نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی سابق بیوتکنولوژی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری
2 استادیار گروه بیوتکنولوژی و اصلاح نباتات، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری
3 پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری کشاورزی طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Pomegranate (Punica granatum L.) is native to Iran with several ecotypes which have been adapted to various climatic conditions and diseases. Although it is one of the important exported fruits, there is not a precise identification criteria to determine the authenticity of genetic inheritance and proprietary rights in the country. In the present study the genetic relationships of 47 pomegranate genotypes, including 9 cultivated genotypes (from the collection of Yazd) and 38 wild genotypes (from Mazandaran, Gilan and Golestan provinces), were investigated with AFLP markers. Using 10 primer combinations, 825 bands were obtained of which 697 showed polymorphism. Among the primers, primer combination of M-CTT and E-ACG showed the highest number of bands (148) and primer combination of E-ACC, M-CTG produced the lowest number of bands (40). The average value for PIC was 0.21, while Average Marker Index (MI) was 17.33 that the highest one belonged to primer combination of M-CAC and E-AAG. Maximum genetic similarity belonged to Bahnamir with Shirin Kan Tehran samples and the minimum genetic similarity observed between Berenjestanak and Khosh Darreh. Principal component analysis showed that 57% of the total variance was explained by first three components. The identified primer combinations in this study could be used as a powerful tool for determination of genetic relationships between Pomegranate genotypes
کلیدواژه‌ها [English]
ارزیابی تنوع و روابط ژنتیکی ژنوتیپهای انار با استفاده از نشانگر AFLP
رضا نظیفی گلیردی1، غفار کیانی2*، علی دهستانی کلاگر3، سید حمیدرضا هاشمی3
1دانشجوی سابق بیوتکنولوژی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری
2استادیار گروه بیوتکنولوژی و اصلاح نباتات، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری
3پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری کشاورزی طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری
تاریخ دریافت: 13/10/1393، تاریخ پذیرش: 11/02/1395
چکیده
انار (Punica granatum L.) گیاهی بومی ایران میباشد. به رغم اینکه انار از مهمترین محصولات صادراتی ایران به شمار میرود، اما شناسنامه دقیقی برای تعیین اصالت ژنتیکی و حفظ حقوق مالکیت این ذخیره توارثی گرانبها در کشور وجود ندارد. در پژوهش حاضر برای بررسی روابط ژنتیکی 47 ژنوتیپ انار، شامل 9 ژنوتیپ زراعی (از کلکسیون انار یزد) و 38 ژنوتیپ وحشی (از استانهای مازندران، گیلان و گلستان)، از نشانگر AFLP استفاده گردید. با استفاده از 10 ترکیب آغازگری تعداد 825 نوار (باند) بدست آمد، که تعداد 697 نوار چندشکلی نشان دادند. از بین آغازگرهای مورد استفاده، ترکیب آغازگری M-CTT و E-ACG با 148 نوار بیشترین تعداد نوار و ترکیب آغازگری E-ACC و M-CTGبا 40 نوار کمترین تعداد نوار را تولید کردند. مقدار متوسط محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) برای آغازگرها برابر با 21/0 بدست آمد. متوسط شاخص نشانگر (MI) 33/17 بدست آمد که بیشترین آن مربوط به ترکیب آغازگری M-CAC و E-AAG میباشد. بیشترین شباهت ژنتیکی بین نمونه های بهنمیر و شیرینکن تهران و کمترین میزان شباهت بین نمونههای برنجستانک و خوش دره دیده شد. تجزیه به مولفه های اصلی نشان داد که 3 مولفه در مجموع 57 درصد واریانس کل را توجیه می نماید. از ترکیبهای آغازگری شناخته شده در این پژوهش می توان به عنوان ابزار قدرتمندی در تعیین روابط ژنتیکی در بین ژنوتیپهای انار استفاده نمود.
کلمات کلیدی: انار، تنوع ژنتیکی، نشانگر AFLP، تجزیه به مولفه های اصلی.
مقدمه
انار با نام علمی Punica granatum L. یکی از قدیمی ترین میوه های خوراکی شناخته شده است که به صورت درختچهای پر شاخ و برگ با پاجوشهای زیاد و ارتفاعی بین پنج تا هشت در هر نوع اقلیمی از نظر آب و هوا و خاک رشد می کند. از نظر گیاهشناسی انار از خانواده Punicaceae با سطح کروموزومی 2n=2x=16 میباشد (Moslemi et al., 2010). شواهد تاریخی دال بر این است که انار بومی ایران و کشورهای همجوار میباشد و به طور طبیعی به آذربایجان ، ترکیه و حوزه مدیترانه گسترش یافته است (Tehranifar et al., 2010). در حدود 800 رقم انار از استان های مختلف ایران در مجموعه انار یزد جمع آوری شده است. آگاهی از تنوع ژنتیکی یک گونه میتواند به اصلاحگر برای چگونگی جمع آوری و استفاده از منابع ژنتیکی مختلف و پیش بینی فواید ژنتیکی بالقوه، در برنامههای اصلاحی کمک کند. امروزه تعیین اصالت ژنتیکی محصولات باغی از سطح مورفولوژی و فنولوژی فراتر رفته و بوسیله روشهای نوین بیوتکنولوژی در سطح ژنوتیپ گیاه (DNA) صورت میگیرد. استفاده از روشهای جدید در برنامههای شناسایی ارقام، فرایند شناسایی را بوسیله انگشت نگاری هر ژنوتیپ در هر مرحله رشدی و بطور مستقل از فاکتورهای محیطی تسریع میکند.
نشانگر چندشکلی طول قطعات حاصل از تکثیر (AFLP) توسط Vos et al. (1995) معرفی شد. آنان مدعی بودند که نشانگر مذکور علاوه بر دارا بودن مزایای RFLP مثل دقت و تکرارپذیری، دارای ویژگیهای مثبت روش های مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز نیز میباشد. این نشانگر ابزاری موثر برای مطالعه تنوع و ارتباط ژنتیکی میان افراد گونهها و اعضای سلسله گیاهی به شمار میرود افزون بر این، این روش کارایی زیادی برای مطالعات فیلوژنی، نقشه یابی پیوستگی ژن ها و شناسایی ارقام دارد. از جمله تحقیقاتی که تا کنون در این رابطه بر روی انار صورت گرفته می توان به موارد زیر اشاره کرد:
روابط ژنتیکی 11 ژنوتیپ کاملا نزدیک انار ایران با استفاده از نشانگر AFLP مورد ارزیابی قرار گرفت (Rahimi et al., 2005). 10 ترکیب آغازگری متفاوت برای تشخیص روابط ژنوتیپهای انار در دو منطقه اصفهان و یزد با اسامی مشابه مورد استفاده قرار گرفت. بیشترین شباهت بین ارقام پوست سیاه و آمنه خاتونی (3/20 درصد) وجود داشت. پس از برش خوشه بندی داده های حاصل از AFLP در فاصله 64/0، هفت رقم در دو گروه جای گرفتند چهار رقم باقی مانده هر کدام یک گروه را تشکیل دادند. علی رغم سطح چند شکلی پایین در ارقام مورد مطالعه، تفاوتهایی در الگو های نوار بندی در بین ژنوتیپهای با اسامی مشابه و همچنین بین دو منطقه جغرافیایی مشاهده گردید.
در پژوهشی Sarkhosh et al. (2006) با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD سطح تنوع موجود بین 24 ژنوتیپ انار ایرانی را بررسی کردند. تعداد 100 آغازگر تصادفی در انجام واکنش PCR بر روی نمونهها آزمایش شد که از بین آنها 16 آغازگر در بین ژنوتیپها چندشکلی نشان دادند. بالاترین و پایینترین میزان تشابه بین ژنوتیپها به ترتیب 89/0 و 29/0 بود و در تشابه 60% ژنوتیپها به 4 زیر شاخه تقسیم شدند. در پژوهشی دیگرAvamleh et al. (2009) از 8 آغازگری AFLP برای بررسی تنوع ژنتیکی 12ژنوتیپ انار که از 3 منطقه در اردن جمعآوری شده بود استفاده کردند. که از این تعداد 15 ژنوتیپ وحشی، 34 ژنوتیپ نیمه وحشی و 14 ژنوتیپ زراعی بودند. 8 آغازگر RAPD و 4 آغازگر DAMD استفاده شده الگوهای چندشکلی مجزایی در بین ژنوتیپها نشان دادند.بیشترین و کمترین فاصلهی ژنتیکی در ژنوتیپهای زراعی 12/0 و 9/0، در ژنوتیپهای نیمه وحشی 24/0 و 97/0 و در مورد ژنوتیپهای وحشی 38/0 و 95/0 بود. نتیج این تحقیق نشان داد که سطح بالایی از تنوع ژنتیکی در میان ژنوتیپها وجود دارد و هر دو روش RAPD و DAMD برای بررسی ژنتیکی انار مفید میباشد.
در مطالعهای DNA ژنومی 31 ژنوتیپ مختلف انار متعلق به هفت استان ایران با استفاده از هفت ترکیب آغازگری AFLP مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از تجزیه خوشهای حاکی از وجود شباهت بسیار بالا بین ژنوتیپ مورد مطالعه بود. نتایج بدست آمده نشان داد که ژنوتیپها عموما مستقل از خاستگاه جغرافیایی و نامگذاریشان گروهبندی شدند (Nemati et al., 2012). تکنیک AFLP بر اساس هضم DNA ژنومی و تحت تاثیر قرار گرفتن جایگاه شناسایی آنزیم برشی به علت حذف، اضافه و جهش در این جایگاه حاصل میآید که نتیجه آن چندشکلی در قطعات حاصل AFLP میباشد (Witkowicz et al., 2003). در این تحقیق کارایی روش AFLP برای بررسی تنوع ژنتیکی و برآورد فاصله ژنتیکی47 نمونه وحشی و زراعی انار 3 استان مازندران، گیلان، گلستان و 9 رقم زراعی مورد بررسی قرار گرفت و انتظار میرود از ترکیب آغازگری شناخته شده در این پژوهش بتوان به عنوان ابزار قدرتمندی در شناسایی روابط و خویشاوندی موجود در بین ژنوتیپهای انار استفاده نمود.
مواد و روشها
مواد گیاهی و استخراج DNA
در این تحقیق از 47 نمونه انار شامل 38 نمونه وحشی و 9 رقم زراعی استفاده شد. نمونه های وحشی از مناطق مختلف استان مازندران، گیلان و گلستان جمعآوری و نمونه های زراعی نیز از کلکسیون انار یزد جمع آوری گردید (جدول 1). استخراج DNA از برگ به روش CTAB انجام گرفت. بررسی کیفیت و کمیت DNA حاصل با استفاده از سه روش سپکتروفوتومتری و الکتروفورز ژل آگارز صورت گرفت.
اجرای مراحلAFLP
آزمایشات AFLP بر اساس روش Vos et al. (1995) انجام گرفت. واکنش هضم با استفاده از دو آنزیم برشیEcoRI و Tru91 (با جایگاه برشی مشابه MseI) ساخت شرکت Roche انجام شد. برای اطمینان از انجام عمل هضم مقدار 5 میکرولیتر از مخلوط، با استفاده از ژل آگارز 5/1 درصد با بافر TBE 1X الکتروفورز شد و از انجام عمل هضم اطمینان حاصل آمد. پس از برش DNA توسط آنزیمهای برشی سازگارسازهای (آداپتور) الیگونوکلئوتیدی دو رشتهای به هر دو انتهای قطعههای برشی چسبنده اضافه شدند. مرحله تکثیر پیش انتخابی با استفاده از آغازگرهایی که کاملاً مکمل توالی سازگارسازها به همراه تعدادی نوکلئوتید اضافی (0 تا 4 عدد) بودند انجام شد. در مرحله تکثیر انتخابی مجدداً مجموعه کوچکتری از قطعات مرحله پیش‌انتخابی برای تکثیر، انتخاب شدند. در این مرحله از آغازگرهایی که دارای 3 نوکلئوتید انتخابی در انتهای 3 خود هستند استفاده شد. تعداد بیش از 16 ترکیب آغازگری مختلف با 3 نوکلئوتید در انتهای 3 مورد آزمون (primer selection) قرار گرفت. از بین این تعداد ترکیب آغازگری، تعداد 10 ترکیب، که دارای بهترین کیفیت نوار با کمترین حالت در پسزمینه و بیشترین مقدار چندشکلی بود، انتخاب شد (جدول 2).
تکثیر قطعات با استفاده از Touch Down PCR انجام گرفت. به این ترتیب که در 12 سیکل ابتدایی دمای اتصال به مقدار 7/0 درجه سانتیگراد در ابتدای هر سیکل کاهش داده شد. محصولات PCR به منظور تفکیک آللی قبل از بارگذاری، واسرشته شد، که به این منظور مقدار 8 تا 10 میکرولیتر از بافر بارگذاری حاوی فرمآمید[1] به 20 میکرولیتر محصول PCR اضافه شد. سپس کلیه نمونهها را به مدت 6 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد در ترموسایکلر قرار داده و بلافاصله بر روی یخ منتقل شد، تا برای بارگذاری بر روی ژل پلیاکریلامید 6% آماده شود. دستگاه (Sequi-Gen GT, BIO-RAD,USA) برای جداسازی قطعات تکثیری بکار رفت. قطر ژل مورد استفاده 25/0 میلیمتر و ابعاد آن 30 × 38 سانتیمتر با حجم 55 میلیلیتر بود. الکتروفورز به مدت 2 ساعت با استفاده از بافر 1x TBA و ولتاژ 1200 ولت انجام و رنگ آمیزی به روش نیترات نقره صورت گرفت (Bassam et al., 1991). تجزیه و تحلیل دادهها: هر یک از قطعات تکثیر شده به عنوان یک صفت در نظر گرفته شد و حضور و عدم حضور آنها به ترتیب با اعداد یک و صفر نمایش داده شد. در مرحله بعد دادههای امتیازدهی شده با استفاده از نرمافزار Excel به یک ماتریس منتقل گردید. سپس با استفاده از نرم افزار NTYSY ver2.02 ماتریس تشابه بر اساس ضریب تشابه جاکارد و الگوریتم UPGMA ترسیم گردید.
جدول1- ژنوتیپ های جمع آوری شده انار از مناطق مختلف.
Table 1- Collected genotypes of pomegranates from different regions.
|
ترتیب نمونه Sample order |
محل جمعآوری Location |
ترتیب نمونه Sample orde |
محل جمعآوری Location |
ترتیب نمونه Sample orde |
محل جمعآوری Location |
ترتیب نمونه Sample orde |
محل جمعآوری Location |
|
G1 |
قوشی چشمه Ghoushi Cheshmeh |
G13 |
بهنمیر Bahnamir |
G26 |
رامسر Ramsar |
G38 |
طوالش Tavalesh |
|
G2 |
جنگل گلستان Golestan Forest |
G14 |
قائم شهر Ghaem Shahr |
G27 |
رودسر Roudsar |
G39 |
آستارا Astara |
|
G3 |
کلاله Kalaleh |
G15 |
برنجستانک Berenjestanak |
G28 |
املش Amlash |
G40 |
ملس ساوه Malas Saveh |
|
G4 |
گنبدکاووس Gonbad Kavous |
G16 |
خوش دره Khosh Darreh |
G29 |
لاهیجان Lahijan |
G41 |
رباب نیریز Robab Neiriz |
|
G5 |
مینودشت Kinoudasht |
G17 |
زیراب Zirab |
G30 |
آستانه اشرفیه Astaneh Ashrafiyeh |
G42 |
الک ساوه Alak Saveh |
|
G6 |
آق قلا Agh Ghala |
G18 |
بابل Babol |
G31 |
رودبار Roudbar |
G43 |
شاهوار شیرین سروستان Shahvar Shirin Sarvestan |
|
G7 |
بندر ترکمن Bandar Torkman |
G19 |
محمود آباد Mahmoud Abad |
G32 |
منجیل Manjil |
G44 |
شیرینپوست کلفت Shirin Poust Koloft |
|
G8 |
علی آباد کتول Aliabad Katoul |
G20 |
آمل Amol |
G33 |
لوشان Loshan |
G45 |
بی هسته شیرین Bihasteh Shirin |
|
G9 |
هزار پیچ Hezar Pich |
G21 |
نور Nour |
G34 |
رشت Rasht |
G46 |
شیرین کن تهران Shirin Kan Tehran |
|
G10 |
کرد کوی Kord Kouy |
G22 |
نوشهر Noshahr |
G35 |
فومن Foman |
G47 |
فردوس Ferdous |
|
G11 |
میانکاله Mian Kaleh |
G23 |
چالوس Chalous |
G36 |
بندر انزلی Bandar Anzali |
||
|
G12 |
فرح آباد Farah Abad |
24 |
تنکابن Tonekabon |
G37 |
رضوانشهر Rezvan Shahr |
جدول 2- ترکیبات آغازگری مورد استفاده در مرحله تکثیر انتخابی.
Table 2- Primer combinations used for selective amplification stage.
|
شماره Number |
آغازگرهای مربوط به MseI Primers related to MseI |
آغازگرهای مربوط به EcoRI Primers related to EcoRI |
|
1 |
MseI Selective Primer+CTG |
EcoRI Selective Primer+AGG |
|
2 |
MseI Selective Primer+CAT |
EcoRI Selective Primer+AGC |
|
3 |
MseI Selective Primer+CTA |
EcoRI Selective Primer+AAG |
|
4 |
MseI Selective Primer+CTC |
EcoRISelective Primer+GGA |
|
5 |
MseI Selective Primer+CTT |
EcoRI Selective Primer+GGA |
|
6 |
MseI Selective Primer+CAA |
EcoRI Selective Primer+GGA |
|
7 |
MseI Selective Primer+CTT |
EcoRISelective Primer+GTG |
|
8 |
MseI Selective Primer+CAA |
EcoRI Selective Primer+GTG |
|
9 |
MseI Selective Primer+CAT |
EcoRI Selective Primer+GGA |
|
10 |
MseI Selective Primer+CCT |
EcoRI Selective Primer+GTG |
علاوه بر تجزیه خوشه ای تجزیه به مولفههای اصلی با استفاده از نرم افزار NTYSY ver2.02 انجام شد و نمودار دوبعدی و سه بعدی جهت گروه بندی و بررسی روابط بین ژنوتیپ ها رسم شد.
نتایج و بحث
انار یک گونه چند ساله با عمر طولانی و دگر‌گشن (گرده افشانی به کمک حشرات) است که این صفت بیولوژیکی به ایجاد و حفظ سطح بالای تنوع ژنتیکی مشاهده شده کمک می کند. در این مطالعه از مجموع 10 ترکیب آغازگری که برای بررسی انتخاب شد، در مجموع 825 باند تولید شد، که 764 باند آن چندشکلی نشان داد. تعداد باندهای تولید شده توسط هر ترکیب آغازگری در دامنه بین 40 باند برای ترکیب آغازگری E-ACC, M-CTG تا 148 باند برای ترکیب آغازگری E-ACG, M-CTT متغیر بود (شکل 1) . متوسط باند کل و باند چندشکل برای هر ژنوتیپ به ترتیب 5/82 و 7/67 باند بود.
محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) برای قدرت تشخیص مکانهای ژنی AFLP محاسبه شد، با توجه به نتایج جدول 3 متوسط PIC بدست آمده برای 10 ترکیب آغازگری 21/0 بود. بیشترین مقدار PIC به ترکیب آغازگری E-AAG M-CAC با 28/0 و کمترین میزان آن مربوط به ترکیب آغازگری E-AGG, M-CTT با متوسط 11/0 تعلق داشت. پایین بودن میزان PIC نشان دهنده سطح پائین تمایز میباشد.
شکل 1- پروفایل ژل اکریلامید مربوط به ترکیب آغازگری E-ACG, M-CTT.
Figure 1- Profile of acrylamide gel for primer combination of E-ACG, M-CTT.
میانگین شاخص نشانگر AFLP بر پایه تعداد نوارهای چندشکل در این تحقیق 33/17 بود که بیشترین و کمترین میزان آن به ترتیب به ترکیب آغازگرهای M-CAC, E-AAG با 47/23 و E-ACC, M-CTG با 59/7 مربوط بود که بالا بودن میزان شاخص نشانگر نشان دهنده توان جداسازی بالای ترکیب در مقایسه با دیگر ترکیبهای آغازگری است. شاخص نشانگر (MI) که یکی از شاخصها در قدرت تفکیک یک نشانگر میباشد نشان میدهد تفاوت این شاخص زمانی ملموستر میشود که در بررسی بین گونهایی به کار گرفته شوند. بر اساس شاخص شائون نیز ترکیب آغازگری (M-CTG 19/0±66/0) و ترکیب آغازگری E-AAA, M-CCC (14/0±14/0) بیشترین و کمترین تنوع را حاصل کردند. دندروگرام مربوط به دادههای حاصل از نشانگر AFLP با استفاده از 764 باند پلی مورف در شکل 2 نشان داده شده است. بر اساس این دندروگرام ژنوتیپ های انار در 5 گروه کاملا مجزا قرار گرفتند. گروه اول شامل نمونههای فردوس و شیرینکن تهران بودند. گروه دوم شامل نمونههای بندر انزلی، رضوانشهر، منجیل، لوشان، رشت، فومن، طوالش، آستارا،ملسساوه، رباب نیریز، قچاققم، الک ساوه، شهوار شیرین سروستان، شیرین پوست کلفت وبی هسته شیرین بود.
جدول 3- نتایج حاصل از بررسی تنوع 47 ژنوتیپ انار با استفاده از نشانگر AFLP.
Table 3- Results of diversity study in 47 pomegranate genotypes using AFLP marker.
|
|
تعداد کل نوار No. total bands |
تعداد نوارهای چندشکل No. polymorphic bands |
درصد نوارهای چندشکل Polymorphism percent |
PIC |
شاخص نشانگر Marker index |
شاخص پراکندگی diversity index |
شاخص شانون Shannon index |
|
E-AAC, M-CAC |
113 |
95 |
84.07 |
0.263 |
22.11 |
0.13 ± 0.17 |
0.29 ± 0.19 |
|
E-ACC, M-CTG |
40 |
23 |
57.50 |
0.132 |
7.59 |
0.17 ± 0.13 |
0.66 ± 0.19 |
|
E-ACC, M-CAT |
50 |
43 |
86 |
0.227 |
19.52 |
0.10 ± 0.16 |
0.16 ± 0.23 |
|
E-ACG, M-CTA |
72 |
63 |
87.50 |
0.158 |
13.82 |
0.16 ± 0.15 |
0.27 ± 0.21 |
|
E-ACT, M-CTC |
126 |
111 |
88.10 |
0.236 |
20.79 |
0.11 ± 0.14 |
0.20 ± 0.19 |
|
E-AGT, M-CTC |
43 |
33 |
76.74 |
0.195 |
14.96 |
0.14 ± 0.10 |
0.26 ± 0.16 |
|
E-ACG, M-CTT |
148 |
127 |
85.81 |
0.256 |
21.96 |
0.14 ± 0.16 |
0.24 ± 0.22 |
|
E-AGG, M-CTT |
46 |
37 |
80.43 |
0.116 |
9.32 |
0.17 ± 0.14 |
0.30 ± 0.20 |
|
E-AAA, M-CCC |
65 |
54 |
83.08 |
0.238 |
19.77 |
0.07 ± 0.10 |
0.14 ± 0.15 |
|
E-AAG M-CAC |
122 |
111 |
90.98 |
0.285 |
23.47 |
0.18±.014 |
0.30 ± 0.19 |
|
میانگین Mean |
82.5 |
67.7 |
82.02 |
0.210 |
17.33 |
|
|
نمونههای خوش دره، زیرآب، بابل، محمود آباد، آمل، نوشهر، نور، چالوس، تنکابن، رودسر، رامسر، املش، لاهیجان، آستانه اشرفیه و رودبار در گروه سوم قرار گرفتند. نمونههای کلاله، گنبد کاووس، مینودشت، فرح آباد، بندرترکمن، علی آباد کتول، هزار پیچ، کردکوی، میانکاله، فرح آباد، بهنمیر، قائمشهر و برنجستانک در گروه چهارم قرار گرفتند و گروه پنجم شامل نمونههای قوشی چشمه و جنگل گلستان بود. بیشترین ژنوتیپ ها در گروه دوم و سوم و کمترین آنها در گروه اول و پنجم بودند. بیشترین شباهت ژنتیکی بین نمونه های بهنمیر و شیرینکن تهران و کمترین میزان شباهت بین نمونههای برنجستانک و خوش دره دیده شد. با توجه به نتایج تجزیه کلاستر می توان گفت تقسیم بندی ناحیهای و جغرافیایی تاثیری در تنوع ایجاد شده بین نمونهها نداشته اما تنوع درون ناحیهای مشهود است، بدین معنی که ژنوتیپهای درون گروهی هر استان تنوع ژنتیکی بالایی از خود نشان دادند که علت این امر عواملی چون جهش و قدرت تفکیک بالای نشانگرهای بکار رفته در تحقیق (Sunil Kumar, 1999)، و نحوه نمونه برداری (شرایط محیطی منطقه) مانند پستی و بلندی از سطح دریا، مناطق جنگلی، مناطق کوهستانی و حتی ساحلی است.
شکل 2- گروهبندی ژنوتیپهای گیاه انار با استفاده از نشانگر AFLP.
Figure 2- Clustering of Pomegranate genotypes using AFLP marker.
نتایج تجزیه بهمولفههای اصلی شامل مقادیر ویژه، نسبت واریانس توجیه شده توسط هر مولفه و واریانس تجمعی سه مولفه اول در جدول 4 نشان داده شده است. نتایج تجزیه بهمولفههای اصلی نشان داد، سه مولفه اول در مجموع 57 درصد واریانس کل را توجیه میکنند که سهم مولفه اول 95/48 درصد، مولفه دوم 48/4 درصد و مولفه سوم 65/3 درصد از تغییرات کل میباشد. این امر نشان دهنده این میباشد که نشانگر AFLP (با ترکیبات به کار رفته در این تحقیق) پوشش نسبتاً خوبی در سطح ژنوم دارد. در بررسی تنوع ژنتیکی با استفاده از دادههای مربوط به نشانگرهای DNA بهترین حالت آن است که نشانگرها توزیع یکنواخت و مناسبی در ژنوم داشته باشند و بتوانند از تمام ژنوم نمونه برداری کنند. بنابراین در صورتی که نشانگرها از بخشهای مختلف ژنوم انتخاب شوند و همبستگی آنها کم باشد تعداد مؤلفههای بیشتری برای توجیه کل تغییرات لازم است. اطلاعات بدست آمده از تجزیه مؤلفههای اصلی مؤید این مطلب است که این ترکیبات آغازگری پراکندگی نسبتاً خوبی در سطح ژنوم دارند.
جدول 4- تجزیه به مولفههای اصلی داده های مربوط به AFLP.
Table 4- Principle component analysis for AFLP data.
|
مولفه component |
مقادیر ویژه Egent values |
واریانس Variance |
واریانس تجمعی Cumulative variance |
|
مولفه اول first component |
23.01 |
48.95 |
48.95 |
|
مولفه دوم second component |
2.10 |
4.48 |
53.44 |
|
مولفه سوم third component |
1.67 |
3.56 |
57.00 |
در شکل 3 نمایش سه بعدی پراکنش افراد پیرامون مؤلفههای اصلی نشان داده شده است. تجمع افراد در یک نقطه از پلات نشان دهنده تشابه ژنتیکی آن افراد میباشد. همان طور که در این شکل مشاهده میشود سهم سه مؤلفه اول در توجیه تغییرات بسیار بالا میباشد 5 گروه حاصل از دندوگرام نیز در تجزیه به مولفه های اصلی قابل رویت است بنابراین نمودار سه بعدی تجزیه بهمولفههای اصلی گروهبندی انجام شده را توجیه میکند.
شکل 3- دیاگرام سه بعدی تجزیه به مولفههای اصلی بر اساس سه مولفه اول دادههای نشانگر AFLP.
Figure 3- Three dimension diagram of principle component analysis based on first three components of AFLP data.
در کل نتایج نشان داد که چندشکلی مطلوبی بین نمونههای وحشی انار در سه استان وجود دارد که این نشان دهنده غنای زیاد پایهی ژنتیکی انار در ایران است. در زمینه بررسی تنوع ژنتیکی انار با استفاده از نشانگرهای مولکولی گزارشات متعددی وجود دارد (Rahimi et al., 2005; Avamleh et al., 2009; Nemati et al., 2012; Zamani et al., 2007; Durgac et al., 2008; Narzary et al., 2009). این تنوع ژنتیکی میتواند منبع قابل استفاده برای کمک به برنامه اصلاحی انار برای اهداف مختلف باشد. با توجه به نتایج این تحقیق می توان گفت که تقسیم بندی ناحیهای و جغرافیایی تاثیری در تنوع ایجاد شده بین نمونهها نداشته اما تنوع درون ناحیهای مشهود است. اینگونه نتایج توسط Yuan et al. (2007) و نیز Narzary et al. (2009) روی جمعیتهای وحشی انار گزارش شده است که نشاندهنده این موضوع است که الگوی مشخصی در تمایز ارقام انار با توجه به مناطق جغرافیایی وجود ندارد.
منابع
Avamleh H, Hassawi D, Migdadi H, Brake M (2009). Molecular characterization of pomegranate (punica granatum L.) landraces grown in Jordan using amplified fragment length polymorphism markers. Biotechnology 8: 316-322.
Bassam BJ, Caetano-Anollés G, Gresshoff PM (1991). Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Annals of Biochemistry 196: 80-83.
Durgac C, Ozgen M, Simsek O, Kacar YA, Kiyaga Y, Celebi S, Gunduz K, Serce S (2008). Molecular and pomological diversity among pomegranate (punica granatum L.) cultivars in Eastern Mediterranean region of Turkey. African Journal of Biotechnology 7: 1294-1301.
Moslemi M, Zahravi M, Bakhshi Khaniki Gh (2010). Genetic diversity and population genetic structure of pomegranate (Punica granatum L.) in Iran using AFLP marker. Scientia Horticulturae 126: 441-447.
Narzary D, Kamalesh SM, Rana TS, Ranade SA (2009). Analysis of genetic diversity among wild pomegranates in Western Himalayas, using PCR methods. Scientia Horticulturae 121: 237-242.
Nemati Z, Tehranifar A, Farsi M, Mirshamsikakhki A, Nemati H, Kayyat M (2012). Evaluation of genetic diversity of Iranian Pomegranate cultivars using fruit morphological characteristics and AFLP markers. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca 1:261-268.
Rahimi T, Seyed Tabatabai B, Sharif nabi B, Ghobadi S (2005). The study of genetic relationship of some of pomegranate from Iran by AFLP marker. Agronomy Science Journal 36: 1373-1379.
Sarkhosh A, Zamani Z, Fatahi R, Ebadi A (2006). RAPD markers revealed polymorphism among (Punica granatum L.) genotypes. Scientia Horticulturae 111:24-29.
Sunil Kumar L (1999). DNA markers in plant improvement. Biotechnology Advances 17: 143-182.
Tehranifar A, Zarei M, Nemati Z, Esfandiyari B, Vazifeshenas MR (2010). Investigation of physicochemical properties and antioxidant activity of twenty Iranian pomegranate (Punica granatum L.) cultivars. Scientia Horticulturae 126: 180–185.
Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, et al. (1997). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23: 4407–4414.
Witkowicz J, Urbanczyk-Wochniak E, Przybecki Z (2003). AFLP marker polymorphism in cucumber (Cucumis sativus L.) near isogenic lines differing in sex expression. Cellular and Molecular Biology Letters 8: 375-381.
Yuan Z, Yin Y, Qu J, Zhu L, Li Y. (2007). Population genetic diversity in Chinese Pomegranate (Punica granatum L.) cultivars revealed by fluorescent-AFLP markers. Journal of Genetics and Genomics 34: 1061-1071.
Zamani Z, Sarkhosh A, Fatahi R, Ebadi A (2007). Genetic relationships among pomegranate genotypes studied by fruit characteristics and RAPD markers. Journal of Horticultural Sciences and Biotechnology 82: 11-18.
Assessment of diversity and genetic relationships in Pomegranate genotypes using AFLP marker
Nazifi-Gelirdi R.1, Kiani G.*2, Dehestani-Kolagar A.3, Hashemi S.H.R. 3
1MSc student of Biotechnology, Sari University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Sari, Iran.
2Department of Biotechnology and Plant Breeding, Sari University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Sari, Iran.
3Genetics and Agricultural Biotechnology Institute of Tabarestan.
Abstract
Pomegranate (Punica granatum L.) is native to Iran with several ecotypes which have been adapted to various climatic conditions and diseases. Although it is one of the important exported fruits, there is not a precise identification criteria to determine the authenticity of genetic inheritance and proprietary rights in the country. In the present study the genetic relationships of 47 pomegranate genotypes, including 9 cultivated genotypes (from the collection of Yazd) and 38 wild genotypes (from Mazandaran, Gilan and Golestan provinces), were investigated with AFLP markers. Using 10 primer combinations, 825 bands were obtained of which 697 showed polymorphism. Among the primers, primer combination of M-CTT and E-ACG showed the highest number of bands (148) and primer combination of E-ACC, M-CTG produced the lowest number of bands (40). The average value for PIC was 0.21, while Average Marker Index (MI) was 17.33 that the highest one belonged to primer combination of M-CAC and E-AAG. Maximum genetic similarity belonged to Bahnamir with Shirin Kan Tehran samples and the minimum genetic similarity observed between Berenjestanak and Khosh Darreh. Principal component analysis showed that 57% of the total variance was explained by first three components. The identified primer combinations in this study could be used as a powerful tool for determination of genetic relationships between Pomegranate genotypes.
Keywords: Pomegranate, Genetic diversity, AFLP markers, Principal component analysis.
)