بررسی تنوع ژنتیکی اکوتیپ‏های گیاه دارویی خارمریم (Silybum marianum L.) با استفاده از نشانگر ISSR

بررسی تنوع ژنتیکی اکوتیپ‏های گیاه دارویی خارمریم (Silybum marianum L.) با استفاده از نشانگر ISSR  

عزیزه سقلی*¹، محمد فرخاری²،افشین صلواتی²، خلیل عالمی سعید²، علیرضا ابدالی‏مشهدی²

¹دانشجوی سابق کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان

² استادیاران گروه  زراعت و اصلاح نباتات دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان

تاریخ دریافت: 31/01/1393، تاریخ پذیرش: 01/07/1395

چکیده

خارمریم (Silybum marianum L.) یکی از گیاهان دارویی مهم است که از زمان‏های باستان برای درمان بیماری کبد و بیماری‏های مرتبط با صفرا و همچنین مسمومیت حاد ناشی از مصرف قارچ‏های سمی مورد استفاده قرار می‌گرفت. شناخت تنوع ژنتیکی در گیاه خارمریم همانند سایر گیاهان کمک بزرگی در جهت تحقیقات به‏نژادی و بررسی و شناسایی تنوع موجود در ذخایر ژرم‏پلاسم این گیاه می‏نماید. هدف از این مطالعه بررسی تنوع ژنتیکی 23 اکوتیپ خارمریم مربوط به مناطق زیستی مختلف ایران با استفاده از نشانگرهای مولکولی ISSR بود. به این منظور از 9 نشانگر ISSR استفاده شد که برمبنای آنها بین اکوتیپ‏ها چندشکلی مشاهده گردید. این آغازگرها مجموعاً 41 باند چندشکل و تکرارپذیر ایجاد نمودند. در این بررسی میانگین میزان محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC)، میانگین شاخص اطلاعاتی شانون و میانگین شاخص ضریب تنوع نی به ترتیب برابر با 38/0، 30/0 و 20/0 بدست آمد. تجزیه خوشه‏ای با استفاده از الگوریتم UPGMA و ماتریس تشابه جاکارد، اکوتیپ‏های خارمریم را در 4 گروه اصلی تقسیم‏بندی نمود. در مجموع بین این گروه‌بندی و مناطق پراکنش جغرافیایی اکوتیپ‌ها تطابق کاملی وجود نداشت. نتایج این پژوهش مبین وجود تنوع ژنتیکی مناسب در بین اکوتیپ‏های خارمریم ایران جهت آغاز مطالعات پروژه‏های بهنژادی است.

کلمات کلیدی: خارمریم، بهنژادی، خوزستان.

مقدمه

خارمریم با نام علمی Gaertn Silybum marianum(L.) یکی از گیاهان دارویی مهم است که از زمان‏های باستان برای درمان بیماری کبد و بیماری‏های مرتبط با صفرا و همچنین مسمومیت حاد ناشی از مصرف قارچ‏های سمی مورد استفاده قرار می‏گرفته است (2005 Rainone,). این گیاه حاوی ترکیبات فنولیک به نام فلاونولیگان‏ها است که عمدتا در دانه آن یافت می‏شود و در مجموع به نام سیلی‏مارین شناخته می‏شود (Kurkin, 2003). خارمریم جایگاه مهمی در زراعت متابولیتی و صنایع دارویی داراست، به طوری که این گیاه از 20 سال پیش در کشورهایی مانند مجارستان، لهستان و بلغارستان در مقیاس وسیع کشت و ارقام اصلاح شده آن تولید شده است (OmidBeigi, 1998).

خارمریم گیاهی دیپلوئید با 17 جفت کروموزم (2n=2x=34) شامل 6 جفت کروموزم متاسنتریک، 10 جفت کروموزم ساب متاسنتریک و یک جفت کروموزم آکرو سنتریک می‌باشد (Asghari-Zakaria et al., 2008). این گیاه به سلسله گیاهان بخش Magnoliophyta، کلاس نهاندانگان، راسته Asterales، خانواده Asteraceae و جنس Silybum است. دو گونه در جنس Silybum وجود دارد، گل بنفش Silybum marianum و گل سفیدS. eburneum Coss ، که هر دو تولید فلاونولیگنان‏های محافظ کبد می‏کنند (Abdali Mashhadi & Fathi, 2002 Murphy et al., 2000;). این گیاه بومی جنوب اروپا، منطقه مدیترانه و شمال آفریقا است (Hasanloo et al., 2005). در ایران این گیاه در مناطق مختلفی از جمله گرگان، گنبد کاووس، بین گرگان و نوده در ارتفاعات 150 تا 500 متری کلاردشت، بابل در ارتفاعات 450 متری، آذربایجان (دشت مرغان)، کرمانشاه (کوه نوه)، لرستان (باغ سراب در ارتفاعات 850 متری، پشت کوه)، خوزستان (شوش، حمیدیه، 25 کیلومتری رامهرمز )، فارس (کازرون، بوشهر، برازجان) می روید (ZareKia & OmidBeigi, 2006).

توده‌های وحشی خارمریم در مناطق مختلف خوزستان به‌وفور به چشم می‏خورد و به خوبی با شرایط آب و هوایی خوزستان سازگار می‏باشد. در خوزستان این گیاه در آبان ماه سبز شده و در پاییز و زمستان با استفاده از بارندگی‌ها رشد رویشی می‏نماید و در بهار به ساقه رفته و گل‏دهی می‏نماید و در اردیبهشت ماه بذور آن به رسیدگی فیزیولوژیک می‏رسد. این گیاه به شرایط نامساعد محیطی همچون سنگین بودن خاک که از مشکلات عمده خوزستان است، مقاوم می‌باشد. بنابراین در صورت اهلی‏سازی و اصلاح این گیاه در جهت افزایش روغن و سیلی‏مارین می‌تواند به عنوان یک گیاه روغنی-دارویی در بسیاری از زمین‌های این استان که شرایط خوبی برای کشت سایر گیاهان زراعی از جمله گندم و کلزا را ندارند، مورد کشت قرار گیرد.

تنوع و انتخاب دو رکن اصلی در هر برنامه اصلاحی بوده و انجام انتخاب منوط به وجود تنوع مطلوب از حیث هدف مورد بررسی می‌باشد (Varma et al., 1980). در مطالعه تنوع ژنتیکی، تنوع بین افراد یا جمعیت‏ها بوسیله روش خاص و یا ترکیبی از روش‏ها انجام می‏شود. یکی از روش‏های مطالعه تنوع استفاده از نشانگرهای DNA می‏باشد. از جمله مزایای نشانگرهای دی.ان.ای نسبت به نشانگرهای مورفولوژیک هزینه پایین، سرعت و دقت بالا است. نشانگرهای مختلف DNA امروزه به این منظور مورد استفاده قرار می‏گیرند که هر یک معایب و مزایای خاص خویش را می‌باشد. تاکنون چندین بررسی برروی تنوع اکوتیپ‏های خار مریم ایران توسط نشانگرهای DNA صورت پذیرفته است. در پژوهشی Mohammadi et al. (2011) در مطالعه خود تنوع ژنتیکی درون و بین 32 اکوتیپ خارمریم جمع‏آوری شده از نواحی مختلف کشور به همراه دو رقم خارجی بوداکالازی و Cnseeds را با استفاده از نشانگرهای AFLP مورد مطالعه قرار دادند. تجزیه خوشه‏ای داده‏های AFLP با استفاده از فاصله ژنتیکی، اکوتیپ‏ها را به سه گروه منتسب کرد. در تحقیقی دیگر تنوع مولکولی و مورفولوژیکی 9 نمونه مختلف خارمریم از 9 مکان مختلف ایران را با استفاده از صفات مورفولوژیکی، فنولوژیکی، فیتوشیمیایی و نشانگرهای RAPD مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه اکوتیپ‏های خارمریم توسط نشانگر RAPD در 3 دسته طبقه‏بندی شدند (2011 .(Hamid et al.  در پژوهشیJorabadi et al. (2012)  نیز در بررسی تنوع ژنتیکی 61 بوته خارمریم بومی استان کرمانشاه با استفاده از 9 نشانگر مولکولی ISSR[1]  اظهار نمودند که با میانگین 11/93 درصد چندشکلی، این نشانگر قابلیت بررسی تنوع ژنتیکی و تفکیک نمونه‏ها را دارا هستند. نشانگرهای بین‏ریزماهواره‏ای (ISSR) تکنیکی است که توالی‏های ریزماهواره‏ای را به عنوان آغازگرها در یک واکنش زنجیره‏ای پلی‏مراز برای ایجاد نشانگرهای چند جایگاهی مورد استفاده قرار می‏دهند. این نشانگرها جزء نشانگرهای غالب بوده و کاربرد آن‏ها نیازی به شناخت قبلی از توالی ژنومی ندارند. میزان چندشکلی در نشانگرهای ISSR بسیار بالاست و برای مطالعات تنوع ژنتیکی، فیلوژنتیک، نشانمند کردن ژن، نقشه‏یابی ژنوم و بیولوژی تکاملی بسیار کارآمد هستند (Reddy et al., 2002). با توجه به موارد فوق و این که استفاده از نشانگرهای ISSR نیازی به اطلاعات توالی ژنوم ندارد و منجر به ایجاد الگوهای چندجایگاهی و بسیار چندشکل می­شود (Askari et al., 2011; Ghasemi et al., 2010; Zamani et al., 2011; Zamani et al., 2015) هدف از اجرای این پژوهش ارزیابی میزان تنوع موجود در ژرم‌پلاسم جمع‌آوری شده خارمریم با استفاده از نشانگر ISSR بود.

مواد وروش‏ها

این تحقیق به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 23 اکوتیپ خارمریم در آزمایشگاه مرکزی دانشگاه کشاورزی ومنابع طبیعی رامین خوزستان انجام گردید. عمده اکوتیپ‌های مورد مطالعه از بانک ژن موسسه جنگل‏ها و مراتع تهران دریافت و تعدادی نیز از استان خوزستان جمع‏آوری گردید (جدول 1). همچنین رقم استاندارد از شرکت پاکان بذر اصفهان و رقم 100 Pکه اکوتیپی وحشی است، از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه گردید.

استخراج DNA از برگ‏های جوان به روش دلاپورتا (Dellaporta et al. 1983)، با کمی تغییرات انجام گرفت. 2/0 گرم نمونه برگی (بدون رگبرگ و دمبرگ) از گیاهچه‌های جوان در ازت مایه پودر و به میکروتیوب 5/1 میلیلیتر منتقل گردید. به میزان 400 میکرولیتر بافر استخراج (شامل 100 میلی‌مولار Tris-HCl با 8 = pH، 50 میلی‌مولار EDTA با 8 = pH، 4/1 میلی‌مولار NaCl و دو درصد SDS) به همراه 2 میکرولیتر مرکاپتواتانول به آن اضافه شد. نمونه ها به مدت 60 دقیقه در حمام بن ماری در دمایC°65 درجه سانتی گراد قرار داده شده و در این مدت هر 5 دقیقه به آرامی سر و ته شدند. سپس نمونه ها در دمای اتاق خنک و به میزان 200 میکرولیتر استات پتاسیم M5 اضافه و 10 دقیقه در دمای C°20- قرار داده شدند. بعد از این مدت 500 میکرولیتر کلروفورم-ایزوآمیل الکل (1:24) سرد به نمونه اضافه و به آرامی بههم زده شدند. نمونه ها با 10000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و پس از حذف مایع رویی رسوب به دست آمده به مدت 15 دقیقه در هوای اتاق خشک شد. در نهایت 200 میکرولیتر TE به هریک از نمونه‌ها اضافه و برای حل شدن کامل DNA، به مدت 24ساعت نمونه‌ها در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری و سپس به فریزر20- منتقل گردیدند. کمیت DNA استخراجی با دستگاه نانودراپ مدل Thermo NANO DROP20000spectro photometer و کیفیت آن از نظر وجود شکستگی بوسیله الکتروفورز با ژل آگاروز 1 درصد ارزیابی شد.

در این پژوهش 9 نشانگر ISSR استفاده شد (جدول2). واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با استفاده از دستگاه Bio Rad در حجم واکنش 25 میکرولیتر شامل 0.2 میلی‌مولار دزکسی نوکلئوتید تری فسفات، 2 درصد دی‌متیل‌سولفوکسید[2] (DMSO)، 2 میلی‌مولار کلریدمنیزیم، 10 پیکومول آغازگر، 1 واحد آنزیم DNA پلیمراز و 30 نانوگرم DNA الگو صورت گرفت.

کاربرد DMSO در واکنش زنجیره‏ای پلیمراز به دلیل بازکردن پیچ و تاب‏های موجود در DNA خارمریم بوده تا واکنش به سهولت انجام گیرد.

جدول 1- اکوتیپ‏های خارمریم‏های مورد بررسی در این تحقیق.

Table 1- Silybum marianum ecotypes that was studied in this study.

چرخه حرارتی PCR شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه و 35  مرحله بعدی واسرشت سازی در 94 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، مرحله اتصال در دمای مناسب آغازگر (47-53درجه سانتی گراد) به مدت 30 ثانیه و مرحله بسط در دمای 72 درجه‌سانتیگراد به مدت 1 دقیقه صورت پذیرفت. در نهایت مرحله بسط نهایی به مدت 10 دقیقه در دمای 72 درجه‌سانتیگراد انجام گردید.

جدول 2- توالی آغازگرهای مورد استفاده.

Table 2- Sequence of used primers.

جهت الکتروفورز فرآورده‏های PCR حاصل از نشانگرهای ISSR از الکتروفورز افقی با ژل آگارز 1 درصد استفاده گردید. از سایز مارکر[3] bp 100 یا 1 کیلو باز شرکت Fermentas جهت تخمین وزن باند‌های تکثیری مورد استفاده قرار گرفت. الکتروفورز با ولتاژ 90 ولت، شدت جریان 100 میلی‏آمپر و قدرت 50 وات به مدت 75 دقیقه صورت پذیرفت. پس از پایان الکتروفورز، ژل از تانک خارج گردید و قطعات تکثیر شده تحت تأثیر نور فرابنفش (با طول موج 254 نانومتر) توسط دستگاه ژل‌داک^[4] شرکت UVI TEC Cambridge مشاهده شد و عکس ژل ثبت گردید. با توجه به اینکه در هر ژل تعداد چاهک‌ها به تعداد ژنوتیپ‌ها نبود بنابراین عمل بارگذاری در چند ژل مستقل از یکدیگر انجام گردید و در نهایت برای امتیاز دهی  باندها از نرم­افزار UV doc که از سایز مارکر به عنوان اندازه معیار کمک می‌گیرد، استفاده شد. نشانگرها به صورت صفر(عدم وجود باند) و یک (وجود باند) امتیاز بندی شدند.

 شاخص‌هایی نظیر تنوع ژنی نی (Nei, 1973) و ضریب شانون (Shannon, 1949) توسط نرم‌افزار Popgene32 (Francis et al., 1997) محاسبه گردید. مقادیر محتوای اطلاعات چندشکلی[5] (PIC) توسط فرمول Rold'an-Ruiz et al., 2000 محاسبه گردید. برای محاسبه ماتریس تشابه از ضریب تشابه جاکارد و برای گروهبندی از الگوریتم UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) استفاده شد. بدین منظور نسخه 2.02 نرم‏افزارNTSYSpc  (Rohlf, 2000 ) استفاده گردید. برای تعیین تعداد گروه‌ها در دندروگرام از تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) توسط نرمv6  GenAlex (Peakall and Smouse, 2006) استفاده گردید. بدین صورت که از بین خطوط برش متفاوت ، موردی انتخاب گردید که در آن واریانس بین گروه‌های ایجاد شده نسبت به واریانس درون گروه‌ها معنی‌دار و دارای بیشترین مقدار بود.

نتایج و بحث

در این بررسی در مجموع 55 جایگاه توسط 9 نشانگر ایجاد گردید که از این بین 41 جایگاه (چندشکلی 74 درصد) بین ژنوتیپ‌ها چندشکلی نشان داد. تعداد قطعات تکثیر شده با نشانگرهای مختلف متفاوت بوده و اندازه قطعات تکثیر شده در تمام نشانگرها در محدوده 1500-200 جفت باز بودند (شکل 1). دامنه ضریب تشابه جاکارد بدست آمده از نشانگر ISSR در این تحقیق از 20/0 بین اکوتیپ‏های شوشتر و روستای ندافیه تا 72/0 بین دو اکوتیپ ملاثانی1 و نجف‏آباد متغیر بود (جدول 3). مقادیر محتوای اطلاعات چندشکلی (Rold'an-Ruiz et al., 2000)، شاخص تنوع ژنی نی (Nei 1973) و شاخص اطلاعاتی شانون (Shannon 1949) محاسبه شده و در جدول 4 گزارش شده است. آغازگر UBC-112 با توالی (GACA)4 از لحاظ این شاخص‌ها در مقایسه با سایر آغازگرها حاوی کمترین مقادیر بود. بنابراین این نشانگر در مقایسه با سایر نشانگرها سهم کمتری در تمایز اکوتیپ‌های از یکدیگر داشته است. سایر آغازگرها از لحاظ این شاخص‌ها دارای مقادیر متوسط و تقریبا برابر بودند.  میانگین محتوای اطلاعات چندشکلی، شاخص ضریب تنوع ژنی نی و شاخص اطلاعاتی شانون  برای نشانگرهای مورد بررسی در این تحقیق به ترتیب برابر با 38/0، 33/0 و 49/0 بود. این مقادیر در مطالعه‌ای که بر روی 32 جمعیت گیاه خارمریم در ایران با 27 آغازگر AFLP صورت گرفت، به ترتیب برابر با 35/0، 20/0 و 30/0 بود (Mohammadi et al., 2011).

جدول 3- ماتریس تشابه جاکارد.

Table 3- Jaccard similarity matrix.

شکل1- چند شکلی حاصل از تکثیر با نشانگر ISSR-11 در برخی اکوتیپ‏های خارمریم، M: سایز مارکر100 bp.

Figure 1- Polymorphism of ISSR-4 in some of Milk Thistle ecotypes, M: size marker 100 bp.

برای طبقه‏بندی اکوتیپ ها از روش گروهبندی UPGMA و ماتریس تشابه جاکارد استفاده شد. ضریب کوفنتیک محاسبه شده برابر با 76/0 و بسیار معنی‌دار بود که تشابه قابل قبول بین ماتریس تشابه و دندروگرام رسم شده را نشان می‌دهد.  در دندروگرام اکوتیپ‏ها در 4 گروه (A، B، C و D) دسته بندی شدند که گروه A نیز خود شامل دو زیر گروه می‌باشد (شکل 2). در این حالت واریانس بین گروه‌ها و واریانس داخل‌گروه‌ها به ترتیب برابر با 26 و 74 درصد و این نسبت از لحاظ آماری بسیار معنی‌دار بود. واریانس بین گروه‌ها برای سایر حالات گروهبندی از جمله 5 گروه و 3 گروه کمتر از 26 درصد درصد بود. تقریبا همه اکوتیپ‌های قرار گرفته در گروه A مربوط به استان خوزستان بودند به جز اکوتیپ مربوط به اردبیل و نجف آباد اصفهان که در این گروه قرار گرفته بودند. در سایر گروه‌ها نیز اکوتیپ‏های مربوط به مناطق مختلف در کنار یکدیگر قرار گرفتند. در مجموع تطابق کاملی بین گروه‏بندی اکوتیپ‌ها توسط دندوگرام با مناطق جغرافیایی وجود نداشت. با این حال دو اکوتیپ متعلق به انگلستان در کنار یکدیگر در گروه دوم قرار گرفتند. در مطالعات (2011) .Hamid et al ، Mohammadi et al. (2011) و Hossini (2012) که به ترتیب از نشانگرهای RAPD، AFLP و SSR برای بررسی تنوع ژنتیکی اکوتیپ‌های خارمریم جمع‌آوری شده از مناطق زیستی مختلف ایران استفاده نموده بودند نیز انطباق کاملی بین گروه‏بندی‌ اکوتیپ‌های خارمریم توسط نشانگرهای مولکولی و منشاء جغرافیایی آنها مشاهده نشد. علت این امر می‏تواند به خاطر تنوع بالای این گیاه و یا جابجایی بذور بین مناطق مختلف باشد. همانطور که در شکل 2 مشاهده می‌شود اکوتیپ‌های مربوط به استان خوزستان در تمام گروه‌ها موجود هستند. اکوتیپ‌های ملاثانی1 و 2 و ملاثانی3 گرچه هر دو مربوط به یک منطقه می‏باشد اما در دو گروه مجزا دسته‏بندی شده‏اند. دو اکوتیپ مربوط به  بهبهان نیز در دو زیرگروه متفاوت در گروه A قرار گرفته‌اند. این موارد نشان‏دهنده تنوع بالای خارمریم در استان خوزستان می‌باشد. اکوتیپ‌های انگلستان یک و دو و نیز رقم مجارستان در کنار اکوتیپ‌های ایرانی قرار گرفته‌اند (شکل 2). بنابراین می‌توان ادعا نمود که این ارقام از اکوتیپ‌های ایرانی حاصل شده‌اند و در صورت اشتباه بودن این ادعا، این موضوع تاییدکننده دیگری مبنی بر تنوع بالای خارمریم در ایران است. در مطالعه Mohammadi et al. (2011) نیز دو رقم تجاری Budakalaszi و CN seeds در کنار اکوتیپ‌های ایرانی قرار گرفتند. تجزیه به مختصات اصلی اکوتیپ‏ها را به چهار گروه تقسیم نمود (شکل 3). این گروه‏بندی به جزء در مورد رقم مجارستان در تطابق با گروه‏بندی حاصل از دندوگرام بود.

شکل 2- دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه‏ای به روش UPGMA  با استفاده از ماتریس تشابه جاکارد.

Figure 2- Dendrogram based on UPGMA cluster analysis using Jaccard similarity matrix. 

جدول 4- محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC)، شاخص اطلاعاتی شانون و شاخص تنوع ژنی نی برای هر آغازگر.

Table 4- Polymorphic information content (PIC), Shannon’s information index and Nei’s gene diversity of each primer.

شکل 3- تجزیه به مختصات اصلی اکوتیپ‏های مختلف خارمریم (1-شوش1، 2-شاهدیه، 3-اهواز-هفتگل، 4-P100، 5-انگلستان1، 6-رستم‏آباد، 7-شوشتر، 8-منجیل، 9-استاندارد، 10-ندافیه، 11-اندیمشک، 12-هفت‏تپه، 13-اردبیل، 14-ملاثانی1، 15-ملاثانی2، 16-بهبهان1، 17-نجف‏آباد، 18-ملاثانی3، 19-انگلستان2، 20-رامهرمز، 21-بهبهان2، 22-شوش2 و 23-مجارستان).

Figure 3- Principal coordinates analysis of  S. marianum ecotypes ( 1 - Shush 1, 2 - Shahdyh, 3 - Ahvaz - Haftgol, 4-P100, 5 - England 1, 6 - Rostam Abad, 7 - Shushtar, 8 - Manjil 9 - Standard, 10 - Ndafyh, 11 - Andimeshk, 12 - Haft hills, 13 - Ardabil, 14 - Molasany 1, 15 - Molasany 2, 16 - Behbahan 1, 17 - Najaf Abad, 18 - Molasany 3, 19 - England 2, 20 - Ramhormuz, 21 - Behbahan 2, 22 - Shush 2, 23 -Hungary).

در سایر مطالعات در رابطه با تنوع مولکولی خارمریم انطباق خوبی بین گروه‏بندی حاصل از تجزیه به مختصات اصلی با دسته بندی حاصل از دندوگرام نیز مشاهده شده است (Mohammadi et al., 2011). ارزیابی تنوع در ژرم‏پلاسم‏ این گیاه گامی مهم در برنامه‏های بهنژادی و نیز مدیریت ژرم‏پلاسم به حساب می‏آید. اهداف اصلی بهنژادی خارمریم افزایش میزان سیلیمارین، افزایش عملکرد بذر، همزمانی در گلدهی و عدم ریزش می‌باشد (Alemardan et al., 2013). با توجه به اینکه تعداد ارقام اصلاح شده این گیاه در دنیا انگشت شمار می‌باشند، دستیابی به این صفات از طریق اکوتیپ‌های وحشی این گیاه امری اجتناب ناپذیر است. نشانگرهای مولکولی برای ارزیابی سریع ژرم‌پلاسم وحشی خارمریم به عنوان ابزار موثری در بهنژادی این گیاه به شمار می‌رود (Alemardan et al., 2013). با توجه به تعداد زیاد اکوتیپ‌های وحشی و مشکل بودن ارزیابی مورفولوژیک در این گیاه استفاده از نشانگرهای مولکولی عملیات ارزیابی ژرم‌پلاسم را تسریع می‌نماید. شکرپور و همکاران (Shokrpour et al, 2008) گزارش نمودند که نشانگر AFLP قادر است 40 درصد از تنوع موجود در ارتفاع ژنوتیپ‌های خارمریم پیش‌بینی نماید. نتایج این بررسی حاکی از تنوع ژنتیکی بالا در بین اکوتیپ‏های جمع‏آوری شده از مناطق زیستی مختلف کشور و همچنین بین اکوتیپ‌های مربوط به استان خوزستان بود. نتایج این پژوهش مبین وجود تنوع ژنتیکی مناسب در بین اکوتیپ‏های خارمریم مورد مطالعه جهت آغاز برنامه‏های بهنژادی است. همچنین با توجه به تنوع بالای این گیاه بررسی جامع‌تر اکوتیپ‌های مختلف این گیاه در سرتاسر ایران جهت جمع‏آوری و حفظ ژنوتیپ‏های متنوع ضروری است. همچنین چندشکلی قابل ملاحظه‏ در الگوهای باندی به دست آمده در این مطالعه، بیانگر مناسب بودن تکنیک ISSR به منظور بررسی تنوع ژنتیکی اکوتیپ‏های مورد مطالعه خارمریم می‏باشد. 

سپاسگزاری

بدین وسیله از موسسه تحقیقات جنگل‏ها و مراتع کشور به خاطر در اختیار قرار دادن بذور اکوتیپ‏های خارمریم تشکر می‏گردد.