نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 قطب علمی ترانسژنزیز دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اصفهان، ایران/گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان (خوراسگان)، اصفهان، ایران
2 گروه علوم دامی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی کرج، دانشگاه تهران، ایران.
3 گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان (خوراسگان)، اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Bone morphogenetic protein receptor-1B is one of the major genes significantly affect ewe ovulation rate. The aim of this study was to screen exon 8 of BMPR1B in single- and twin-birth ewes of Iranian Lori-Bakhtyari, Shal, Ghezel, and Afshari breeds. DNA was extracted from blood of ewes and rams from numerous sheep flocks and the genotype patterns were screened by PCR-SSCP approach. Results of SSCP analysis showed that there are three genotypic patterns in the four above-mentioned breeds. The highest abundant pattern and the lowest pattern were pattern 1 (73 %) and pattern 2 (8 %), respectively, in the whole flocks. There was a significant difference between these three genotypic patterns in terms of litter size attribute, so that ewes harboring Pattern 2 had the highest litter size average (1.7 lamb per parturition) while ewes carrying Pattern 3 had the lowest litter size average (1.4 lamb per parturition). Furthermore, the PCR amplicon from exon 8, containing these genotypic patterns, were sequenced. The sequencing results of candidate samples from different classes of SSCP showed that there were four new mutations in BMPR1B of Iranian sheep. Three of these mutations were nucleotide conversions, including G812T, T854A, and C855A mutations which caused to tryptophan to lysine (W219L), phenyl alanine to tyrosine (F233Y), and phenyl alanine to lysine (F233L) conversions, respectively. More importantly a C nucleotide insertion mutation corresponding to 855 nt of BMPR1B CDs was also observed which can cause to producing a stop codon at 266 amino acid position and consequently a dysfunctional polypeptide. In conclusion, these results clearly indicate the presence of important mutation in BMPR1B in Iranian sheep breeds which can significantly affect ewe fecundity attributes.
کلیدواژه‌ها [English]
شناسایی جهش های جدید در اگزون 8 ژن BMPR1B در گوسفندان ایرانی نژاد لری-بختیاری، شال، قزل و افشاری
شاهین اقبال سعید1و2*، حمیدرضا امینی3، فرزاد رشیدی2، داود ولایتی2، شیلا پورعلی2
1قطب علمی ترانسژنزیز دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اصفهان، ایران
2 گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان (خوراسگان)، اصفهان، ایران
3 گروه علوم دامی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی کرج، دانشگاه تهران، ایران.
تاریخ دریافت: 23/06/1395، تاریخ پذیرش: 23/08/1395
چکیده
ژن گیرنده پروتئین مورفوژنتیک استخوان (BMPR1B) یکی از ژنهای بزرگ اثر است که نقش مهمی در افزایش میزان تخمکگذاری در گوسفندان دارد. بر این اساس، هدف از این مطالعه بررسی و مقایسه چندشکلیهای موجود در اگزون 8 ژنBMPR1B و ارتباط آن با صفت چندقلوزایی در جمعیت گوسفندان نژاد لریبختیاری، شال، قزل و افشاری بود. لذا، نمونه خون از قوچها و میشهای تک قلو و چندقلوزا اخذ و پس از تکثیر این جایگاه،جهت تعیین الگوی ژنوتیپی نمونهها از روش PCR-SSCP استفاده شد. نتایج SSCP حضور سه الگوی ژنوتیپی را در این 4 جمعیت گوسفندان نژاد ایرانی نشان داد که بیشترین فراوانی مربوط به الگوی ژنوتیپی 1 (73%) و کمترین آن مربوط به الگوی ژنوتیپی 2 (8%) بود. همچنین نتایج نشان داد که در رابطه با اثر الگوهای ژنوتیپی اگزون 8 ژن BMPR1B بر میانگین تعداد نتاج در هر زایش، بین سه الگوی ژنوتیپی اختلاف معنی داری وجود داشت. گوسفندان دارای الگوی 2 با 7/1 بره در هر زایش و گوسفندان دارای الگوی 3 با 4/1 بره در هر زایش به ترتیب بیشترین و کمترین تعداد بره در هر زایش را داشتند. سپس، توالی یابی این قطعه تکثیر شده از اگزون 8 انجام شد. نتایج توالی یابی نشان دهنده وجود چهار جهش در توالی mRNA بود. جایگزینی باز C در موقعیت 855 که موجب ایجاد یک کدون توقف در موقعیت 266 (I266*) میشود. همچنین جهش تبدیلی تک نوکلئوتیدی در موقعیتهای G812T، T854A و C855A نیز مشاهده گردید که به موجب آنها به ترتیب اسیدآمینه تریپتوفان به لیزین در موقعیت 219 (W219L)، فنیل آلانین به تیروزین در موقعیت 233 (F233Y) و فنیل آلانین به لیزین در موقعیت 233 (F233L) تبدیل گردید. به طور کلی، نتایج این تحقیق نشان داد که در اگزون 8 ژن BMPR1B در گوسفندان ایرانی نژادهای مختلف جهش های مهمی وجود دارد که میتوانند بر صفات مرتبط با تعداد نتاج در هر زایش موثر باشند.
کلمات کلیدی: چند قلوزایی، تعداد نتاج تولیدی کل، ژن BMPR1B، PCR-SSCP، گوسفند، ایران.
مقدمه
استفاده از ژنتیک ملکولی فواید زیادی دارد که یکی از این فواید معنی دار تعیین ژنوتیپ افراد برای جایگاه خاصی است (Mousavizadeh et al., 2009) همچنین استفاده از نشانگرهای ژنتیکی در انتخاب و اصلاح نژاد به طور مهیجی پیشرفت ژنتیکی را تسریع میکند (Javanmard et al., 2008). مطالعه تنوع ژنتیکی نژادهای بومی برای حفاظت از منابع ژنتیکی لازم و ضروری است (Mohammadi et al., 2009). بالغ بر 26 نژاد گوسفند در ایران وجود دارد که با مناطق مختلف سازگار شده اند. در حال حاضر، تولید گوشت مهمترین دلیل پرورش گوسفند در ایران است و تولیدات دیگر مانند پشم، شیر و پوست در درجات بعدی اهمیت قرار دارند (SattaiMokhtari et al., 2009).
دامنه بزرگی از چند قلوزایی در بین و داخل نژادهای مختلف در گوسفندانمشاهده شده است. در بعضی از مطالعات ژنتیکی نشان داده شده که چندقلوزایی و میزان تخمکریزی میتوانند تحت تاثیر چند ژن بزرگ اثر باشند (Davis et al., 1991). سه ژن از اعضای خانواده (TGF-β)Transforming Growth Factor β که از لحاظ بیولوژیکی دارای سیستم فعالی میباشندکه روی هم رفته بخش قابل توجهی از واریانس صفت چندقلوزایی را در گوسفند تشکیل میدهند.
این سه دسته ژن باروری که اخیرا در گوسفند شناسایی شده عبارتند از: گیرنده نوعB پروتئین مورفوژنتیک استخوانی[1] ((BMPR-IB یا کیناز شبه اکتیوین شماره 6 (ALK6) تحت عنوان FecB که روی کروموزوم شماره 6 واقع است (Moghadaszadeh et al., 2015)، فاکتور متمایز کننده رشد[2]GDF9 به نام FecG که روی کروموزم شماره 5 قرار دارد (Moghadaszadeh et al., 2015) و دسته پروتئینهای مورفوژنیک استخوانی[3](BMP ها) که به نام FecX معروفند و روی کروموزوم X قرار دارند(Moghadaszadeh et al., 2015). ژنهای BMP جزءفوق خانواده TGFβ بوده، بر تنظیم بیان و ترشح هورمونهای موثر بر رشد فولیکولی و نرخ تخمکاندازی موثرند و توسط تخمک تولید میشوند. BMP ها در توسعه جنین، هموستازی، تعمیر و اصلاح الگوهای بافتی مختلف، تمایز سلولی و مرگ برنامه ریزی شده سلول نقش دارند (Moghadaszadeh et al., 2015).
ژن BMPR1B یا بورولا (Boroola) نخستین ژن بزرگ اثری بود که در مورد افزایش میزان باروری گزارش داده شد (Davis, 2005). مهمترین جهش شناخته شده در این ژن که همان جهش بورولاست در اگزون 8 گزارش شده است که منجر به جایگزینی آدنین با گوانین در باز 746 و به دنبال آن تبدیل گلوتامین به آرژنین می گردد (Souza et al., 2001).سپس محققین توانستند با روشPCR-RFLP وجود این جهش را در نژادهای مختلف تایید نمایند به طوری که گوسفندانی که دارای آلل هموزیگوس FecBB/FecBB، هتروزیگوس FecBB/FecB+ و تیپ وحشی FecB+/FecB+ از ژن بورولا هستند به ترتیب میزان تخمکگذاریدر این گوسفندانبه طور متوسط 5، 3-4 و 1-2می باشد (Davis et al., 2005). افزایش میزان باروری در گوسفندان حامل FecB در ارتباط با افزایش تعداد فولیکولهای آنترال و پیش آنترال میباشد که دارای اندازه کوچکتری نسبت به فولیکولهای گوسفندان غیر حامل میباشد (Davis et al., 2001). بررسیهای بیشتر نشان داد که علیرغم اندازه کوچکتر فولیکولهای آنترال و بالغ در گوسفندان حامل ژن بورولا نسبت به گوسفندان تیپ وحشی، در مراحل اولیه رشد فولیکولی تا مرحله تیپ 3 فولیکولی دارای اندازه تخمک بزرگتری نسبت به گوسفندان حامل تیپ وحشی برای این ژن میباشند (Reader et al., 2012). بررسی تعداد نتاج در هر زایش در گوسفندان حامل این ژن نشان دهنده این است که وجود یک کپی از این ژن میتواند منجر به افزایش تعداد نتاج در هر زایش به اندازه 5/0- 5/1 بره گردد(Nimbkar et al., 2002; Polley et al., 2010). در پژوهشی که با استفاده از روش PCR-RFLP روی 9 نژاد از گوسفندان چینی و اروپایی برای بررسی چندشکلیهای موجود در ژن FecB انجام شد، نشان داد که تمام گوسفندان نژاد هو[4] حامل ژنوتیپ هموزیگوس FecB بودندو در سایر نژادها تنها ژنوتیپ وحشی برای این ژن مشاهده شد (Guan et al., 2006).همچنین، در مطالعه ای بر روی 21 نژاد و سویه گوسفندان چند قلوزا در 13 کشور جهش FecB را تنها در دو نژاد هو و هانکشور چین که دارای متوسط 9/2-0/3 بره در هر زایش بودند، مشاهده کردند و سایر نژادها شامل توکا، وودلندز، اولکاسو، لاکان، بلکلیر و کمبریج با متوسط 5/1-5/4 بره در هر زایش این جهش را نشان ندادند. آنهانتیجه گیری کردند که ژن بورولا از نژادهای گرول بنگال منشا گرفته است و احتمالا نژادهای چینی هم دارای اجداد مشترکی با نژاد گرول می باشند (Davis et al., 2006).
در کشور ماطی دهههای اخیر مطالعات گستردهای برای افزایش میزان بهرهوری صفات تولیدمثلی گوسفندان در کشور انجام گرفته است. مطالعه ژنهای GDF9 و BMP15 در گوسفندان ایرانی نشان دهنده عدم وجود جهشهای بزرگ اثر که در حالت هوموزیگوت منجر به عقیمی میگردد، میباشد (Ghafari et al., 2009; Moradband et al., 2011; Eghbalsaied ea al., 2012; Moradi et al. 2004)). با این وجود، وجود جهشهای کوچک اثر در این ژنها در گوسفندان ایرانی تایید شده است (Barzegari et al., 2010; Eghbalsaied et al., 2012; Zamani et al., 2015a; Zamani et al., 2015b, Eghbalsaied et al. 2014).
اگر چه پژوهشهای زیادی در گوسفندان و بزهای ایرانی روی ژنهای مرتبط با باروری، از قبیل GDF9 و BMP15 انجام شده است (Alinaghizadeh et al., 2010; Hadizadeh et al., 2014; Khodabakhshzadeh et al., 2015; Moghadaszadeh et al., 2015; Hadizadeh et al., 2014; Khodabakhshzadeh et al., 2016a; Hadizadeh et al., 2013; Khodabakhshzadeh et al., 2015b; Khodabakhshzadeh et al., 2016b; Soufy et al., 2009)، ولی نتایج بررسیها بر روی ژن BMPR1B در گوسفندان ایرانی نشان دهنده این است که جهش بورولا در گوسفندان کرکوهی و زل با فراوانی بسیار اندک شناسایی شده است (Asadpour et al., 2012; Mahdavi et al., 2014)و در سایر نژادها مشاهده نشده است (Moradband et al., 2011). با این وجود، اندازه جمعیت و نیز تنوع نژادی مورد استفاده دراین مطالعات محدود بوده و نیاز به یک مطالعه گسترده در این خصوص میباشد.لذا این مطالعه به منظور شناسایی چندشکلیهای موجود در اگزون 8 ژنBMPR1Bدر گوسفندان نژاد لریبختیاری، شال، قزل و افشاری انجام گرفت.
مواد و روشها
نمونههای خون با استفاده از سرنگ 5 میلی‌لیتریاز رگ گردن گرفته شد و با 5/0 میلی‌لیتر از EDTA5/0 مولار در لوله‌های فالکون 15سی سی ریخته شد و سپسبرروی یخ به آزمایشگاه منتقل شد. برایخونگیری از گوسفندان نژاد شال از یک گله گوسفند مردمی معرفی شده توسط جهاد کشاورزی بوئین زهرا در استان قزوین، برای گوسفندان قزل از گوسفندان موجود در مرکز اصلاح دام میاندواب، گوسفندان نژاد لری بختیاری واقع در گله های مردمی استان چهارمحال و بختیاری و گوسفندان افشاریاز گوسفندان افشاری موجود در مزرعه دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان استفاده شد. همچنین دستهبندی گوسفندان برای صفت دوقلوزایی با کمک صاحب گله و در مرکز اصلاح دام بر اساس اطلاعات ثبت شده گوسفندان انجام گرفت. دراین بخش از مطالعه، نمونه خون از 130رأس میش دو قلوزا (20 رأس افشاری ، 30 رأس شال، 30 رأس قزل و 50 رأس لری بختیاری)، 72 رأس میش تک قلوزا (14 رأس افشاری،10 رأس شال، 10 رأس قزل و 38 رأس لری بختیاری) و 33 رأس قوچ (3 رأس افشاری،14 رأس شال، 8 رأس قزل و 8 رأس لری بختیاری) جمع آوری و به آزمایشگاه بیوتکنولوژی مستقر در دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان منتقل شد. پس از سانتریفوژ در دورrpm10000به مدت 5 دقیقه و جداسازی بخش حاوی گلبول‌های سفید، استخراج DNAاز 250 میکرولیتر خون با استفاده از روش استاندارد فنل-کلروفورم انجام و جهت تعیین کیفیتDNA استخراج شده از ژل آگارز 1 درصد و جهت تعیین کمیت آن از دستگاه نانودراپ استفاده شد.
برای تکثیر قطعه 140 جفت بازی (شکل1) ژن BMPR1B (شماره دسترسی در NCBI؛ GQ863578) از آغازگر رفت و برگشت استفاده گردید که توالی آغازگر رفت به صورت
5’-GTCGCTATGGGGAAGTTTGG-3’ و توالی آغازگر برگشت به صورت
5’-CAAGATGTTTTCATGCCTCATC-3’ بود (Abdoli et al., 2013). جهت بهینه سازی واکنش PCR از برنامههای حرارتی مختلفی استفاده شد و در نهایت برنامهی حرارتی زیر با 35 سیکل، ایده آل ترین شرایط برای تکثیر اگزون 8 ژن BMPR1B تشخیص داده شد. واسرشت سازی اولیهDNA به مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی گراد، واسرشت سازیDNA به مدت 40 ثانیه در دمای 95 درجه سانتی گراد، اتصال آغازگر به DNA به مدت 30 ثانیه در دمای60 درجه سانتی گراد، بسط DNA به مدت 40 ثانیه در دمای 72 درجه سانتی گراد و بسط نهایی به مدت 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد در حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام شد. حجم PCR انجام شده الکتروفورز محصولات PCR جهت بررسی قطعه تکثیر یافته روی ژل آگارز 2 درصد، با ولتاژ 80 ولت، به مدت 20 دقیقه صورت گرفت.
به منظور تعیین الگوهای ژنوتیپی از روش چندشکلی ساختاری رشتههای منفرد (SSCP) استفاده گردید که به طور خلاصه، 5 میکرولیتر از DNA تکثیر شده با 15 میکرولیتر از بافر مخصوص SSCP (99% فرمامید، 9/0% EDTA 6 مولار، 05/0% برموفنل و 05/0% زاینول سیانید) ترکیب و به مدت زمان 10 دقیقه در دمای96 درجه انکوبه و تک رشتهای شدند و بلافاصله پس از این مرحله در داخل یخ قرار گرفتند. در مرحله بعد الکتروفورز محصولات تک رشتهای شده، روی ژل اکریل آمید12 درصد، با ولتاژ 250 به مدت 18 ساعت جهت بررسی چند شکلیها انجام و رنگ آمیزی ژل اکریل آمید با استفاده از نیترات نقره طی سه مرحله تثبیت، لکه گذاری و ظهور انجام گرفت (Bassam et al., 1991). محصولات PCR حاصل از الگوهای مختلف ژنتیکی توالی یابی شدند.
آنالیز آماری داده‌ها براساس الگوهای ژنوتیپی موجود در اگزون 8 ژنBMPR1B با استفاده از نرم افزار SAS9.2 و با استفاده از رویه GENMOD انجام و مقایسه میانگینها با استفاده از میانگین حداقل مربعات انجام و سطح احتمال 5% به عنوان سطح اختلاف معنی دار در نظر گرفته شد.
نتایج و بحث
در این تحقیق جهت بررسی جهشهای موجود در اگزون 8 ژن BMPR1B، پرایمر جهت تکثیر این قطعه به گونهای بود که علاوه بر جهش گزارش شده موثر بر چندقلوزایی موجود در این ناحیه،دیگر چند شکلیهای احتمالی موجود در این ناحیه را نیز بتوان با استفاده تکنیک SSCP شناسایی کرد. همردیفی توالی پرایمر با توالی این ژن در بانکNCBI (شکل1) نشان داد که قطعه تکثیری در PCR برای این پرایمر باید دارای طول 140 جفت باز باشد.بر همین اساس PCR مربوط به نمونه DNA تمامی گوسفندان نمونه گیری شده لریبختیاری، افشاری، شال و قزل گذاشته شد. لازم به ذکر است که در تمام نمونههای مورد بررسی روی ژل آگارز 2 درصد، محصولات PCR مشابه هم بودند. وجود یک نوار مشخص بر روی ژل آگارز موید این است که پرایمر بکار رفته تنها دارای یک قطعه هدف رویDNA بودند و شباهت توالی در مکانهای دیگری از DNA وجود نداشت. نتایج حاصل از SSCP و رنگ آمیزی ژل اکریل آمید بیانگر سه الگو باندی متفاوت برای این چهار جمعیت بودند. فراوانیهای الگوهای ژنوتیپی در جدول 1 برای هر دو جنس از چهار نژاد مورد بررسی آورده شده است. همانطور که در جدول مشاهده میشود بیشترین فراوانی الگوی ژنوتیپی مربوط به الگوی 1 و به ترتیب با فراوانیهای90/0، 80/0، 65/0 و 64/0 متعلق به گوسفندان شال، قزل، افشاری و لری-بختیاری بود. همچنین کمترین فراوانی الگوهای ژنتوتیپی مربوط به الگوی ژنتوتیپی 2 و به ترتیب با فراوانیهای12/0، 10/0، 05/0 و 00/0 متعلق به گوسفندان لری-بختیاری، قزل، شال و افشاری بود، به عبارتی الگوی ژنوتیپی 2 در جمعیت گوسفندان افشاری مشاهده نگردید. نتایج بدست آمده در این بخش از مطالعه نشان داد که تنوع قابل ملاحظهای در صفت چندقلوزایی در ناحیه اگزون 8 ژن BMPR1B در جمعیت گوسفندان نژاد ایرانی وجود دارد.
همچنین نتایج ارتباط بین الگوهای ژنوتیپی حاصل با تعداد نتاج در هر زایش (جدول 2) نشان داد که بین الگوهای ژنوتیپی بدست آمده از ناحیه اگزون 8ژن BMPR1B و تعداد نتاج در هر زایش تفاوت معنی داری وجود دارد (05/0>P). به طوری که بالاترین میانگین تعداد نتاج در هر زایش متعلق به الگوی ژنوتیپی 2 و برابر با 70/1 و کمترین آن مربوط به الگوی ژنوتیپی 3 و برابر با 40/1 بود (05/0>P). محققین توصیف کردند که اثرات آلل‌های موتانت در ژن BMPR1B بهصورت افزایشی است که باعث افزایش میزان تخمکگذاری میشوند (Davis et al., 2004). بنابراین، با توجه به این که در مطالعه حاضر الگوهای ژنوتیپی متفاوتی در اگزون 8 ژن BMPR1B در هر چهار جمعیت گوسفندان نژاد لری-بختیاری، شال، قزل و افشاری مشاهده شد، لذا جهشهای موجود در این ناحیه میتواند علاوه بر سایر جهشهای موجود در ژنهای عمده موثر بر چند قلوزایی، بر میزان تعداد نتاج در هر زایش در گوسفندان ایرانی موثر باشد.
نتایج توالی یابی اگزون 8 ژن BMPR1B از سه گروه الگوی ژنتیکی نشان دهنده چهار جهش در توالی DNA این ژن است (جدول4) که شامل یک جهش جایگزینی باز C منطبق با موقعیت 855 توالی CDs است (شکل2-B) که موجب ایجاد یک کدون خاتمه زود هنگام در موقعیت 266 رشته پلی پپتیدی (I266*) شده است.
شکل 1- (A)جهش G812Tدر اگزون 8 ژن BMPR1B گوسفندان ایرانی، (B) مقایسه توالی پلی پپتیدی حاصل از این جهش در ژنوتیپ جهش یافته و وحشی.
Figure 1- (A) Detected mutations, G812T in exon 8 of BMPR1B gene of Iranian sheep breeds, (B) Comparison of polypeptide sequences in mutant and wild type sheep.
جدول 1- فراوانی الگوهای ژنوتیپی در اگزون 8 ژن BMPR1B گوسفندان نژاد لری بختیاری، قزل، شال و افشاری
Table 1: The frequency of genotypic patterns in exon 8 of BMPR1B gene in four breeds including Lori-Bakhtiari, Shal, Ghezel and Afshari
|
نژاد Breed |
جنس Sex |
فراوانی الگوی ژنوتیپیFrequency of Genotypic patterns |
||
|
1 |
2 |
3 |
||
|
افشاری Afshari |
میش Ewe |
|||
|
قوچ Ram |
||||
|
شال Shal |
میش Ewe |
|||
|
قوچ Ram |
||||
|
قزل Ghezel |
میش Ewe |
|||
|
قوچ Ram |
||||
|
لری بختیاری Lori-Bakhtiari |
میش Ewe |
|||
|
قوچ Ram |
||||
|
کل |
میش Ewe |
|||
|
قوچ Ram |
||||
جدول 2- اثر الگوهای ژنوتیپی در اگزون 8 ژن BMPR1B بر میانگین تعداد نتاج در هر زایش.
Table 2- The effects of genotypic patterns in exon 8 of BMPR1B gene on mean of litter size.
|
نژاد Breed |
الگوهای ژنوتیپی Genotype Patterns |
||
|
1 |
2 |
3 |
|
|
افشاریAfshari |
0.10±ab1.33 |
0.09±a1.50 |
0.11±b1.15 |
|
شال Shal |
0.11±ab1.66 |
0.10±a1.78 |
0.12±b1.45 |
|
قزل Ghezel |
0.09±1.59 |
0.06±1.60 |
0.10±1.45 |
|
لری بختیاری Lori-Bakhtiari |
0.07±b1.60 |
0.08±a2 |
0.09±b1.45 |
|
کلTotal |
0.09±ab1.55 |
0.05±a1.72 |
0.09±b1.40 |
:a,b در هر ردیف میانگینهای دارای حروف متفاوت اختلاف معنی داری در سطح 5% با یکدیگر دارند.
جدول 3- هتروزیگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار و تعادل هاری-وینبرگ با استفاده از آماره کای اسکور
Table 3- Expected and observed heterozygosity and Hardy-Weinberg equilibrium by chi-square statistic.
|
نژاد Breed |
هتروزیگوسیتی مشاهده شده Observed Heterozygosity |
هتروزیگوسیتی مورد انتظار Expected Heterozygosity |
درجه آزادی Freedom |
کای مربع () Chi Square |
|
افشاریAfshari |
0.79 |
0.49 |
1 |
12.3*** |
|
شال Shal |
0.94 |
0.50 |
1 |
36.7*** |
|
قزل Ghezel |
0.62 |
0.47 |
1 |
8.77*** |
|
لری بختیاری Lori-Bakhtiari |
0.70 |
0.50 |
1 |
8.96*** |
***: اختلاف معنی دار در سطح کمتر از 001/0
بنابراین، این جهش منجر به ایجاد کدون خاتمه زود هنگام و کوتاه شدن طول رشته پلی پپتیدی از 503 به 255 اسید آمینه می گردد. هرچند این جهش متفاوت از جهش گزارش شده در نژاد بورولا مرینو بود ولی نتیجه ای مشابه با جهش بورولا (FecB) ایجاد خواهد کرد (Souza et al., 2001). همچنین، جهش T854A نیز مشاهده شد (شکل2-C)، که به موجب آن اسیدآمینه فنیل آلانین به تیروزین در موقعیت 233 (F233Y) تبدیل می شود. به علاوه، جهش C855A مشاهده شد (شکل4-C) که موجب تبدیل اسیدآمینه فنیل آلانین به لیزین در موقعیت 233 (F233L) گردید. همچنین، توالی یابی این قطعه تکثیر شده از اگزون 8 نشان دهنده وجود جهش G812T بود (شکل2-D) که موجب این تبدیل اسیدآمینه تریپتوفان به لیزین در موقعیت 219 (W219L) گردید. از آنجایی که تبدیل های نوکلئوتیدی ذکرشده درتوالی زنجیره پلی پپتید منجر به تبدیل اسید های آمینه تریپتوفان و لیزین، و همچنین فنیل آلانین، تیروزین و لیزین می گردد که از نظر سیستم طبقه بندی استاندارد اسید های آمینه، در خانواده های مشابه دسته بندی قرار دارند. بنابراین، به احتمال زیاد جهش های تبدیلی شناسایی شده در گوسفندان ایرانی موجب ایجاد تغییرات اساسی در ساختار پروتئین و به دنبال آن عملکرد پروتئین بالغ نمی گردد. درحالیکه جهش شناسایی شده ورود تک نوکلئوتیدی که منجر به تغییر خوانش اسیدهای آمینه و چارچوب رمز می گردد، میتواند تاثیر به سزایی در ساختار و عملکرد گیرنده پروتئین مورفوژنتیک استخوانی (BMPR1B) داشته باشد (Souza et al., 2001). بررسی بیان ژن BMPR1B در گوسفندان ایرانی دارای تخمدان پرفولیکول انترال نسبت به گوسفندان کم فولیکول نشان داد که میزان بیان این ژن اختلاف معنی داری نداشت، ولی همبستگی بسیار بالای این ژن با GDF9 و BMP15 نشان دهنده اهمیت آن در مکانیسم کنترل تعداد فولیکول های انترال از طریق لیگاندهای BMP می باشد (Foroughinia et al. 2016).
جدول 4- وجود پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی در ژن BMPR1B و توالی پلی پپتید فرضی آن در گوسفندان ایرانی.
Table 4- Presence of SNPs in BMPR1B and the presumptive polypeptide changes in Iranian ewes.
|
Amino acid conversion |
Nucleotide conversion |
|
Isoleucine to Stop codon (I266*) |
855C insertion |
|
Tryptophan to Lysine (W219L) |
G812T |
|
Phenylalanine to Tyrosine (F233Y) |
T854A |
|
Phenylalanine to Lysine (F233L) |
C855A |
به طور کلی، نتایج این تحقیق نشان داد که در اگزون 8 ژن BMPR1B در گوسفندان نژادهای مختلف ایرانی جهش های مهمی وجود دارد که میتواند بر صفات مرتبط با تعداد نتاج در هر زایش موثر باشد. پیشنهاد میشود که سایر اگزون های ژن BMPR1B نیز در نژادهای مختلف گوسفندان ایرانی مورد مطالعه قرار گیرد.
سپاسگزاری
این پروژه با حمایت معنوی و مالی دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان (خوراسگان) انجام گردید.
شکل2- جهش های مشاهده شده در اگزون 8 ژن BMPR1B گوسفندان ایرانی. نمونه تیپ وحشی فاقد جهش (A)، جهش تک نوکلئوتیدی 855 C Insertion (B)، جهشهای تک نوکلئوتیدی T854A و C855A (C) و جهشهای تک نوکلئوتیدی G812T (D).
Figure 4- Detected mutations in exon 8 of BMPR1B gene of Iranian sheep breeds: Wild type genotype (A), insertion of C nucleotide in the 855 position (B), simultaneous presence of single nucleotide polymorphisms of T854A and C855A (C), and single nucleotide polymorphism G812T (D).
منابع
Abdoli R, Zamani P, Deljou A, Rezvan H (2013). Association of BMPR-1B and GDF9 genes polymorphisms and secondary protein structure changes with reproduction traits in Mehraban ewes. Gene 524: 296-303.
Alinaghizadeh R, Mohammad Abadi MR, Zakizadeh S (2010). Exon 2 of BMP15 gene polymorphisminJabalBarez Red Goat. Journal of Agricultural Biotechnology 2: 69-80 (In Farsi).
Asadpour R, Jafari-Joozani R, Alijani S, Mahmod H (2012). Detection of polymorphism in booroola gene (FecB) and its association with litter size in Zel sheep breed in Iran. Slovak Journal of Animal Science 45: 63-66.
Barzegari A, Atashpaz S, Ghabili K, Nemati Z, Rustaei M, Azarbaijani R (2010). Polymorphisms in GDF9 and BMP15 associated with fertility and ovulation rate in Moghani and Ghezel sheep in Iran. Reproduction in Domestic Animals 45: 666-669.
Bassam BJ, Caetano-Anollés G, Gresshoff PM (1991). Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry 196: 80-83.
Davis G (2004). Fecundity genes in sheep. Animal Reproduction Science 82: 247-253.
Davis GH (2005). Major genes affecting ovulation rate in sheep. Genetics Selection Evolution 37: S11.
Davis G, Balakrishnan L, Ross I, Wilson T, Galloway S, Lumsden B, Hanrahan J, Mullen M, Mao X, Wang G (2006). Investigation of the Booroola (FecB) and Inverdale (FecX I) mutations in 21 prolific breeds and strains of sheep sampled in 13 countries. Animal Reproduction Science 92: 87-96.
Davis G, Galloway SM, Ross I, Gregan, SM, Ward J, Nimbkar BV, Ghalsasi PM, Nimbkar C, Gray GD, Inounu I (2002). DNA tests in prolific sheep from eight countries provide new evidence on origin of the Booroola (FecB) mutation. Biology of Reproduction 66: 1869-1874.
Davis G, McEwan J, Fennessy P, Dodds K, Farquhar P (1991). Evidence for the presence of a major gene influencing ovulation rate on the X chromosome of sheep. Biology of Reproduction 44: 620-624.
Eghbalsaied S, Amini H, Shahmoradi S, and Farahi M (2014). Simultaneous Presence o=f G1 and G4 Mutations in Growth Differentiation Factor 9 Gene of Iranian Sheep. Iranian Journal of Applied Animal Research 4: 781-785.
Eghbalsaied S, Ghaedi K, Shahmoradi S, Pirestani A, Amini H, Saiedi T, Nicol L, McNeilly A (2012). Presence of SNPs in GDF9 mRNA of Iranian Afshari sheep. International Journal of Fertility and Sterility 5: 225–230 (In Farsi).
Foroughinia G, Fazileh A, Eghbalsaied S (2016). Expression of genes involved in BMP and estrogen signaling and AMPK production can be important factors affecting total number of antral follicles in ewes. Theriogenology DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.theriogenology.2016.12.023
Ghaffari M, Nejati-Javaremi A, Rahimi-Mianji G (2009). Lack of polymorphism in the oocyte derived growth factor (GDF9) gene in the Shal breed of sheep. South African Journal of Animal Science 39: 355-360.
Guan F, Liu SR, Shi GQ, Yang LG (2007). Polymorphism of FecB gene in nine sheep breeds or strains and its effects on litter size, lamb growth and development. Animal Reproduction Science 99: 44-52.
Hadizadeh M, Mohammadabadi MR, Niazi A, Esmailizadeh AK, Mehdizadeh Y G, Molaei S (2013). Use of bioinformatics tools to study exon 2 of GDF9 gene in Tali and Beetalgoats. Modern Genetics Journal 8: 283-288 (In Farsi).
Hadizadeh M, Mohammadbadi MR, Niazi A, Esmailizadeh A, Gazooei YM (2014). Search for polymorphism in growth and differentiation factor 9 (GDF9) gene in prolific beetal and tali goats (Capra hircus). Journal of Biodiversity and Environmental Sciences 4: 186-191.
Hadizadeh M, Niazi A, MohammadAbadi MR, Esmailizadeh AK, Mehdizadeh Gazooei Y (2014). Bioinformatics analysis of the BMP15 exon 2 in Tali and Beetal goats. Modern Genetics 9: 117-120 (In Farsi).
Javanmard A, Mohammadabadi MR, Zarrigabayi GE, Gharahedaghi AA, Nassiry MR, Javadmansh A, Asadzadeh N (2008). Polymorphism within the intron region of the bovine leptin gene in Iranian Sarabi cattle (Iranian Bostaurus) Russian Journal of Genetics 44 (4), 495-497.
Khodabakhshzadeh R, Mohamadabadi MR, Esmailizadeh AK, MoradiShahrebabak H, Bordbar F, Ansari Namin S (2016a). Identification of point mutations in exon 2 of GDF9 gene in Kermani sheep. Polish Journal of Veterinary Sciences 19: 281–289.
Khodabakhshzadeh R, Mohammadabadi MR, Moradi H, Esmailizadeh AK (2016b). Identification of available mutations in the first-half (from 5’ end) of exon 2 of GDF9 gene in crossbred sheep from crossing of Romanov and Lori-Bakhtiari breeds. Animal Production Research 4: 15-26 (In Farsi).
Khodabakhshzadeh R, Mohammadabadi MR, Moradi H, Esmailizadeh AK, Ansari NS (2015a). Identify of G―›A point mutation at positions 477 and 721 in exon 2 of GDF9 gene in Kermani sheep. Modern Genetics 10: 261-268 (In Farsi).
Khodabakhshzadeh R, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh AK, Moradi-Shahrebabak H, Ansari Namin S (2015b). Study of mutations available in first-halfexon 2 of GDF9 gene in crossbred sheep born from crossing of Romanov rams with Kermani ewes. Iranian Journal of Animal Science Research 6: 395-403 (In Farsi).
Mahdavi M, Nanekarani S, Hosseini S D (2014). Mutation in BMPR-IB gene is associated with litter size in Iranian Kalehkoohi sheep. Animal Reproduction Science 147: 93-98.
Moghadaszadeh M, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh AK. 2015. Association of Exon 2 of BMP15 Gene with the Litter Size in the Raini Cashmere Goat. Genetics in the 3rd Millennium 13: 4062-4067.
Mohammadabadi MR, Sattayimokhtari R (2013). Estimation of (co) variance components of ewe productivity traits in kermani sheep. Slovak Journal of Animal Science 46: 45-51.
Mohammadi A, Nassiry MR, Mosafer J, Mohammadabadi MR, Sulimova GE (2009). Distribution of BoLA-DRB3 allelic frequencies and identification of a new allele in the Iranian cattle breed Sistani (Bos indicus). Russian Journal of Genetics 45: 198-202.
Moradband F, Rahimi G, Gholizadeh M (2011). Association of polymorphisms in fecundity genes of GDF9, BMP15 and BMP15-1B with litter size in Iranian Baluchi sheep. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences 24: 1179-1183.
Moradi N, Nazifi N, Rahimi Mianji G, Ansari Piresaraei Z (2014). Polymorphisms in FSHR and GDF9 loci and their associations with litter size in Zel sheep. 14: 163-176 (In Farsi).
Mousavizadeh A, Mohammad Abadi MR, Torabi A, Nassiry MR, Ghiasi, Esmailizadeh AK (2009). Genetic polymorphism at the growth hormone locus in Iranian Talli goats by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP). Iranian Journal of Biotechnology 7: 51-53.
Mulsant P, Lecerf F, Fabre S, Schibler L, Monget P, Lanneluc I, Pisselet C, Riquet J, Monniaux D, Callebaut I (2001). Mutation in bone morphogenetic protein receptor-IB is associated with increased ovulation rate in Booroola Merino ewes. Proceedings of the National Academy of Sciences 98: 5104-5109.
Nimbkar C, Ghalsasi P, Walkden-Brown S, Kahn L (2002). Breeding program for the genetic improvement of Deccani sheep of Maharashtra, India. In: Proceedings of the Seventh World Congress on Genetics Applied to Livestock Production pp. 349-352.
Polley S De S, Brahma B, Mukherjee A, Vinesh P, Batabyal S, Arora JS, Pan S, Samanta A K, Datta T K (2010). Polymorphism of BMPR1B, BMP15 and GDF9 fecundity genes in prolific Garole sheep. Tropical Aanimal Health and Production 42: 985-993.
Sattai Mokhtari M, Rashidi A, Mohammadabadi MR, MoradishahrbabakH (2009). Estimation of Genetic, Phenotypic and Environmental Trends of Growth Traits in Kermani Sheep. Iranian Journal of Animal Science 4: 51-58 (In Farsi).
Soufy B, Mohammadabadi MR, Shojaeyan K, Baghizadeh A, Ferasaty S, Askari N, Dayani O (2009). Evaluation of Myostatin gene polymorphism in Sanjabi sheep by PCR-RFLP method. Animal Science Reserches 19: 81-89 (In Farsi).
Souza C, MacDougall C, Campbell B, McNeilly A, Baird D (2001). The Booroola (FecB) phenotype is associated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type 1 B (BMPR1B) gene. Journal of Endocrinology 169: R1-R6.
Zamani P, Abdoli R., Deljou A, Rezvan H (2015a). Polymorphism and bioinformatics analysis of growth differentiation factor 9 gene in lori sheep. Annals of Animal Science 15: 337-348.
Zamani P, Nadri S, Saffaripour R, Ahmadi A, Dashti F, Abdoli R (2015b). A new mutation in exon 2 of the bone morphogenetic protein 15 gene is associated with increase in prolificacy of Mehraban and Lori sheep. Tropical Animal Health and Production 47: 855-860.
Detection of new mutations in exon 8 of BMPR1B gene in Iranian Lori-Bakhtyari, Shal, Ghezel and Afshari sheep breeds
Eghbalsaied S.1,2*, Amini H.R.3, Rashidi F.2, Velayati D. 2, Pourali S. 2
1Transgenesis Center of Excellence, Isfahan (Khorasgan) branch, Islamic Azad University, Iran; 2Department of Animal Science, Isfahan (Khorasgan) branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran; 3Department of Animal Science, University College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran.
Abstract
Bone morphogenetic protein receptor-1B is one of the major genes significantly affect ewe ovulation rate. The aim of this study was to screen exon 8 of BMPR1B in single- and twin-birth ewes of Iranian Lori-Bakhtyari, Shal, Ghezel, and Afshari breeds. DNA was extracted from blood of ewes and rams from numerous sheep flocks and the genotype patterns were screened by PCR-SSCP approach. Results of SSCP analysis showed that there are three genotypic patterns in the four above-mentioned breeds. The highest abundant pattern and the lowest pattern were pattern 1 (73 %) and pattern 2 (8 %), respectively, in the whole flocks. There was a significant difference between these three genotypic patterns in terms of litter size attribute, so that ewes harboring Pattern 2 had the highest litter size average (1.7 lamb per parturition) while ewes carrying Pattern 3 had the lowest litter size average (1.4 lamb per parturition). Furthermore, the PCR amplicon from exon 8, containing these genotypic patterns, were sequenced. The sequencing results of candidate samples from different classes of SSCP showed that there were four new mutations in BMPR1B of Iranian sheep. Three of these mutations were nucleotide conversions, including G812T, T854A, and C855A mutations which caused to tryptophan to lysine (W219L), phenyl alanine to tyrosine (F233Y), and phenyl alanine to lysine (F233L) conversions, respectively. More importantly a C nucleotide insertion mutation corresponding to 855 nt of BMPR1B CDs was also observed which can cause to producing a stop codon at 266 amino acid position and consequently a dysfunctional polypeptide. In conclusion, these results clearly indicate the presence of important mutation in BMPR1B in Iranian sheep breeds which can significantly affect ewe fecundity attributes.
Keywords: BMPR1B, Fecundity, Iran, Litter size, PCR-SSCP, Sheep.
|
* نویسنده مسئول: شاهین اقبال سعید تلفن: 35354084-031 Email: shahin.eghbal@khuisf.ac.ir
[1]Bone Morphogenetic Protein Receptor type IB
[2]Growth Differentiation Factor
[3]Bon Morphogenetic Protein
[4]Hu sheep breed
* Corresponding Author: Eghbalsaied S. Tel: 031-35354001 Email: shahin.eghbal@khuisf.ac.ir
)
