نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد گروه بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس
2 دانشیار گروه بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس
3 دانشیار گروه اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Flowers of Gladiolus sp. are among the top six flowers of export value and in Iran take the second place in the production of cut flowers. Cucumber mosaic virus is one of the most common viruses in gladiolus worldwide. As, the gladioli are propagated through corms, therefore viral diseases could be easily transmitted to the next generation. To produce healthy stock plants, it is important to produce and culture virus-free corms. In the present research, thermotherapy along with meristem culture, electrotherapy along with meristem culture and meristem culture alone were employed to eliminate CMV from infected gladiolus plants. CMV detection using DAS-ELISA showed that 73 percent of the regenerated plants were free of viruses whereas, RT-PCR analysis showed that 42 percent of plants were virus-free. The efficiency of virus elimination from thermo-treated meristems culture with size 0.5 were 100%. This is the first report of application of electrotherapy for CMV elimination from gladiolus plants and the best results were obtained by using 15 milliamps for 15 minutes. The results showed that thermotherapy along with meristem culture was a more efficient method for elimination of CMV from infected gladiolus plants.
کلیدواژه‌ها [English]
حذف ویروس موزاییک خیار از گلایل با استفاده از روشهای کشت مریستم، گرمادرمانی و برقدرمانی
ثریا تورنگ1، مسعود شمس بخش*2، احمد معینی3
1دانش آموخته کارشناسی ارشد گروه بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس.
2دانشیار گروه بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس.
3دانشیار گروه اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس.
تاریخ دریافت: 01/07/1393، تاریخ پذیرش: 29/08/1394
چکیده
گل گلایل (Gladiolus sp.) جزء شش گل برتر صادراتی در دنیا میباشد و در ایران نیز مقام دوم تولید گل شاخهبریده را به خود اختصاص دادهاست. ویروس موزاییک خیار (Cucumber mosaic virus, CMV) از جمله ویروسهای شایع گل گلایل است. از آنجاییکه گلایل به روش رویشی از طریق پداژه تکثیر میشود، آلودگی ویروسی به آسانی به نسل بعد منتقل میشود. از اینرو کنترل ویروسهای گلایل از طریق استفاده از گیاهان مادری سالم دستیافتنی است. در تحقیق حاضر روشهای کشت مریستم و کشت مریستم همراه با گرمادرمانی و برقدرمانی برای حذف CMV از گیاهان آلوده بهکار گرفته و کارایی این روشها مقایسهشد. در مجموع ردیابی CMV با استفاده از آزمون الایزا نشان داد که 73 درصد از گیاهان باززایی شده عاری از ویروس بودند درحالیکه ردیابی با آزمون RT-PCR نشان دادکه 42 درصد گیاهان عاری از ویروس شدند. بهترین نتیجه حذف ویروس از کشت مریستم گرمادرمانی شده در اندازه 5/0 میلیمتر بدست آمد که در نتیجه همهی گیاهان تیمارشده عاری از ویروس شدند. این اولین گزارش از کاربرد برقدرمانی برای حذف CMV از گیاهان گلایل آلوده میباشد، بهترین نتیجه برق درمانی از تیمار شدت جریان 15 میلی آمپر همراه با کشت مریستم به مدت 15 دقیقه به دست آمد. همچنین نتایج بهدستآمده نشان داد که گرمادرمانی همراه با کشت مریستم روش مناسبتری برای حذف CMV از گیاهان گلایل آلوده بود.
واژههای کلیدی: گلایل، ویروس موزاییک خیار، ویروس زدایی.
مقدمه
گل زینتی گلایل (Gladiolus sp.) متعلق به خانواده Iridaceae با بیش از 180 گونه است که گونه‌های اصلاح شده آن از جمله مهمترین گیاهان زینتی شاخه بریده و تکلپهای در دنیا بشمار میرود و جزء شش گل برتر صادراتی میباشد (Dubey & Singh, 2010). در ایران نیز تولید گل گلایل اهمیت زیادی داشته و پس از گل رز رتبه دوم تولید گل شاخهبریده را به خود اختصاص میدهد (Anonymous, 2010).
ویروس موزاییک خیار Cucumber mosaic virus متعلق به جنس Cucumovirus و خانواده Bromoviridae میباشد. این ویروس توسط 60 گونه شته بهصورت ناپایا منتقل میشود و بیش از 1300 گونه گیاهی متعلق به 500 جنس و بیش از 100 خانواده شامل انواع سبزیها، گیاهان زینتی، علفهای هرز و سایر گیاهان را آلوده میکند (Duarte et al., 2013). علایم بیماری ناشی از ویروس بستگی به استرین بیمارگر، رقم گلایل و شرایط آب و هوایی متفاوتاست و شامل موزاییک، کوتولگی، کلروز، رگههای زرد در برگها، شکستگی رنگ گلبرگها، کاهش میزان گلدهی و ریزبودن پداژه میباشد (Duarte et al., 2013; Raizada et al., 1989).
قارچها و باکتریهای بیمارگر معمولآ علایم مشخصی روی پداژهها ایجاد میکنند، بنابراین پداژههای آلوده بههنگام کاشت شناسایی و حذف میشوند یا عوامل بیماریزای آنها توسط قارچکش و باکتریکش کنترل میشوند. بهدلیل عدم بروز علایم مشخص آلودگی ویروسی روی پداژههای گلایل، آلودگی به ویروسها مخفی میماند و سبب خسارت میشود. بعلاوه، تکثیر ارقام گلایل از طریق اندام رویشی (پداژه) است و در نتیجه ویروسها از نسلی به نسل بعد منتقل و باعث افزایش شدت خسارت بیماری از سالی به سال دیگر میشوند و همچنین انتقال پداژههای آلوده به ویروس به نقاط مختلف دنیا سبب اشاعه ویروس میشود. بنابراین، استفاده از مواد گیاهی سالم مناسبترین و مؤثرترین راه مدیریت بیماریهای ویروسی به شمار میرود و از جمله روشهای رایج در تولید اندامهای تکثیری عاری از ویروس کشت مریستم، گرمادرمانی و کشت مریستم همراه با گرمادرمانی و برق درمانی است.
از روش کشت مریستم به منظور حذف ویروسهای مختلفی از میزبانهای متنوعی استفاده شده است بهعنوان مثال برای حذف ویروسهای موزاییک نیشکر (Sugarcane mosaic virus, SCMV)، ویروس موزاییک سورگوم (Sorghum mosaic virus, SrMV)، ویروس موزاییک رگهای نیشکر (Sugarcane streak mosaic virus, SCSMV) و ویروس زردی برگ نیشکر (Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV) از گیاه نیشکر آلوده (Cheong et al., 2012)، حذف ویروس موزاییک آلسترومریا (Alstromeria mosaic virus, AIMV) ازگیاه آلسترمریا (Fuji et al., 2005) و حذف ویروس برگ بادبزنی مو (Grapevine fanleaf virus, GFLV) از دو رقم انگور ایرانی (سیاه و بی دانه) (Salami et al., 2005) استفاده شده است. روش کشت مریستم انتهایی برای حذف CMV از اندامهای تکثیری گلایل توسط محققین مورد استفاده قرارگرفتهاست که سبب حذف ویروس از این گیاهان شده است (Lilien-kipnis et al., 1997; Selvarajan et al., 1999; Mangal et al., 2003).
استفاده از روش گرمادرمانی تواَم با کشت مریستم انتهایی سبب حذف ویروس موزاییک زرد لوبیا از گلایل (Sharifi Nezamabad et al., 2015)، حذف دو ویروس لکه سبزرد برگ سیب (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) و ساقه شیاری سیب (Apple stem grooving virus, ASGV) از درختان دانهدار (Wang et al., 2006)، حذف ویروس ابلقی میخک (Carnation mosaic virus, CarMV) (Sepahpour et al., 2009)، حذف ویروسهای ساقه آبله آلو (Plum pox virus, PPV) و نقش حلقوی نکروتیک هسته‌داران (Prunus necrotic ring spot virus, PNRSV) (Manganaris et al., 2003) و حذف PPV از زردآلو (Koubouris et al., 2007) شده است. از روش گرمادرمانی تواَم با کشت مریستم انتهایی جهت تولید گیاهان گلایل عاری از ویروسهای موزاییک زرد لوبیا و موزاییک خیار استفادهشدهاست، پداژههای گلایل پس از گرمادرمانی با آب گرم 50 درجه سلسیوس، مریستم در اندازه 7/0 -5/0 میلیمتر جدا شد و در محیطکشت MS2/1 با ترکیبات هورمونی ویژه کشت شدند. این روش در حذف هر دو ویروس مؤثر عمل کرده است و سبب حذف 80 تا 100 درصد گیاهان حاصل شده است (Mangal et al., 2003).
استفاده از روش برقدرمانی تواَم با کشت مریستم سبب حذف ویروس ای سیب زمینی (Potato virus A, PVA) و وای سیبزمینی (Potato virus Y, PVY) (Emami Meybodi et al., 2011)، حذف ویروس ای انگور (Grapvine virus A, GVA) از انگورهای آلوده به این ویروس (Bayati et al., 2011)، حذف PVY از سیبزمینی (Almaarri et al., 2012)، حذف ویروس ایکس سیب زمینی (Potato virus X, PVX) ازسیب زمینی (Gonzales et al., 2004) وحذف CarMV از میخکهای آلوده به این ویروس (Sepahpour et al., 2009) شدهاست. از این روش تا کنون برای حذف CMV از گلایل استفادهنشدهاست.
با توجه به اهمیت گل گلایل، آلودگی آن به ویروس موزاییک خیار و نحوه تکثیر این گل، تولید پداژههای عاری از ویروس و ارائه آن به پرورشدهندگان گل و گیاه امری ضروری است. از اینرو هدف از انجام تحقیق حاضر مقایسه کارآیی روشهای کشت مریستم انتهایی، کشت مریستم همراه با گرمادرمانی و کشت مریستم همراه با برقدرمانی برای حذف ویروس موزاییک خیار از گیاه گلایل میباشد.
مواد و روشها
نمونههای گیاهی آلوده
طی ماههای تیر تا آبان سال 1391 از گلخانههای پاکدشت و مراکز توزیع پداژههای گلایل در استانهای تهران و البرز نمونهبرداری انجامشد. پداژهها کاملاَ تصادفی انتخاب و در گلدانهای پلاستیکی حاوی نسبت مساوی خاک و ماسه کاشته و در دمای 23-18 درجه سلسیوس نگهداری شدند.
آزمون الیزا(Enzyme-linked immunosorbent assay)
برای ردیابی ویروس آزمون سرولوژیکی به روش الیزا غیرمستقیم با استفاده از آنتیسرم چندهمسانهای (تهیه شده از مرکز تحقیقات بیماریهای ویروسی غلات، دانشگاه شیراز) با رقت 1:1000 انجام گرفت. برای این منظور یکدهم گرم از برگ هر نمونه گیاه، کنترل منفی و کنترل مثبت در سه میلی لیتر بافر استخراج عصارهگیری شد. هفتادوپنج میکرولیتر از عصاره گیاهی به همراه 25 میکرولیتر از بافر پوششی در چاهکهای تشتک الیزا ریخته شد. سه چاهک با بافر عصارهگیری پر شد و تشتک به مدت یک شب در دمای چهار درجه سلسیوس نگهداری شد. پس از تخلیه چاهکها و شستوشو توسط بافر ، 100 میکرولیتر بافر حائل (Blocking buffer) به هر چاهک اضافه شد و به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس نگهداری شد. سپس شستوشو مانند مرحله قبل انجام گرفت. آنتیسرم چندهمسانهای به نسبت 1:1000 در بافر کانجوگیت رقیق شد و به میزان 100 میکرولیتر به هر چاهک اضافه شد. در این مرحله تشتک به مدت چهار ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس نگهداری شد. سپس شستوشو مانند مراحل قبل انجام و آنتی بادی متصل شده به آنزیم آلکالینفسفاتاز به عنوان آنتی بادی ثانویه (Goat anti-rabbit-IgG-alkaline phosphatase conjugate) به نسبت 1:7500 در بافر کانجوگیت رقیق شد و به میزان 100 میکرولیتر به هر چاهک اضافه شد و تشتک به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس نگهداری شد. سپس شستوشو مانند مراحل قبل انجام گرفت. در مرحله بعد 10 میلیگرم پارانیتروفنلفسفات بهعنوان سوبسترای آنزیم آلکالینفسفاتاز در 10 میلیلیتر بافر سوبسترا حل و به مقدار 100 میکرولیتر از آن به هر چاهک اضافه شد. برای بررسی نتایج آزمون الیزا هر 15 دقیقه یکبار به مدت یک ساعت میزان تغییر رنگ چاهکها در طول موج 405 نانومتر با دستگاه الیزا خوان Anthos 2020 ساخت کشور اتریش اندازه گرفته شد. چاهکهایی که میزان جذب نوری آنها بیش از دوبرابر میانگین جذب نوری چاهکهای کنترل منفی (گیاه عاری از ویروس) بود، به عنوان نمونه مثبت تلقی شدند (Dijkstra & Jager,1998).
نسخهبرداری معکوس - واکنش زنجیرهای پلیمراز (Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)
جهت استخراج آرانای کل (Total RNA) از برگهای گلایل حاصل از کشت مریستم با استفاده از محلول RNX-Plus سیناژن (تهران، ایران) بر اساس دستوالعمل شرکت سازنده با تغییراتی به شرح زیر انجام شد؛ یکدهم گرم از بافت برگ در ازت مایع پودر، سپس یک میلیلیتر محلول RNX-Plus اضافه و پس از تکان دادن، 400 میکرولیتر فنل اشباع به آن اضافه شد. بعد از مخلوط کردن، نمونهها به مدت یک دقیقه با سرعت 13000 دور سانتریفیوژ شدند، رونشین به میکروتیوب جدید منتقل و 200 میکرولیتر فنل اشباع و200 میکرولیتر کلروفرم به هر نمونه اضافه شد. پس از مخلوط کردن، نمونهها به مدت یک دقیقه با سرعت 13000 دور سانتریفیوژ شد، رونشین به میکروتیوب جدید منتقل و 400 میکرولیتر کلروفرم به آن اضافه شد. مجددا نمونهها مخلوط و به مدت یک دقیقه با سرعت 13000 دور سانتریفیوژ شدند، رونشین به لوله جدید منتقل و دو برابر حجم فاز رویی اتانول سرد اضافه شد و به مدت یک شب در فریزر نگهداری شد، نمونهها در سانتریفیوژ یخچالدار به مدت 10 دقیقه با سرعت 13000 دور و در دمای چهار درجه سلسیوس سانتریفیوژ شدند و سپس با 500 میکرولیتر اتانول سرد 70 درصد شستوشو شد، پس از خشک کردن رسوب در دمای 37 درجه سلسیوس 25 میکرولیتر آب اضافه شد و به مدت 10 دقیقه در دمای 55 درجه سلسیوس قراردادهشد. آر ان ای استخراج شده تا زمان استفاده در دمای منفی 70 درجه سلسیوس نگهداری شد. آرانای استخراج شده با کمک آغازگرهای اختصاصی برای ساخت cDNA (دیانای مکمل) استفاده شد. ساخت cDNA با استفاده از کیت hyperScript RT premix (GeneAll, South Korea) طبق دستورالعمل شرکت تولید کننده انجام شد. برای انجام این واکنش از هفت میکرولیتر آب، ده پیکومول از آغازگر اختصاصی معکوسCMV-R (5'- GCG CGA AAC AAG CTT CTT ATC -3') (De Blass et al., 1984)، دو میکرولیتر آرانای کل استخراج شده از گیاهان مورد آزمایش و 10 میکرولیتر RT premix استفاده شد. واکنش در دمای 55 درجه سلسیوس به مدت یک ساعت با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (ep Gradient Termocycler، اپندورف، ساخت کشور آلمان) انجامشد. برای انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز از آغازگرهای CMV-F (5'- GTA GAC ATC TGT GAC GCG A -3') و CMV-R استفادهشد (De Blass et al., 1984). برای انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز، 3/16 میکرولیتر آب مقطر استریل، 5/2 میکرولیتر بافر PCR (×PCR buffer 10) 2/1 میکرولیتر MgCl2با غلظت 50 میلیمولار، 5/1 میکرولیتر dNTPs (dATP، dGTP، dTTP،dCTP) با غلظت 10 میلیمولار، یک میکرولیتر از هر کدام از آغازگرها با غلظت 10 پیکومول، پنج واحد آنزیم Taq DNA Polymerase و دو میکرولیتر از cDNA ساختهشده CMV در لولههای 2/0 میلیلیتری سترون ریختهشد و با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (ep Gradient Termocycler، اپندورف، ساخت کشور آلمان) انجام شد. برنامه حرارتی استفاده شده شامل یک چرخه دمایی 94 درجه سلسیوس به مدت دو دقیقه، 35 چرخه دمایی شامل 94 درجه سلسیوس به مدت 30 ثانیه، 58 درجه سلسیوس به مدت 35 ثانیه، دمایی 72 درجه سلسیوس به مدت 80 ثانیه و در آخر یک چرخه دمایی 72 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه انجام شد. تفکیک محصولات PCR، با استفاده از الکتروفورز محصول واکنش در ژل آگارز 2/1 درصد در بافر 1×TAE (تریس باز 48/0 گرم، استیک اسید 11/0 میلیلیتر و اتیلن دیآمین تترا استات 5/0 مولار با اسیدیته 8 ،2/0 میلیلیتر) انجام شد. برای بررسی اندازه باندهای تشکیل شده از نشانگر دیانای یک کیلوبازی(GeneRuler™ 1kb DNA ladder, Fermentas) استفادهشد.
گرمادرمانی
آزمایش در دو دما (دمای اتاق و دمای 37 درجه سلسیوس) و با دو سطح مریستم (نیم و یک میلیمتر) با نه تکرار به مدت سه هفته طراحی شد. گیاهان گلایل آلوده به ویروس موجود در گلخانه، به اتاق رشد با دمای اولیه 28 درجه سلسیوس، منتقل و به منظور سازگار کردن گیاهان با دمای 37 درجه سلسیوس، هر روز دو درجه دما افزایش داده شد، سپس گیاهان به مدت سه هفته در دمای 37 درجه سلسیوس نگهداری شدند.
برقدرمانی
آزمایش برق درمانی با دو فاکتور؛ مدت زمان (با 2 سطح 10 و 15 دقیقه) و شدت جریان ( با سه سطح صفر، 10 و 15 میلیآمپر) با 17 تکرار انجام شد. برای ضد عفونی سطحی، قطعههای ساقه با اندازه 5-2 سانتیمتری از گیاهان آلوده به ویروس جدا وبه مدت 15 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 05/0 قراردادهشدند و سپس با آب مقطر سترون شستوشو شدند. ساقهها درون دستگاه الکتروفورز افقی حاوی بافر 1×TBE (تریس باز 8/10 گرم، بوریک اسید 5/5 گرم و اتیلن دی آمین تترا استات 4 میلیلیتر) در معرض جریان الکتریکی قراردادهشدند. قلمهها پس از تیمار الکتریکی بلافاصله بهصورت سطحی سترون و پس از جدا کردن مریستم با اندازه 7/0 میلیمتر به محیطکشت منتقل شدند.
کشت مریستم
این آزمایش با سه سطح از اندازه مریستم 5/0، 7/0 و 1 میلیمتر انجام شد. برای انجام کشت مریستم از محیطکشت MS (Murashige & Skoog, 1962) استفاده شد. نوع و غلظت هورمونها، میزان آگار و ساکارز اضافه شده به محیط در مراحل مختلف در جدول 1 آمده است.
جدول 1- نوع و غلظت هورمونها، میزان آگار و ساکارز اضافه شده به محیط کشت در مراحل مختلف کشت مریستم.
Table 1- Type and concentration of hormones, agar and sucrose added to medium in the different steps of meristem culture.
|
ساکارز (گرم در لیتر) Sucrose (g/l) |
آگار (گرم در لیتر) Agar (g/l) |
هورمون (میلیگرم در لیتر) Hormone (mg/l) |
مدت زمان (هفته) Time (week) |
مرحله رشدی Growing steps |
|
25 |
6-7 |
BAP (4) |
10 |
استقرار (Establishment) |
|
25 |
6-7 |
BAP(4) NAA (0.125) |
6 |
پرآوری (Proliferation) |
|
25 |
5.4 |
NAA (0.5) |
5 |
ریشهزایی (Root induction) |
|
50-60 |
5.4 |
NAA (0.125) |
13 |
القای کورم (Corm induction) |
نتایج
نمونهبرداری
از مجموع 486 پداژه گلایل بررسی شده با آزمون الایزا، تعداد 246 پداژه به ویروس موزاییک خیار آلوده بودند. درصد آلودگی نمونههای جمعآوریشده به ویروس موزاییک خیار 61/50 درصد بود. نتایج حاصل از نمونهبرداری از نظر آلودگی به ویروس موزاییک خیار در جدول 2 آمده است.
ردیابی ویروس در گیاهان حاصل از کشت مریستم و کشت مریستم توام با گرمادرمانی و برقدرمانی
نتایج حاصل از ردیابی ویروس از گیاهان باززایی شده با آزمون الایزا نشان داد که در مجموع 73 درصد گیاهان عاری از ویروس شده بودند در صورتیکه در ردیابی ویروس از گیاهان باززایی شده با آزمون RT-PCR 42 درصد گیاهان عاری از ویروس شده بودند. واکنش RT-PCR با آغازگرهای اختصاصی CMV (De Blass et al., 1984) منجر به تکثیر قطعه مورد انتظار به اندازه 519 جفت باز شد که تایید کننده آلودگی گیاهان بود (شکل 1). بهترین نتیجه حذف ویروس از کشت مریستم با اندازه 5/0 میلیمتر از نمونههای تیمار شده با گرمادرمانی بدست آمد که در نتیجه همهی گیاهان تیمارشده عاری از ویروس شدند و بهترین نتیجه باززایی گیاهان از کشت مریستم با اندازه یک میلیمتر بدست آمد که در نتیجه آن 75 درصد گیاهان باززایی شدند (جدول 3).
جدول 2- نتایج آزمون الایزای پداژههای گلایل در بررسی آلودگی به ویروس موزاییک خیار.
Table 2- Results of ELISA for survey of gladiolus corm infection with CMV.
|
محل جمع آوری Collection place
|
نمونههای بررسی شده Tested samples |
نمونه آلوده Infected sample |
درصد آلودگی Percentage of infection |
|
پاکدشت (Pakdasht) |
436 |
233 |
53.44 |
|
کرج (Karaj) |
50 |
13 |
26 |
شکل 1- الگوی الکتروفورزی محصول RT-PCR ویروس موزاییک خیار با استفاده از آغازگرهای اختصاصی CMV-F و CMV-R در ژل آگارز 2/1% همراه با شاهد مثبت و منفی.
Figure 1- Electrophoresis pattern of products amplified by RT- PCR of CMV using CMV-F and CMV-R primers on 1.2% agarose gel. Lane M, molecular weight marker (GeneRulerTM 1kbp DNA ladder, Fermentas); Lane C- ,negative control; Lane C+, positive control; Empty lanes depict healthy samples and lanes with bands depict infected samples.
جدول 3- حذف CMV از گلایل با استفاده از روش گرمادرمانی همراه با کشت مریستم.
Table 3- CMV elimination from Gladiolus by thermotherapy along with meristem culture.
|
اندازه مریستم (میلیمتر)/تیمار Meristem size (mm)/ Treatment |
تعداد ریزنمونه Explants number |
تعداد باززایی، ریشهزایی و القایی پداژه Shoot regeneration, Root induction and Corm induction |
حذف ویروس بر اساس نتیجه RT-PCR Virus elimination based on RT-PCR |
|
5/0/ بدون تیمار حرارتی 0.5/ No thermotherapy |
8 |
3 |
2 |
|
1/ بدون تیمار حرارتی 1/ No thermotherapy |
6 |
4 |
0 |
|
5/0 تیمار حرارتی 0.5/ thermotherapy |
10 |
4 |
4 |
|
1/ تیمار حرارتی 1/ thermotherapy |
8 |
6 |
0 |
بررسی روش تلفیقی گرمادرمانی با کشت مریستم روی تولید گیاهچههای عاری از ویروس موزاییک خیار گلایل
باززایی، ریشهزایی، القای پداژه و حذف ویروس 18 مریستم گرمادرمانی شده و 14 مریستم گرمادرمانی نشده در اندازه نیم و یک میلیمتر از پداژههای گلایل آلوده به CMV بررسی شد. نتایج بهدستآمده نشان داد که از 18 مریستم گرمادرمانی شده 10 گیاه باززایی شد و از این تعداد چهار گیاهچه عاری از ویروس بودند در حالیکه از 14 مریستم گرمادرمانی نشده هفت گیاه باززایی شد و از این تعداد دو گیاهچه عاری از CMV بودند. جزئیات نتایج در جدول 3 آورده شدهاست.
بررسی روش تلفیقی برقدرمانی با کشت مریستم روی تولید گیاهچههای عاری از ویروس گلایل
حذف CMV از گلایل با استفاده از روش برقدرمانی همراه با کشت مریستم پس از اعمال تیمار الکتریکی و سپس کشت مریستم بررسی شد. از تعداد 34 نمونه که به مدت 10 دقیقه تحت اثر شدت جریان قرار داده شد پنج نمونه و از همین تعداد که به مدت 15 دقیقه تیمار شد تعداد شش نمونه عاری از ویروس شدند. جزئیات نتایج این آزمایش در جدول 4 آمده است.
جدول4- حذف CMV از گلایل با استفاده از روش برقدرمانی همراه با کشت مریستم هایی به اندازه 7/0 میلیمتر بر اساس نتیجه RT-PCR.
Table 4- Elimination of CMV from Gladiolus by electrotherapy along with meristem culture from meristem with 0.7 mm in size based on RT-PCR.
|
تعداد ریزنمونه Explants number |
مدت زمان تیمار (دقیقه) Time (min) |
شدت جریان ثابت (میلیآمپر) Electric current (mA) |
باززایی، ریشهزایی و القای پداژه Shoot regeneration, Root induction and Corm induction |
حذف ویروس Virus elimination |
|
17 |
10 |
10 |
6 |
2 |
|
17 |
10 |
15 |
5 |
3 |
|
17 |
10 |
0 |
10 |
2 |
|
17 |
15 |
10 |
5 |
3 |
|
17 |
15 |
15 |
4 |
3 |
|
17 |
15 |
0 |
10 |
2 |
بررسی تاَثیر روش کشت مریستم روی تولید گیاهچههای گلایل عاری از ویروس موزاییک خیار
باززایی، ریشهزایی، القای کورم و حذف ویروس از اندازههای 5/0، 7/0 و یک میلیمترمریستمهای کشتشده در محیطکشت MS نشان داد که مریستم کشت شده با اندازه یک میلیمتر قادر به حذف ویروس موزاییک خیار از گلایل نبود در حالیکه از مریستمهای کشت شده در اندازه 5/0 و 7/0 میلیمتردو نمونه عاری از ویروس شدند. نتایج این آزمایش در جدول 5 نشان دادهشدهاست.
جدول 5- حذف CMV از گلایل با استفاده از روش کشت مریستم.
Table 5- CMV elimination from Gladiolus by meristem culture.
|
تعداد ریزنمونه Explants number |
اندازه مریستم (میلیمتر) Meristem size (mm) |
باززایی، ریشهزایی و القای پداژه Shoot regeneration, root induction and corm induction |
حذف ویروس بر اساس نتیجه RT-PCR Virus elimination based on RT-PCR |
|
8 |
0.5 |
3 |
2 |
|
17 |
0.7 |
10 |
2 |
|
6 |
1.0 |
4 |
0 |
بحث
در این پژوهش به طور کلی میزان آلودگی پداژههای گلایل به ویروس موزاییک خیار در نمونههای جمعآوری شده ازپاکدشت 44/53 درصد و در نمونههای جمعآوری شده از کرج 26 درصد تعیین شد. بررسی میزان آلودگی پداژههای جمعآوری شده از تهران، کرج و محلات به ویروس موزاییک زرد لوبیا حاکی از 35/80 درصد آلودگی بودهاست. همچنین نتایج آن پژوهش نشان دادهاست که پداژههای جمعآوری شده به ویروس موزاییک خیار، ویروس موزاییک توتون و ویروس رگهای توتون آلوده نمیباشد (Sharifi, 2009). این اختلاف در نتایج را میتوان به تفاوت در مکان جمعآوری پداژهها نسبت داد. با توجه به آلودگی بیش از نیمی از پداژههای موجود در بازار به ویروس موزاییک خیار، گستردگی دامنه میزبانی این ویروس و شیوه انتقال آن در طول فصل رشد، احتمال آلودگی اکثر گیاهان وجود دارد، بنابراین استفاده از پداژههای سالم برای کشت در مزارع جدید تولید گل از روشهای اساسی برای کنترل آلودگی به ویروس موزاییک خیار و کاهش خسارت این ویروس میباشد.
در تحقیق حاضر از روش کشت مریستم انتهایی و همچنین گرمادرمانی و برق درمانی به همراه کشت مریستم برای حذف ویروس موزاییک خیار از گلایل استفاده شد. نتایج بهدست آمده نشان داد که میزان حذف ویروس از مریستم انتهایی با اندازه نیم میلیمتر 66/66 درصد و از مریستمهایی با اندازه 7/0 میلیمتر 20 درصد بود (جدول 5). کشت مریستم انتهایی با اندازه 7/0-5/0 میلیمتر برای حذف ویروس موزاییک زرد لوبیا از گلایل سبب حذف ویروس از 90-80 درصد گیاهان تیمار شده گردید (Bertaccini & Marani, 2003). کشت مریستم انتهایی با اندازه 5/0 تا 7/0 میلیمتر برای حذف دو ویروس موزاییک خیار و موزاییک زرد لوبیا از گلایل سبب حذف هر دو ویروس از همه گیاهان شده است (Logan & Zettler, 1985). نتایج این تحقیق با یافتههای فوق متفاوت بود. در این تحقیق برای ردیابی ویروس در گیاهان باززاییشده از آزمون RT-PCR استفادهشد در حالیکه پژوهشگران یادشده برای شناسایی ویروس در گیاهان باززاییشده از آزمون سرولوژیکی الایزا استفاده کردند. بنابراین بهنظر میرسد این اختلاف بهدلیل استفاده از روش با حساسیت بیشتر (RT-PCR) در ردیابی ویروس در پژوهش حاضر میباشد.
در تحقیق حاضر میزان حذف ویروس در روش گرمادرمانی همراه با کشت مریستم انتهایی در اندازه 5/0 میلیمتر 100 درصد بود (جدول 3) که با نتایج پژوهشهای قبلی مشابه است (Mangal et al., 2006; Selvarajan et al., 1999). از روش گرمادرمانی همراه با کشت مریستم انتهایی برای حذف دو ویروس موزاییک خیار و موزاییک زرد لوبیا از گیاه گلایل استفاده شدهاست و در نتیجه کشت مریستم با اندازه 5/0-3/0 میلیمتر سبب عاری شدن 80 تا 100 درصد نمونهها از هر دو ویروس شده است (Selvarajan et al., 1999) و در پژوهش دیگری روش گرمادرمانی همراه با کشت مریستم انتهایی با اندازه 7/0-5/0 میلیمتر برای حذف این دو ویروس از گیاه گلایل سبب حذف هر دو ویروس به میزان 100 درصد گیاهان شده است (Mangal et al., 2006). کشت مریستم همراه با گرمادرمانی برای حذف ویروس موزاییک زرد لوبیا از گلایلهای آلوده به این ویروس، مورد استفاده قرارگرفتهاست کشت مریستم با اندازههای 5/0 و یک میلیمتر سبب حذف ویروس از 89 تا 99 درصد گیاهان شده است (Sharifi Nezamabad et al., 2015). در پژوهش حاضر کارایی حذف ویروس در روش کشت مریستم همراه با گرمادرمانی مریستم با اندازه 5/0 میلیمتر 100درصد و مریستم با اندازه 5/0 میلیمتر بدون اعمال گرما 66/66 بود (جدول 3) که بالابودن درصد عاری از ویروسشدن در گیاهان حاصل از ریزنمونههای گرمادرمانیشده نسبت به گرمادرمانینشده، نشاندهنده کارایی گرمادهی در تولید گیاهچههای عاری از ویروس است. نتایج بدست آمده توسط سایر محققین نیز نشان دهنده موثرتر بودن روش کشت مریستم همراه با گرمادرمانی نسبت به روش کشت مریستم بهتنهایی در تولید اندامهای گیاهی عاری از ویروس میباشد (Koubouris et al., 2007; Manganaris et al., 2003; Wang et al., 2006).
در تحقیق حاضر روش برقدرمانی برای اولینبار بهمنظور حذف ویروس موزاییک خیار از گلایل استفادهشد. نتایج بدستآمده از بکارگیری روش برقدرمانی نشانداد که شدت جریان 10 میلیآمپر به مدت 10 و 15 دقیقه به ترتیب باعث حذف 33/33 و 60 درصد ویروس از نمونههای باززاییشده شد. در حالیکه تیمار 15 میلیآمپر به مدت 10 و 15 دقیقه به ترتیب باعث حذف 60 و 75 درصد از نمونههای باززاییشد. پایههای مادری مو آلوده به ویروس ای انگور با استفاده از روش برق درمانی همراه با کشت مریستم سبب حذف ویروس در گیاهان تیمار شده با شدت جریان 20 و 30 میلیآمپر به مدت 15 دقیقه شده است در حالیکه تیمار 10 دقیقه قادر به حذف ویروس نشده است (Bayati et al., 2011). نتایج پژوهش حاضر با نتایج Bayati و همکاران (211) تفاوت دارد، در این تحقیق از اندازه مریستم 7/0 میلیمتر استفادهشد درحالیکه که Bayati و همکاران (2011) از اندازه مریستم یک میلیمتر استفاده کرده بودند و احتمالا اختلاف در میزان حذف ویروس به دلیل اختلاف در گونه گیاه میزبان، گونه ویروس و احتمالا اختلاف در اندازه مریستم کشت شده است.
در تحقیق حاضر در مجموع 73 درصد گیاهان تیمار شده با استفاده از آزمون الایزا عاری از ویروس تشخیص داده شدند درصورتیکه در آزمون ملکولی 42 درصد عاری از ویروس تشخیص داده شدند. تفاوت بین درصد ردیابی ویروس با این دو روش در نتایج سایر محققین نیز مشاهده شده است (Verma et al., 2004; Baker et al., 1993). این اختلاف را میتوان به دقت بیشتر روش RT-PCR نسبت به الیزا نسبت داد.
با توجه به اهمیت گل گلایل، آلودگی گسترده پداژههای موجود در بازار به ویروس موزاییک خیار و نحوه تکثیر این گل، توصیه میشود پداژههای گلایل عاری از ویروس موزاییک خیار با استفاده از روش کشت مریستم با اندازه 5/0 میلیمتر همراه با گرمادرمانی تولید و در اختیار تولیدکنندگان گل قرار گیرد.
منابع
Almaarri K, Massa R, Albiski F (2012). Evaluation of some therapies and meristem culture to eliminate Potato Y potyvirus from infected potato plants. Plant Biotechnology 29: 237-243.
Anonymous (2010). Statistics office of ornamental plants and vegetable, Deputy of Horticulture, Ministry of Jahad-e-Agriculture of Iran, Tehran.
Baker KF (1993). Thermotherapy of planting material. Phytopathology 52: 1244- 1255.
Bayati S, Shams-Bakhsh M, Moieni A (2011). Elimination of Grapevine virus A (GVA) by cryotherapy and electrotherapy. Journal of Agriculture, Science and Technology 13: 443-450.
Bertaccini A, Marani F (2003). BYMV-free clones of eight gladiolus cultivars obtained by meristem tip culture. Acta Horticulture 177:299-308.
Cheong EJ, Mock R, Li R (2012). Elimination of five viruses from sugarcane using in vitro culture of axillary buds and apical meristems. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC) 109: 439-445.
De Blass C, Borja MI, Saiz M, Remero J (1994). Broad spectrum detection of Cucumber mosaic virus using the polymerase chain reaction. Journal of Phytopathology 141:323-329.
Dijkstra J, Jager C (1998). Practical plant virology protocols and exercise. Springer Lab Manual, 459pp.
Duarte L M L, Rivas E B, Harakava R, Veauvy M C D, lexandre M A (2013). Genealogy of cucumber mosaic virus isolated from ornamental species, American Journal of Plant Sciences, 4: 1081-1087.
Dubey VK, Singh VP (2010). Molecular characterization of Cucumber mosaic virus infecting Gladiolus, revealing its phylogeny distinct from the Indian isolate and alike the Fny strain of CMV. Virus Genes 41: 126-134.
Emami Meybodi D, Mozafari J, Babaeiyan N, Rahimian H (2011). Application of electrotherapy for thee of potato potyviruses. Journal of Agriculture, Science and Technology 13: 921-927.
Fuji S, Shinoda K, Ikeda M, Furuya H, Fukumota F. (2005). Complete nucleotide sequence of the new potexvirus (Alstromeria virus X). Archive of virology 150: 2377-2385.
Gonzales JE, Sanchez R, Sanchez A (2004). Biophysical analysis of electric current mediate nucleoprotein inactivation process. Centro Agricola 2:42-47.
Koubouris GC, Malioga VI, Katis NI, Efthimiou K, Valsilakakis MD (2007). Elimination of Plum pox virus through in vitro thermotherapy and shoot tip culture compared to conventional heat treatment in apricot cultivar Bebecou. Journal of General Plant Pathology 73: 370-373.
Lilien-Kipnis H, Azizbekova N, Ziv M (1997). Bulb and inflorescence development in Nerinesarniensis. Israel Journal of Plant Sciences 45: 13-18.
Logan AE, Zettler FW (1985). Rapid in vitro propagation of virus indexed gladioli. Acta Horticulture165: 168-172.
Mangal M, Bhardwaj SV, Handa A, Jindal KK (2003). Production of virus tested gladioli through in vitro and in vivo techniques. Acta Horticulturae 624: 511-514.
Mangal SV, Bhardwaj A, Handa KK (2006). Production of viruses tested gladioli through in vitro and invivo. Acta Horticulture 164:169-180.
Manganaris GA, Economou AS, Boubourakas IN, Katis NI (2003). Elimination of PPV and PNRSV through thermotherapy and meristem-tip culture in Nectarine. Plant Cell Reports 22:195-200.
Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum 15: 437-496.
Raizada RK, Zaidi AA, Srivastava KM, Shreni VCD, Singh BP (1989). Detection of bean yellow mosaic virus in different part of Gladiolus Indian. Journal of Plant Pathology 7(2): 91-96.
Salami AR, Ebadi A, Zamani Z, Koohi-Habibi M (2005). Elimination of grapevine fanleaf virus two Iranian cultivars “BidaneSefid” and “Shahroodi” by in vitro meristem culture and thermotherapy. International Workshop on Advances in Grapevine and Wine Research. Septamber 2005, Venosa, Italy.
Selvarajan R, Gupta M, Datta L, Misra RL (1999) Production of gladiolus virus-free plants through meristem tip culture and in combination with thermotherapy and chemotherapy. Acta Horticulture 2:101- 106.
Sepahpour S, Moieni A, Shams-Bakhsh M, Baghizadeh A (2009) Effects of electric current value and time treatments on elimination of Carnation mottle virus and in vitro plantlet regeneration of carnation (Dianthus caryophyllus). Acta Horticulturae 829: 395-398.
Sharifi N (2009). Elimination of Bean yellow mosaic virus from Gladiolus by meristem tip culture and thermotherapy. M.S. Thesis, Tehran University, Tehran, Iran.
Sharifi Nezamabad P, Koohi Habibi M, Dizadji A, Kalantari S (2015). Elimination of Bean yellow mosaic virus through thermotherapy combined with meristem-tip culture in gladiolus corms. Journal of Crop Protection 4(4): 533-543.
Verma N, Ram R, Hallan V, Kumar K, Zaidi AA (2004). Production of Cucumber mosaic virus-free chrysanthemum by meristem tip culture. Crop Protection 23: 469-473.
Wang LP, Wang GP, Hong N, Tan RR, Deng XY, Zhang H (2006). Effect of thermotherapy on elimination of Apple stem grooving virus and Apple chlorotic leaf spot virus for in vitro-culture pear shoot tips. Horticultural Science 41: 729-732.
Elimination of Cucumber mosaic virus from gladiolus by meristem tip culture, thermotherapy and electrotherapy
Turang S.1, Shams-bakhsh M.*2, Moieni A.3
1Former Ms.c. student of Plant Pathology Department, Faculty of Agriculture, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran.
2Associate Professor of Plant Pathology Department, Faculty of Agriculture, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran.
3Associate Professor of Plant Breeding Department, Faculty of Agriculture, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran.
Abstract
Flowers of Gladiolus sp. are among the top six flowers of export value and in Iran take the second place in the production of cut flowers. Cucumber mosaic virus is one of the most common viruses in gladiolus worldwide. As, the gladioli are propagated through corms, therefore viral diseases could be easily transmitted to the next generation. To produce healthy stock plants, it is important to produce and culture virus-free corms. In the present research, thermotherapy along with meristem culture, electrotherapy along with meristem culture and meristem culture alone were employed to eliminate CMV from infected gladiolus plants. CMV detection using DAS-ELISA showed that 73 percent of the regenerated plants were free of viruses whereas, RT-PCR analysis showed that 42 percent of plants were virus-free. The efficiency of virus elimination from thermo-treated meristems culture with size 0.5 were 100%. This is the first report of application of electrotherapy for CMV elimination from gladiolus plants and the best results were obtained by using 15 milliamps for 15 minutes. The results showed that thermotherapy along with meristem culture was a more efficient method for elimination of CMV from infected gladiolus plants.
Key words: Gladiolus, Cucumber mosaic virus, Virus elimination.
* نویسنده مسئول: مسعود شمس بخش تلفن: 02148292274 Email: shamsbakhsh@modares.ac.ir
* Corresponding Author: Shams-Bakhsh M. Tel: 02148292274 Email: shamsbakhsh@modares.ac.ir
)