل 3، A-C) نشان داد که در هر سن ریزنمونه بین زمان­های تلقیح از نظر تعداد ریشه مویین القاء اختلاف معنی­دار آماری (01/0 > P) وجود دارد. اگر چه در همه زمان­های تلقیج القاء ریشه مویین مشاهده شد، با اینحال میزان القاء در ریزنمونه­های برگ و کوتیلدون در مدت زمان تلقیح 30 دقیقه­ای بیشترین مقدار بود، ولی در ریزنمونه گیاهچه مدت زمان تلقیح 5 دقیقه­ای باعث القاء بیشترین تعداد ریشه مویین شد. نتایج این آزمایش نشان داد که مدت زمان تلقیح بهینه برای موفقیت در تراریختی کارآمد به نوع و سن ریزنمونه بستگی دارد.

شکل 3- تاثیر مدت زمان تلقیح با rhizogenes Agrobacterium بر القاء ریشه مویین در ریزنمونه­های گیاهچه، برگ و کوتیلدون جدا شده از گیاهچه­های درون شیشه­ای. A: ریزنمونه برگی، B: ریزنمونه کوتیلدونی، C: ریزنمونه گیاهچه­ای (ریشه­چه حذف شده). حروف غیریکسان در بالای هر ستون نشان دهنده اختلاف آماری معنی­دار (01/0 > P یا 05/0 > P) بر اساس آزمون FLSD است.

Figure 3- Effect of Agrobacterium rhizogenes inoculation time on hairy root induction in different explants isolated from in vitro-raised seedlings. A: Leaf explant; B: Cotyledon explant; C: Seedling explant without radicle; D: Bars followed by the different letters are significantly different (P < 0.01 or P < 0.05) according to FLSD test.

تایید وضعیت تراریختی ریشه­های مویین

اگر چه رشد پلاژیوتروپیک^[7] (ورین­گرا، سوگرائی به صورت انشعابات افقی) سریع با تولید انشعابات فراوان در محیط کشت فاقد تنظیم­کننده رشد، معرف مویین بودن ریشه­ها بود، ولی با این­حال ماهیت تراریختی آنها بوسیله PCR مورد بررسی قرار گرفت. PCR برای ریشه­های تراریخته احتمالی حضور نوار مورد انتظار bp 1105 مربوط به تکثیر همزمان بخش­هایی از ژن­های rolA و rolB را نشان داد که با نوار حاصل از شاهد مثبت (باکتری مورد استفاده در تلقیح) هم اندازه بود، در مقابل برای ریشه­های حاصل از ریزنمونه تلقیح نیافته (شاهد منفی) نواری در تکثیر نگردید (شکل 4). با توجه به اینکه ریشه­های مویین در واکشت­های مختلف در محیط کشت جامد و همچنین در محیط کشت مایع بدون آنتی­بیوتیک سفوتاکسیم فاقد هر گونه آلودگی آگروباکتریوم بودند، لذا احتمال حضور باکتری در فضاهای بین سلولی تقریبا صفر بود و نوار تکثیر شده در PCR برای نمونه­های DNA ریشه­های مویین احتمالی، نشان دهنده تلفیق ژن­های rol در ژنوم آنها است و بدین ترتیب تراریخته بودن ریشه­ها بوسیله PCR تایید شد.

بررسی میزان تجمع زیست­توده تر در لاین­های ریشه مویین مختلف

از آنجا که ریشه­های مویین از ریزنمونه­های مختلف و یا از بخش­های مختلف یک ریزنمونه القاء شده بودند، بنابراین می­توان هر ریشه مویین را یک لاین یا رخداد تراریخته مستقل در نظر گرفت. لذا برای بررسی فنوتیپ رشدی لاین­های ریشه مویین، 5 لاین تراریخته مستقل از هم انتخاب شدند. بر اساس نتایج حاصل از تجزیه واریانس (داده­ها نشان داده نشدند)، بین لاین­های مختلف از نظر تولید زیست توده اختلاف آماری معنی­دار (01/0 > P) وجود داشت. در بین لاین­های ریشه مویین، بیشترین و کمترین وزن تر متعلق به لاین­های H و V (به ترتیب gr 17/16 و gr 86/15 در هر ml 30 محیط کشت) و A (gr 27/9 در هر ml 30 محیط کشت) در انتهای هفته سوم بود، در حالیکه ریشه غیرتراریخته (شاهد) پس از 3 هفته کمترین رشد و تجمع زیست توده (gr 97/5 در هر ml 30 محیط کشت) را نشان داد (شکل 5). بالا بودن (تقریبا 3 برابر) زیست توده تولید شده در ریشه­های حاصل از ریزنمونه­های تلقیح شده نسبت به ریشه شاهد در یک محیط فاقد تنظیم­کننده رشد تأییدی دوباره بر مویین بودن این ریشه­ها از لحاظ سریع الرشد بودن آنها است (شکل 6).

شکل 4- الگوی PCR ریشه­های مویین تراریخته گل میمونی بیابانی با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن­های rolA-B. :M 1Kb DNA Ladder (Fermentas)، چاهک­های 6-1: لاین­های ریشه مویین حاصل از ریزنمونه­های مختلف تراریخته، چاهک C⁺: A. rhizogenes سویه A13 به عنوان شاهد مثبت، چاهک C^‒: ریشه نابجای حاصل از ریزنمونه غیرتراریخته به عنوان شاهد منفی اول، چاهک 7: واکنش PCR بدون DNA به عنوان شاهد منفی دوم.

Figure 4- PCR pattern of hairy roots of Scrophularia deserti using the rolA-B genes specific primers. M: 1 Kb DNA Ladder (Fermantas); Lane C⁺: A. rhizogenes strain A13 as positive control; Lane C^¯: Adventitious root raised form non-transformed explant as first negative control; Lanes 1-6: Transgenic hairy root lines raised from different transformed explants; Lane 7: Non-DNA template PCR reaction as second negative control.

شکل 5- مقایسه میزان رشد بر اساس تجمع زیست توده تر در لاین­های مختلف ریشه­های مویین (A, G, H, M, V) کشت شده در محیط کشت پایه MS مایع بدون تنظیم کننده رشد در یک دوره کشت سه هفته­ای. Control: ریشه حاصل از ریزنمونه تلقیح نشده.

Figure 5- Comparison of growth rate on a fresh biomass accumulation basis in hairy root lines (A, G, H, M and V) cultured on liquid growth regulator-free MS basal medium over a 3-week growth period. Control: root raised from the non-transformed explant.

شکل 6- استقرار ریشه­های مویین تراریخته در محیط کشت مایع بدون تنظیم کننده رشد و تولید زیست توده. A و B: رشد ریشه مویین در محیط کشت MS جامد بدون تنظیم کننده رشد به ترتیب پس از 10 و 21 روز کشت و ایجاد وضعیت توری مانند به دلیل رشد پلاژیوتروپیک و درجه بالای انشعاب­دهی، C و D: رشد نمایی ریشه­های مویین در محیط کشت MS مایع بدون تنظیم کننده رشد به ترتیب پس از 14 و 28 روز کشت. E: رشد بسیار کم ریشه نابجا القا شده از ریزنمونه تلقیح نیافته در محیط کشت جامد بدون تنظیم کننده رشد، F: رشد کم با انشعاب بسیار کم و تشکیل ساختار شبه کالوس در ریشه نابجای غیرتراریخته در محیط کشت MS مایع بدون تنظیم کننده رشد پس از 28 روز کشت.

Figure 5- Establishment of hairy roots in growth regulator-free liquid medium and biomass production. A and B: Growth of hairy root on solid growth regulator-free MS medium after 10 and 21 days of culture, respectively and making a mesh-like structure due to its plagiotropic growth and high degree lateral of branching. C and D: Exponential growth of transgenic hairy roots in liquid growth regulator-free MS medium after 14 and 28 days of culture, respectively; E: Lowest growth rate in adventitious root, raised from non-transformed explant cultured on solid growth regulator-free MS medium; F: low growth with lower branching of the non-transformed root and formation of callus-like structure on liquid growth regulator-free MS medium after 28 days of culture.

در مطالعه حاضر، لاین­های مورد بررسی از نظر رشد و تجمع زیست­توده تنوع معنی­داری نشان دادند. تنوع در مورفولوژی و فنوتیپ رشدی ریشه­های مویین ممکن است به دلیل بیان ژن­های T-DNA در داخل ریشه­های مویین، تعداد متفاوت کپی­های T-DNA که منتقل می­شوند و اثرات ادغام T-DNA در ژنوم میزبان باشد (Cho et al., 1998). علاوه بر عوامل فوق الذکر، چنین تنوعی به میزان بیان ژن­های rol نیز نسبت داده می­شود، چرا که بیان این ژن­ها، سطوح تنظیم کننده­های اکسینی و سیتوکینینی درونی و یا میزان حساسیت سلول­های گیاهی به سطوح آنها را تغییر می­دهد .(Shen et al., 1988) Mano و همکارن (1989) نیز تنوع قابل ملاحظه­ای در سرعت رشد، تجمع متابولیت­های ثانویه و بازدهی 45 لاین ریشه مویین گیاه Duboisia leichhardtii گزارش نمودند. Soleimani و همکاران (2012) در مقایسه لاین­های ریشه مویین گیاه درمنه خزری، آنها را از نظر ویژگی رشدی به گروه­هایی با انشعابات فراوان، سرعت رشد خوب و غیر کالوس­زا و لاین­های تولید کننده کالوس با سرعت رشد متفاوت تقسیم­بندی کردند (Soleimani et al., 2012).

تأثیر محیط کشت­های مختلف بر روی زیست­توده تر ریشه­های مویین

دو لاین G و H از نظر میزان رشد در بین لاین­های مختلف متمایز بودند. لذا این دو لاین علاوه بر محیط کشت پایه MS در محیط کشت­های مختلف طی 4 هفته مورد مقایسه قرار گرفتند. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که نوع محیط کشت و زمان تلقیح تاثیر معنی­داری (01/0 > P) بر تجمع زیست­توده تر ریشه­های مویین دارد (داده­ها نشان داده نشدند). نتایج مقایسه میانگین­ها نشان داد که بیشترین وزن تر در لاین­های G و H (به ترتیب gr 12 و gr 33/16 به ازای هر ml 30 محیط کشت) در محیط کشت MS و کمترین زیست توده (gr 14/2 برای لاین G و gr 80/2 برای لاین H) با استفاده از محیط کشت PG_oB در انتهای هفته چهارم مشاهده گردید (شکل 7، A و B). محیط­های کشت بر اساس میزان رشد و تولید زیست­توده در لاین­ها به صورت MS > B5 > ½ MS > PG_oB رتبه بندی شدند. به نظر می­رسد تغییر مقادیر مواد مغذی محیط کشت، تأثیر قابل ملاحظه­ای بر رشد ریشه­های مویین دارد و غلظت و نوع مواد تشکیل دهنده محیط کشت در میزان رشد یک لاین ریشه مویین تاثیر به سزایی دارد. بنابراین، بهینه سازی محیط کشت به منظور رشد مطلوب و افزایش تجمع متابولیت­ها در کشت ریشه­های مویین است بسیار حائز اهمیت است (Condori et al., 2010; Shinde et al., 2010). در این تحقیق، دو لاین G و H در 4 نوع محیط کشت مختلف مورد بررسی قرار گرفت که محیط MS مناسب­ترین محیط کشت برای افزایش زیست­توده در لاین­های ریشه مویین بود. تحقیقات گذشته حاکی از تأثیر بسیار مهم نسبت کربن به نیتروژن (C/N) در گیاهان و تولید متابولیت­های ثانویه به ویژه آلکالوییدها است (Wink, 1999). نوع قند موجود در محیط کشت و نسبت آن در مقایسه با ترکیبات نیتروژنه، اثر تعیین کننده­ای بر میزان آلکالویید­ها به ویژه تاکسوﺋﯿﺪ در کشت سلولی سرخدار داشت (Hirasuna et al., 1996). به طور کلی نقش تعیین کننده ترکیبات نیتروژنه در افزایش متابولیت­ها به حضور نیتروژن به عنوان مولکول اصلی در ترکیب اسیدهای آمینه و بعضی از متابولیت­های حاصل از آنها نسبت داده می­شود (Facchini et al., 2001). در تحقیق حاضر هم وجود ارتباط مستقیم میان مقدار تجمع زیست­توده و ترکیبات نیتروژنه محیط کشت مشهود است و در بین محیط کشت­های استفاده شده، محیط کشت­های MS و B5 دارای بیشترین میزان نیتروژن (به ترتیب 5/32 و 8/26 میلی­مولار) هستند و تأثیر قابل توجه آن­ها بر میزان زیست­توده ریشه­ها موید این موضوع است. مشابه با نتایج تحقیق حاضر، در آزمایشی طی مقایسه اثر سه نوع محیط کشت MS، B5 و LS بر میزان رشد ریشه­های موﺋﯿﻦ در گیاه کاسنی، محیط کشت MS به عنوان مناسب­ترین محیط کشت معرفی گردید (Kabirnetaj et al., 2012). در گیاه Scrophularia buergeriana Miquel از 4 نوع محیط کشت مورد بررسی (MS, 1/2 MS, SH, 1/2 SH)، محیط ½ MS مناسب­ترین محیط برای کشت ریشه­های مویین گزارش شد (Park et al, 2010). مطالعات انجام شده در کشت ریشه مویین گیاه Glycrrhiza glabra نشان داد که از میان 4 تیمار محیطی MS, NB, WP و B5، محیط کشت NB بیشترین تاثیر را بر سرعت رشد و در نتیجه وزن خشک آن داشته است (Mehrotra et al., 2008). این تفاوت در نتایج را می­توان به تفاوت در نوع ژنوتیپ گیاهی و تفاوت در نیازهای فیزیولوژیکی و رشدی گیاه و همچنین نوع سویه باکتری مورد استفاده نسبت داد (Shakti et al., 2008). تحقیق حاضر برای اولین بار القاء بهینه ریشه مویین در گیاه گل میمونی بیابانی را گزارش نمود. بر اساس نتایج حاصل، میزان القاء ریشه مویین بسته به سن و نوع ریزنمونه و مدت زمان تلقیح متفاوت بود. بیشترین میزان ریشه مویین در ریزنمونه­های گیاهچه­ای با سن 18 روزه و مدت زمان تلقیح 5 دقیقه­ای حاصل شد. در بین لاین­های ترایخته ریشه مویین، دو لاین H و G به عنوان بهترین لاین­ها از نظر میران تجمع زیست­توده در محیط کشت MS انتخاب شدند. در مطالعات بعدی این لاین­ها می­توانند برای بررسی تولید متابولیت­های ثانویه مهم این گیاه از طریق روش­های زیست­فناورانه مانند استفاده از عوامل محرک[8] و یا دستکاری­های ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرند.

شکل 7- اثر محیط­های کشت مختلف بر تجمع زیست توده تر لاین­های ریشه مویین تراریخته G و H کشت شده در 30 میلی لیتر محیط کشت مایع بدون تنظیم کننده رشد در یک دوره کشت 4 هفته­ای. A. لاین G، B: لاین H. میزان تجمع زیست توده به صورت وزن تر در هر 30 میلی­لیتر هر هفته طی یک دوره­ای 4 هفته­ای اندازه­گیری شد.

Figure 7- Effect of different culture media (B5, PG_oB, ½ MS and MS) on accumulation of fresh biomass in transgenic hairy root lines G and H cultured on 30 ml liquid growth regulator-free medium over a 4-week growth period. Control: root raised from the non-transformed explant.  A: Line A; B: Line H. Biomass accumulation was measured as free weight per 30 ml culture medium.

سپاسگزاری

از پژوهشکده علوم و زیست ­فناوری دانشگاه ارومیه به خاطر در اختیار گذاشتن امکانات لازم برای آنالیز PCR کمال تشکر و قدردانی می­شود.