تغییر متابولیکی مسیر اکسی‌لیپین در پاسخ به تنش سرما در نخود

تغییر متابولیکی مسیر اکسی­لیپین در پاسخ به تنش سرما در نخود

رضا معالی امیری¹*، بهزاد صادق­زاده²، یدالله فرایدی³

¹دانشیار پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران

²استادیار موسسه تحقیقات دیم مراغه

³مربی موسسه تحقیقات دیم مراغه

تاریخ دریافت: 28/03/1394، تاریخ پذیرش: 22/07/1394

چکیده

اکسی­لیپین­ها، محصولات اکسیداسیون اسید­های چرب غشا در جهت سازگاری به تنش­های زنده و غیر­زنده محسوب می­شوند. در این پژوهش تجمع میزان مالون دی آلدهید (به­عنوان شاخص خسارت غشا)، فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز (LOX)، آلن اکسید سینتاز (AOS) و میزان رونوشت ژن­های LOX، AOS و آلن اکسید سیکلاز (AOC) به کمک واکنش زنجیره­ای پلیمراز در زمان واقعی (QPCR) در دو ژنوتیپ متحمل (Sel96Th11439) و حساس (ILC533) نخود (Cicer arietinum L.) زراعی تحت تنش سرمای 4 درجه سانتی­گراد به مدت 6 روز بررسی شد. تحت تنش سرما میزان مالون دی آلدهید به­طور معنی­داری در ژنوتیپ­ها افزایش یافت طوری که در ژنوتیپ حساس بیشترین افزایش در روز ششم اعمال تنش سرما (تا 57 درصد) مشاهده شد در حالی­که در ژنوتیپ متحمل پس از افزایش در روز اول تغییر معنی­دار نداشت. این افزایش نسبی میزان مالون دی آلدهید در ژنوتیپ متحمل در روز اول تنش سرما احتمالا نقش انتقال سیگنال و القا مکانیسم­های دفاعی داشت. میزان فعالیت آنزیم LOX و AOS در تیمارهای زمانی تنش افزایش معنی­دار نشان داد اگرچه این میزان در ژنوتیپ متحمل نسبت به ژنوتیپ حساس در سطح کمتری بود. بنابراین فعالیت مسیر اکسی­لیپین تحت تنش سرما در نخود احتمالا منجر به تولید هورمون جاسمونیک اسید و در نتیجه تحریک و القا ژن­های دفاعی در گیاه شود. آنالیز بیان ژن­های LOX، AOS و AOC به کمک نرم افزار REST تایید کننده روند تغییر اجزای مسیر اکسی­لیپین بود. بنابراین درجه تحمل به سرما در ژنوتیپ متحمل با کنترل میزان خسارت­های سلولی و فعالیت مسیر اکسی­لیپین در ارتباط است.

واژه­های کلیدی: بیان ژن، تنش سرما، اکسی­لیپین، لیپوکسیژناز، آلن اکسید سینتاز.

مقدمه

توانایی گیاهان در افزایش تحمل به تنش سرما طی فرایند سازگاری[1] با تغییرات متعدد در بیان ژن، متابولیسم، فیزیولوژی و مورفولوژی همراه بوده که این تغییرات شامل افزایش یا کاهش بیان ژن­ها، کاهش یا توقف رشد، تغییر در ترکیب لیپیدی غشا، تغییر در ترکیب محلول­های سازگار (مثل پرولین و بتائین و پلیول و قندهای محلول) و افزایش آنتی­اکسیدان­های آنزیمی و غیرآنزیمی سلول و به­طور کلی تغییر متابولیت­های اولیه و ثانویه هستند (Heidarvand and Maali 2013; Kazemi Shahandashti et al., 2014). این تغییرات، به طور مستقیم در تحمل به تنش درگیر بوده و بنابراین به عنوان عناصر فعال^[2] در تحمل به تنش­های محیطی به خصوص تنش سرما محسوب می­شوند. با این وجود سازگاری به سرما به محدوده وسیعی از سازوکارهای سلولی مربوط می­شود و مشخص نیست که چند ژن در تعیین تحمل به سرما درگیر است (Rakei et al., 2016). بنابراین در بسیاری از موارد ارتباط منطقی بین تغییرات در سطح مولکولی این گروه با تغییرات فیزیولوژی و مورفولوژی وجود ندارد. اجزایی از سلول که عموماً به طور مستقیم تحت اثر نوسانات دمایی قرار دارند غشا­ها و پروتئین­ها هستند. اکسیداسیون اسید­های چرب[3] واکنش متابولیک متداول در سیستم­های زنده در جهت سازگاری به تنش­های زنده و غیر زنده می­باشد. محصولات حاصل از فرایند­های اکسیداسیون اسید­های چرب در مجموع اکسی­لیپین[4] نامیده می­شوند که به طور عمده توسط آنزیم لیپوکسیژناز[5] (LOX)، آلن اکسید سینتاز[6] (AOS) و آلن اکسید سیکلاز[7] (AOC) کاتالیز می­شوند. محصولات اولیه فعالیت آنزیم LOX، هیدروپروکسیدهای اسید چرب می­باشند که از نظر واکنشی فعال بوده و قادر به تولید رادیکال­های آزاد و خسارت به غشا و مرگ سلولی هستند (Ble´e 2002). با این حال این هیدروپرکسیدها به طور سریع تبدیل به گروهی از اکسی­لیپین­های پایدار شده که می­توانند فعالیت­های فیزیولوژیکی متعددی در سلول داشته ­باشند (Nemchenko et al., 2006). مسیر اکسی­لیپین در گیاهان منجر به تولید اسید جاسمونیک[8] شده که به دلیل نقش هورمونی آن، تنظیم کننده مهم پاسخ­ به محرک­های درونی و بیرونی سلول است (Kazan 2015) به­طوری که بسیاری از پاسخ­های دفاعی و نموی گیاهان با میزان فعالیت ژن­های این مسیر در سطح رونویسی و ترجمه تنظیم می­شود (Santino et al., 2013). برخی تحقیقات نشان داده که جاسمونات­ها به طور غیر مستقیم موجب بیان برخی از ژن­های دفاعی در گیاهان می­شوند(Bhardwaj et al., 2011). مشاهده شده که جاسمونات­ها در اثر ایجاد تنش در دو فاز پاسخ سریع در اوایل تنش و پاسخ دیر در مدتی پس از تنش افزایش می­یابند (Heidarvand and Maali-Amiri 2013). آنها همچنین می­توانند تحریک کننده افزایش فعالیت دو آنزیم مهم در مسیر اکسی­لیپین یعنی آنزیم LOX و آنزیم آلن اکسید سینتاز AOS در هنگام تنش در گیاه شوند (Wasternack 2007).

گیاه نخود (Cicer arietinum L.) به عنوان دومین لگوم خوراکی کشور، دارای تنوع مورفولوژیکی بالا ولی تنوع ژنتیکی ضعیف، حساس به سرما بوده و تحت تنش سرما تولید آن محدود می­شود (Mantri et al., 2007). جلوگیری از این کاهش عملکرد (که حتی عملکرد را به 400 کیلوگرم در هکتار می­رساند) نقش مهمی در رویارویی با افزایش جمعیت و تامین نیازهای پروتئینی در کشورهای فقیر و در حال توسعه دارد. با توجه به این که در نواحی جغرافیایی با خصوصیات آب و هوای مدیترانه­ای،  کشت پاییزه گیاه نخود به دلیل حساسیت به سرما و کشت بهاره آن به دلیل خشکی آخر فصل از پتانسیل عملکرد مناسبی برخوردار نیست (Habibpour et al., 2012)، لذا شناخت عوامل و فرایند­هایی که موجب بهبود عملکرد این محصول در مواجهه با تنش­های محیطی می­شود، ضروری به نظر می­رسد. همچنین مقایسه بین ژنوتیپ­های مختلف این گیاه و اینکه چطور یک ژنوتیپ تحمل بالاتر و در نتیجه پایداری عملکرد بالاتری نسبت به ژنوتیپ­های دیگر را دارد ما را در شناخت مکانیسم­ها و عوامل موثر در تحمل نخود به تنش و اتخاذ روش­های موثر­تر برای بهبود تحمل یاری می­دهد. سنجش میزان اثر عوامل مختلف در تحمل به تنش­های غیر زنده مانند سرما از روش­های متعددی از جمله اندازه­گیری سطوح رونویسی ژن‌ها و روش­های فیزیولوژیکی انجام می­شود. بنابراین یافتن رابطه­ بین پاسخ­های مختلف گیاه در سطوح ژنتیکی و فیزیولوژیکی حائز اهمیت بوده و به ارزیابی بهتر گیاه و همچنین درک بعضی از ساز وکار­های ت متابولیکی گیاه کمک می­کند. در این پژوهش، میزان بیان ژن­های دخیل در مسیر اکسی­لیپین به کمک واکنش زنجیره­ای پلیمراز در زمان واقعی (QPCR[9]) و همچنین برخی پاسخ­های فیزیولوژیکی گیاه نخود تحت تنش سرما چهار درجه سانتی­گراد پس از یک، سه و شش روز اعمال تنش در ژنوتیپ­های متحمل (Sel96Th11439) و حساس (ILC533) نخود کابلی ارزیابی شد.

مواد و روش­ها

مواد آزمایشی و تیمار سرما

بذور دو ژنوتیپ متحمل (Sel96Th11439) و حساس (ILC533) به تنش سرما نخود کابلی از موسسه تحقیقات کشاورزی دیم کشور تهیه شد. بذور در محلول هیپوکلریت سدیم 10 درصد به مدت 10 دقیقه ضد عفونی شده و پس از شستشو  5 الی 10 بذر در پتری دیش بر روی کاغذ صافی و آب مقطر جوانه زدند. گیاهچه­ها به گلدان (نسبت ماسه، خاک رس و کود برگ 1:3:1) انتقال داده شد و در اتاقک رشد در گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشگاه تهران با شرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و شدت نوری 220 میکرو مول بر متر مربع بر ثانیه و دمای 23 درجه سانتی­گراد و رطوبت 75 درصد به مدت 21 روز نگه­داری شدند. بخشی از گیاهان در چنین شرایطی حفظ شده و بخشی دیگر به دمای 4 درجه سانتی­گراد منتقل شد و به مدت 6 روز در آن دما نگه­داری شد. نمونه­­برداری­ها در روز اول، سوم و ششم تحت تیمار دمایی 4 درجه سانتی­گراد انجام شد. نمونه­های کنترل یا شاهد در دمای 23 درجه سانتی­گراد با شرایط فوق الذکر قرار داشتند.

اندازه گیری میزان پراکسیداسیون سلولی بر اساس مالون دی آلدهید

میزان پراکسیداسیون ژنوتیپ­های نخود براساس تجمع مالون دی آلدهید برگ با استفاده از تیوباربیتوریک اسید تعیین شد (Heath and Packer 1968). سیصد میلی­گرم نمونه برگی از بخش میانی ساقه در 5 میلی لیتر بافر استخراج (1/0 مولار Tris-HCl، 6/7=pH) کوبیده شد تا یک محلول یکنواخت به دست آید. سپس سه میلی­لیتر از این محلول با دو میلی­لیتر محلول تیوباربیتوریک اسید حاوی اسید تری کلرواستیک در لوله آزمایش مخلوط شد و در حمام آب جوش (100 درجه سانتی­گراد) به مدت 30 دقیقه قرار داده شد. پس از عبور از صافی یا سانتریفوژ با سرعت 5000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه، چگالی نمونه در طول موج 532 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر Shimadzu160 (ساخت شرکت شیماتزو، شهر کیوتو ژاپن) تعیین شد. غلظت مالون دی­آلدهید براساس فرمول زیر محاسبه شد که D اشاره به چگالی و E ضریب تمایز مولار (10⁵×56/1 مول برسانتی‌متر ) دارد.

اندازه گیری فعالیت آنزیم LOX

تمام مراحل استخراج بر روی یخ و بر اساس روش (Kazemi Shahandashti et al., 2013) انجام شد. برگ­ها در داخل هاون چینی با استفاده از ازت مایع پود شدند. یک دهم گرم بافت برگ پس از پودر شدن توسط هاون در ازت مایع به فالکون­های 15 میلی­لیتری انتقال داده شد و 2 میلی لیتر به آن بافر استخراج شامل محلول (1/0 مولار Tris-HCl، 5/8=pH)حاوی یک درصد پلی وینیل پیرولیدین[10] (PVP)، کلرید کلسیم (CaCl₂) یک میلی­مولار، 5 میلی­مولار دی تیوتریتول[11] (DTT) و 15 درصد گلیسرول افزوده شد. پس از ورتکس نمونه و بافر استخراج، نمونه­ها به مدت 20 دقیقه و با سرعت  g×11000 در دمای 4 درجه سانتی­گراد سانتریفوژ شد. سپس مایع رویی به تیوب­ منتقل شده و از این عصاره برای سنجش فعالیت آنزیم LOX استفاده شد. محلول سوبسترا شامل 50 میلی­گرم لینولئیک اسید یا لینولنیک اسید است که به 50 میلی­گرم توئین 20 اضافه شد و با 10 میلی لیتر بافر Na₂Hpo4 (7/8pH=) مخلوط شد و پس از بهم خوردن تحت اولتراسونیک قرار گرفت. محلول با اضافه کردن 20 میکرولیتر NaOH یک میلی­مولار شفاف شد و با اضافه کردن بافر استخراج حجم آن به 25 میلی لیتر رسید. سنجش فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز به روش اسپکتروفتومتری و در دمای 25 درجه سانتی گراد اندازه­گیری شد. نوع و میزان مواد استفاده شده شامل 2850 میکرولیتر بافر Na₂HPO₄، 150 میکرولیتر عصاره آنزیمی و 30 میکرولیتر سوبسترا بود و دستگاه اسپکتروفتومتر روی طول موج 234 نانومتر تنظیم شد.

اندازه گیری فعالیت آنزیم AOS

استخراج آنزیم بر اساس روش (Yang et al., 2011) انجام شد. یک گرم برگ پودر شده توسط نیتروژن مایع تهیه شده با 3 میلی­لیتر از محلول استخراج شامل (بافر فسفات 50 میلی مولار، DDT 5 میلی مولار، PMSF 1/0 میلی مولار،2/7 pH=) مخلوط شد و مخلوط در  g×12000 برای 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ شد. محلول رویی جمع آوری و برای اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم استفاده شد. مخلوط واکنش شامل 3 میلی لیتر بافر فسفات (7pH=)، 200 میکرولیتر محلول هیدرو پروکسید که شامل 4/0 میلی­لیتر محلول لیپوکسیژناز 2/0 میلی­لیتر از لینولنیک اسید (25 mM) و 10 میلی لیتر آب مقطر که برای 2 ساعت در دمای 30 درجه سانتی­گراد انکوبه شد. محلول لیپوکسیژناز شامل یک میلی­گرم آنزیم LOX (15000 واحد بر میلی­گرم) در 10 میلی­لیتر بافر برات با 9pH= می­باشد. در نهایت به میزان 3 میلی­لیتر از محلول واکنش دهنده را با 100 میکرولیتر از آنزیم استخراجی مخلوط و در طول موج 234 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر میزان فعالیت آنزیم اندازه گیری شد.

استخراج RNA و ساخت cDNA

80 میلی گرم از بافت برگی که با کمک هاون چینی استریل به خوبی در نیتروژن مایع کوبیده شده بودند برای استخراج RNA کل به روش بایوزول استفاده شد (Kazemi Shahandashti et al., 2013). غلظت RNA­ پس از هر استخراج، با استفاده از دستگاه نانودراپ تعیین شد. همچنین جهت تعیین کیفیت RNA نیز مقدار 5 میکروگرم از هر نمونه روی ژل یک درصد آگارز، الکتروفورز شد. پس از اطمینان از کیفیت RNA و مشاهده باندهای مربوط به RNA ریبوزومی S18 و S28 تیمار آنزیمی DNase بر اساس روش پیشنهادی شرکت ترموساینتیفیک^[12] برای تمامی نمونه­ها اعمال شد. دو میکروگرم  RNA، یک میکرولیتر بافر، یک واحد (u) آنزیم DNaseI و 10 واحد آنزیم (u)  RNase inhibitor مخلوط شدند و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. سپس یک میکرولیتر EDTA به تیوب­ها اضافه شد و به مدت10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند. تیوب­ها جهت نگهداری، در دمای80- درجه سانتی­گراد قرار داده شدند. برای ساخت cDNA، از روش پیشنهادی شرکت ترموساینتیفیک برای تمامی نمونه­ها استفاده شد. طراحی آغازگرها  با استفاده از  نرم افزار  Primer 3 انجام شد (جدول 1). در این تحقیق از دستگاه  iQ5 شرکت بایورد^[13] و کیت حاوی رنگ فلورسنت SYBR BioPars (دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان) برای ارزیابی کمی استفاده شد. بیست میکرولیتر مخلوط واکنش شامل 10 میکرولیتر مخلوط SYBR BioPars، یک میکرولیتر از هریک از آغازگرهای اختصاصی پیشرو و پسرو با غلظت 10 میکرومول، 3 میکرولیتر آب مقطر استریل و 5 میکرولیتر نمونه cDNA مورد بررسی بود. برای هر واکنش سه تکرار تکنیکی و دو تکرار بیولوژیکی در نظر گرفته شد. پس از آماده­سازی مخلوط واکنش، پلیت مورد نظر به دستگاه iQ5 منتقل شده و با شرایط زیر واکنش زنجیره­ای پلیمراز انجام شد: 2 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی­گراد و 35 تکرار با چرخه‌های 10 ثانیه در دمای 95 درجه سانتی­گراد، 10 ثانیه در دمای Tm آغازگر و 10 ثانیه در دمای 72 درجه سانتی­گراد. بیان نسبی ژن­ها با روش ^–ΔΔCT2 محاسبه شد. به این صورت که هر تیمار با گیاهان کنترل مربوط به زمان خود مقایسه شد. جهت تجزیه­ داده­ها از نرم افزار ^[14]REST  استفاده شد.

تجزیه و تحلیل آماری

داده­های آزمایشی بر اساس آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کاملا تصادفی درسه تکرار به کمک نرم­افزار SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرارگرفت و میانگین­ها بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن مقایسه شدند.

نتایج و بحث

تحقیقات گذشته نشان داده که ژنوتیپ­ متحمل Sel96TH11439 در مقایسه با ژنوتیپ­ حساس  ILC533 دارای مکانیسم­های متمایزی در پاسخ به تنش سرما می­باشد که برخی از آن احتمالا مرتبط با مسیر اکسی­لیپین است (Heidarvand and Maali-Amiri 2013; Kazemi et al., 2014). اختلاف در تحمل به تنش سرما در دوره­های طولانی­تر[15] تنش بیانگر ظرفیت ژنتیکی و برنامه­ریزی مجدد ژنوم در ژنوتیپ­های نخود می­باشد (Khazaei et al., 2015). با توجه به نقش خسارت­زایی تنش سرما به غشا سلولی از طریق خسارت به لیپیدها  در این تحقیق میزان پراکسیداسیونغشا(MDA) به عنوان شاخص خسارت سلولی اندازه­گیری شد (شکل 1).

جدول 1- توالی­های آغازگر استفاده شده در واکنش زنحیره­ای پلیمراز در زمان واقعی (qPCR) تحت تیمارهای دمایی آزمایش.

Table 1- Primer sequences used in qPCR amplification of known chickpea genes undergoing thermal treatments.

آزمون مقایسه میانگین داده­ها اختلاف معنی­داری بین تیمارهای دمایی نشان داد که بیانگر تنوع بالقوه پاسخ­های دفاعی گیاه تحت این شرایط بود به طوری­که تحت تنش سرما میزان MDA در ژنوتیپ متحمل پس از یک افزایش معنی­دار در روز اول (تا 39 درصد)، تغییر معنی­داری در روز سوم و ششم نشان نداد در حالیکه در ژنوتیپ حساس روند تغییر الگوی میزان این ترکیب با طولانی­تر شدن دوره تنش افزایش پیدا کرده به طوری که در روز ششم تنش این میزان به بالاترین سطح خود (تا 57 درصد) رسید. تغییر میزان MDA در ژنوتیپ­های نخود نشان میدهد که گیاه نخود تنش سرما را احساس کرده (Kazemi Shahandashti et al., 2014) و افزایش میزان MDA در این گیاه به معنی افزایش میزان خسارت سلولی در اثر افزایش میزان ROS می باشد (Heidarvand and Maali-Amiri 2013).  با این وجود افزایش میزان ROS به نسبت­های کم طی مراحل اولیه تنش می­تواند نقش­های دیگری علاوه بر القا خسارت سلولی از جمله نقش سیگنال­رسانی سلولی داشته باشد (Nazari et al., 2012). در مراحل اولیه تنش میزان ROS سبب القا پاسخ­های دفاعی در گیاه شده به این ترتیب می­تواند در افزایش سازگاری و درجه تحمل نقش داشته باشد. بنابراین افزایش اولیه میزان ROS در ژنوتیپ متحمل می­تواند سبب القا مسیر دفاعی در گیاه نخود شود (Habibpour et al., 2012)، در حالیکه عدم القا مسیرهای دفاعی در ژنوتیپ حساس سبب افزایش پی­در­پی میزان ROS شده­است. تحقیقات گذشته نشان داده که کاهش در میزان مالون دی آلدهید موجب پایداری بیشتر اسید­های چرب غیر اشباع و تحمل بیشتر به تنش سرما می شود. چنین وضعیتی در تنش های محیطی دیگر از جمله تنش خشکی، شوری نیز به اثبات رسیده است (Maali-Amiri et al., 2007).

شکل 1- میزان مالون دی­آلدئید (MDA) تحت تیمارهای دمایی آزمایش شامل شرایط کنترل (23 درجه سانتی گراد)، روز اول، روز سوم و روز ششم تنش سرما (4 درجه سانتی گراد) در ژنوتیپ متحمل Sel96Th11439 (ستون سیاه) و ژنوتیپ حساسILC533 (ستون خاکستری) گیاه نخود.

Figure 1-  The malondialdehyde (MDA) content of the leaves of tolerant (Sel96Th11439) and susceptible (ILC533) chickpea genotypes (black and light gray bars, respectively) grown under control (23°C) and day 1, day 3 and day 6 of cold stress (4°C).

در گیاهان آنزیم LOX عمدتاً مسیر آنزیمی ‌پراکسیداسیون لیپیدی را کاتالیز می‌کند (Berger et al., 2001). لینولئیک اسید پیش­ساز بیوسنتز جاسمونیک اسید است که به عنوان مولکولی نشان­دار، مکانیسم­های دفاعی گیاه را فعال می­کند. تجزیه نتایج اندازه گیری این آنزیم نشان داد که افزایش میزان این آنزیم در روز اول تنش سرما در دو ژنوتیپ متحمل و حساس در مقایسه با شاهد غیر معنی­دار بود که نشان دهنده عدم تغییر الگوی فعالیت این آنزیم در تنش­های زمانی کوتاه مدت می­باشد اما در روز­های سوم وششم تنش، الگوی فعالیت آنزیم سطح بالاتری را نشان داد (شکل 2). بااین وجود میزان فعالیت این آنزیم در تیمارهای زمانی تنش در ژنوتیپ متحمل نسبت به ژنوتیپ حساس در سطح کمتری (تا 5/2 برابر) تولید شد. به نظر می­رسد اگرچه ژنوتیپ متحمل در روزهای سوم و ششم تنش فعالیت آنزیم بیشتری نسبت به روز اول تنش داشته اما این مسیر با اکسید کردن اسیدهای چرب غشا می­تواند با خسارت به غشا سبب اختلال در فعالیت­های سلولی و مرگ سلول شود. بنابراین در ژنوتیپ متحمل برخلاف ژنوتیپ حساس، فعالیت آنزیم  LOXو بهره­گیری از این مسیر جهت پاسخ به اثرات تنش ایجاد شده محدود بود (Porta and Rocha-Sosa, 2002; Cho et al., 2011). نتایج نشان داد که در گیاه نخود فعالیت آنزیم LOX به طور مستقیم مرتبط با خسارت سلولی القا شده توسط تنش سرما نبوده و بسته به ظرفیت ژنتیکی ژنوتیپ نخود با پاسخ­های دفاعی نیز در ارتباط است. تحقیقات گذشته نشان داده که فعالیت آنزیم LOX سبب القا پاسخ­های دفاعی به تنش­های زیستی و غیرزیستی شده است (Lim et al., 2015).

نتایج تجزیه وتحلیل فعالیت آنزیم AOS در هردو ژنوتیپ نشان داد که همانند فعالیت آنزیم LOX میزان تولید این آنزیم در روز اول در مقایسه با تیمار شاهد از تفاوت معنی­داری برخوردار نبود اما در هر دو ژنوتیپ در روز سوم در مقایسه با روز اول افزایش معنی­داری (77-70 درصد) در میزان فعالیت این آنزیم مشاهده شد و در روز ششم تنش، میزان فعالیت آنزیم AOS به بیشترین میزان خود رسید (شکل 3).

شکل 2- میزان فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز (LOX) تحت تیمارهای دمایی آزمایش شامل شرایط کنترل (23 درجه سانتی گراد)، روز اول، روز سوم و روز ششم تنش سرما (چهار درجه سانتی گراد) در ژنوتیپ متحمل Sel96Th11439 (ستون سیاه) و ژنوتیپ حساسILC533 (ستون خاکستری) گیاه نخود.

Figure 2- The lipoxygenase (LOX) activity of the leaves of tolerant (Sel96Th11439) and susceptible (ILC533) chickpea genotypes (black and light gray bars, respectively) grown under control (23°C) and day 1, day 3 and day 6 of cold stress (4°C).

افزایش فعالیت این آنزیم برای ژنوتیپ حساس به طور معنی­د­اری نسبت به ژنوتیپ متحمل در سطوح بالاتری (تا 170 درصد) قرار گرفت. با توجه به فعالیت آنزیم­های LOX و AOS در مسیر اکسی­لیپین (Wasternack 2007) نتایج این آزمایش نشان می­دهد که فعالیت شاخه AOS به عنوان شاخه اصلی مسیر اکسی­لیپین تحت تنش سرما در نخود فعالیت کرده که می­تواند احتمالا منجر به تولید هورمون جاسمونات و در نتیجه تحریک و القا ژن­های دفاعی در گیاه شود. تحقیقات گذشته نیز بیانگر  فعالیت آنزیم­های LOX، AOS و AOC در سنتز جاسمونیک اسید می­باشد (Pushpalatha et al., 2011).

شکل 3- میزان فعالیت آنزیم آلن اکسید سینتاز (AOS) تحت تیمارهای دمایی آزمایش شامل شرایط کنترل (23 درجه سانتی گراد)، روز اول، روز سوم و روز ششم تنش سرما (چهار درجه سانتی گراد) در ژنوتیپ متحمل Sel96Th11439 (ستون سیاه) و ژنوتیپ حساسILC533 (ستون خاکستری) گیاه نخود.

Figure 3- The allene oxide synthase (AOX) activity of the leaves of tolerant (Sel96Th11439) and susceptible (ILC533) chickpea genotypes (black and light gray bars, respectively) grown under control (23°C) and day 1, day 3 and day 6 of cold stress (4°C).

تجزیه داده­ها به کمک نرم افزار REST نشان داد که بیان ژن­های LOX، AOS و AOCتحت تیمارهای زمانی اختلاف معنی­داری داشت (شکل 4). اگرچه در ژنوتیپ متحمل با افزایش دوره تنش افزایش بیان این ژن­ها  (تا حدود چهار برابر در مقایسه با کنترل) مشاهده شد ولیکن در ژنوتیپ حساس این افزایش میزان بیان در روز سوم و ششم تنش به مراتب بالاتر از ژنوتیپ متحمل بود (تا حدود نه برابر در مقایسه با کنترل). با توجه به روند الگوی بیان ژن، به نظر می­رسد که شاخه AOS در گیاه نخود فعال­تر از سایر مسیرهای اکسی­لیپینی تلقی شده که احتمالا تایید کننده نتایج فعالیت­های آنزیمی LOX و AOS و تاکیدی بر القای برخی از پاسخ­های دفاعی گیاه در برابر تنش می­باشد. اختلاف بیان ژن­های lox، aos و aoc به موازات تغییر در فعالیت آنزیم­های مسیر اکسی­لیپین تحت تنش برخی از پیچیدگی­های پاسخ­های گیاه نخود را به تنش سرما نشان داد به طوری که تنظیم مسیر اکسی­لیپین احتمالا در سطح رونویسی و پس از رونویسی کنترل می­شود (Yang et al., 2011). دو ژنوتیپ متحمل و حساس واکنش­های متفاوتی به تنش سرما حتی در یک مسیر بیوشیمیایی نشان می­دهند. این نتایج نشان می­دهد که تحت تنش سرما افزایش فعالیت مکانیسم­های تخریب آنزیم­ها از یک طرف و کاهش فعالیت مکانیسم­های سنتز پروتئینی از طرف دیگر، سبب القا تغییرات در فعالیت متابولیت­های سلولی شده است. بنابراین چنین متابولیتهایی دارای نقش تنظیمی در گیاه نخود بوده و در طول دوره­ نمو گیاه و سازگاری با تنش سرما به عنوان مولکول­های سیگنال عمل می­کنند (Wasternack 2007). تجزیه­های انجام شده نشان داد که گیاه در روز نخست تنش توانسته که تاحدی پایداری خود را نسبت به تنش اعمال شده نشان دهد که این واکنش در ژنوتیپ متحمل به مراتب بهتر و از میزان تحمل بیشتری در برابر تنش برخوردار بود. به نظر می­رسد در گیاهان حساس به تنش سرما مانند نخود نیز ظرفیت ژنتیکی متفاوتی وجود دارد که ارتباط مستقیم با سازگاری و مکانیسم­های متعدد فیزیولوژیکی بیوشیمیایی دارد که بایستی در جزئیات مورد مطالعه قرار گیرد. نتایج مرتبط با میزان ROS به عنوان ترکیباتی که در خسارت سلولی به ویژه غشا فعالیت دارند نیز تاکید کننده نتایج فوق بود. تحقیقات گذشته نشان داده که القا مسیر تولید جاسمونیک اسید سبب سنتز ترکیبات سلولی متعددی مانند مهارکننده­های پروتئینی، ترکیبات ضد میکروبی، آنتی­اکسیدان­ها و متابولیت­های درگیر در تعادل ROS در سلول می­شود (Gill et al., 2013) به طوری که افزایش میزان جاسمونیک اسید باعث کاهش میزان نشت الکترولیتی و در نتیجه افزایش پایداری غشا شده است (Paull and Rohrbach 1985). به طورکلی مسیر اکسی­لیپینی در هنگام تنش سرما از طریق اکسید­کردن اسیدهای چرب غیر­اشباع غشا فعالیت می­کند که در نهایت با تولید فیتوهورمون جاسمونیک اسید به عنوان سیگنال دفاعی منجر به القای برخی از پاسخ های دفاعی از جمله افزایش میزان ترکیبات فنلی گیاه می­شود (Kazemi-Shahandashti et al., 2014). از طرف دیگر به نظر می­رسد که این مسیر بیوشیمیایی روشی پرهزینه برای گیاه در مقابله با تنش می­باشد به طوری که فعالیت زیاد این مسیر (در ژنوتیپ حساس) سبب خسارت به ساختار غشایی شد. تغییر همزمان الگوی فعالیت آنزیم­های مسیر اکسی لیپین و رونوشت این آنزیم­ها و مکانیسم­های دفاعی دیگر که با تغییر شاخص خسارت مرتبط است گویای آن است که بررسی این شاخص­ها ممکن است در ارزیابی ژنوتیپ­های مختلف به تنش سرما بکار گرفته شود.