اشباع نقشه ژنتیکی جو با استفاده از نشانگرهای رتروترنسپوزونی و جمعیت دابل هاپلوئیدی حاصل از تلاقی Clipper×Sahara

اشباع نقشه ژنتیکی جو با استفاده از نشانگرهای رتروترنسپوزونی و جمعیت دابل هاپلوئیدی حاصل از تلاقی Clipper×Sahara

فریبا قادری¹، بابک عبدالهی مندولکانی^2*، نادعلی بابائیان جلودار¹، بهزاد صادق­زاده³

¹ دانش آموخته کارشناسی ارشد اصلاح نباتات و استاد دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

² دانشیار گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه

³ دانشیار موسسه تحقیقات کشاورزی دیم کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مراغه       

تاریخ دریافت: 09/03/1395، تاریخ پذیرش: 23/07/1395

چکیده

نقشه­های ژنتیکی با تراکم و پوشش بالای ژنومی نقش بسزایی در تحقیقات پایه­ای و کاربردی ژنتیک ایفا می­کنند. در دهه­های اخیر با پیدایش نشانگرهای DNA تحول عظیمی در تهیه و اشباع نقشه­های ژنتیکی در گیاهان مختلف فراهم شده است. در این تحقیق از نشانگرهای رتروترنسپوزونی IRAP و REMAP و نشانگرهای ISSR جهت اشباع نقشه ژنتیکی جو در 149 فرد هاپلوئید مضاعف حاصل از تلاقی دو والد Clipper و Sahara استفاده شد. از چهارچوب نقشه ژنتیکی این جمعیت به عنوان نقشه پایه در تجزیه و تحلیل­های بعدی استفاده شد. از 120 آغازگر به­کار رفته، 6 آغازگر IRAP، 7 آغازگر REMAP و 3 آغازگر ISSR بین والدین چندشکلی نشان دادند که از این میان 11 باند چندشکل برای نشانگر IRAP، 8 باند چندشکل برای نشانگر REMAP و 4 باند چندشکل برای نشانگر ISSR بدست آمد. درکل 18 نشانگر چندشکل در جمعیت تفرق نشان دادند که از این تعداد 12 نشانگر به هفت گروه لینکاژی جو منتسب شدند. دو نشانگر از نسبت مندلی 1:1 انحراف نشان دادند. بیشترین تعداد نشانگرها به گروه لینکاژی دوم منتسب شدند. نشانگرهای رتروترنسپوزونی در این مطالعه به خوبی توانستند بخشی از نواحی خالی گروه­های لینکاژی 1، 3، 5 و 6 را در نقشه ژنتیکی جو پر کنند. نتایج تحقیق نشان داد که نشانگرهای رتروترنسپوزونی می­تواند بطور مؤثری جهت اشباع نقشه ژنتیکی جو مورد استفاده قرارگیرند.

کلمات کلیدی: جو، نشانگرهای IRAP، نقشه ژنتیکی، جمعیت دابل­هاپلوئید.

مقدمه

جو با نام علمی Hordeum vulgare L. یکی از سازگارترین و ساده­ترین زراعت­ها در جهان، ازجمله ایران است. این گیاه منبع غذایی بسیار مهمی در برخی از کشورها از جمله خاورمیانه و شمال آفریقا به­شمار می­رود. جو بیشتر برای خوراک دام و تهیه فرآورده­های تخمیری از جمله ماءالشعیر مورد استفاده قرار می­گیرد. در ایران زراعت این گیاه مقام دوم را بعد از گندم داراست (Banisadr, 1995). افزایش عملکرد و کیفیت محصول از اهداف اصلی برنامه­های به نژادی جو می­باشد که نیل به این اهداف نیازمند وجود تنوع کافی و داشتن اطلاعات از نحوه کنترل ژنتیکی صفات و شناسایی نواحی ژنومی مرتبط با تغییرات آن­ها می­باشد. تعیین نحوه توارث و محل ژن­های کنترل کننده این صفات از چالش­های اصلی برنامه­های اصلاح جو می­باشد (Li et al., 2005; Hassan et al., 2010). امروزه نقشه­های ژنتیکی با پوشش بالای ژنومی نقش بسزایی در تحقیقات پایه و کاربردی ژنتیک ایفا می­کنند. در جو نشانگرهای مولکولی به­طور گسترده­ای برای تهیه نقشه­های پیوستگی با پوشش ژنومی بالا، مکان یابی ژن­های کنترل کننده صفات کمّی، گزینش به کمک نشانگر (Marker assisted selection) و همسانه­سازی ژن­ها براساس نقشه استفاده می­شوند (Marquez-Cedillo et al., 2000; Hearnden et al., 2007; Sadeghzadeh et al., 2010; Heydari et al., 2014). پس از تهیه چهارچوب نقشه، لازم است که با استفاده از نشانگرهای چندشکل نقشه ژنتیکی اشباع شود. نشانگرهای ISSR (Inter-simple sequence repeat) و نشانگرهای مبتنی بر رتروترنسپوزون­ها از جمله REMAP (Retrotransposon-microsatellite amplification polymorphism) و IRAP (Inter-retrotransposon amplification polymorphism) به دلیل پوشش ژنومی بالا، تکرار پذیری زیاد و چندشکلی بالا، نشانگرهای ایده­آلی برای تهیه نقشه­های ژنتیکی و اشباع آنها، گزینش به کمک نشانگر، انگشت نگاری ژنتیکی، تجزیه و تحلیل شجره­ها و تعیین میزان تنوع ژنتیکی در ژرم پلاسم­های گیاهی هستند (Collard et al., 2005; Basirnia et al., 2014). در پژوهشی Waugh et al. (1997) اولین نشانگرهای رتروترنسپوزونی را معرفی کردند و نشان دادند که این نشانگرها برای تهیه نقشه­های ژنتیکی و درک بهتری از عملکرد ژن و تنظیم آن در گیاهان بسیار مفید هستند. رتروترنسپوزون­ها نواحی متحرک تکراری در ژنوم هستند که بر خلاف ترنسپوزون­ها کپی­های خود را از طریق ساختن cDNA در ژنوم درج می­کنند و خودشان از محل اولیه­شان در ژنوم بریده نمی­شوند. این نشانگرها تکرارپذیر و ساده بوده و چند­شکلی زیادی نشان می­دهند. در برخی مطالعات نشانگرهای مبتنی بر رتروترنسپوزون­ها، 25 درصد چندشکلی بیشتری در مقایسه با AFLP نشان داده­اند (Yu & Wise, 2000). توزیع تصادفی و تعداد متغیر کپی رتروترنسپوزون­ها در ژنوم، استفاده از آن­ها را به عنوان نشانگرهای مولکولی کارا میسّر می­سازد. همچنین بسیاری از مطالعات توالی­یابی ژنومی حاکی از توزیع و حضور وسیع رتروترنسپوزون­ها در نواحی یوکروماتینی و اطراف ژن­ها است، بنابراین شناسایی نشانگرهای بسیار نزدیک با ژن­های مهم زراعی با استفاده از این نشانگرها امکان­پذیر است (Kumar & Bennetzen, 1999). با استفاده از نشانگرهای رتروترنسپوزونی IRAP و REMAP، نقشه ژنتیکی اطراف ژن Yr15 (دخیل در مقاومت به زنگ زرد) در گندم دوروم اشباع و نشانگرهایی با فاصله کمتر از 2 سانتی مورگان با این ژن شناسایی شد (Abdollahi Mandoulakani et al., 2008). در جو بیشتر مطالعات در مورد خانواده­ی رتروترنسپوزونی Bare-1 انجام گرفته است (Suoniemi et al., 1997). نشانگرهای رتروترنسپوزونی IRAP و RAMAP مبتنی بر خانواده­های Bare1 و Sukkula (از جو) همراه با نشانگرهای ISSR و SSR برای تهیه نقشه ژنتیکی ژنوم گندم در Aegilops tauschii استفاده شد. با استفاده از 13 ترکیب آغازگری، 80 نشانگر رتروترنسپوزونی به این نقشه افزوده شد. در این مطالعه مشخص شد که Bare1 به وفور در نزدیکی SSRها دیده می­شود (Boyko et al., 2001). در مکان­یابی ژن DW6 در یولاف با استفاده از نشانگرهای IRAP، REMAP و RAPD، دو نشانگر REMAP و IRAP در فاصله 2/5 و 6/12 سانتی مورگان این ژن شناسایی و به نشانگرهای هم­بارز SNP تبدیل شدند Tanhuanpaa et al., 2006)). با توجه به شناسایی رتروترنسپوزون­ها در ژنوم جو و گیاهان نزدیک به آن و کارایی بالای نشانگرهای مبتنی بر این عناصر، تحقیقی با اهداف ذیل پایه گذاری و اجرا گردید: 1) بررسی الگوی توزیع رتروترنسپوزون­های LTR دار در ژنوم جو و 2) اشباع نقشه ژنتیکی جو با نشانگرهای IRAP و REMAP مبتنی بر این خانواده­های رتروترنسپوزونی.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی شامل 149 لاین هاپلوئید مضاعف جو، حاصل از تلاقی ارقام Clipper (والد مادری) و Sahara3771 (والد پدری) می­باشد. رقم Clipper دارای تیپ رشدی بهاری و ناکارآمد در جذب Zn و دو ردیفه می­باشد که به عنوان یک رقم زراعی در استرالیا کشت می­شود. Sahara3771 رقم بومی الجزایر دارای تیپ رشدی زمستانی، کارآمد در جذب Zn و شش ردیفه می­باشد. این جمعیت به روش H. bolbosum (Islam & Shepherd, 1981) در دانشگاه ادلاید استرالیا تهیه شده و توسط دکتر صادق­زاده از مؤسسه تحقیقات دیم کشور فراهم شد (Sadeghzadeh, 2008). بذور ارقام والدینی و افراد جمعیت به تعداد 4 بذر در گلدان­های پلاستیکی کشت شدند و در مرحله دو برگی از هرگلدان به میزان 2/0 گرم برگ جوان جدا و استخراج DNA به روش CTAB انجام شد (Ausubel et al., 1995). کمیت و کیفیت DNA ژنومی با روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل 8/0 درصد آگارز تعیین شد و نمونه­ها به غلظت 20 نانوگرم در میکرولیتر رقیق و در واکنش­های زنجیره­ای پلیمراز استفاده شدند.

واکنش­های PCR و چرخه دمایی آن، الکتروفورز و رنگ­آمیزی محصولات PCR مربوط به هر سه نشانگر طبق روش Abdollahi Mandoulakani et al., (2012) انجام گرفت. در این مطالعه در کل 120 آغازگر شامل 21 آغازگر ISSR، 65 آغازگر REMAP و 34 آغازگر IRAP استفاده شد. واکنش زنجیره­ای پلی­مراز در حجم 20 میکرولیتر در دستگاه ترموسایکلر Bio-RAD (شرکت BioRAD، آمریکا) انجام­شد.

الگوی نواری نشانگرهای چند شکل در جمعیت به صورت A برای افراد مشابه والد Clipper و B برای افراد مشابه والد Sahara3771 امتیازدهی شدند. داده­های گمشده با علامت - مشخص گردید. به­منظور بررسی تبعیت نشانگرها از نسبت 1:1 مندلی، آزمون 2χ با نرم­افزار SPSS نسخه 20 انجام شد. نشانگرهایی که از نسبت 1:1 انحراف نشان دادند (2 نشانگر) در مرحله تهیه نقشه استفاده نشدند. تعیین گروه­های لینکاژی با در نظر گفتن میزان LOD برابر 3 و لحاظ کردن حداکثر فاصله بین دو نشانگر مجاور برابر 50 سانتی­مورگان، توسط نرم­افزار  JoinMapنسخه 3 انجام گرفت و با استفاده از نرم افزار MapChart نسخه 1/2 گروه­های لینکاژی رسم شد.

نتایج و بحث

در این بررسی 34 آغازگر IRAP مورد استفاده قرار گرفت. از بین آغازگرهای IRAP، سه آغازگر ترکیبی و سه آغازگر منفرد باندهای چندشکل بین والدین نشان دادند. دامنه باندهای تولید شده از 200 تا 2000 جفت باز متغیر بود (شکل 1). آغازگر منفرد مبتنی بر رتروترنسپوزون Sukkula دو باند چند شکل نشان داد که نشانگر فعالیت ادغامی قابل توجه این خانواده رتروترنسپوزونی در ژنوم جو می­باشد. تعداد زیاد کپی و فعالیت بالای این خانواده رتروترنسپوزونی در گندم و سایر غلات نیز گزارش شده است (Nasri et al., 2013).

در این مطالعه سه آغازگر ترکیبی 5LTR-Bare1، LTR725-LTR455 و 5LTR- LTR2106، هرکدام به ترتیب 4، 2 و 1 باند چند­شکل تولید نمودند. تعداد زیاد باندهای چند شکل تولید شده توسط خانواده رتروترنسپوزونی Bare1 و خانوادهای LTR دار، بیانگر تعداد زیاد و فعالیت ادغامی قابل توجه این رتروترنسپوزون­ها در ژنوم جو می­باشد. در این مطالعه آغازگرهای مبتنی بر رتروترنسپوزونهای LTR­ دار هم به صورت تکی و هم به صورت ترکیبی باند چند شکل تولید نمودند بنابراین می­توان بیان نمود که این عناصر رتروترنسپوزونی در ژنوم جو در نزدیکی هم و یا در داخل یکدیگر به صورت آشیانه­ای ادغام شده­اند.

شکل 1- الگوی باندی چند­شکل بین والدین Clipper (c) و Sahara (s)، a: 5LTR-440، b: Sukkula-857، c: 825-440.

Figure 1- Polymorphic banding pattern between parents Clipper (c) and Sahara (s), a: 5LTR-440, b: Sukula-857, c: 825-440.

مطالعات قبلی نیز گزارش کردند که رتروترنسپوزون­های LTR دار چندشکلی ادغامی بالایی در گونه­های مختلف گیاهی بویژه غلات نشان می­دهند و می­توانند به آسانی در گونه­ها و جنس­های نزدیک و حتی گاهی بین خانواده­های گیاهی نزدیک به عنوان نشانگرهای کارا مورد استفاده قرارگیرند (Lou and Chen 2007; Kalendar et al., 2011; Nasri et al., 2013). همچنین حرکت و ادغام خانواده­های مختلف رتروترنسپوزونی از جمله Bare1 در ژنوم جو نیز گزارش شده است (Shirasu et al., 2000). بطور کلی درصد بالای چند­شکلی شناسایی شده توسط آغازگرهای IRAP (75%) و REMAP (٪66/16)، در این مطالعه نشان دهنده فعالیت بالای خانواده­های رتروترنسپوزونی مورد استفاده در ژنوم جو می­باشد. در این تحقیق اکثر خانواده­های رتروترنسپوزونی مورد استفاده در واکنش­های REMAP باندهای چندشکل تولید کردند که بیانگر حضور و ادغام خانواده­های رتروترنسپوزونی مورد مطالعه در نزدیکی ریزماهواره­ها در ژنوم جو می­باشد. درج خانواده­های رتروترنسپوزونی در نزدیکی توالی­های ریزماهواره­ای در گیاهان مختلف مانند مرکبات (Biswas et al., 2010) و دیگر غلات مانند گندم گزارش شده است (Boyko et al., 2001). آغازگرهای مبتنی بر خانواده­های رتروترنسپوزونی 5LTR وBare1 هم در واکنش­های IRAP و هم در واکنش­های REMAP (در ترکیب با آغازگرهای ISSR 818، 440  و 808 )، باندهای چندشکل تولید کردند. بنابراین احتمالا این خانواده­های رتروترنسپوزونی و سایر رتروترنسپوزون­های LTR در سازماندهی و تکامل ژنوم جو نقش اساسی دارند (Manninen et al., 2000). بررسی­های سیتولوژی نشان داده که Bare1 به صورت همگن در سراسر بازوهای کروموزومی جو پراکنده است اما در مناطق سانترومرها، تلومرها و ناحیه سازماندهی هستکی وجود ندارد (Manninen et al., 2000). به طور کلی نتایج این تحقیق نشان داد که خانواده­های رتروترنسپوزونی LTR هم به حالت منفرد و هم به حالت آشیانه­ای در ژنوم جو ادغام شده­اند. همچنین این عناصر دارای فعالیت انتقالی و چندشکلی زیادی در ژنوم جو می­باشند و می­توان از نشانگرهای IRAP و REMAP مبتنی بر این عناصر در مطالعات ژنتیکی مانند ارزیابی تنوع ژنتیکی، بررسی روابط تکاملی و تهیه نقشه­های ژنتیکی و مکان­یابی ژن­ها استفاده کرد.

کارایی نشانگرهای رتروترنسپوزونی در شناسایی چندشکلی

از بین آغازگرهای IRAP مورد استفاده، 3 آغازگر ترکیبی و 3 آغازگر منفرد به ترتیب 7  و 4 باند چندشکل تولید کردند که برای بررسی چندشکلی 149 فرد از جمعیت دابل­هاپلوئیدی حاصل از تلاقی دو والد Clipper×Sahara مورد استفاده قرار گرفتند. در کل 75 درصد پوشش­دهی گروه­های لینکاژی به آغازگرهای IRAP اختصاص یافت. بعد از گروه بندی داده­ها از بین 11 نشانگرIRAP، 9 نشانگر به گروه­های لینکاژی در جمعیت مورد بررسی منتسب شدند (جدول 1). از بین آغازگرهای منفرد IRAP، تنها آغازگر Sukkula دو باند چند شکل تولید کرد که بعد از امتیاز­دهی باندها و رسم گروه­های لینکاژی فقط یک باند چند شکل حاصل روی گروه لینکاژی 3 جو قرار گرفت. در بین آغازگرهای ترکیبی IRAP، آغازگر Bare1-5LTR با تکثیر 4 باند چندشکل بیشترین میزان چندشکلی را ایجاد نمود (شکل 2). 69 ترکیب آغازگری REMAP روی دو والد مورد آزمون قرار گرفت که از این تعداد 60 آغازگر باند واضح ولی مونومورف و تنها 3 ترکیب آغازگری REMAP باند چندشکل در جمعیت ایجاد نمود (80/5 درصد)، (جدول 1، شکل 3). بعد از انجام آنالیزهای آماری 2 نشانگر REMAP روی گروه­های لینکاژی قرار گرفتند و دو نشانگر دیگر به هیچ گروه لینکاژی منتسب نشدند. نشانگرهای REMAP، 66/16 درصد از فضای خالی نقشه RFLP را پوشش دادند (جدول 1)، از بین این نشانگرها یک نشانگر از نسبت مندلی 1:1 انحراف نشان داد که به سمت والد Sahara اریب بود. این تحقیق اولین گزارش در مورد اشباع نقشه ژنتیکی جو با نشانگرهای IRAP و REMAP می­باشد. در این تحقیق خانواده­های مختلف رتروترنسپوزونی به عنوان نشانگر مولکولی کارایی بالایی نشان دادند. بر اساس گزارشات موجود میزان چندشکلی در غلات متفاوت است. این میزان در برنج 6/26، ذرت 48، گندم ماکارونی 8/23، گندم نان 8/12 و در جو 3/11 درصد گزارش شده است (Langridge et al., 2001).  

شکل 2- الگوی باندی آغازگر SukulaL روی والدها و برخی افراد جمعیت هاپلوئید مضاعف حاصل از تلاقی Clipper×Sahara.

Figure 2- Banding pattern amplified by Sukkula primer on parents and some individuals from doubled haploid population derived from a cross of Clipper×Sahara.

شکل 3- الگوی باندی آغازگر 5LTR-440 روی والدها و برخی افراد جمعیت هاپلوئید مضاعف حاصل از تلاقی Clipper×Sahara.

Figure 3- Banding pattern amplified by 5LTR-440 primer on parents and some individual of doubled haploid population derived from a cross Clipper×Sahara.

این نتایج نشان می­دهد که درصد چندشکلی در جو پایین است. میزان چندشکلی حاصل از این مطالعه (15%) کمی بالاتر از سایر گزارشات مربوط به بررسی  چندشکلی جو می­باشد که احتمالا دلیلی بر کارایی بالای نشانگرهای رتروترنسپوزونی برای شناسایی چندشکلی در این گیاه می­باشد. در مطالعات قبلی نیز گزارش شده که استفاده از نشانگرهای رتروترنسپوزونی در اصلاح جو همانند برنج مفید بوده است (Castelo et al., 2007). در پژوهشی Kalendar et al.  (2010) نشانگرهای IRAP مبتنی بر Bare1 را در گونه­های مختلف جو، تریتیکوم و آژیلوپس استفاده نمودند و نشان دادند که این خانواده رتروترنسپوزونی در این گونه­ها چندشکل و فعال می­باشند. همچنین Carvalho et al. (2010) با استفاده از نشانگرهای رتروترنسپوزونی مبتنی برBare1 ، چند­شکلی بالایی را در گندم شناسایی نمودند. در آژیلوپس نیز با استفاده از نشانگرهای مبتنی بر همین رتروترنسپوزون نتیجه مشابهی بدست آمد (Saeidi et al., 2008). از کل آغازگرهای ISSR به کار رفته در این تحقیق، 2 آغازگر یعنی 76/11 درصد آغازگرها باند چندشکل در جمعیت تولید کردند. بقیه آغازگرها الگوی باندی مونومورف بین والدین تولید کردند. با ایجاد گروه­های لینکاژی، از بین سه نشانگر  ISSR یک نشانگر روی گروه لینکاژی 6 جو قرار گرفت. در نهایت در نقشه اشباع شده جمعیت مورد بررسی، 33/8  درصد فضای خالی پرشده نقشه به نشانگرهای ISSR اختصاص داشت. از بین نشانگرهای ISSR هم یک نشانگر از نسبت 1:1 مندلی انحراف نشان داد. در مجموع دو نشانگر از نسبت 1:1 مندلی تبعیت نکردند که یکی ازنشانگرها به سمت والد  Clipper اریب بود (جدول 1). تجزیه و تحلیل داده­ها نشان داد که از بین نشانگرهای مورد استفاده، یک نشانگر از هر کدام از نشانگرهای REMAP و ISSR، در مجموع دو نشانگر یعنی 11/11 درصد از نشانگرها  از نسبت 1:1 مندلی انحراف معنی داری نشان دادند (P≤0.05).  میزان انحراف بدست آمده در مقایسه با میزان انحراف از نسبت مندلی توسط نشانگرهای AFLP در جو (6% توسط Becker et al., 1995) و RFLP در جو (10% توسطHeun et al., 1991 ) بیشتر است اما در مقایسه با میزان انحراف بدست آمده از نشانگرهای RFLP در تحقیق Kleinhofs et al. (1993) در جمعیت مشابه این جمعیت دابل ­هاپلوئیدی (3% با P≤0.01 و 14% با P≤0.05) کمتر است. میزان انحراف از نسبت مندلی بدست آمده در این تحقیق با نتایج گزارش شده از غلات دیگر مانند برنج (22% و 33% توسطXu et al., 1997 ) و گندم نان (2/18% توسطRahimmalek et al., 2007 ) نیز نزدیک است.

در این مطالعه نشانگرهای IRAP در مقایسه با نشانگرهای REMAP و ISSR میزان چندشکلی بیشتری نشان دادند. در مقایسه میزان چندشکلی و توانایی تمایز نشانگرهای RAPD، ISSR، IRAP و REMAP در مرکبات، سطوح بالایی از چند­شکلی برای هر چهار سیستم نشانگری گزارش شد. همچنین در تجزیه و تحلیل گروه­های لینکاژی طبق نتایج، نشانگرهای IRAP و REMAP به عنوان نشانگرهای قابل اعتمادی برای شناسایی ژرم­پلاسم مرکبات و صدور گواهینامه­های گیاهی و تهیه نقشه­های ژنتیکی معرفی شدند. در مقایسه میانگین ارزش چندشکلی حاصل از توزیع رتروترنسپوزون­ها و نشانگرهای ISSR و RAPD در ژنوم مرکبات، بیشترین و کمترین میانگین ارزش چندشکلی، به ترتیب مربوط به نشانگرهای REMAP (94/5) و RAPD (48/4) بود (Biswas et al., 2010). در مطالعه­ای که به منظور ارزیابی رتروترنسپوزون­ها به عنوان نشانگرهای ملکولی در گندم انجام شد این نشانگرها کارایی بالایی نشان دادند. بیش از 90 درصد آغازگرهای رتروترنسپوزونی، الگوی واضح و قابل امتیازدهی تولید کردند. اکثر آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق بر اساس نواحی محفوظ LTR طراحی شده بودند (Abdollahi Mandoulakani et al., 2009). در این مطالعه نیز بیشترین میزان چندشکلی به آغازگرهای رتروترنسپوزونی اختصاص داشت، ولی تعداد زیادی از آغازگرهای مورد استفاده باند چندشکل بین والدین نشان ندادند. میانگین چند شکلی بدست آمده در این تحقیق (15%) با 6 آغازگر ترکیبی کمی پایین­تر از نتایج گزارش شده توسط Waugh et al. (1997) در جمعیت Blenhim × E224/3 جو (26%) بود. شاید دلیل تفاوت نتایج حاصل از دو مطالعه، سیستمهای نشانگری متفاوتی باشد که در دو پژوهش استفاده شده است.

توزیع نشانگرها در گروههای لینکاژی

از بین 120 آغازگر استفاده شده، 5 نشانگر ISSR، 12 نشانگر IRAP و 9 نشانگر REMAP در بین والدین چند­شکل بودند که از این بین 18 نشانگر درجمعیت تفرق نشان دادند (شکل 3)،  از بین 18 نشانگر چندشکل بدست آمده، 12 نشانگر IRAP، REMAP و ISSR به 393 نشانگر RFLP نقشه­ی پیوستگی این جمعیت اضافه شدند (جدول2 ).

جدول 1- تعداد و درصد چندشکلی سیستم­های نشانگری مورد استفاده.

Table 1- Number and polymorphism percentage of the used marker systems.

^*: درصد اول، درصد چند شکلی آغازگرهای هر سیستم نشانگری از مجموع آغازگرهای به کار رفته همان سیستم می­باشد. درصد داخل پرانتز، درصد پوشش گروه­های لینکاژی توسط آغازگرهای هر سیستم می­باشد.

نشانگرها در چهار گروه لینکاژی 1، 3، 5 و 6 توزیع شدند و بیشترین نشانگرهای چندشکل روی گروه لینکاژی 6 قرار گرفتند. در گروه­های لینکاژی 2، 4 و 7 هیچ نشانگری قرار نگرفت. نشانگرهای IR-1B، IR-1C و IR-1D با اختلاف 1/0 سانتی ­مورگان در مجاورت یکدیگر روی گروه لینکاژی 6 قرار گرفتند ولی بقیه نشانگرها با فاصله­های بیشتری از هم در گروه­های لینکاژی توزیع شدند. براساس نتایج، نشانگرهای حاصل از این مطالعه با قرار گرفتن در میان نشانگرهای نقشه­ پایه، فضاهای خالی روی گروه­های لینکاژی را به خوبی پوشش دادند. در نقشه لینکاژی پایه حاصل از این جمعیت، در گروه لینکاژی 6 نشانگرهای IR-1B، IR-1C و IR-1D بین نشانگرهای Bmag0807 و Bmac0144، نشانگر  IR-3 بین نشانگرهای psr627 و ksuA3b و نشانگرهایISSR-8  و RE-4 در ابتدای گروه لینکاژی 6 قرار گرفتند.

جدول 2- نام، کد و موقعیت آغازگرهای چندشکل مورد استفاده در جمعیت هاپلوئید مضاعف حاصل از تلاقی دو والد Clipper×Sahara.

Table 2- Name, code and position of the polymorphic markers used in doubled haploid population derived from a cross of Clipper×Sahara.

در گروه لینکاژی 5 نشانگر IR-7A با قرارگیری بین نشانگرهای EBmac0854 و GBM1399 فاصله زیاد این دو نشانگر را پوشش داد. در گروه لینکاژی 3 نشانگر  IR-10بین نشانگرهای Bmag0877 و wg110، نشانگر  IR-9B بین  Bmag0606و Bmag0363 و نشانگر  IR-11 فضای خالی بین دو نشانگر GBM5047 و GV1 را پر کرد و در گروه لینکاژی یک نشانگر RE-2B فضای خالی بین نشانگرهای bcd402 و  ksuD14 را پوشش داد (شکل 5).

یکی از مواردی که از اشباع نقشه ژنتیکی گندم با استفاده از نشاگرهای AFLP بدست آمد عدم توزیع یکنواخت نشانگرها در طول ژنوم بود که دلیل توزیع غیر یکنواخت این نشانگر به مکانیسم­­های ایجاد چندشکلی در این نشانگر، نسبت داده می­شود. تجمع نشانگرهای AFLP و RFLP در نواحی سانترومری شاید به دلیل کاهش یا ممانعت از نوترکیبی در این مناطق باشد (Rahimmalek et al., 2007) باتوجه به توزیع رتروترنسپوزن­ها در سرتاسر کروموزوم، قابلیت انتقال آنها در طول ژنوم و قرارگیری آن­ها در نواحی هتروکروماتین کروموزوم (Manninen et al., 2000) می­توان از این نشانگرها به طور جداگانه یا ترکیبی جهت نقشه­یابی کامل ژنوم استفاده کرد (Castelo et al., 2007).

نشانگرهای نزدیک به QTLهای کنترل کننده صفات روی یک نقشه با تراکم نشانگری بالا، می­تواند وسیله قدرتمندی برای گزینش به وسیله نشانگر مولکولی ­باشد. تهیه نقشه­های ژنتیکی با تراکم بالای نشانگر و توزیع مناسب در مناطق با سطح نوترکیبی بالا به راحتی امکان­پذیر است ولی در مناطقی که نوترکیبی کاهش می­یابد، استفاده از جمعیت بزرگ­تر برای افزایش دقت نقشه ژنتیکی ضروری می­باشد (Tanksley et al., 1989). بنابراین ضروری به­نظر می­رسد که نواحی با تراکم کم نشانگر توسط نشانگرهای چندشکل تا حد امکان پوشش داده شود تا مکان­یابی ژن­ها با سهولت و دقت بیشتری صورت پذیرد. با توجه به این­که جو گیاهی خودگشن است و میزان دگرگشنی کمی دارد و نظر به این­که جمعیت مورد استفاده در این تحقیق جمعیت هاپلوئید مضاعف با هموزیگوسیتی بالا می­باشد، از این­رو امکان مطالعات تکراردار و بررسی اثر متقابل محیط و مکان­های کنترل کننده صفات کمی با این جمعیت امکان­پذیر می­باشد پس به منظور تعیین موقعیت ژن­های صفات کمی و سایر ژن­های مفید، اشباع هرچه بیشتر این نقشه لازم به­نظر می­رسد.

شکل 5- تعیین گروه­های لینکاژی جو در جمعیت دابل هاپلوئیدی حاصل از تلاقی Clipper×Sahara، نشانگرهایی که به نقشه اضافه شدند با خطوط قرمز در شکل مشخص شدند و گروه­های لینکاژی 2، 3، 5 و 7  که نشانگرهای شناسایی شده در این تحقیق به آنها منتسب شدند در شکل نشان شده است. 

Figure 5- Determination of barley linkage groups in doubled haploid population derived from a cross of Clipper×Sahara. New markers, highlighted with red color, assigned to the linkage groups 2, 3, 5 and 7.