بررسی بیان موقت آنتی ژن HA1 ویروس آنفلوانزای پرندگان (H5N1) در گیاهان یونجه، سویا و کاهو به روش آگرواینفیلتراسیون

بررسی بیان موقت آنتی ژن HA1 ویروس آنفلوانزای پرندگان (H5N1) در گیاهان یونجه، سویا و کاهو به روش آگرواینفیلتراسیون

افسانه سادات فرساد¹، سعید ملک زاده شفارودی*²، نسرین مشتاقی³، فاطمه فتوحی⁴، سعید زیبایی⁵

¹دانشجوی دکترای بیوتکنولوژی کشاورزی-گروه بیوتکنولوژی و اصلاح نباتات-دانشکده کشاورزی-دانشگاه فردوسی مشهد

²دانشیار گروه بیوتکولوژی و اصلاح نباتات- دانشکده کشاورزی- دانشگاه فردوسی مشهد

³دانشیار گروه بیوتکولوژی و اصلاح نباتات- دانشکده کشاورزی- دانشگاه فردوسی مشهد

⁴استادیار مرکز تحقیقات آنفلوانزای انستیتو پاستور ایران

⁵استادیار موسسه واکسن و سرم سازی رازی شعبه شمال شرق مشهد

تاریخ دریافت: 07/06/1393، تاریخ پذیرش: 15/10/1394

  چکیده

      آنتی ژن HA1 ایمونوژن اصلی تولید کننده بیماری فوق حاد پرندگان (H5N1) می­باشد که منجر به بروز اپیدمی و پاندمی­های متعددی در جهان شده است. با توجه به اهمیت فناوری جدید تولید پروتئین­های نوترکیب در گیاهان، تولید این پروتئین نیز بسیار مورد توجه قرار دارد. در مطالعه حاضر از بیان موقت آنتی ژن HA1 به روش آگرواینفیلتراسیون، برای تولید این پروتئین نوترکیب درگیاهان یونجه، سویا و کاهو استفاده شده است. همچنین اثر سه پپتید راهنمای KDEL، Extensin و پپتید راهنمای ZERA در تجمع پروتئین به ترتیب در شبکه آندوپلاسمی، فضای آپوپلاستی و اجسام پروتئینی مورد بررسی قرار گرفت. 72 ساعت بعد از آگرواینفیلتراسیون، نتایج qRT-PCR نشان داد که کاهو بیشترین و سویا کمترین میزان رونوشت از ژن HA1 را داشت. بیان موقت پروتئین در برگ­های تراریخت، با استفاده از تکنیک الایزا اندازه­­گیری شد. نتایج آزمون الیزا نشان داد که با هدف گذاری پروتئین به فضای آپوپلاستی، گیاه یونجه بیشترین تجمع پروتئین را داشته­است. در حالی که کاهو علیرغم رونویسی بالا از ژن HA1 تجمع پروتئین نوترکیب کمتری را نشان داد. بنابراین با استفاده از روش آگرواینفیلتراسیون و انتقال سازه بیانی HA1، نتایج نشان داد که گیاه یونجه و هدایت پروتئین به آپوپلاست راهکار مناسبی جهت تولید پروتئین های نوترکیب HA1 است.

کلمات کلیدی: آگرواینفیلتراسیون، آنتی ژن HA1،  سویا، کاهو، یونجه.

مقدمه

پیشرفت در تکنیک­های زیست­شناسی مولکولی منجر به توسعه راهبردهای جدید برای تولید نسل جدیدی از واکسن­ها به نام واکسن­های نوترکیب یا زیر واحد[1] در خلال دهه 1980 گردید (Houdebine, 2009). این واکسن­ها از پروتئین­های مشتق شده از ویروس­های بیماری­زا، باکتری­ها یا پارازیت­ها ساخته می­شوند و تولید آنها به سیستم بیوراکتور و موجوداتی مثل باکتری، مخمر، سلول­های جانوری و گیاهی نیازمند است، در این روش بخش بیماری­زای پاتوژن­ها در تهیه واکسن استفاده نمی­شود و تنها ژن رمزگردان پروتئین­های آنتی ژن یک ویروس شناسایی شده و سپس به منظور تولید پروتئین مورد نظر به یک میزبان مناسب وارد می­شود. در مقایسه با سایر سیستم­های بیانی، گیاهان تراریخته بهترین میزبان جهت تولید واکسن­های نوترکیب به حساب می­آیند زیرا منجر به تولید ارزان آنتی ژن­هایی می­شوند که بعنوان واکسن تزریقی و در حالتی ایده­آل­تر به صورت خوراکی مورد استفاده قرار می­گیرند (Kim & Yang, 2010).

انتقال ژن به کمک آگروباکتریوم تومفاسینس و تفنگ ژنی روش­های مرسوم تولید گیاهان تراریخت می­باشند. بر اساس الگوی بیان ژن، دو روش بیان ثابت و موقت وجود دارد. در بیان ثابت باید شرایط کشت بافت و باززایی گونه گیاهی بهینه شده باشد زیرا دست­یابی به گیاهان تراریخت با بیان ثابت زمانبر می­باشد (Obeme et al., 2011). از طرف دیگر با توجه به مشکلات تولید پروتئین­های نوترکیب در گیاهان تراریخت پایدار از جمله خاموشی ژن پس از انتقال، تغییرات نامطلوب در ترکیب کربوهیدرات­های مرکب و بزرگ قندی، وقت گیر بودن تولید یک رده گیاهان تراریخت پایدار با قابلیت تولید مطلوب پروتئین و مهم­تر از همه مشکلات زیست محیطی و احتمال فرار ژن و خطرات ناشی از آن سبب شده است که در سال­های اخیر از روش­های بیان موقت ژن در گیاه به عنوان روش­های مناسب برای تولید فرآورده­های نوترکیب استفاده شود (Wang & Ma, 2011). از دو روش آگرواینفیلتراسیون  و آلودگی با ویروس­های گیاهی برای بیان موقت ژن­های خارجی استفاده می شود. اگرچه ناقل­های ویروسی به دلیل آلودگی سیستمیک امکان تولید بالای مقادیر پروتئین نوترکیب را ایجاد می­کنند، اما محدودیت در بیان ژن­هایی با اندازه بزرگ و نگرانی­های زیست محیطی سبب کاهش کاربرد آن­ها شده­است (Fischer et al., 2004). عوامل مختلفی در افزایش تولید پروتئین­های نوترکیب در گیاهان تراریخته نقش دارند که از آن جمله می­توان به بهینه­سازی کدونی، بیان کافی و پایدار ژن خارجی و ... اشاره نمود. با این وجود، روش، زمان و محل بیان ژن در گیاهان بوسیله مجموعه­ای ا عوامل کنترلی تنظیم می­گردد (Ahmadi et al., 2011). پپتیدهای راهنما توالی­هایی هستند که در انتهای کربوکسیل یا آمینی پروتئین قرار دارند تا پروتئین را به بخش­های مختلف سلول هدایت کنند (Fischer et al., 2004). سیگنال پپتید  KDEL (Wandeltt et al., 1992)، پپتید راهنمای ژن گاما زئین ذرت (ZERA) (Torrent et al., 2009)، پپتید راهنمای Extensin هویج (Richardson et al., 2001) از جمله پپتیدهای راهنما در گیاهان هستند که به ترتیب پروتئین را در شبکه آندوپلاسمی، اندامک­های مستقل پروتئینی و فضای آپوپلاستی هدف گذاری می­کنند (et al., 2011 Wandeltt et al., 1992; Obeme).

استرین شدیدا بیماری­زای آنفلوانزای پرندگان (H5N1) از سال 2004 سریعا شروع به پخش شدن کرده و بیماری­های خطرناکی را در ماکیان چندین کشور آسیایی، اروپایی و آفریقایی ایجاد کرده است (et al., 2012 Chichester). دامنه میزبانی این ویروس وسیع بوده و علاوه بر ماکیان، انسان و پستانداران دیگر را نیز آلوده می­کند. این ویروس از خانواده اورتومیکسوویریده بوده و دارای ژنوم قطعه قطعه تک رشته­ای از جنس RNA می­باشد. پوشش سطحی ویروس آنفلوانزا دارای دو گلیکوپروتئین هماگلوتینین و نورآمینیداز است که این گلیکوپروتئین­های سطحی اجزاء اصلی ساختار آنتی ژنیک ویروس و بخش اساسی واکسن­های آنفلوانزا را  تشکیل می­دهند (Carter & Saunders, 2007). هماگلوتنین فراوان ترین پروتئین سطحی غشاء خارجی ویروس است که از قدرت ایمنی­زایی بالایی برخوردار بوده و به صورت یک پیش ساز پروپپتیدی تولید می­شود (Spitsina et al., 2009 Norkin, 2010;). HA دارای دو زیر واحد بزرگ (HA1) و کوچک (HA2) می­باشد که تقریبا تمام سایت­های آنتی­ژنی ویروس روی دامین HA1 این گلیکوپروتئین قرار دارند و قادر به تحریک تولید پاسخ ایمنی برابر با پروتئین کامل ویروس می­باشد. به دلیل شدت بالای عفونت و احتمال بروز موتاسیون در آنتی­ژن ویروس اقدام برای ساخت واکسن­های موثر برای ماکیان ، انسان و حیوانات بر علیه عفونت و پاندمی­های احتمالی H5N1 در آینده ضروری به نظر می­رسد (Steel et al., 2010). با توجه به جایگاه با ارزش آنتی­ژن HA1 در کنترل بیماری آنفلوانزای پرندگان، در اولین گام HA1 در باکتری به عنوان یک میزبان مدل پروکاریوتی بیان شد سپس بیان موقت ژن HA1 در گیاه یونجه، سویا و کاهو با روش آگرواینفیلتراسیون صورت گرفت و اثر سه نوع پپتید راهنما بر تجمع نهایی پروتئین مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش ها

بهینه سازی ژن و طراحی سازه ها

جایگاه­های برشی موجود در توالی ژن HA1 Gene ID: CY116646.1)) با نرم افزار CLC Sequence Viewer حذف شدند. سپس توالی اسیدهای آمینه جهت بیان بهینه در باکتری و گیاهان با استفاده از سایت GenScript دستورزی شدند. در نهایت برای سیستم E.coli ناقل بیانی pET28a حامل توالی بهینه شده ژن (شکل 1- A) و برای بیان موقت از طریق آگروباکتریوم نیز سازه های pBI-KDHA1  (شکل 1- B)، pBI-ZRHA1 (شکل 1- C) و pBI-ETHA1 (شکل 1- D) طراحی و ساخته­شدند. در ساختار سازه­های گیاهی، آنتی ژن HA1 در ناقل pBI121 و مابین پیشبرنده[2] CaMV35S و خاتمه دهنده[3] NOS با استفاده از آنزیم­های برشی BamHI و SacI کلون گردید. سازه­های ساخته­شده توسط PCR با آغازگرهای ویژه ژنی (شکل 2) مورد تایید قرار گرفتند. نتایج تعیین توالی سازه  pET28a-HA1 که صحت ساخت این سازه را تایید می­کند در شکل 3 آورده­شده­است.

بیان پروتئین در باکتری  E.coli

یک کلونی BL21 تایید شده با کلونی پی سی آر، در 250 سی سی محیط کشت LB مایع حاوی μg/ml 100 کانامایسین رشد داده­شد (دمای °C37 و دور شیکر 180). بعد از رسیدن تراکم سلولی در 600 نانومتر به حدود 5/0، القای بیان تراژن با  IPTG انجام شد. نمونه­های پروتئینی استخراج شده از سلول­های E.coli حاوی پلاسمید نوترکیب (pet28a-HA1) قبل و بعد از القا با غلظت 1 میلی مولار از IPTG توسط ژل SDS-PAGE (شکل 4-A) و وسترن بلات (Shoji et al., 2011; Pourseyedi et al., 2009) مورد بررسی قرار گرفتند (شکل 4-B). پروتئین HA1  بیان شده از سلول BL21 به روش دناتوره[4] و با استفاده از اوره 8 مولار استخراج شد Khurana et al., 2010)). سپس نمونه­های پروتئینی با عبور از ستون Ni-NTA agarose شرکت کیاژن تخلیص شدند.

تهیه مایه تلقیح و انجام آگرواینفیلتراسیون

از هرکدام از کلونی­های آگروباکتری سویه  LBA4404 واجد ناقل نوترکیب، 50 میلی لیتر کشت شبانه در محیط کشت LB مایع حاوی μg/ml 50 کانامایسین، μg/ml 50 ریفامپیسین و (دمای °C 28 و دور شیکر 180) تهیه شد و بعد از رسیدن OD به حدود 5/0 تا 6/0 در g 5000 رسوب داده­شد و در محیط آگرواینفیلتراسیون (محیط MS 2/1، 3 درصد ساکاروز به همراه ppm 100 مویان توئین 20) به مدت 60 دقیقه رشد داده­شد تا باکتری به محیط جدید عادت کند. نمونه­های برگی در محیط تلقیح حاوی باکتری در داخل دسیکاتور قرار داده­شدند. سوسپانسیون باکتریایی تحت شرایط خلا 250 میلی بار و سه بار شکست ناگهانی وارد فضای بین بافتی شد و سپس برگ­ها بروی کاغذ صافی آغشته به محیط MS قرار داده شدند.

(B) pBI-KDHA1

شکل 1- سازه­های طراحی شده: سازه HA1- pET28a(A)، سازه pBI121 حاوی ژن HA1 همراه با سیگنال پپتیدهای KDEL، ZERA و Extensin که به ترتیب ژن را در شبکه آندوپلاسمی، اجسام پروتئینی و فضای آپوپلاست هدف گذاری می­کنند (B، C و D)؛ :Nos promoter نواحی پروموتور ژن نوپالین سنتاز؛ NPTII: ژن نئومایسین فسفوترانسفراز که موجب مقاومت به کانامایسین می­شود؛Nos Terminator : ترمیناتور ژن نوپالین سنتاز؛ CaMV35: پروموتور ویروس موزائیک گل کلم؛ sequence KOZAK: توالی افزایش دهنده بیانی (GCAACA)؛ 6His tag: تگ هیستیدین؛  TAA: کدون خاتمه. RB و LB: توالی­های مرزی راست و چپ.

Figure 1- Designed contructs: pET28a construct (A), pBI121 construct contained HA1 with KDEL, ZERA and Extensin signal peptide which cause protein accumulation respectively in endoplasmic reticulum, protein bodies and apoplastic space (B, C & D); NPTII: Neomycin phosphotransferase gene which confers kanamycin resistance; CaMV35: Cauliflower mosaic virus promoter; KOZAK sequence: The sequence (GCAACA) that increases the gene expression level; 6His tag: Histidine Tag; TAA: Stop codon. RB & LB: Right & Left Border.

(C) pBI-ZRHA1

(D) pBI-ETHA1

ادامه شکل 1

Figure 1 (continued)

شکل 2- تایید سازه­های ساخته شده با واکنش زنجیره­ای پلیمراز (A) شاهد منفی (NT)؛ نشانگر مولکولی شرکت فرمنتاز (M).

Figure 2- Designed contructs verification with PCR (A), Negative Control (NT); Molecular Marker (M).

شکل 3- بخشی از نتیجه تعیین توالی سازه  pET28a-HA1که صحت ساخت این سازه را تایید می­کند.    

Figure 3- Verification of the pET28a-HA1 construct by DNA sequencing.

استخراج RNA و انجام Real time PCR

    بعد از گذشت 72 ساعت از آگرواینفیلتراسیون و اطمینان از بیان ژن، RNA کل استخراج شد و بعد از تیمار DNase، رشته مکمل  cDNAبا استفاده از یک آغازگر اولیگو dT (20 نوکلئوتیدی) ساخته شد. آزمایش RT-PCR با آغازگرهای ویژه HA1 و ژن  Houskeeping صورت گرفت (جدول 1). مقادیر Ct با نرم افزار   RESTبه­دست آمد و سطح نسبی بیان HA1 در مقادیر  ^ΔΔCt- 2  با روش لیواک و اشمیتگن (Livak & Schmittgen, 2001) محاسبه شد.

استخراج پروتئین، SDS-PAGE ، وسترن بلات و ELISA

1/0 گرم از برگ­های اینفیلتره در ازت مایع پودر شد و بعد از اضافه کردن 800 میکرولیتر بافر استخراج (50 mM Tris–HCl, 0.5 M NaCl, 2 mM EDTA and 1 mM dithiothreitol (DTT)) و سانتریفیوژ به مدت 20 دقیقه در g 1200، روشناور جدا و بر اساس روش برادفورد (Bradford, 1972) غلظت پروتئین کل اندازه­گیری شد. آزمایش SDS-PAGE روی ژل 12% با 15 میکروگرم پروتئین کل و رنگ­آمیزی با کوماسی بلو صورت گرفت (Shoji et al., 2011). جهت وسترن بلاتینگ ژل به غشاء نیتروسلولزی منتقل شد و با استفاده از آنتی‌بادی مونوکلونال تگ هیستیدین کونژوگه و سوبسترای [5]DAB رنگ­آمیزی گردید (Shoji et al., 2011).

جدول 1- توالی آغازگرهای مورد استفاده برای آزمون  PCRو Real time PCR

Table 1- Oligonucleotide primers used to PCR  and Real time PCR.

* آغازگر مورد استفاده برای تایید سازه های ژنی (محصول PCR، 345 جفت باز)

** آغازگر مورد استفاده برای بررسی های  Real time PCR(محصول PCR، 170 جفت باز)

T: ژن HA1 بیان شده به صورت موقت در کاهو، سویا و یونجه

H: ژن استاندارد داخلی برای مقایسه سطح رونوشت برداری ژن HA1 بیان شده

 * primers used to verify gene constructs (PCR product: 345 bp)

**primers used for Real time PCR assey (PCR product: 170 bp)

T: HA1 gene that expressed transiently in Lettuce, Soybean and Medicago

H: Internal standard gene for comparison of HA1 gene transcription level

 شکل 4- بررسی نمونه­های پروتئینی استخراج شده از E.coli توسط ژل SDS-PAGE 12 درصد (A) M: نشانگر پروتئینی (شرکت فرمنتاز)؛ 1و2: نمونه­های پروتئینی حاوی (pet28a-HA1) قبل از القا با IPTG (1 میلی مولار)؛ 3: نمونه پروتئینی حاوی (pet28a-HA1) پس از القا با غلظت 1 میلی مولار از IPTG، که باند 40 کیلو دالتون مربوط به HA1 در نمونه پس از القا به خوبی قابل مشاهده­است. بررسی نمونه­های پروتئینی استخراج شده از E.coli توسط وسترن بلاتینگ (B) M: نشانگر پروتئینی (شرکت فرمنتاز)؛ 1 و 2: نمونه­های پروتئینی استخراج شده از E. coli قبل از القا با 1 میلی مولارIPTG  ؛ 3: نمونه پروتئینی استخراج شده از E. coli پس از القا با 1 میلی مولار از  .IPTG(باند 40 کیلو دالتون نشان دهنده وزن مولکولی پروتئین HA1 می­باشد).

Figure 4- 12% SDS-PAGE gel analysis of protein samples extracted from E.coli cells (A), Lane M: Protein molecular marker (Fermentase); Lane 1 & 2: protein samples containing  pet28a-HA1 before 1 mM IPTG induction. Lane 3: HA1 expressed samples (pet28a-HA1) after 1 mM IPTG induction. gel analysis of protein samples extracted from E.coli cells using western blot analysis (B), Lane M: Protein molecular marker (Fermentase); Lane 1 & 2: protein samples extracted from infected E.coli cells with pET28-HA1 before IPTG induction, 40 KD band shows HA1 molecular weight; Lane 3: protein samples extracted from infected E.coli cells with pET28-HA1 after IPTG induction, 40 KD band shows HA1 molecular weight.

در نهایت انباشت و تعیین غلظت HA1 با ELISA انجام شد (Shoji et al., 2009)، به این ترتیب که از HA1 خالص شده از باکتری در غلظت­های صفر تا 25 نانوگرم به عنوان استاندارد جهت تعیین غلظت پروتئین در گیاهان استفاده شد. بعد از پوشش دادن پلیت ELISA با آنتی ژن و استفاده از آنتی‌بادی پلی هیستیدین کونژوگه و سوبسترای OPD[6]، جذب[7]OD در 450 نانومتر در 3 تکرار قرائت شد و در نهایت، غظت نهایی پروتئین به صورت درصد از کل پروتئین محلول (TSP[8]) به دست آمد.

نتایج و بحث

در این مطالعه برای بیان موقت ژن از روش انتقال آگروباکتریوم تحت خلاء و برگ­های گیاهان یونجه، سویا و کاهو به عنوان میزبان برای بیان آنتی ژن HA1 استفاده شد. گیاه سویا به دلیل قابلیت بیان بالا و یونجه و کاهو با توجه به قابلیت تولید برگ فراوان در طول سال، و امکان استفاده مستقیم در جیره غذایی طیور و توانایی نسبتا خوب تولید پروتئین انتخاب شدند (Fieler et al., 1997). پس از همسانه­سازی آنتی ژن HA1 در ناقل بیانی pET28a، کلونی­های به دست آمده با PCR با استفاده از آغازگرهای ویژه ژنی (جدول 1) تایید (شکل 2) و سازه ژنی به دست آمده توالی یابی شد. نتایج توالی یابی میزان 99 درصد همولوژی را با توالی ژن سنتزی HA1 نشان داد. بخشی از نتیجه تعیین توالی سازه pET28a-HA1 در شکل 3 آورده شده است. به این دلیل که پروتئین نوترکیب HA1 مربوط به ویروس آنفلوانزای تولید شده در باکتری به صورت نامحلول تولید می­شود، استخراج پروتئین به روش واسرشته انجام شد. بررسی بیان HA1 در سطح رونوشت: با تکثیر قطعه 170 جفت بازی از cDNA حاصل از mRNA نمونه­های اینفیلتره شده، رونوشت برداری از آنتی ژن HA1 به اثبات رسید (شکل 5- A). تکثیر ژن ACTIN 160 جفت بازی نیز به عنوان ژن کنترل داخلی در شکل 5-B نشان داده شده است. نتایج آزمون Real Time PCR با استفاده از آغازگرهای ژن HA1 و آغازگرهای ژن کنترل برای هر گیاه نشان داد که بیشترین میزان رونویسی از روی ژن HA1 در مقایسه با گیاه غیر اینفیلتره شده در کاهو مشاهده شد در حالی که سویا کمترین بیان ژن را در سطح رونوشت برداری نشان داد (شکل 5- C). با توجه به داده­های الگوی رونوشت ژن ها، پپتید­های راهنما تاثیری بر رونوشت برداری نداشتند. از طرف دیگر چون بیان بالای یک ژن همیشه نشان دهنده انباشت بیشتر پروتئین نیست، برای بررسی میزان پروتئین نهایی، آزمون الیزا صورت گرفت. به منظور تعیین غظت نهایی پروتئین به صورت درصد از کل پروتئین محلول، منحنی استاندارد بر اساس میزان جذب در رقت­های مختلف HA1 بیان شده در باکتری، ترسیم شد (شکل 6). نتایج آزمون الیزا با آنتی بادی پلی هیستیدین کونژوگه نشان داد که بیشترین مقدار بیان هنگامی به دست آمد که ژن HA1 به سمت فضای بین سلولی (آپوپلاستی) هدف گذاری شد و میزان پروتئین تولید شده در آپوپلاست گیاهان یونجه، سویا و کاهو به ترتیب 57/3 ، 2/3 و 5/2 درصد از پروتئین کل محلول بود (شکل 7). در رتبه دوم بیشترین مقدار بیان هنگامی حاصل شد که پروتئین نوترکیب در اجسام پروتئینی تجمع یافت. هدف گذاری پروتئین HA1 در فضای آپوپلاستی گیاه یونجه، بیشترین عملکرد پروتئین نوترکیب را ارائه داد. در کل گیاه یونجه بیشترین عملکرد پروتئین نوترکیب را داشت (شکل 7).

C

شکل 5 - بررسی بیان ژن HA1: تایید بیان HA1 در کاهو با  RT-PCR(A)، تکثیر ژن ACTIN کاهو به عنوان ژن کنترل داخلی(B) و سطح نسبی بیان ژن HA1 در نمونه­های اینفیلتره شده با سازه­های حاوی پپتید راهنمای KDEL، Extensin و ZERA (C).

Figure 5- HA1 gene expression assessment: Verification of HA1 expression in lettuce with RT-PCR (A), Amplification pf lettuce ACTIN as internal control (B) and relative HA1 expression level in infiltrated samples with constructs including KDEL, Extensin and ZERA (C).

شکل 6- منحنی استاندارد بر اساس میزان جذب در رقت­های مختلفHA1 بیان شده در باکتری. محور افقی میزان جذب در آزمون الایزا و محور عمودی غلظت پروتئین در نمونه (بر حسب میکروگرم) را نشان می­دهد.

Figure 6- Standard HA1 curve based on the absorption rate in different concentration of bacterial HA1. Horizontal and vertical Axis show the absorption rate in Elisa assey and the protein concentration of the samples (µg) respectively.

شکل 7- نتایج حاصل از آزمون الیزا (درصد HA1 نوترکیب از پروتئین کل محلول). بین سه گیاه مورد بررسی، یونجه بیشترین انباشت پروتئین را داشت، بیشترین تولید پروتئین نیز زمانی صورت گرفت که پروتئین در آپوپلاست با استفاده از پپتید راهنمای Extensin هدف­گذاری شد.

Figure 7- Elisa results (recombinant HA1 percent of total soluble protein). Among three assayed plants, medicago had the most protein accumulation in apoplastic space by Extensin signal peptide.

تولید پروتئین­ها و داروهای نوترکیب اهمیت ویژه­ای برای محققان و کشورها دارد. در این راستا نیز میزبان­های مختلفی شامل باکتری­ها، قارچ ها، حیوانات و گیاهان به عنوان راکتور تولید کننده استفاده شده است. از این میان گیاهان برای تولید داروهای نوترکیب ترجیح داده می­شوند. زیرا قیمت تمام شده محصول در گیاهان کمتر از سایر منابع می­باشد. بعلاوه داروهای نوترکیب تولید شده از طریق گیاهان به علت عدم وجود آلودگی­های میکروبی و بویژه عوامل بیماریزای مشترک با انسان، ایمنی بالاتری را دارند.

در تحقیق حاضر پس از طی مراحل همسانه سازی در ناقل بیانی pET28a، بیان پروتئین نوترکیب HA1 در سلول میزبان BL21-DE3 به دلیل عدم وجود پروتئازهای سلولی و کاهش فعالیت پروتئازی روی محصول، با موفقیت انجام شد. ناقل بیانی pET28a با داشتن پیشبرنده قویT7 قادر به بیان توالی­های ژنی بعد از خود است و این ناقل بعد از بیان پروتئین نوترکیب به انتهای آمین آن پروتئین نشانگر 6HisTag اضافه می­کند. این نشانگر برای تخلیص پروتئین نوترکیب بیان شده با انجام روش کروماتوگرافی میل ترکیبی کاربرد دارد. محصول نوترکیب با این نشانگر تمایلی، به خوبی خالص می­شود و این نشانگر تأثیری در ایمنی­زایی پروتئین مورد نظر ندارد (Arnau et al., 2006).

امروزه جداسازی و خالص سازی پروتئین­های نوترکیب با سیستم His-tag 6 یک روش معمول می­باشد (Arnau et al., 2006)، طوری که زیرواحد HA1 ویروس آنفلوانزای H5N1 در E. coli تولید و از سیستم His-tag 6 جهت تخلیص بالای پروتئین استفاده شد (Khurana et al., 2010). در مطالعات پیشین از سیستم تخلیص His-tag 6 و سیگنال پپتید KDEL در انتهای کربوکسیل آنتی ژن HA آنفلوانزا برای بیان موقت این پروتئین در توتون استفاده شد (Shoji et al., 2011). در تحقیق حاضر نیز استفاده از سیستم His-tag 6 منجر به تخلیص مناسب و تولید سطوح بالای HA1 در باکتری گردید.

این تحقیق با هدف استفاده از پتانسیل بالای گیاهان جهت تولید پروتئین HA1 طراحی و اجرا گردید. برای رسیدن به این هدف لازم است که بهینه­سازی از جنبه های مختلف صورت گیرد. در این تحقیق جهت افزایش بیان ژن از توالی افزایش دهنده سیستم بیان گیاهی استفاده شد که از بررسی توالی­های قبل از کدون آغاز، در ژن هایی با بیان بالا در گیاهان بدست آمده است (Taylor et al., 2000). توالی مورد توافق کذاک (GCAACA) در مولکول­های mRNA یوکاریوتی توسط ریبوزوم به عنوان جایگاه آغاز ترجمه شناخته می­شود (Wang et al., 2004).

از عوامل بسیار مهم جهت بهینه­سازی سیستم­های تولید پروتئین­های نوترکیب می­توان به انتخاب پروموتور قوی، هدف­گیری پروتئین مورد نظر به بافت مناسب گیاه و نیز قرار گرفتن پروتئین در جایگاه مناسب در داخل سلول اشاره نمود. در مطالعات مختلف به منظور افزایش پایداری پروتئین تولید شده در داخل سلول با استفاده از توالی KDEL آن را به شبکه آندوپلاسمی هدف گیری نموده­اند زیرا این توالی موجب افزایش بیان پروتئین نوترکیب می­شود. هدف دیگر از اضافه کردن توالی KDEL، ممانعت از ورود پروتئین تولید شده به دستگاه گلژی گیاه است. در غشای سیسترون گلژی، گلیکان­های گیاهی به پروتئین نوترکیب اضافه می­شود که این گلیکان­ها در بدن انسان پاسخ­های ایمنی را موجب می­شوند، در حالی که حضور توالی KDEL از وارد شدن پروتئین به دستگاه گلژی ممانعت بعمل می­آورد (Asgharzadeh et al., 2015). برای اولین بار اثر  KDEL بر تجمع پروتئین ویسیلین در شبکه آندوپلاسمی بذور و افزایش پایداری این پروتئین گزارش شد (1992 Wandeltt et al.,). محققان گزارش کردند که این توالی به خوبی توسط گیرنده­های مربوطه شناسایی شده و موجب نگهداری پروتئین تولید شده در شبکه آندوپلاسمی می­شود. این مقدار افزایش تولید (تا 100 برابر حالتی که از توالی KDEL استفاده نشود) به دلیل قرار گرفتن پروتئین در شبکه آندوپلاسمی و در امان ماندن آن از تجزیه توسط پروتئازها است (Schouten et al., 1996). هدف دیگر از افزودن توالی KDEL، ممانعت از ورود پروتئین تولید شده به دستگاه گلژی گیاه است. در غشای سیسترون گلژی، گلیکان­های گیاهی به پروتئین نوترکیب اضافه می­شود که این گلیکان ها در بدن انسان پاسخ­های ایمنی را موجب می­شوند. نتایج محققان نشان داده است که توالی KDEL با کارایی بالا از قرار گرفتن پروتئین در دستگاه گلژی ممانعت به عمل می­آورد (et al., 2001 Frigerio). در مطالعه­ای به طور موقت بیان آنتی ژن HA ویروس (H5N1 (A/Indonesia/05/05 که به درون شبکه آندوپلاسمی هدف گیری شده بود در گیاه توتون مورد ارزیابی قرار گرفت و پروتئین تولید شده سطح بیان بالایی (60 میلی گرم بر کیلوگرم وزن تر گیاه) را در سیستم گیاهی نشان داد (2009 Shoji et al.,). در تحقیقی دیگر بیان گلیکوپروتئین HA ویروس (A/Viet Nam/ 1194/2004)H5N1  به طور کامل و نیز برش خورده به طور موقت با هدف­گیری های متفاوت (آپوپلاست، شبکه آندوپلاسمی، سیتوزول و کلروپلاست) در گیاه توتون مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که بیشترین بیان مشاهده شده به ترتیب مربوط به نمونه­های تجمع یافته در آپوپلاست و شبکه آندوپلاسمی می­باشد (2012 Mortimer et al.,). در سلول­های تراریخت، تتراپپتید KDEL نمی­تواند نقش خود را به طور کامل ایفا کند (Movafeghi, 2006) زیرا تجمع پروتئین­های دارای توالی راهنما در شبکه آندوپلاسمی بیش از سلول­های طبیعی است، همین امر می تواند سبب اشباع گیرنده­های KDEL شود. با توجه به بیان بیشتر پروتئین نوترکیب دارای  KDELدر گیاه یونجه نسبت به سویا و کاهو می­توان نتیجه گرفت که احتمالا تعداد گیرنده­های KDEL در سلول­های یونجه بیشتر بوده است (شکل 7). با مقایسه اثرات KDEL و ZERA بر میزان پروتئین تولیدی، نتایج ELISA نشان داد که پپتید راهنمای ZERA با انباشت HA1 در اجسام پروتئینی نقش بیشتری ایفا نموده­است (شکل 7). زیرا گیاهان دارای آن پپتید راهنما یکنواختی بیشتری نشان داده­اند و شاید این به دلیل حفظ پروتئین نوترکیب از گزند پروتئازهای درون سلول­های گیاهی باشد. اما چون پپتید راهنمای KDEL به صورت مبتنی بر گیرنده عمل می­کند با اشباع این گیرنده­ها، پروتئین در سیتوسول آزاد و احتمالا تجزیه می­شود (شکل 7). اثر بهتر پپتید راهنمای ZERA می­تواند ناشی از بسته بندی پروتئین در اجسام پروتئینی یا انباشت در نزدیک دیواره سلولی باشد (Torrent et al., 2009).

استفاده از پپتید راهنمای ژن Extensin هویج سبب افزایش تجمع پروتئین HA1 در فضای بین سلولی شد و بدین طریق نوعی ممانعت فیزیکی بین محل تجمع پروتئین نوترکیب و پروتئازها به وجود آورد. هدایت پروتئین به بخش آپوپلاستی، منجر به افزایش میزان پروتئین تولیدی و همچنین بالاتر رفتن درصد پروتئین نوترکیب در میان کل پروتئین­های محلول در گیاهان مورد بررسی گردید (شکل 7). این روش علاوه بر تسهیل در استخراج پروتئین، می­تواند به دلیل آلودگی کمتر پروتئین­های همراه، هزینه پایین دستی مرتبط به تخلیص پروتئین را کاهش دهد. در مطالعه­ای با هدف گذاری آنزیم فیتاز در فضای بین سلولی، 20 برابر فیتاز بیشتر در آرابیدوپسیس بدست آمد (2001 Richardson et al.,). بیان آنتی ژن HA ویروسH5N1 (A/Viet Nam/1203/2004)  تحت سیستم بیان موقت و با هدف­گیری محصول در شبکه آندوپلاسمی و آپوپلاست در گیاه توتون مورد بررسی قرار گرفت و بیان بالای آنتی ژن HA1 با هدف گیری پروتئین به آپوپلاست به دست آمد (2009 Spitsina et al.,). نتایج ما نیز کارآیی مناسب این پپتید راهنما برای هدف­گذاری پروتئین های نوترکیب را تایید نمود.

به نظر می­رسد بهینه­سازی توالی بر اساس ترجیح کدون گیاهی تاثیر زیادی در میزان بیان داشته­است. امروزه بهینه­سازی توالی ژنی یکی از راهکارهای افزایش رونویسی و ترجمه ژن­های خارجی می­باشد که در این تحقیق در مورد گیاه کاهو مشاهده شد. افزایش رونوشت­های mRNA ژن الزاماً نمی­تواند منجر به سطوح بالای پروتئین گردد. زیرا تنها حدود 40-20 درصد فراوانی پروتئین با غلظت mRNA قابل تعیین است (Nie et al., 2006). غلظت نهایی پروتئین­ها، به سرعت ترجمه و تجزیه نیز بستگی دارد. هدف­گذاری پروتئین­ها به سمت اندامک­ها و فضاهای بین سلولی که در آنها میزان پروتئازهای سلولی کمتر است سبب افزایش بازده پروتئین نوترکیب می­شود. اگرچه دستگاه رونویسی در گیاه کاهو بسیار بهتر از سویا و یونجه عمل کرده­است اما میزان نهایی پروتئین HA1 کمتر بوده­است.

در بیان موقت ژن VP2، گیاهان یونجه و توتون نسبت به کاهو پتانسیل بیشتری برای تولید پروتئین نوترکیب داشته­اند (Pourseydi et al., 2009) که با نتایج ما در بیان آنتی ژن HA1 مطابقت دارد. همچنین نتایج ما نشان داد که در گیاه یونجه علیرغم بیان پایین­تر در سطح رونوشت نسبت به کاهو، با هدف­گذاری پروتئین در جایگاه مناسب سلول، پروتئین نوترکیب بیشتری به دست آمد که بیانگر دستگاه ترجمه قدرتمند یونجه است. بافت برگی کاهو دارای محتوای آب بالایی است و پروتئین­ها ثبات خوبی در این شرایط نداشته و تجزیه می­شوند اما کاهو به دلیل داشتن ترکیبات آلکالوییدی کم و هزینه کمتر فرآیندهای پایین دست مورد توجه است (Hefferon, 2010). سویا نیز از اهداف مناسب زراعت مولکولی است طوری که آنتی بادی تولید شده در این گیاه جزو معدود پروتئین­هایی است که وارد فاز بالینی شده­است (et al., 2004 Fischer).

به طور کلی نتایج حاصل از این تحقیق نشان دهنده این است که با توجه به رفتار بیانی خاص هر پروتئین در محیط سلول، استفاده از روش اگروباکتریوم تحت خلاء می­تواند یکی از روش­های مناسب برای بررسی سازه­های بیانی و میزان بیان ژن در گیاهان باشد (et al., 2000 Gidding). با توجه به این نتایج گیاه یونجه پتانسیل خوبی برای تولید پروتئین HA1 دارد در حالی که میزان تولید در گیاه سویا کمتر و در کاهو بسیار کم است. به نظر می­رسد تولید این پروتئین با غلظت بالاتر درگیاه یونجه و پایداری آن در محیط آپوپلاستی موجب شده­است که میزان بیشتری از این پروتئین تولید گردد. تولید پروتئین HA1 نوترکیب در گیاه یونجه با قابلیت تولید پروتئین بالا، قابلیت کشت مناسب، چند چین برداشت و تولید 30 تن برگ در سال در هر هکتار به سهولت دست یافتنی است (Fischer & Schilberg, 2004). با توجه به خوراکی بودن این پروتئین نوترکیب برای طیور و استفاده از این گیاهان علوفه ای به ویژه یونجه در خوراک مرغ، به نظر می­رسد با انجام بررسی­هائی بتوان برگ­های حاوی این پروتئین نوترکیب را مستقیماً در جیره غذائی جوجه­ها مصرف کرد. گیاه کاهو اگرچه عملکرد بیوماس بیشتری حتی نسبت به یونجه دارد و به حدود 30 تن در هکتار می­رسد ولی حضور بافت­های برگی پر آب که حدود 98 درصد آن ها را آب تشکیل می­دهد، عاملی برای کاهش عملکرد پروتئین و پایداری آن است و در مقایسه با یونجه و سویا قابلیت کمتری برای تولید این پروتئین دارد و نتایج & Schilberg (2004) Fischer و Hashemi et al., (2005) را تایید می­کند. نتایج حاصل اولین گزارش مبنی بر استفاده از روش اگرواینفیلتراسیون به منظور تولید آنتی ژن HA1 در گیاهان مختلف می­باشد که راه را برای انجام تحقیقات بیشتر هموار می­سازد.

در این پژوهش همه مراحل بیان موقت تنها با استفاده از امکانات آزمایشگاهی و بدون نگرانی از آزادسازی محیطی انجام شد و نشان داده شد که آنتی­ژن HA1 امکان بیان در گیاهان یونجه، سویا و کاهو را داشته و این آنتی­ژن تولید شده با استفاده از آنتی­بادی هیس تگ کونژوگه قابل شناسایی می­باشد. از آنجایی­که در این بررسی، آنتی­ژن مورد نظر در سطح مناسبی از کل پروتئین­های تولیدی در گیاهان تولید شد، می­توان با بهره­گیری از روش اگرواینفیلتراسیون میزان نسبتا بالایی از آنتی­ژن را تولید کرده و برای امکان تولید آنتی­بادی و برانگیختن پاسخ ایمنی مناسب در حیوانات آزمایشگاهی مورد بررسی قرار داد. همچنین با توجه به امکان بیان این آنتی­ژن در یونجه، سویا و کاهو و حفظ ساختار مناسب و خواص آنتی ژنیک آن، می توان در ادامه، این گیاهان را به عنوان یک واکسن بالقوه علیه عفونت آنفلوانزای پرندگان تحت تراریزش پایدار قرار داد.