تولید رزمارینیک اسید در کشت ریشه‌های مویین مریم‌گلی اصفهانی (Salvia reuterana)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش‌آموخته گروه باغبانی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران.

2 استاد گروه باغبانی، پردیس کشاورزی ومنابع طبیعی دانشگاه تهران.

3 مربی گروه علوم گیاهی، دانشکده زیست شناسی، پردیس علوم دانشگاه تهران.

4 دانشیار پژوهشکده گیاهان و مواد اولیه دارویی دانشگاه شهید بهشتی

چکیده

برای نخستین بار ریشه­های مویین تراریخت گیاه Salvia reuterana (مریم­گلی اصفهانی) توسط تلقیح با اگروباکتریوم رایزوژنز سویه 15834 ATTC حاصل گردید. ماهیت تراریختی ریشه­های مذکور از طریق ردیابی بخشی از ژن­های T-DNA وارد شده به ژنوم گیاهی به اثبات رسید. ریشه­های مویین این گیاه توانایی تولید رزمارینیک اسید را داشتند، از این­رو اثر شش نوع محیط کشت مایع شامل B5، ½ B5، MS، ½ MS، White’s و  WPM بر روی میزان رشد و میزان تولید رزمارینیک اسید در ریشه­های مویین این گیاه بررسی گردید. ریشه­های مویین در محیط کشت MS بیشترین وزن تر (6/41 گرم در لیتر) و وزن خشک (7/3 گرم در لیتر) را داشتند. همچنین نتایج نشان داد با این­که  بیشترین میزان تولید رزمارینیک اسید (2/52 میلی­گرم به ازای هر گرم وزن خشک) در محیط کشت B5 حاصل گردید، اما بالاترین عملکرد تولید رزمارینیک اسید در محیط کشت MS (13/0 گرم در لیتر) به دست آمد. از این­رو محیط کشت MS مناسب­ترین محیط برای رشد و تولید رزمارینیک اسید در کشت ریشه­های مویین تراریخت مریم­گلی اصفهانی است.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Production of rosmarinic acid in hairy root cultures of Salvia reuterana

نویسندگان [English]

  • Reza Norouzi 1
  • Mesbah Babalar 2
  • Masoud Mir Masoumi 3
  • Javad Hadiyan 4
چکیده [English]

It was the first time that hairy roots were initiated from Salvia reuterana by infection with Agrobacterium rhizogenes strain ATTC 15834. Confirmatory studies were carried out by direct detection of inserted T-DNA by the polymerase chain reaction. These hairy root cultures had the ability to produce rosmarinic acid. The effect of six different basic media including B5، ½ B5، MS، ½ MS، White’s and WPM on the root growth and rosmarinic acid production was studied. Results showed that maximum fresh weight (41.4 g/L-1) and dry weight (3.7 g/L-1) were found in MS medium. Despite the maximum rosmarinic acid production (52.2 mg/g DW) was achieved in B5 medium, the highest amount of rosmarinic acid yield (0.13 g/L-1) was observed in MS medium. Therefore MS medium was suggested as the best culture medium for growth and rosmarinic acid production in hairy root culture of Salvia reuterana.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Lamiaceae
  • Salvia reuterana
  • Hairy Root
  • Rosmarinic acid

تولید رزمارینیک اسید در کشت ریشه­های مویین مریم­گلی اصفهانی (Salvia reuterana)

 

رضا نوروزی*1، مصباح بابالار2، مسعود میرمعصومی3، جواد هادیان4

 

1دانش­آموخته گروه باغبانی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران.

2استاد گروه باغبانی، پردیس کشاورزی ومنابع طبیعی دانشگاه تهران.

3مربی گروه علوم گیاهی، دانشکده زیست شناسی، پردیس علوم دانشگاه تهران.

4دانشیار پژوهشکده گیاهان و مواد اولیه دارویی دانشگاه شهید بهشتی.

تاریخ دریافت: 1/06/1393، تاریخ پذیرش: 11/07/1394

 

چکیده

برای نخستین بار ریشه­های مویین تراریخت گیاه Salvia reuterana (مریم­گلی اصفهانی) توسط تلقیح با اگروباکتریوم رایزوژنز سویه 15834 ATTC حاصل گردید. ماهیت تراریختی ریشه­های مذکور از طریق ردیابی بخشی از ژن­های T-DNA وارد شده به ژنوم گیاهی به اثبات رسید. ریشه­های مویین این گیاه توانایی تولید رزمارینیک اسید را داشتند، از این­رو اثر شش نوع محیط کشت مایع شامل B5، ½ B5، MS، ½ MS، White’s و  WPM بر روی میزان رشد و میزان تولید رزمارینیک اسید در ریشه­های مویین این گیاه بررسی گردید. ریشه­های مویین در محیط کشت MS بیشترین وزن تر (6/41 گرم در لیتر) و وزن خشک (7/3 گرم در لیتر) را داشتند. همچنین نتایج نشان داد با این­که  بیشترین میزان تولید رزمارینیک اسید (2/52 میلی­گرم به ازای هر گرم وزن خشک) در محیط کشت B5 حاصل گردید، اما بالاترین عملکرد تولید رزمارینیک اسید در محیط کشت MS (13/0 گرم در لیتر) به دست آمد. از این­رو محیط کشت MS مناسب­ترین محیط برای رشد و تولید رزمارینیک اسید در کشت ریشه­های مویین تراریخت مریم­گلی اصفهانی است.

واژه­های کلیدی: نعناعیان، Salvia reuterana (مریم­گلی اصفهانی) ، ریشه­های مویین، رزمارینیک اسید.



مقدمه

ویژگی دارویی بودن برخی از گیاهان به علّت وجود ترکیبات متنوعی است که متابولیت­های ثانویه نامیده می­شوند (Chaudhuri et al., 2005; Wu et al., 2007). تولید متابولیت­های ثانویه از طریق روش­های رایج، از قبیل جمع­آوری از طبیعت و کشت در زمین­های زراعی به دلایل متعددی کار ساده­ای نیست. از طرف دیگر، متابولیت­های ثانویه ممکن است محدود به جنس یا گونه خاصی باشند و یا فقط در مرحله رشدی خاصی، یا شرایط فصلی، تنش و تغذیه­ای ویژه­ای تولید گردند (Verpoorte et al., 2002). از این رو در چند دهه اخیر تلاش­های فراوانی در جهت توسعه روش­های جایگزین تولید ترکیبات ارزشمند گیاهی صورت گرفته است که در این میان استفاده از روش­های کشت بافت­ گیاهی به عنوان یکی از نوید بخش­ترین راهکارها به طور قابل ملاحظه­ای مورد توجه پژوهشگران قرار گرفته است (Dhakulkar et al., 2005; Rao & Ravishankar, 2002; Triplett et al., 2008). البته از آن­جا که بی­ثباتی در تولید و بازدهی اندک (Hu & Du, 2006; Jung et al., 2003; Rahnama et al., 2008) و نیز غیر قابل پیش­بینی بودن تشکیل متابولیت­های ثانویه (Syklowska-Baranek et al., 2009) از محدودیت­های عمده کشت سلول­های گیاهی است، و از طرفی برخی از متابولیت­ها فقط در اندام­ها­ی تمایز یافته تولید می­شوند (Verpoorte et al., 2002)، ریشه­های مویین تراریخت شده رهیافت نوینی برای تولید متابولیت­های ثانویه با ثبات بیوشیمیایی و ژنتیکی بالا می­باشند (Zarei et al., 2013; Syklowska-Baranek et al., 2009). ریشه­های مویین به دست آمده می­توانند منبع مناسب و ارزشمندی جهت تولید ترکیبات شیمیایی گیاهی[1]، متابولیت­های ثانویه در مقیاس وسیع، آنتی بادی­ها­ی مونوکلونال و گیاه پالایی و ... به شمار آیند (Kumar et al., 2006; Shi & Lindemann, 2006). رشد سریع، ثبات ژنتیکی، مرفولوژیکی و بیوشیمیایی، نداشتن زمین گرایی، سهولت نگهداری و قابلیت رشد در محیط­های کشت فاقد هورمون و تولید دامنه وسیعی از متابولیت­های ثانویه از ویژگی­های خاص ریشه­های مویین هستند و این خصوصیات سبب شده است ریشه­های مویین به عنوان مواد گیاهی ارزشمند در زمینه­های مختلف بیوتکنولوژی گیاهی مورد توجه قرار گیرند (Giri & Narasu, 2000; Hu & Du, 2006; Pawar & Maheshwari, 2004; Kabirnetaj et al., 2012).

جنس Salvia بالغ بر 900 گونه دارد، که در مناطق گرمسیری و معتدل پراکنش دارند (Barrett et al., 2000). جنس Salvia در ایران دارای 58 گونه می­باشد که 17 گونه آن اندمیک است. یکی از گونه­های این جنس، S. reuterana (مریم­گلی اصفهانی) می­باشد که گیاهی علفی و چند ساله اندمیک ارتفاعات مرکزی ایران است (Rabbani et al., 2005). ترکیبات شیمیایی موجود در اسانس اندام­های مختلف این گیاه شناسایی شده است (Mirza & Sefidkon, 1999). همچنین اثرات ضد باکتریایی (Esmaeili et al., 2008)، ضد اضطرابی و آرامبخشی (Rabbani et al., 2005) این گیاه به اثبات رسیده است. در پژوهشی دیگر، عصاره متانولی این گونه بیشترین فعالیت آنتی­اکسیدانی و نیز بالاترین میزان مواد فنلی را در میان سه گونه اندمیک ایران به خود اختصاص داده است (Esmaeili et al., 2010). از طرفی مطالعات پیشین اثبات کرده است که گیاهان خانواده نعناع شامل یک ترکیب فنلی به نام رزمارینیک اسید می­باشند که از استر­های کافئیک اسید است (Petersen et al., 2009). همچنین این ترکیب دارای خواص ضدمیکروبی، ضد ویروسی، ضدالتهابی و آنتی­اکسیدانی است (Huang et al., 2008; Lee et al., 2010). تحقیقات فراوانی برای تولید رزمارینیک اسید در کشت ریشه­های مویین گیاهان خانواده نعناع انجام شده است (Tada et al., 1996; Yan et al., 2006) اما علی­رغم تنوع قابل ملاحظه جنس مریم­گلی در ایران تاکنون مطالعه مناسبی در زمینه القای ریشه­های مویین آن­ها صورت نگرفته است، همچنین تا­کنون گزارشی از تولید رزمارینیک اسید در مریم­گلی اصفهانی ((S. reuterana منتشر نشده است. از طرفی مطالعات متعددی نشان می­دهد که نوع و غلظت محیط کشت نقش عمده­ای در رشد و تولید متابولیت­های ثانویه در کشت ریشه­های مویین گیاهان دارد (Bensaddek et al., 2001; Nussbaumer et al., 1998; Satdive et al., 2007). بنابراین تحقیق حاضر با هدف بررسی امکان تولید رزمارینیک اسید در ریشه­های مویین مریم­گلی اصفهانی انجام شد. همچنین اثرات نوع محیط کشت بر روی میزان رشد و تولید رزمارینیک اسید در ریشه­های مویین مریم­گلی اصفهانی مورد بررسی قرار گرفت.

 

مواد وروش­ها

بذر­های مریم­گلی اصفهانی ((S. reuterana از بانک ژن منابع طبیعی سازمان تحقیقات جنگل­ها و مراتع کشور (شماره هرباریومی: 8501001) تهیه گردید. این بذرها از جاده چالوس، منطقه بیلقان، استان البرز، ارتفاع 1363 متری جمع­آوری شده بودند. به منظور تولید گیاهچه­های گلدانی بذرها پس از ضد عفونی سطحی، در گلدان­های حاوی مخلوطی از پیت­ماس و پرلیت به نسبت مساوی، کشت شدند و تا زمان تولید گیاهچه­های جوان چهارهفته­ای، در دمای اتاق با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار داده شدند (Wang et al., 2013).

کشت سوسپانسون باکتری اگروباکتریوم رایزوژنز سویه 15834ATTC (تهیه شده از آزمایشگاه فیزیولوژی گیاهی دانشکده علوم دانشگاه تهران) در محیط LB (Bertani, 2004) مایع و در ارلن­های  ml100 انجام گرفت. بدین منظور کشت­های مذکور، به مدت 48 ساعت در تاریکی بر روی شیکر با سرعت rpm 100 در دمای  ̊C 26  قرار می­گرفت.

جهت تلقیح ریزنمونه­ها با باکتری، از برگ­ها و دمبرگ­های جوان گیاهچه­های حدود چهارهفته­ای استفاده شد. به منظور ضدعفونی سطحی، برگ­ها ابتدا با آب ولرم حاوی مویان شستشو گردیدند و سپس به مدت 10 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 5% که به هر لیتر از آن یک قطره توین 20 افزوده شده بود قرار گرفتند. در طی مدت ضدعفونی ظرف حاوی برگ به آرامی تکان داده شد. سپس برگ­ها با آب مقطر استریل 3 بار آبکشی شدند. برگ­ها و دمبرگ­ها توسط اسکالپل به قطعات دو سانتی­متری تقسیم شدند و به مدت 10 دقیقه در سوسپانسیون باکتری غوطه­ور بودند. سپس تمامی ریزنمونه­ها بر روی محیط کشت جامد MS عاری از هورمون قرار گرفتند. ظروف کشت به اتاق رشد با دمای C ̊2± 25 و تاریکی منتقل شدند. به منظور حذف باکتری 48 تا 72 ساعت پس از تلقیح ریزنمونه­ها به محیط تازه حاویppm  500 آنتی­بیوتیک سفوتاکسیم منتقل شدند. و این عمل تا حذف کامل باکتری چند بار با فواصل 4-2 روز در محیط­های کشت حاوی غلظت­های ppm  250، ppm 100 و ppm 50 سفوتاکسیم تکرار شد.

پس از 11-9 روز، ریشه­های مویین در حاشیه قطعات برگی ظاهر شدند. ریشه­هایی با طول 3-2 سانتی­متر به طور جداگانه از ریزنمونه­ها جدا شدند و جهت کشت در ارلن­ ml250 حاوی cc 70 محیط کشت B5 نیم غلظت دارای ppm 50 سفوتاکسیم قرار گرفتند. این ارلن­ها با پوشش­های تیره پوشانده شدند و روی شیکر با سرعتrpm  90 قرار گرفتند. پس از یک ماه یک کلون پر رشد انتخاب و واکشت گردید. جهت بررسی اثر شش نوع محیط کشت مایع شامل B5، ½ B5، MS، ½ MS، White’s و WPM (George et al., 2008)، بر فاکتور­های رشد و تولید رزمارینیک اسید در کشت ریشه­های مویین مریم­گلی اصفهانی، آزمایشی به صورت طرح کاملا تصادفی در سه تکرار انجام شد. پس از گذشت 28 روز ریشه­های مویین رشد یافته در محیط کشت­های مختلف با همدیگر مقایسه شدند.

DNA ژنومی ریشه­های مویین و ریشه­های طبیعی غیر تراریخت (شاهد منفی) به روشDoyle & Doyle (1987) استخراج گردید. به منظور استخراج پلاسمید باکتریایی از روش لیز قلیایی سامبروک و راسل (Sambrook & Russell, 2001) استفاده گردید.

DNA به دست آمده، به همراه دو جفت آغازگر اختصاصی با توالی­های 5′-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3′ و 5́́-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3́́́ برای تکثیر قطعه­ای از ژن rol C ( bp586) و توالی­های 5́-ATGTCGCAAGGACGTAAGCCGA-3́ و 5́-GGAGTCTTTCAGCATGGAGCAA-3́ برای تکثیر قطعه­ای از ژن vir D (bp 438) وارد واکنش PCR گردید. جهت بررسی الگوی باندی DNA، محصولات PCR بر روی ژل آگارز 2/1% به مدت 2 ساعت در کنار نشانگر اندازه[2] (50 bp) تولید شرکت فرمنتاز (Fermentas) الکتروفورز شدند. ژل پس از رنگ آمیزی در حمام اتیدیوم برماید در دستگاه ژل داک مشاهده گردید.

استخراج عصاره گیاهی توسط روش اولتراسونیک انجام گرفت. جداسازی و شناسایی رزمارینیک اسید با استفاده از سیستم کروماتوگرافی لایه نازک با کارایی بالا (اچ­پی­تی­ال­سی)[3] انجام پذیرفت (Babalar et al., 2010). همچنین عملکرد تولید رزمارینیک اسید از حاصلضرب میزان رزمارینیک اسید (mg/g DW) در وزن خشک (g/L-1) برای هر تیمار محاسبه شد.

برای تجزیه داده­ها از نرم افزار SAS نگارش 1/9 استفاده گردید و میانگین­ها نیز با استفاده از آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح احتمال 5% مقایسه شدند.  

 

نتایج

تلقیح نمونه­های برگی با اگروباکتریوم رایزوژنز سویه 15834ATTC پس از 11-9 روز سبب تشکیل ریشه­های مویین در حاشیه قطعات برگی گردید. از سوی دیگر در نتیجه تلقیح ریزنمونه­های دمبرگی با سویه مورد مطالعه، هیچ ریشه­ای تشکیل نگردید. ماهیت تراریختی ریشه­های مویین به­ دست آمده، با استفاده از ردیابی قسمتی از ژن rol C بررسی شد. واکنش PCR با DNA استخراج شده از ریشه­های مویین تراریخت شده موجب تکثیر قطعاتی با طول حدود 586 جفت باز گردید (شکل 1). توالی­ ژنی ناحیه D vir سبب تکثیر قطعات در DNA استخراج شده از پلاسمید باکتری شد، ولی هیچ باندی در DNA ریشه­های مویین تراریخت و ریشه­های غیر تراریخت تشکیل نگردید (شکل 2)، که نشان دهنده عدم حضور بقایای ژن­های باکتری در روی ریشه­های مویین تراریخت می­باشد.

 

میزان وزن تر نمونه­ها

نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده­های به دست آمده نشان داد اثر نوع محیط کشت بر میزان وزن تر ریشه­های مویین در سطح یک درصد معنی­دار است (جدول 1). حداکثر میزان تولید وزن تر ریشه مویین (65/41 گرم در لیتر) در محیط MS به دست آمد. میانگین وزن تر به دست آمده از ریشه­های مویین که درون محیط کشت B5 رشد یافته بودند برابر 4/18 گرم در لیتر بود. وزن تر ریشه­های مویین در این محیط تقریبا 2/1 برابر محیط  WPM بود. از میان پنج تیمار به کار رفته در این آزمایش محیط کشت White’s با میانگین وزن تر 6/8 گرم در لیتر کمترین تولید را به خود اختصاص داد. همچنین مشاهده شد که با افزایش غلظت از یک دوم به تمام غلظت میزان وزن ریشه­ها در محیط کشت MS، 7/1 برابر و در محیط کشت B5، 5/1 برابر گردید (جدول 1).

 

 

 

شکل 1- آنالیز PCR با پرایمراختصاصی ژن rol C، M: نشانگر اندازه (50 bp)، A و B: DNA ریشه طبیعی، C و D: DNA ریشه­های تراریخت، E و F: DNA پلاسمید سویه  15834.

Figure 1- PCR detection of rol C genes, M: DNA ladder (50 bp), A and B: non-transformed roots DNA, C and D: hairy roots DNA, E and F: plasmid DNA of strain15834.

 

 

 

شکل 2- آنالیز PCR با پرایمر اختصاصی ژن vir D ، M: نشانگر اندازه 50 bp، A و B: DNA پلاسمید سویه  15834، C و D: DNA ریشه­های تراریخت، E و F: DNA ریشه طبیعی.

Figure 2- PCR detection of vir D genes, M: DNA ladder (50 bp), A and B: plasmid DNA of strain 15834, C and D: hairy roots DNA, E and F: non-transformed roots DNA.

 


جدول 1- تجزیه واریانس و مقایسه میانگین  تاثیر نوع محیط کشت بر رشد و تولید رزمارینیک اسید در کشت ریشه­های مویین مریم گلی اصفهانی.

Table 1- Analysis of Variance and Compare Means of the effect of medium type on hairy root growth and rosmarinic acid production of S. reuterana hairy root.

منابع تغییرات

(SOV)

 

درجه آزادی

Degree of freedom

مجموع مربعات

(Sums Of Squares)

وزن تر

Fresh weight

وزن خشک

Dry weight

میزان رزمارینیک اسید

Rosmarinic acid

) محیط کشت Medium(

5

419.97**

4.44*

881.42**

) خطاerror(

12

4.29

0.031

2.1

) ضریب تغییراتCV%(

-

10.4

12.35

4.77


 محیط کشت

Medium

 

وزن تر

Fresh weight

 (g/L-1)

وزن خشک

Dry weight

 (g/L-1)

میزان رزمارینیک اسید

Rosmarinic acid

 (mg/g DW)

 

B5

18.467 c

1.13 c

52.26 a

1/2B5

12.307 de

0.6733 de

13.53 e

MS

41.657 a

3.7467 a

33.93 c

1/2MS

23.653 b

1.7267 b

48.4 b

White’s

8.64 e

0.4633 e

14.93 e

WPM

14.8 cd

0.84 cd

18.96 d

ns:  Not significant, *: Significant at p>0.05, **: Significant at p>0.01

There is no statically difference between means with the same letter.

ns عدم وجود اختلاف معنی­دار ،*معنی­دار در سطح 5%، **معنی­دار در سطح 1%،

میانگین هایی که در هر ستون دارای حرف مشترک هستند تفاوت معنی داری ندارند

 


میزان وزن خشک

اثر نوع محیط کشت بر روی میزان وزن خشک ریشه­های مویین در سطح 5% معنی­دار است. مقایسه میانگین داده­ها نشان داد که محیط کشت MS در میان محیط کشت­های مختلف به­کار رفته، دارای حداکثر تولید ماده خشک می­باشد. هر چند بین محیط کشت White’s و محیط کشت B5 نیم غلظت از نظر آماری اختلاف معنی­داری وجود ندارد اما به­ هر حال کمترین میزان تولید ماده خشک مربوط به محیط کشت White’s  با میزان ماده خشک 46/0 گرم در لیتر می­باشد (جدول 1).

وزن خشک ریشه­ها با افزایش غلظت از یک دوم به تمام غلظت در محیط کشت  MS،1/2 برابر و در محیط کشت B5، 8/1 برابر شد (جدول 1).

میزان تولید رزمارینیک اسید

مطابق جدول تجزیه واریانس نوع محیط کشت اثر معنی­داری بر میزان رزمارینیک اسید تولید شده در ریشه­های مویین مریم­گلی اصفهانی دارد (جدول 1). حداکثر میزان تولید رزمارینیک اسید در محیط کشت B5 حاصل گردید، به طوری­که در این محیط 2/52 میلی­گرم رزمارینیک اسید به ازای هر گرم وزن خشک به دست آمد. محیط کشت MS با اینکه بالاترین میزان تولید ریشه مویین را دارا بود اما با تولید  9/33 میلی­گرم رزمارینیک اسید به ازای هر گرم وزن خشک، به صورت معنی­داری میزان کمتری را نسبت به محیط­های کشت B5 و MS نیم­غلظت دارا بود. کمترین میزان تولید رزمارینیک اسید نیز در محیط کشت B5 نیم غلظت مشاهده گردید، هر چند مطابق نتایج به دست آمده میزان رزمارینیک اسید در ریشه­های مویین کشت داده شده در این محیط کشت از لحاظ آماری اختلاف معنی­­داری با محیط کشت White’s ندارند (جدول 1).

میزان رزمارینیک اسید تولید شده در محیط کشت نیم­غلظت MS تقریبا 4/1 برابر محیط کشت MS می­باشد. همچنین با کاهش غلظت به نصف در محیط کشت B5، میزان تولید رزمارینیک اسید بیش از 5/2 برابر تقلیل یافت (جدول 1).

 


بحث

در مطالعه حاضر برای نخستین بار ریشه­های مویین توسط اگروباکتریوم رایزوژنز در S. reuterana القا گردید و سپس اثر نوع محیط کشت بر رشد ریشه­های مویین و بیوسنتز رزمارینیک اسید در آن، مورد بررسی قرار گرفت. عملکرد کشت­ ریشه­های مویین توسط برخی از شاخص­ها نظیر میزان رشد وزنی و میزان ترکیبات تولید شده در واحد وزن خشک سنجیده می­شود. نتایج به دست آمده در این مطالعه نشان داد که نوع محیط کشت اثر قابل توجهی بر رشد و میزان تولید رزمارینیک اسید در ریشه­های مویین مریم­گلی اصفهانی دارد. مطالعات پیشین نیز نشان می­دهد که علاوه بر توانایی و قابلیت درونی ریزنمونه­ی استفاده شده، شرایط و محیط کشت نیز به دلیل دارا بودن خاصیت تغذیه­ای و تحریک کنندگی[4] نقش به سزایی در رشد ریشه­های مویین و بیوسنتز متابولیت­های ثانویه در آن­ها دارند (Xu et al., 2009; Srivastava & Srivastava, 2007). همچنین پژوهش­های مختلفی نشان می­دهد که محیط کشت­های مختلف به دلیل تفاوت­شان در اجزا و غلظت، می­توانند بر بیان تعداد قابل توجهی از ژن­ها، به ویژه ژن­های­ آنزیم­های مرتبط با بیوسنتز و استفاده از ذخایر غذایی تاثیر بگذارند و از این طریق تولید متابولیت­های ثانوی را تنظیم ­نمایند. از طرف دیگر، پتانسیل اسمزی محیط کشت می­تواند رشد ریشه­های مویین و تولید متابولیت­های ثانوی را تحت تاثیر قرار ­دهد (Asghari & Salimian Rizi, 2008; Do & Cormier, 1990). در مطالعه حاضر نیز مشاهده می­شود که بیشترین وزن تر و خشک در محیط کشت MS که دارای بیشترین قدرت یونی (mM 8/95) در میان محیط کشت­ها می­باشد، حاصل گردید. همچنین کمترین میزان وزن تر و خشک در محیط کشت White’s با کمترین قدرت یونی (mM 18) به دست آمد (George et al., 2008).

 همچنین نتایج مطالعه حاضر نشان داد که میزان تولید رزمارینیک اسید به ازای هر گرم ماده خشک در محیط کشت B5 به حداکثر خود رسید. در یک بررسی، از میان سه محیط کشت MS،B5 و WPM که در کشت ریشه­های موئین گیاه Ocimum basilicum به کار گرفته شدند، بیشترین میزان رشد در محیط کشت MS حاصل گردید (Tada et al., 1996). همچنین در بررسی تاثیر چهار نوع محیط کشت مختلف شامل B5، WPM ، MS و NN بر کشت ریشه­های مویین گیاه Coleus forskolii ، بیشترین رشد در محیط کشت MS و بیشترین میزان تولید رزمارینیک اسید در محیط B5 حاصل گردید (Li et al., 2005). نتایج فوق با مشاهدات به دست­ آمده از آزمایش حاضر در توافق است. این در حالی است که بیشترین میزان وزن تر، وزن خشک و رزمارینیک اسید تولید شده در کشت ریشه­های مویین گیاهHyssopus officinalis  در محیط کشت WPM به دست آمد ((Murakami et al., 1998، که این نتیجه به همراه نتایج تعداد دیگری از مطالعات (Chen et al., 1999; Satdive et al., 2007; Tiwari et al., 2007) با نتایج تحقیق حاضر مغایرت دارد. این تفاوت می­تواند به علت تفاوت ژنتیکی هر یک از گیاهان که در تولید ریشه­های مویین به کار گرفته شده­اند و یا به علت ماهیت ترکیب تولید شده باشد.

در مطالعه حاضر، ریشه­های کشت شده در محیط کشت MS هرچند رشد بیشتری نسبت به ریشه­های رشد یافته در محیط کشت B5 و MS نیم غلظت داشتند، اما میزان تولید رزمارینیک اسید کمتری نسبت به این دو محیط داشت. به نظر می­رسد این امر نشان­دهنده همبستگی منفی میان رشد و تولید متابولیت­های ثانویه در کشت ریشه­های مویین است. وجود همبستگی منفی میان رشد و تولید تروپان آلکالوئید نیز در کشت ریشه­های مویین Hyoscyamus alba مشاهده شده است (Christen et al., 1992)، که با نتایج حاصل از این مطالعه همخوانی دارد. در توجیه این پدیده می­توان گفت، احتمالا بالا بودن غلظت اجزای تشکیل دهنده محیط کشت MS و در نتیجه بالا بودن ارزش تغذیه­ای این محیط (George et al., 2008)، سبب افزایش میزان تنفس در ریشه­های مویین می­گردد که این شرایط جهت تولید بیوماس مطلوب است، در حالی­که بیوسنتز ترکیبات ثانوی را تحت تاثیر قرار می­دهد.

هر چند تولید رزمارینیک اسید به ازای هر گرم ماده خشک در محیط کشت MS نسبت به محیط کشت B5 و MS نیم غلظت کمتر بود، با این حال محاسبه عملکرد میزان تولید رزمارینیک اسید نشان می­دهد میزان تولید این ماده به ازای هر لیتر محیط کشت، در محیط کشت MS بیشتر بود (13/0 گرم در لیتر در برابر 08/0 و 05/0 گرم در لیتر). از این­رو به طور کلی محیط کشت MS مناسب­ترین محیط برای رشد ریشه­های مویین S. reuterana می­باشد.

 

نتیجه­گیری

مطالعه حاضر نشان می­دهد ریشه­های مویین S. reuterana (مریم گلی اصفهانی)  قادر به تولید رزمارینیک اسید هستند و محیط کشت MS به عنوان مناسب­ترین محیط کشت برای رشد ریشه­های مویین تراریخت جهت تولید رزمارینیک اسید پیشنهاد می­گردد.

 

 

 

منابع

Asghari Gh, Salimian Rizi T (2008). The influence of fructose, glucose and sucrose on flavolignans formation in Silybum marinum Callus Culture. Journal of Medicinal Plants 7: 16-23.

Babalar M, Mumivand H, Hadian J, Fakhr Tabatabaei SM (2010). Effects of nitrogen and calcium carbonate on growth, rosmarinic acid content and yield of Satureja hortensis L. Journal of Agricultural Science 2: 92-98.

Barrett SCH, Wilken DH, Cole WW (2000). Heterostyly in the Lamiaceae: the case of Salvia brandegeei. Plant Systematics and Evolution 223: 211-219.

Bensaddek L, Gillet F, Saucedo JE, Fliniaux MA (2001). The effect of nitrate and ammonium concentrations on growth and alkaloid accumulation of Atropa belladonna hairy roots. Journal of Biotechnology 85: 35-40.

Bertani G (2004). Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. Journal of Bacteriology 186: 595-600.

Chaudhuri KN, Ghosh B, Tepfer D, Jha S (2005). Genetic transformation of Tylophora indica with Agrobacterium rhizogenes A4: growth and tylophorine productivity in different transformed root clones. Plant Cell Reports 24: 25-35.

Chen H, Chen F, Zhang YL, Song JY (1999). Production of lithospermic acid B and rosmarinic acid in hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 22: 133-138.

Christen P, Aoki T, Shimomura K (1992). Characteristics of growth and tropane alkaloid production in Hyoscyamus albus hairy roots transformed with Agrobacterium rhizogenes A4. Plant Cell Reports 11: 597-600.

Dhakulkar S, Bhargava S, Ganapathi TR, Bapat VA (2005). Induction of Hairy Roots in Gmelina arborea Roxb. using Agrobacterium rhizogenes. Founder’s Day Special Issue 261: 100-106.

Do CB, Cormier F (1990). Accumulation of anthocyanins enhanced by a high osmotic potential in grape (Vitis vinifera L.) cell suspensions. Plant Cell Reports 9: 143-146.

Doyle JJ, Doyle JL (1987). A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19: 11-15.

Esmaeili A, Rustaiyan A, Nadimi M, Larijani K, Nadjafi F, Tabrizi L, Chalabian F, Amiri H (2008). Chemical composition and antibacterial activity of essential oils from leaves, stems and flowers of Salvia reuterana Boiss. grown in Iran. Natural Product Research 22: 516-520.

Esmaeili MA, Kanani MR, Sonboli A (2010). Salvia reuterana extract prevents formation of advanced glycation end products: an in vitro study. Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences 6: 33-50.

Giri A, Narasu ML (2000). Transgenic hairy roots: recent trends and applications. Biotechnology Advances 18: 1-22.

George EF, Hall MA, Klerk GJD (2008). Plant propagation by tissue culture, volume 1. Springer, Netherlands.

Hu Z-B, Du M (2006). Hairy root and its application in plant genetic engineering. Journal of Integrative Plant Biology 48: 121-127.

Huang B, Yi B, Duan Y, Sun L, Yu X, Guo J, Chen W (2008). Characterization and expression profiling of tyrosine aminotransferase gene from Salvia miltiorrhiza (Dan-shen) in rosmarinic acid biosynthesis pathway. Molecular Biology Reports 35: 601-612.

Jung H-Y, Kang S-M, Kang Y-M, Kang M-J, Yun D-J, Bahk J-D, Yang J-K, Choi M-S (2003). Enhanced production of scopolamine by bacterial elicitors in adventitious hairy root cultures of Scopolia parviflora. Enzyme and Microbial Technology 33: 987-990.

Kabirnetaj S, Zolala J, Nematzadeh GA, Shokri E (2012). Optimization of hairy root cultue establishment in chicory plants (Cichorium intybus) through inoculation by Agrobacterium rhizogenes. Journal of Agricultural Biotechnology 4: 61–75.

Kumar V, Sharma A, Narasimha Prasad BC, Bhaskar Gururaj H, Aswathanarayana Ravishankar G (2006). Agrobacterium rhizogenes mediated genetic transformation resulting in hairy root formation is enhanced by ultrasonication and acetosyringone treatment. Electronic Journal of Biotechnology 9: 349-357.

Lee SY, Lee CY, Eom SH, Kim YK, Park NI, Park SU ( 2010). Rosmarinic acid production from transformed root cultures of Nepeta cataria L. Scientific Research and Essays 5: 1122-1126.

Li W, Koike K, Asada Y, Yoshikawa T, Nikaido T (2005). Rosmarinic acid production by Coleus forskohlii hairy root cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80: 151-155.

Mirza M, Sefidkon F (1999). Essential oil composition of two Salvia species from Iran, Salvia nemorosa L. and Salvia reuterana Boiss. Flavour and Fragrance Journal 14: 230-232.

Murakami Y, Omoto T, Asai I, Shimomura K, Yoshihira K, Ishimaru K (1998). Rosmarinic acid and related phenolics in transformed root cultures of Hyssopus officinalis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 53: 75-78.

Nussbaumer P, Kapétanidis I, Christen P (1998). Hairy roots of Datura candida×D. aurea: effect of culture medium composition on growth and alkaloid biosynthesis. Plant Cell Reports 17: 405-409.

Pawar PK, Maheshwari VL (2004). Agrobacterium rhizogenes mediated hairy root induction in two medicinally important members of family Solanaceae. Indian Journal of Biotechnology 3: 414-417.

Petersen M, Abdullah Y, Benner J, Eberle D, Gehlen K, Hucherig S, Janiak V, Kim KH, Sander M, Weitzel C, Wolters S (2009). Evolution of rosmarinic acid biosynthesis. Phytochemistry 70: 1663-1679.

Rabbani M, Sajjadi SE, Jafarian A, Vaseghi G (2005). Anxiolytic effects of Salvia reuterana Boiss. on the elevated plus-maze model of anxiety in mice. Journal of Ethnopharmacology 101: 100-103.

Rahnama H, Hasanloo T, Shams MR, Sepehrifar R ( 2008). Silymarin production by hairy root culture of Silybum marianum (L.). Iranian Journal of Biotechnology. 6: 113–119.

Rao SR, Ravishankar GA (2002). Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances 20: 101-153.

Satdive RK, Fulzele DP, Eapen S (2007). Enhanced production of azadirachtin by hairy root cultures of Azadirachta indica A. Juss by elicitation and media optimization. Journal of Biotechnology 128: 281-289.

Sambrook J, Russell DW (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. New York.

Shi HP, Lindemann P (2006). Expression of recombinant Digitalis lanata EHRH. cardenolide 16'-O-glucohydrolase in Cucumis sativus L. hairy roots. Plant Cell Reports 25: 1193-1198.

Srivastava S, Srivastava AK (2007) Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology 27: 29-43.

Syklowska-Baranek K, Pietrosiuk A, Kokoszka A, Furmanowa M (2009). Enhancement of taxane production in hairy root culture of Taxus x media var. Hicksii. Journal of Plant Physiology 166: 1950-1954.

Tada H, Murakami Y, Omoto T, Shimomura K, Ishimaru K (1996). Rosmarinic acid and related phenolics in hairy root cultures of Ocimum basilicum. Phytochemistry 42: 431-434.

Tiwari RK, Trivedi M, Guang ZC, Guo GQ, Zheng GC (2007). Genetic transformation of Gentiana macrophylla with Agrobacterium rhizogenes: growth and production of secoiridoid glucoside gentiopicroside in transformed hairy root cultures. Plant Cell Reports 26: 199-210.

Triplett BA, Moss SC, Bland JM, Dowd MK, Phillips GC (2008). Induction of hairy root cultures from Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense to produce gossypol and related compounds. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 44: 508-517.

Verpoorte R, Contin A, Memelink J (2002). Biotechnology for the production of plant secondary metabolites. Phytochemistry Reviews 1: 13-25.

Wang QJ, Zheng LP, Yuan HY, Wang J (2013). Propagation of Salvia miltiorrhiza from hairy root explants via somatic embryogenesis and tanshinone content in obtained plants. Industrial Crops and Products 50: 648-653.

Wu JY, Ng J, Shi M, Wu SJ (2007). Enhanced secondary metabolite (tanshinone) production of Salvia miltiorrhiza hairy roots in a novel root-bacteria coculture process. Applied Microbiology and Biotechnology 77: 543-550.

Xu H, Park J, Kim Y, Park N, Lee S, Park S (2009). Optimization of growth and pyranocoumarins production in hairy root culture of Angelica gigas Nakai. Journal of Medicinal Plants Research 3: 978-981.

Yan Q, Shi M, Ng J, Wu JY (2006). Elicitor-induced rosmarinic acid accumulation and secondary metabolism enzyme activities in Salvia miltiorrhiza hairy roots. Plant Science 170: 853-858.

Zarei B, Kahrizi D, Mousavi SA, Nasrollahnezhad Ghomi AA (2013) Agrobacterium rhizogense-mediated transformation of Atropa belladonna. Journal of Agricultural Biotechnology 5: 59–68.

 

 


Production of rosmarinic acid in hairy root cultures of Salvia reuterana

 

Norouzi R.*1, Babalar M.2, Mirmasoumi M.3, Hadian J.4

 

1Graduated from Department of Horticultural Sciences, University of Tehran, Karaj, Iran.

2 Professor, Department of Horticultural Sciences, University of Tehran, Karaj, Iran.

3 Lecturer, Department of Botany, College of Sciences, University of Tehran, Iran.

4Associate Professor, Medicinal Plants and Drug Research Institute, Shahid Beheshti University, Iran.

 

Abstract

It was the first time that hairy roots were initiated from Salvia reuterana by infection with Agrobacterium rhizogenes strain ATTC 15834. Confirmatory studies were carried out by direct detection of inserted T-DNA by the polymerase chain reaction. These hairy root cultures had the ability to produce rosmarinic acid. The effect of six different basic media including B5، ½ B5، MS، ½ MS، White’s and WPM on the root growth and rosmarinic acid production was studied. Results showed that maximum fresh weight (41.4 g/L-1) and dry weight (3.7 g/L-1) were found in MS medium. Despite the maximum rosmarinic acid production (52.2 mg/g DW) was achieved in B5 medium, the highest amount of rosmarinic acid yield (0.13 g/L-1) was observed in MS medium. Therefore MS medium was suggested as the best culture medium for growth and rosmarinic acid production in hairy root culture of Salvia reuterana.

Key words: Lamiaceae, Salvia reuterana, Hairy root, Rosmarinic acid.


 



* نویسنده مسئول: رضا نوروزی                                       تلفن: 04532545623                                  Email: reza.norouzi@uma.ac.ir

[1] phytochemicals

[2] Size Marker

[3] High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC)

[4] Elicitation

*Corresponding Author: Norouzi R.                 Tel: 04532545623                              Email: reza.norouzi@uma.com

Asghari Gh, Salimian Rizi T (2008). The influence of fructose, glucose and sucrose on flavolignans formation in Silybum marinum Callus Culture. Journal of Medicinal Plants 7: 16-23.
Babalar M, Mumivand H, Hadian J, Fakhr Tabatabaei SM (2010). Effects of nitrogen and calcium carbonate on growth, rosmarinic acid content and yield of Satureja hortensis L. Journal of Agricultural Science 2: 92-98.
Barrett SCH, Wilken DH, Cole WW (2000). Heterostyly in the Lamiaceae: the case of Salvia brandegeei. Plant Systematics and Evolution 223: 211-219.
Bensaddek L, Gillet F, Saucedo JE, Fliniaux MA (2001). The effect of nitrate and ammonium concentrations on growth and alkaloid accumulation of Atropa belladonna hairy roots. Journal of Biotechnology 85: 35-40.
Bertani G (2004). Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. Journal of Bacteriology 186: 595-600.
Chaudhuri KN, Ghosh B, Tepfer D, Jha S (2005). Genetic transformation of Tylophora indica with Agrobacterium rhizogenes A4: growth and tylophorine productivity in different transformed root clones. Plant Cell Reports 24: 25-35.
Chen H, Chen F, Zhang YL, Song JY (1999). Production of lithospermic acid B and rosmarinic acid in hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 22: 133-138.
Christen P, Aoki T, Shimomura K (1992). Characteristics of growth and tropane alkaloid production in Hyoscyamus albus hairy roots transformed with Agrobacterium rhizogenes A4. Plant Cell Reports 11: 597-600.
Dhakulkar S, Bhargava S, Ganapathi TR, Bapat VA (2005). Induction of Hairy Roots in Gmelina arborea Roxb. using Agrobacterium rhizogenes. Founder’s Day Special Issue 261: 100-106.
Do CB, Cormier F (1990). Accumulation of anthocyanins enhanced by a high osmotic potential in grape (Vitis vinifera L.) cell suspensions. Plant Cell Reports 9: 143-146.
Doyle JJ, Doyle JL (1987). A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19: 11-15.
Esmaeili A, Rustaiyan A, Nadimi M, Larijani K, Nadjafi F, Tabrizi L, Chalabian F, Amiri H (2008). Chemical composition and antibacterial activity of essential oils from leaves, stems and flowers of Salvia reuterana Boiss. grown in Iran. Natural Product Research 22: 516-520.
Esmaeili MA, Kanani MR, Sonboli A (2010). Salvia reuterana extract prevents formation of advanced glycation end products: an in vitro study. Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences 6: 33-50.
Giri A, Narasu ML (2000). Transgenic hairy roots: recent trends and applications. Biotechnology Advances 18: 1-22.
George EF, Hall MA, Klerk GJD (2008). Plant propagation by tissue culture, volume 1. Springer, Netherlands.
Hu Z-B, Du M (2006). Hairy root and its application in plant genetic engineering. Journal of Integrative Plant Biology 48: 121-127.
Huang B, Yi B, Duan Y, Sun L, Yu X, Guo J, Chen W (2008). Characterization and expression profiling of tyrosine aminotransferase gene from Salvia miltiorrhiza (Dan-shen) in rosmarinic acid biosynthesis pathway. Molecular Biology Reports 35: 601-612.
Jung H-Y, Kang S-M, Kang Y-M, Kang M-J, Yun D-J, Bahk J-D, Yang J-K, Choi M-S (2003). Enhanced production of scopolamine by bacterial elicitors in adventitious hairy root cultures of Scopolia parviflora. Enzyme and Microbial Technology 33: 987-990.
Kabirnetaj S, Zolala J, Nematzadeh GA, Shokri E (2012). Optimization of hairy root cultue establishment in chicory plants (Cichorium intybus) through inoculation by Agrobacterium rhizogenes. Journal of Agricultural Biotechnology 4: 61–75.
Kumar V, Sharma A, Narasimha Prasad BC, Bhaskar Gururaj H, Aswathanarayana Ravishankar G (2006). Agrobacterium rhizogenes mediated genetic transformation resulting in hairy root formation is enhanced by ultrasonication and acetosyringone treatment. Electronic Journal of Biotechnology 9: 349-357.
Lee SY, Lee CY, Eom SH, Kim YK, Park NI, Park SU ( 2010). Rosmarinic acid production from transformed root cultures of Nepeta cataria L. Scientific Research and Essays 5: 1122-1126.
Li W, Koike K, Asada Y, Yoshikawa T, Nikaido T (2005). Rosmarinic acid production by Coleus forskohlii hairy root cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80: 151-155.
Mirza M, Sefidkon F (1999). Essential oil composition of two Salvia species from Iran, Salvia nemorosa L. and Salvia reuterana Boiss. Flavour and Fragrance Journal 14: 230-232.
Murakami Y, Omoto T, Asai I, Shimomura K, Yoshihira K, Ishimaru K (1998). Rosmarinic acid and related phenolics in transformed root cultures of Hyssopus officinalis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 53: 75-78.
Nussbaumer P, Kapétanidis I, Christen P (1998). Hairy roots of Datura candida×D. aurea: effect of culture medium composition on growth and alkaloid biosynthesis. Plant Cell Reports 17: 405-409.
Pawar PK, Maheshwari VL (2004). Agrobacterium rhizogenes mediated hairy root induction in two medicinally important members of family Solanaceae. Indian Journal of Biotechnology 3: 414-417.
Petersen M, Abdullah Y, Benner J, Eberle D, Gehlen K, Hucherig S, Janiak V, Kim KH, Sander M, Weitzel C, Wolters S (2009). Evolution of rosmarinic acid biosynthesis. Phytochemistry 70: 1663-1679.
Rabbani M, Sajjadi SE, Jafarian A, Vaseghi G (2005). Anxiolytic effects of Salvia reuterana Boiss. on the elevated plus-maze model of anxiety in mice. Journal of Ethnopharmacology 101: 100-103.
Rahnama H, Hasanloo T, Shams MR, Sepehrifar R ( 2008). Silymarin production by hairy root culture of Silybum marianum (L.). Iranian Journal of Biotechnology. 6: 113–119.
Rao SR, Ravishankar GA (2002). Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances 20: 101-153.
Satdive RK, Fulzele DP, Eapen S (2007). Enhanced production of azadirachtin by hairy root cultures of Azadirachta indica A. Juss by elicitation and media optimization. Journal of Biotechnology 128: 281-289.
Sambrook J, Russell DW (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. New York.
Shi HP, Lindemann P (2006). Expression of recombinant Digitalis lanata EHRH. cardenolide 16'-O-glucohydrolase in Cucumis sativus L. hairy roots. Plant Cell Reports 25: 1193-1198.
Srivastava S, Srivastava AK (2007) Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology 27: 29-43.
Syklowska-Baranek K, Pietrosiuk A, Kokoszka A, Furmanowa M (2009). Enhancement of taxane production in hairy root culture of Taxus x media var. Hicksii. Journal of Plant Physiology 166: 1950-1954.
Tada H, Murakami Y, Omoto T, Shimomura K, Ishimaru K (1996). Rosmarinic acid and related phenolics in hairy root cultures of Ocimum basilicum. Phytochemistry 42: 431-434.
Tiwari RK, Trivedi M, Guang ZC, Guo GQ, Zheng GC (2007). Genetic transformation of Gentiana macrophylla with Agrobacterium rhizogenes: growth and production of secoiridoid glucoside gentiopicroside in transformed hairy root cultures. Plant Cell Reports 26: 199-210.
Triplett BA, Moss SC, Bland JM, Dowd MK, Phillips GC (2008). Induction of hairy root cultures from Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense to produce gossypol and related compounds. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 44: 508-517.
Verpoorte R, Contin A, Memelink J (2002). Biotechnology for the production of plant secondary metabolites. Phytochemistry Reviews 1: 13-25.
Wang QJ, Zheng LP, Yuan HY, Wang J (2013). Propagation of Salvia miltiorrhiza from hairy root explants via somatic embryogenesis and tanshinone content in obtained plants. Industrial Crops and Products 50: 648-653.
Wu JY, Ng J, Shi M, Wu SJ (2007). Enhanced secondary metabolite (tanshinone) production of Salvia miltiorrhiza hairy roots in a novel root-bacteria coculture process. Applied Microbiology and Biotechnology 77: 543-550.
Xu H, Park J, Kim Y, Park N, Lee S, Park S (2009). Optimization of growth and pyranocoumarins production in hairy root culture of Angelica gigas Nakai. Journal of Medicinal Plants Research 3: 978-981.
Yan Q, Shi M, Ng J, Wu JY (2006). Elicitor-induced rosmarinic acid accumulation and secondary metabolism enzyme activities in Salvia miltiorrhiza hairy roots. Plant Science 170: 853-858.
Zarei B, Kahrizi D, Mousavi SA, Nasrollahnezhad Ghomi AA (2013) Agrobacterium rhizogense-mediated transformation of Atropa belladonna. Journal of Agricultural Biotechnology 5: 59–68.