نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشآموخته گروه باغبانی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران.
2 استاد گروه باغبانی، پردیس کشاورزی ومنابع طبیعی دانشگاه تهران.
3 مربی گروه علوم گیاهی، دانشکده زیست شناسی، پردیس علوم دانشگاه تهران.
4 دانشیار پژوهشکده گیاهان و مواد اولیه دارویی دانشگاه شهید بهشتی
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
It was the first time that hairy roots were initiated from Salvia reuterana by infection with Agrobacterium rhizogenes strain ATTC 15834. Confirmatory studies were carried out by direct detection of inserted T-DNA by the polymerase chain reaction. These hairy root cultures had the ability to produce rosmarinic acid. The effect of six different basic media including B5، ½ B5، MS، ½ MS، White’s and WPM on the root growth and rosmarinic acid production was studied. Results showed that maximum fresh weight (41.4 g/L-1) and dry weight (3.7 g/L-1) were found in MS medium. Despite the maximum rosmarinic acid production (52.2 mg/g DW) was achieved in B5 medium, the highest amount of rosmarinic acid yield (0.13 g/L-1) was observed in MS medium. Therefore MS medium was suggested as the best culture medium for growth and rosmarinic acid production in hairy root culture of Salvia reuterana.
کلیدواژه‌ها [English]
تولید رزمارینیک اسید در کشت ریشههای مویین مریمگلی اصفهانی (Salvia reuterana)
رضا نوروزی*1، مصباح بابالار2، مسعود میرمعصومی3، جواد هادیان4
1دانشآموخته گروه باغبانی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران.
2استاد گروه باغبانی، پردیس کشاورزی ومنابع طبیعی دانشگاه تهران.
3مربی گروه علوم گیاهی، دانشکده زیست شناسی، پردیس علوم دانشگاه تهران.
4دانشیار پژوهشکده گیاهان و مواد اولیه دارویی دانشگاه شهید بهشتی.
تاریخ دریافت: 1/06/1393، تاریخ پذیرش: 11/07/1394
چکیده
برای نخستین بار ریشههای مویین تراریخت گیاه Salvia reuterana (مریمگلی اصفهانی) توسط تلقیح با اگروباکتریوم رایزوژنز سویه 15834 ATTC حاصل گردید. ماهیت تراریختی ریشههای مذکور از طریق ردیابی بخشی از ژنهای T-DNA وارد شده به ژنوم گیاهی به اثبات رسید. ریشههای مویین این گیاه توانایی تولید رزمارینیک اسید را داشتند، از اینرو اثر شش نوع محیط کشت مایع شامل B5، ½ B5، MS، ½ MS، White’s و WPM بر روی میزان رشد و میزان تولید رزمارینیک اسید در ریشههای مویین این گیاه بررسی گردید. ریشههای مویین در محیط کشت MS بیشترین وزن تر (6/41 گرم در لیتر) و وزن خشک (7/3 گرم در لیتر) را داشتند. همچنین نتایج نشان داد با اینکه بیشترین میزان تولید رزمارینیک اسید (2/52 میلیگرم به ازای هر گرم وزن خشک) در محیط کشت B5 حاصل گردید، اما بالاترین عملکرد تولید رزمارینیک اسید در محیط کشت MS (13/0 گرم در لیتر) به دست آمد. از اینرو محیط کشت MS مناسبترین محیط برای رشد و تولید رزمارینیک اسید در کشت ریشههای مویین تراریخت مریمگلی اصفهانی است.
واژههای کلیدی: نعناعیان، Salvia reuterana (مریمگلی اصفهانی) ، ریشههای مویین، رزمارینیک اسید.
مقدمه
ویژگی دارویی بودن برخی از گیاهان به علّت وجود ترکیبات متنوعی است که متابولیتهای ثانویه نامیده میشوند (Chaudhuri et al., 2005; Wu et al., 2007). تولید متابولیتهای ثانویه از طریق روشهای رایج، از قبیل جمعآوری از طبیعت و کشت در زمینهای زراعی به دلایل متعددی کار سادهای نیست. از طرف دیگر، متابولیتهای ثانویه ممکن است محدود به جنس یا گونه خاصی باشند و یا فقط در مرحله رشدی خاصی، یا شرایط فصلی، تنش و تغذیهای ویژهای تولید گردند (Verpoorte et al., 2002). از این رو در چند دهه اخیر تلاشهای فراوانی در جهت توسعه روشهای جایگزین تولید ترکیبات ارزشمند گیاهی صورت گرفته است که در این میان استفاده از روشهای کشت بافت گیاهی به عنوان یکی از نوید بخشترین راهکارها به طور قابل ملاحظهای مورد توجه پژوهشگران قرار گرفته است (Dhakulkar et al., 2005; Rao & Ravishankar, 2002; Triplett et al., 2008). البته از آنجا که بیثباتی در تولید و بازدهی اندک (Hu & Du, 2006; Jung et al., 2003; Rahnama et al., 2008) و نیز غیر قابل پیشبینی بودن تشکیل متابولیتهای ثانویه (Syklowska-Baranek et al., 2009) از محدودیتهای عمده کشت سلولهای گیاهی است، و از طرفی برخی از متابولیتها فقط در اندامهای تمایز یافته تولید میشوند (Verpoorte et al., 2002)، ریشههای مویین تراریخت شده رهیافت نوینی برای تولید متابولیتهای ثانویه با ثبات بیوشیمیایی و ژنتیکی بالا میباشند (Zarei et al., 2013; Syklowska-Baranek et al., 2009). ریشههای مویین به دست آمده میتوانند منبع مناسب و ارزشمندی جهت تولید ترکیبات شیمیایی گیاهی[1]، متابولیتهای ثانویه در مقیاس وسیع، آنتی بادیهای مونوکلونال و گیاه پالایی و ... به شمار آیند (Kumar et al., 2006; Shi & Lindemann, 2006). رشد سریع، ثبات ژنتیکی، مرفولوژیکی و بیوشیمیایی، نداشتن زمین گرایی، سهولت نگهداری و قابلیت رشد در محیطهای کشت فاقد هورمون و تولید دامنه وسیعی از متابولیتهای ثانویه از ویژگیهای خاص ریشههای مویین هستند و این خصوصیات سبب شده است ریشههای مویین به عنوان مواد گیاهی ارزشمند در زمینههای مختلف بیوتکنولوژی گیاهی مورد توجه قرار گیرند (Giri & Narasu, 2000; Hu & Du, 2006; Pawar & Maheshwari, 2004; Kabirnetaj et al., 2012).
جنس Salvia بالغ بر 900 گونه دارد، که در مناطق گرمسیری و معتدل پراکنش دارند (Barrett et al., 2000). جنس Salvia در ایران دارای 58 گونه میباشد که 17 گونه آن اندمیک است. یکی از گونههای این جنس، S. reuterana (مریمگلی اصفهانی) میباشد که گیاهی علفی و چند ساله اندمیک ارتفاعات مرکزی ایران است (Rabbani et al., 2005). ترکیبات شیمیایی موجود در اسانس اندامهای مختلف این گیاه شناسایی شده است (Mirza & Sefidkon, 1999). همچنین اثرات ضد باکتریایی (Esmaeili et al., 2008)، ضد اضطرابی و آرامبخشی (Rabbani et al., 2005) این گیاه به اثبات رسیده است. در پژوهشی دیگر، عصاره متانولی این گونه بیشترین فعالیت آنتیاکسیدانی و نیز بالاترین میزان مواد فنلی را در میان سه گونه اندمیک ایران به خود اختصاص داده است (Esmaeili et al., 2010). از طرفی مطالعات پیشین اثبات کرده است که گیاهان خانواده نعناع شامل یک ترکیب فنلی به نام رزمارینیک اسید میباشند که از استرهای کافئیک اسید است (Petersen et al., 2009). همچنین این ترکیب دارای خواص ضدمیکروبی، ضد ویروسی، ضدالتهابی و آنتیاکسیدانی است (Huang et al., 2008; Lee et al., 2010). تحقیقات فراوانی برای تولید رزمارینیک اسید در کشت ریشههای مویین گیاهان خانواده نعناع انجام شده است (Tada et al., 1996; Yan et al., 2006) اما علیرغم تنوع قابل ملاحظه جنس مریمگلی در ایران تاکنون مطالعه مناسبی در زمینه القای ریشههای مویین آنها صورت نگرفته است، همچنین تاکنون گزارشی از تولید رزمارینیک اسید در مریمگلی اصفهانی ((S. reuterana منتشر نشده است. از طرفی مطالعات متعددی نشان میدهد که نوع و غلظت محیط کشت نقش عمدهای در رشد و تولید متابولیتهای ثانویه در کشت ریشههای مویین گیاهان دارد (Bensaddek et al., 2001; Nussbaumer et al., 1998; Satdive et al., 2007). بنابراین تحقیق حاضر با هدف بررسی امکان تولید رزمارینیک اسید در ریشههای مویین مریمگلی اصفهانی انجام شد. همچنین اثرات نوع محیط کشت بر روی میزان رشد و تولید رزمارینیک اسید در ریشههای مویین مریمگلی اصفهانی مورد بررسی قرار گرفت.
مواد وروشها
بذرهای مریمگلی اصفهانی ((S. reuterana از بانک ژن منابع طبیعی سازمان تحقیقات جنگلها و مراتع کشور (شماره هرباریومی: 8501001) تهیه گردید. این بذرها از جاده چالوس، منطقه بیلقان، استان البرز، ارتفاع 1363 متری جمعآوری شده بودند. به منظور تولید گیاهچههای گلدانی بذرها پس از ضد عفونی سطحی، در گلدانهای حاوی مخلوطی از پیتماس و پرلیت به نسبت مساوی، کشت شدند و تا زمان تولید گیاهچههای جوان چهارهفتهای، در دمای اتاق با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار داده شدند (Wang et al., 2013).
کشت سوسپانسون باکتری اگروباکتریوم رایزوژنز سویه 15834ATTC (تهیه شده از آزمایشگاه فیزیولوژی گیاهی دانشکده علوم دانشگاه تهران) در محیط LB (Bertani, 2004) مایع و در ارلنهای ml100 انجام گرفت. بدین منظور کشتهای مذکور، به مدت 48 ساعت در تاریکی بر روی شیکر با سرعت rpm 100 در دمای ̊C 26 قرار میگرفت.
جهت تلقیح ریزنمونهها با باکتری، از برگها و دمبرگهای جوان گیاهچههای حدود چهارهفتهای استفاده شد. به منظور ضدعفونی سطحی، برگها ابتدا با آب ولرم حاوی مویان شستشو گردیدند و سپس به مدت 10 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 5% که به هر لیتر از آن یک قطره توین 20 افزوده شده بود قرار گرفتند. در طی مدت ضدعفونی ظرف حاوی برگ به آرامی تکان داده شد. سپس برگها با آب مقطر استریل 3 بار آبکشی شدند. برگها و دمبرگها توسط اسکالپل به قطعات دو سانتیمتری تقسیم شدند و به مدت 10 دقیقه در سوسپانسیون باکتری غوطهور بودند. سپس تمامی ریزنمونهها بر روی محیط کشت جامد MS عاری از هورمون قرار گرفتند. ظروف کشت به اتاق رشد با دمای C ̊2± 25 و تاریکی منتقل شدند. به منظور حذف باکتری 48 تا 72 ساعت پس از تلقیح ریزنمونهها به محیط تازه حاویppm 500 آنتیبیوتیک سفوتاکسیم منتقل شدند. و این عمل تا حذف کامل باکتری چند بار با فواصل 4-2 روز در محیطهای کشت حاوی غلظتهای ppm 250، ppm 100 و ppm 50 سفوتاکسیم تکرار شد.
پس از 11-9 روز، ریشههای مویین در حاشیه قطعات برگی ظاهر شدند. ریشههایی با طول 3-2 سانتیمتر به طور جداگانه از ریزنمونهها جدا شدند و جهت کشت در ارلن ml250 حاوی cc 70 محیط کشت B5 نیم غلظت دارای ppm 50 سفوتاکسیم قرار گرفتند. این ارلنها با پوششهای تیره پوشانده شدند و روی شیکر با سرعتrpm 90 قرار گرفتند. پس از یک ماه یک کلون پر رشد انتخاب و واکشت گردید. جهت بررسی اثر شش نوع محیط کشت مایع شامل B5، ½ B5، MS، ½ MS، White’s و WPM (George et al., 2008)، بر فاکتورهای رشد و تولید رزمارینیک اسید در کشت ریشههای مویین مریمگلی اصفهانی، آزمایشی به صورت طرح کاملا تصادفی در سه تکرار انجام شد. پس از گذشت 28 روز ریشههای مویین رشد یافته در محیط کشتهای مختلف با همدیگر مقایسه شدند.
DNA ژنومی ریشههای مویین و ریشههای طبیعی غیر تراریخت (شاهد منفی) به روشDoyle & Doyle (1987) استخراج گردید. به منظور استخراج پلاسمید باکتریایی از روش لیز قلیایی سامبروک و راسل (Sambrook & Russell, 2001) استفاده گردید.
DNA به دست آمده، به همراه دو جفت آغازگر اختصاصی با توالیهای 5′-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3′ و 5́́-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3́́́ برای تکثیر قطعهای از ژن rol C ( bp586) و توالیهای 5́-ATGTCGCAAGGACGTAAGCCGA-3́ و 5́-GGAGTCTTTCAGCATGGAGCAA-3́ برای تکثیر قطعهای از ژن vir D (bp 438) وارد واکنش PCR گردید. جهت بررسی الگوی باندی DNA، محصولات PCR بر روی ژل آگارز 2/1% به مدت 2 ساعت در کنار نشانگر اندازه[2] (50 bp) تولید شرکت فرمنتاز (Fermentas) الکتروفورز شدند. ژل پس از رنگ آمیزی در حمام اتیدیوم برماید در دستگاه ژل داک مشاهده گردید.
استخراج عصاره گیاهی توسط روش اولتراسونیک انجام گرفت. جداسازی و شناسایی رزمارینیک اسید با استفاده از سیستم کروماتوگرافی لایه نازک با کارایی بالا (اچپیتیالسی)[3] انجام پذیرفت (Babalar et al., 2010). همچنین عملکرد تولید رزمارینیک اسید از حاصلضرب میزان رزمارینیک اسید (mg/g DW) در وزن خشک (g/L-1) برای هر تیمار محاسبه شد.
برای تجزیه دادهها از نرم افزار SAS نگارش 1/9 استفاده گردید و میانگینها نیز با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال 5% مقایسه شدند.
نتایج
تلقیح نمونههای برگی با اگروباکتریوم رایزوژنز سویه 15834ATTC پس از 11-9 روز سبب تشکیل ریشههای مویین در حاشیه قطعات برگی گردید. از سوی دیگر در نتیجه تلقیح ریزنمونههای دمبرگی با سویه مورد مطالعه، هیچ ریشهای تشکیل نگردید. ماهیت تراریختی ریشههای مویین به دست آمده، با استفاده از ردیابی قسمتی از ژن rol C بررسی شد. واکنش PCR با DNA استخراج شده از ریشههای مویین تراریخت شده موجب تکثیر قطعاتی با طول حدود 586 جفت باز گردید (شکل 1). توالی ژنی ناحیه D vir سبب تکثیر قطعات در DNA استخراج شده از پلاسمید باکتری شد، ولی هیچ باندی در DNA ریشههای مویین تراریخت و ریشههای غیر تراریخت تشکیل نگردید (شکل 2)، که نشان دهنده عدم حضور بقایای ژنهای باکتری در روی ریشههای مویین تراریخت میباشد.
میزان وزن تر نمونهها
نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادههای به دست آمده نشان داد اثر نوع محیط کشت بر میزان وزن تر ریشههای مویین در سطح یک درصد معنیدار است (جدول 1). حداکثر میزان تولید وزن تر ریشه مویین (65/41 گرم در لیتر) در محیط MS به دست آمد. میانگین وزن تر به دست آمده از ریشههای مویین که درون محیط کشت B5 رشد یافته بودند برابر 4/18 گرم در لیتر بود. وزن تر ریشههای مویین در این محیط تقریبا 2/1 برابر محیط WPM بود. از میان پنج تیمار به کار رفته در این آزمایش محیط کشت White’s با میانگین وزن تر 6/8 گرم در لیتر کمترین تولید را به خود اختصاص داد. همچنین مشاهده شد که با افزایش غلظت از یک دوم به تمام غلظت میزان وزن ریشهها در محیط کشت MS، 7/1 برابر و در محیط کشت B5، 5/1 برابر گردید (جدول 1).
شکل 1- آنالیز PCR با پرایمراختصاصی ژن rol C، M: نشانگر اندازه (50 bp)، A و B: DNA ریشه طبیعی، C و D: DNA ریشههای تراریخت، E و F: DNA پلاسمید سویه 15834.
Figure 1- PCR detection of rol C genes, M: DNA ladder (50 bp), A and B: non-transformed roots DNA, C and D: hairy roots DNA, E and F: plasmid DNA of strain15834.
شکل 2- آنالیز PCR با پرایمر اختصاصی ژن vir D ، M: نشانگر اندازه 50 bp، A و B: DNA پلاسمید سویه 15834، C و D: DNA ریشههای تراریخت، E و F: DNA ریشه طبیعی.
Figure 2- PCR detection of vir D genes, M: DNA ladder (50 bp), A and B: plasmid DNA of strain 15834, C and D: hairy roots DNA, E and F: non-transformed roots DNA.
جدول 1- تجزیه واریانس و مقایسه میانگین تاثیر نوع محیط کشت بر رشد و تولید رزمارینیک اسید در کشت ریشههای مویین مریم گلی اصفهانی.
Table 1- Analysis of Variance and Compare Means of the effect of medium type on hairy root growth and rosmarinic acid production of S. reuterana hairy root.
|
منابع تغییرات (SOV) |
درجه آزادی Degree of freedom |
مجموع مربعات (Sums Of Squares) |
||
|
وزن تر Fresh weight |
وزن خشک Dry weight |
میزان رزمارینیک اسید Rosmarinic acid |
||
|
) محیط کشت Medium( |
5 |
419.97** |
4.44* |
881.42** |
|
) خطاerror( |
12 |
4.29 |
0.031 |
2.1 |
|
) ضریب تغییراتCV%( |
- |
10.4 |
12.35 |
4.77 |
محیط کشت Medium
|
وزن تر Fresh weight (g/L-1) |
وزن خشک Dry weight (g/L-1) |
میزان رزمارینیک اسید Rosmarinic acid (mg/g DW)
|
|
|
B5 |
18.467 c |
1.13 c |
52.26 a |
|
|
1/2B5 |
12.307 de |
0.6733 de |
13.53 e |
|
|
MS |
41.657 a |
3.7467 a |
33.93 c |
|
|
1/2MS |
23.653 b |
1.7267 b |
48.4 b |
|
|
White’s |
8.64 e |
0.4633 e |
14.93 e |
|
|
WPM |
14.8 cd |
0.84 cd |
18.96 d |
|
ns: Not significant, *: Significant at p>0.05, **: Significant at p>0.01
There is no statically difference between means with the same letter.
ns عدم وجود اختلاف معنیدار ،*معنیدار در سطح 5%، **معنیدار در سطح 1%،
میانگین هایی که در هر ستون دارای حرف مشترک هستند تفاوت معنی داری ندارند
میزان وزن خشک
اثر نوع محیط کشت بر روی میزان وزن خشک ریشههای مویین در سطح 5% معنیدار است. مقایسه میانگین دادهها نشان داد که محیط کشت MS در میان محیط کشتهای مختلف بهکار رفته، دارای حداکثر تولید ماده خشک میباشد. هر چند بین محیط کشت White’s و محیط کشت B5 نیم غلظت از نظر آماری اختلاف معنیداری وجود ندارد اما به هر حال کمترین میزان تولید ماده خشک مربوط به محیط کشت White’s با میزان ماده خشک 46/0 گرم در لیتر میباشد (جدول 1).
وزن خشک ریشهها با افزایش غلظت از یک دوم به تمام غلظت در محیط کشت MS،1/2 برابر و در محیط کشت B5، 8/1 برابر شد (جدول 1).
میزان تولید رزمارینیک اسید
مطابق جدول تجزیه واریانس نوع محیط کشت اثر معنیداری بر میزان رزمارینیک اسید تولید شده در ریشههای مویین مریمگلی اصفهانی دارد (جدول 1). حداکثر میزان تولید رزمارینیک اسید در محیط کشت B5 حاصل گردید، به طوریکه در این محیط 2/52 میلیگرم رزمارینیک اسید به ازای هر گرم وزن خشک به دست آمد. محیط کشت MS با اینکه بالاترین میزان تولید ریشه مویین را دارا بود اما با تولید 9/33 میلیگرم رزمارینیک اسید به ازای هر گرم وزن خشک، به صورت معنیداری میزان کمتری را نسبت به محیطهای کشت B5 و MS نیمغلظت دارا بود. کمترین میزان تولید رزمارینیک اسید نیز در محیط کشت B5 نیم غلظت مشاهده گردید، هر چند مطابق نتایج به دست آمده میزان رزمارینیک اسید در ریشههای مویین کشت داده شده در این محیط کشت از لحاظ آماری اختلاف معنیداری با محیط کشت White’s ندارند (جدول 1).
میزان رزمارینیک اسید تولید شده در محیط کشت نیمغلظت MS تقریبا 4/1 برابر محیط کشت MS میباشد. همچنین با کاهش غلظت به نصف در محیط کشت B5، میزان تولید رزمارینیک اسید بیش از 5/2 برابر تقلیل یافت (جدول 1).
بحث
در مطالعه حاضر برای نخستین بار ریشههای مویین توسط اگروباکتریوم رایزوژنز در S. reuterana القا گردید و سپس اثر نوع محیط کشت بر رشد ریشههای مویین و بیوسنتز رزمارینیک اسید در آن، مورد بررسی قرار گرفت. عملکرد کشت ریشههای مویین توسط برخی از شاخصها نظیر میزان رشد وزنی و میزان ترکیبات تولید شده در واحد وزن خشک سنجیده میشود. نتایج به دست آمده در این مطالعه نشان داد که نوع محیط کشت اثر قابل توجهی بر رشد و میزان تولید رزمارینیک اسید در ریشههای مویین مریمگلی اصفهانی دارد. مطالعات پیشین نیز نشان میدهد که علاوه بر توانایی و قابلیت درونی ریزنمونهی استفاده شده، شرایط و محیط کشت نیز به دلیل دارا بودن خاصیت تغذیهای و تحریک کنندگی[4] نقش به سزایی در رشد ریشههای مویین و بیوسنتز متابولیتهای ثانویه در آنها دارند (Xu et al., 2009; Srivastava & Srivastava, 2007). همچنین پژوهشهای مختلفی نشان میدهد که محیط کشتهای مختلف به دلیل تفاوتشان در اجزا و غلظت، میتوانند بر بیان تعداد قابل توجهی از ژنها، به ویژه ژنهای آنزیمهای مرتبط با بیوسنتز و استفاده از ذخایر غذایی تاثیر بگذارند و از این طریق تولید متابولیتهای ثانوی را تنظیم نمایند. از طرف دیگر، پتانسیل اسمزی محیط کشت میتواند رشد ریشههای مویین و تولید متابولیتهای ثانوی را تحت تاثیر قرار دهد (Asghari & Salimian Rizi, 2008; Do & Cormier, 1990). در مطالعه حاضر نیز مشاهده میشود که بیشترین وزن تر و خشک در محیط کشت MS که دارای بیشترین قدرت یونی (mM 8/95) در میان محیط کشتها میباشد، حاصل گردید. همچنین کمترین میزان وزن تر و خشک در محیط کشت White’s با کمترین قدرت یونی (mM 18) به دست آمد (George et al., 2008).
همچنین نتایج مطالعه حاضر نشان داد که میزان تولید رزمارینیک اسید به ازای هر گرم ماده خشک در محیط کشت B5 به حداکثر خود رسید. در یک بررسی، از میان سه محیط کشت MS،B5 و WPM که در کشت ریشههای موئین گیاه Ocimum basilicum به کار گرفته شدند، بیشترین میزان رشد در محیط کشت MS حاصل گردید (Tada et al., 1996). همچنین در بررسی تاثیر چهار نوع محیط کشت مختلف شامل B5، WPM ، MS و NN بر کشت ریشههای مویین گیاه Coleus forskolii ، بیشترین رشد در محیط کشت MS و بیشترین میزان تولید رزمارینیک اسید در محیط B5 حاصل گردید (Li et al., 2005). نتایج فوق با مشاهدات به دست آمده از آزمایش حاضر در توافق است. این در حالی است که بیشترین میزان وزن تر، وزن خشک و رزمارینیک اسید تولید شده در کشت ریشههای مویین گیاهHyssopus officinalis در محیط کشت WPM به دست آمد ((Murakami et al., 1998، که این نتیجه به همراه نتایج تعداد دیگری از مطالعات (Chen et al., 1999; Satdive et al., 2007; Tiwari et al., 2007) با نتایج تحقیق حاضر مغایرت دارد. این تفاوت میتواند به علت تفاوت ژنتیکی هر یک از گیاهان که در تولید ریشههای مویین به کار گرفته شدهاند و یا به علت ماهیت ترکیب تولید شده باشد.
در مطالعه حاضر، ریشههای کشت شده در محیط کشت MS هرچند رشد بیشتری نسبت به ریشههای رشد یافته در محیط کشت B5 و MS نیم غلظت داشتند، اما میزان تولید رزمارینیک اسید کمتری نسبت به این دو محیط داشت. به نظر میرسد این امر نشاندهنده همبستگی منفی میان رشد و تولید متابولیتهای ثانویه در کشت ریشههای مویین است. وجود همبستگی منفی میان رشد و تولید تروپان آلکالوئید نیز در کشت ریشههای مویین Hyoscyamus alba مشاهده شده است (Christen et al., 1992)، که با نتایج حاصل از این مطالعه همخوانی دارد. در توجیه این پدیده میتوان گفت، احتمالا بالا بودن غلظت اجزای تشکیل دهنده محیط کشت MS و در نتیجه بالا بودن ارزش تغذیهای این محیط (George et al., 2008)، سبب افزایش میزان تنفس در ریشههای مویین میگردد که این شرایط جهت تولید بیوماس مطلوب است، در حالیکه بیوسنتز ترکیبات ثانوی را تحت تاثیر قرار میدهد.
هر چند تولید رزمارینیک اسید به ازای هر گرم ماده خشک در محیط کشت MS نسبت به محیط کشت B5 و MS نیم غلظت کمتر بود، با این حال محاسبه عملکرد میزان تولید رزمارینیک اسید نشان میدهد میزان تولید این ماده به ازای هر لیتر محیط کشت، در محیط کشت MS بیشتر بود (13/0 گرم در لیتر در برابر 08/0 و 05/0 گرم در لیتر). از اینرو به طور کلی محیط کشت MS مناسبترین محیط برای رشد ریشههای مویین S. reuterana میباشد.
نتیجهگیری
مطالعه حاضر نشان میدهد ریشههای مویین S. reuterana (مریم گلی اصفهانی) قادر به تولید رزمارینیک اسید هستند و محیط کشت MS به عنوان مناسبترین محیط کشت برای رشد ریشههای مویین تراریخت جهت تولید رزمارینیک اسید پیشنهاد میگردد.
منابع
Asghari Gh, Salimian Rizi T (2008). The influence of fructose, glucose and sucrose on flavolignans formation in Silybum marinum Callus Culture. Journal of Medicinal Plants 7: 16-23.
Babalar M, Mumivand H, Hadian J, Fakhr Tabatabaei SM (2010). Effects of nitrogen and calcium carbonate on growth, rosmarinic acid content and yield of Satureja hortensis L. Journal of Agricultural Science 2: 92-98.
Barrett SCH, Wilken DH, Cole WW (2000). Heterostyly in the Lamiaceae: the case of Salvia brandegeei. Plant Systematics and Evolution 223: 211-219.
Bensaddek L, Gillet F, Saucedo JE, Fliniaux MA (2001). The effect of nitrate and ammonium concentrations on growth and alkaloid accumulation of Atropa belladonna hairy roots. Journal of Biotechnology 85: 35-40.
Bertani G (2004). Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. Journal of Bacteriology 186: 595-600.
Chaudhuri KN, Ghosh B, Tepfer D, Jha S (2005). Genetic transformation of Tylophora indica with Agrobacterium rhizogenes A4: growth and tylophorine productivity in different transformed root clones. Plant Cell Reports 24: 25-35.
Chen H, Chen F, Zhang YL, Song JY (1999). Production of lithospermic acid B and rosmarinic acid in hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 22: 133-138.
Christen P, Aoki T, Shimomura K (1992). Characteristics of growth and tropane alkaloid production in Hyoscyamus albus hairy roots transformed with Agrobacterium rhizogenes A4. Plant Cell Reports 11: 597-600.
Dhakulkar S, Bhargava S, Ganapathi TR, Bapat VA (2005). Induction of Hairy Roots in Gmelina arborea Roxb. using Agrobacterium rhizogenes. Founder’s Day Special Issue 261: 100-106.
Do CB, Cormier F (1990). Accumulation of anthocyanins enhanced by a high osmotic potential in grape (Vitis vinifera L.) cell suspensions. Plant Cell Reports 9: 143-146.
Doyle JJ, Doyle JL (1987). A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19: 11-15.
Esmaeili A, Rustaiyan A, Nadimi M, Larijani K, Nadjafi F, Tabrizi L, Chalabian F, Amiri H (2008). Chemical composition and antibacterial activity of essential oils from leaves, stems and flowers of Salvia reuterana Boiss. grown in Iran. Natural Product Research 22: 516-520.
Esmaeili MA, Kanani MR, Sonboli A (2010). Salvia reuterana extract prevents formation of advanced glycation end products: an in vitro study. Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences 6: 33-50.
Giri A, Narasu ML (2000). Transgenic hairy roots: recent trends and applications. Biotechnology Advances 18: 1-22.
George EF, Hall MA, Klerk GJD (2008). Plant propagation by tissue culture, volume 1. Springer, Netherlands.
Hu Z-B, Du M (2006). Hairy root and its application in plant genetic engineering. Journal of Integrative Plant Biology 48: 121-127.
Huang B, Yi B, Duan Y, Sun L, Yu X, Guo J, Chen W (2008). Characterization and expression profiling of tyrosine aminotransferase gene from Salvia miltiorrhiza (Dan-shen) in rosmarinic acid biosynthesis pathway. Molecular Biology Reports 35: 601-612.
Jung H-Y, Kang S-M, Kang Y-M, Kang M-J, Yun D-J, Bahk J-D, Yang J-K, Choi M-S (2003). Enhanced production of scopolamine by bacterial elicitors in adventitious hairy root cultures of Scopolia parviflora. Enzyme and Microbial Technology 33: 987-990.
Kabirnetaj S, Zolala J, Nematzadeh GA, Shokri E (2012). Optimization of hairy root cultue establishment in chicory plants (Cichorium intybus) through inoculation by Agrobacterium rhizogenes. Journal of Agricultural Biotechnology 4: 61–75.
Kumar V, Sharma A, Narasimha Prasad BC, Bhaskar Gururaj H, Aswathanarayana Ravishankar G (2006). Agrobacterium rhizogenes mediated genetic transformation resulting in hairy root formation is enhanced by ultrasonication and acetosyringone treatment. Electronic Journal of Biotechnology 9: 349-357.
Lee SY, Lee CY, Eom SH, Kim YK, Park NI, Park SU ( 2010). Rosmarinic acid production from transformed root cultures of Nepeta cataria L. Scientific Research and Essays 5: 1122-1126.
Li W, Koike K, Asada Y, Yoshikawa T, Nikaido T (2005). Rosmarinic acid production by Coleus forskohlii hairy root cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80: 151-155.
Mirza M, Sefidkon F (1999). Essential oil composition of two Salvia species from Iran, Salvia nemorosa L. and Salvia reuterana Boiss. Flavour and Fragrance Journal 14: 230-232.
Murakami Y, Omoto T, Asai I, Shimomura K, Yoshihira K, Ishimaru K (1998). Rosmarinic acid and related phenolics in transformed root cultures of Hyssopus officinalis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 53: 75-78.
Nussbaumer P, Kapétanidis I, Christen P (1998). Hairy roots of Datura candida×D. aurea: effect of culture medium composition on growth and alkaloid biosynthesis. Plant Cell Reports 17: 405-409.
Pawar PK, Maheshwari VL (2004). Agrobacterium rhizogenes mediated hairy root induction in two medicinally important members of family Solanaceae. Indian Journal of Biotechnology 3: 414-417.
Petersen M, Abdullah Y, Benner J, Eberle D, Gehlen K, Hucherig S, Janiak V, Kim KH, Sander M, Weitzel C, Wolters S (2009). Evolution of rosmarinic acid biosynthesis. Phytochemistry 70: 1663-1679.
Rabbani M, Sajjadi SE, Jafarian A, Vaseghi G (2005). Anxiolytic effects of Salvia reuterana Boiss. on the elevated plus-maze model of anxiety in mice. Journal of Ethnopharmacology 101: 100-103.
Rahnama H, Hasanloo T, Shams MR, Sepehrifar R ( 2008). Silymarin production by hairy root culture of Silybum marianum (L.). Iranian Journal of Biotechnology. 6: 113–119.
Rao SR, Ravishankar GA (2002). Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances 20: 101-153.
Satdive RK, Fulzele DP, Eapen S (2007). Enhanced production of azadirachtin by hairy root cultures of Azadirachta indica A. Juss by elicitation and media optimization. Journal of Biotechnology 128: 281-289.
Sambrook J, Russell DW (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. New York.
Shi HP, Lindemann P (2006). Expression of recombinant Digitalis lanata EHRH. cardenolide 16'-O-glucohydrolase in Cucumis sativus L. hairy roots. Plant Cell Reports 25: 1193-1198.
Srivastava S, Srivastava AK (2007) Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology 27: 29-43.
Syklowska-Baranek K, Pietrosiuk A, Kokoszka A, Furmanowa M (2009). Enhancement of taxane production in hairy root culture of Taxus x media var. Hicksii. Journal of Plant Physiology 166: 1950-1954.
Tada H, Murakami Y, Omoto T, Shimomura K, Ishimaru K (1996). Rosmarinic acid and related phenolics in hairy root cultures of Ocimum basilicum. Phytochemistry 42: 431-434.
Tiwari RK, Trivedi M, Guang ZC, Guo GQ, Zheng GC (2007). Genetic transformation of Gentiana macrophylla with Agrobacterium rhizogenes: growth and production of secoiridoid glucoside gentiopicroside in transformed hairy root cultures. Plant Cell Reports 26: 199-210.
Triplett BA, Moss SC, Bland JM, Dowd MK, Phillips GC (2008). Induction of hairy root cultures from Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense to produce gossypol and related compounds. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 44: 508-517.
Verpoorte R, Contin A, Memelink J (2002). Biotechnology for the production of plant secondary metabolites. Phytochemistry Reviews 1: 13-25.
Wang QJ, Zheng LP, Yuan HY, Wang J (2013). Propagation of Salvia miltiorrhiza from hairy root explants via somatic embryogenesis and tanshinone content in obtained plants. Industrial Crops and Products 50: 648-653.
Wu JY, Ng J, Shi M, Wu SJ (2007). Enhanced secondary metabolite (tanshinone) production of Salvia miltiorrhiza hairy roots in a novel root-bacteria coculture process. Applied Microbiology and Biotechnology 77: 543-550.
Xu H, Park J, Kim Y, Park N, Lee S, Park S (2009). Optimization of growth and pyranocoumarins production in hairy root culture of Angelica gigas Nakai. Journal of Medicinal Plants Research 3: 978-981.
Yan Q, Shi M, Ng J, Wu JY (2006). Elicitor-induced rosmarinic acid accumulation and secondary metabolism enzyme activities in Salvia miltiorrhiza hairy roots. Plant Science 170: 853-858.
Zarei B, Kahrizi D, Mousavi SA, Nasrollahnezhad Ghomi AA (2013) Agrobacterium rhizogense-mediated transformation of Atropa belladonna. Journal of Agricultural Biotechnology 5: 59–68.
Production of rosmarinic acid in hairy root cultures of Salvia reuterana
Norouzi R.*1, Babalar M.2, Mirmasoumi M.3, Hadian J.4
1Graduated from Department of Horticultural Sciences, University of Tehran, Karaj, Iran.
2 Professor, Department of Horticultural Sciences, University of Tehran, Karaj, Iran.
3 Lecturer, Department of Botany, College of Sciences, University of Tehran, Iran.
4Associate Professor, Medicinal Plants and Drug Research Institute, Shahid Beheshti University, Iran.
Abstract
It was the first time that hairy roots were initiated from Salvia reuterana by infection with Agrobacterium rhizogenes strain ATTC 15834. Confirmatory studies were carried out by direct detection of inserted T-DNA by the polymerase chain reaction. These hairy root cultures had the ability to produce rosmarinic acid. The effect of six different basic media including B5، ½ B5، MS، ½ MS، White’s and WPM on the root growth and rosmarinic acid production was studied. Results showed that maximum fresh weight (41.4 g/L-1) and dry weight (3.7 g/L-1) were found in MS medium. Despite the maximum rosmarinic acid production (52.2 mg/g DW) was achieved in B5 medium, the highest amount of rosmarinic acid yield (0.13 g/L-1) was observed in MS medium. Therefore MS medium was suggested as the best culture medium for growth and rosmarinic acid production in hairy root culture of Salvia reuterana.
Key words: Lamiaceae, Salvia reuterana, Hairy root, Rosmarinic acid.
)