نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 استادیار گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.
2 دانش آموخته کارشناسی ارشد ژنتیک و اصلاح دام، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.
3 استاد گروه اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.
4 استاد گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران.
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
The aim of this study was to map loci affecting live weight and body size in Lori-Bakhtiari sheep and identification of biomarkers linked to growth rate in sheep. Quantitative trait loci (QTL) linkage analysis in a Lori-Bakhtiari sheep population was conducted using the regression-based interval mapping method. The mapping population consisted of 162 animals related to 5 paternal half families. Phenotypic data were measurements of birth weight (BW), weight at one month of age (W1), weaning weight (WW), weight at six months of age (W6), chest circumference (HG6), body length (BL6), wither height at six months of age (HT6), weight at nine months of age (W9) and yearling weight (W12). Five sires and their progeny were genotyped for microsatellite markers in a candidate region on sheep chromosome 1. Data were analyzed in two phases, individual family analysis and combined family’s analysis using a single-QTL model. Analysis based on individual families revealed QTL related to W1 (210.6 cM), near INRA011 marker segregating in the second family. In the third family, QTL affecting W1 and WW were identified at 252.6 and 223.6 cM, nearby MCM137 and LSCV105 markers, respectively. In addition, in the fourth family, a QTL underlying W1 was detected at 256.6 cM near LSCV105 marker. Combined analysis of all the families resulted to the identification of a QTL associated with W1 at position 254.6 cM relative to the centromere near the LSCV105 marker. There were two strong candidate genes close to the location of the detected QTL, the transferrin and PIT1 genes, thus these genes may account for the observed QTL effects for growth traits in Lori-Bakhtiari sheep.
کلیدواژه‌ها [English]
ابراهیم اسدی خشویی1، رویا حریت2، سعداله هوشمند3، علی اسمعیلی زاده کشکوئیه4*
1 استادیار گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.
2 دانش آموخته کارشناسی ارشد ژنتیک و اصلاح دام، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.
3 استاد گروه اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.
4 استاد گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران.
تاریخ دریافت: 12/04/1396، تاریخ پذیرش: 17/08/1396
چکیده
هدف از انجام این پژوهش، نقشه یابی جایگاههای ژنی موثر بر وزن زنده و اندازه بدن و شناسایی نشانگرهای زیستی مهم مرتبط با سرعت رشد در گوسفند نژاد لری بختیاری بود. آنالیز نواحی ژنومی موثر بر صفات کمی مورد بررسی (QTL) در یک جمعیت گوسفند نژاد لری بختیاری با استفاده از تحلیل پیوستگی به روش مکانیابی درون فاصلهای مبتنی بر رگرسیون انجام گردید. جمعیت مورد بررسی شامل 162 حیوان مربوط به 5 خانواده ناتنی پدری بود. دادههای فنوتیپی شامل اندازهگیریهای وزن تولد (BW)، وزن یکماهگی (W1)، وزن شیرگیری (WW)، وزن شش ماهگی (W6)، دور سینه در شش ماهگی (HG6)، طول بدن در شش ماهگی (BL6)، ارتفاع جدوگاه در شش ماهگی (HT6)، وزن نه ماهگی (W9) و وزن دوازده ماهگی (W12) بودند. 5 والد نر و نتاج آنها برای شش نشانگر ریزماهواره تعیین ژنوتیپ شدند. دادهها در دو مرحله، آنالیز هر خانواده به صورت انفرادی و آنالیز توام تمام خانوادهها به کمک یک مدل تک QTLتجزیه و تحلیل شدند. براساس آنالیزهای انفرادی خانوادهها، QTL مرتبط با صفت وزن یک ماهگی (روی کروموزوم شماره 1 در موقعیت 6/210 سانتی مورگان) در نزدیکی پرایمر INRA011در خانواده دوم شناسایی گردید. در خانوادهی سوم نیز QTL های مرتبط با صفات وزن یک ماهگی و وزن شیرگیری به ترتیب در موقعیت های 6/252 و 6/223 سانتی مورگان در نزدیکی نشانگرهای LSCV105 و MCM137 شناسایی شدند. همچنین در خانواده چهارم نیز یک QTL موثر بر صفت وزن یک ماهگی در موقعیت 6/254 سانتی مورگان در نزدیکی نشانگر LSCV105شناسایی شد. با انجام آنالیز به صورت همزمان بر روی تمام خانوادهها یک QTL مرتبط با صفت وزن یک ماهگی در موقعیت 6/254 سانتی مورگان در نزدیکی نشانگر LSCV105شناسایی شد. با توجه به آن که ژن های ترانسفرین و PIT1 بر روی کروموزوم 1 قرار دارند این دو ژن کاندیداهای قوی برای اثرات مشاهده شدهی QTL برای صفات رشد در این نژاد هستند.
کلمات کلیدی: صفات رشد، گوسفند ، خانوادهی ناتنی، نشانگرهای ریزماهواره، QTL.
مقدمه
بالغ بر 26 نژاد گوسفند در ایران وجود دارد که با مناطق مختلف سازگار شدهاند (Mohammadabadi and Sattai Mokhtari, 2013; Zamani et al., 2015; Khodabakhshzadeh et al., 2016b). در حال حاضر، تولید گوشت مهمترین دلیل پرورش گوسفند در ایران است و تولیدات دیگر مانند پشم، شیر و پوست در درجات بعدی اهمیت قرار دارند (Mohammadabadi and Sattai Mokhtari, 2013; Zamani et al., 2015; Khodabakhshzadeh et al., 2016b). هم اکنون نیز نرخ رشد بالای جمعیت در کشور اهمیت تولید و عرضه گوشت قرمز را دو چندان کرده است، همچنین به دلیل پائین بودن بازده تولید، به کارگیری حیواناتی با ظرفیت ژنتیکی بالا در افزایش تولیدات دامی اهمیت به سزایی دارد. عوامل بسیاری در بهبود تولید دامها مؤثر است که شامل تغذیه، مدیریت، بهداشت و توان ژنتیکی دامها میباشد. از میان تمام عوامل موثر بر بهبود تولید، توان ژنتیکی دام تنها عاملی است که علاوه بر نسل جاری در نسل های بعد هم بر تولید تاثیر دارد. گوسفند لری- بختیاری یکی از سنگین وزنترین نژادهای گوسفند بومی ایران میباشد. در این نژاد، رشد به عنوان مهمترین صفت اقتصادی مطرح است و وزن شیرگیری و وزن 6 ماهگی به عنوان مهمترین معیارهای انتخاب در این نژاد به کار گرفته شده است (1999 Asadi-khoshoei). اما فرآیند انتخاب اغلب در این نژاد فقط بر مبنای اطلاعات فنوتیپی و بدون داشتن تفاوتهای ژنتیکی افراد در سطح DNA آنها صورت گرفته است. هزینه زیاد یا مشکل بودن رکوردبرداری برای برخی از صفات اقتصادی، عامل محدودکننده در بهبود ژنتیکی آنها با استفاده از روشهای سنتی اصلاحنژاد میباشد که فقط از دادههای فنوتیپی برای ارزیابی ژنتیکی حیوانات استفاده میکنند،. صفات مرتبط با رشد دارای ماهیت کمی بوده و به نظر میرسد که بوسیله چندین ژن، که هر کدام اثرات افزایشی نسبتاً کوچکی روی فنوتیپ دارند کنترل میشوند (Falconer and Mackay, 1996).
فنآوریهای مولکولی به شکل نشانگرهایی که تفاوت افراد را در سطح DNA آنها نشان میدهند، میتوانند نقش مهمی در بهبود ژنتیکی صفات دارای مکانیسم توارثی پیچیده از طریق انتخاب به کمک نشانگر یا ژن داشته باشند (Esmailizadeh et al, 2008). از طرفی استفاده از نشانگرهای ژنتیکی در انتخاب و اصلاح نژاد به طور مهیجی پیشرفت ژنتیکی را تسریع میکند (Mousavizadeh et al., 2009; Javanmard et al., 2008) و مطالعه ساختار ژنتیکی نژادهای بومی برای حفاظت از منابع ژنتیکی لازم و ضروری است (Khodabakhshzadeh et al., 2016a). در حال حاضر، تولید گوشت مهمترین دلیل پرورش گوسفند در ایران است و تولیدات دیگر مانند پشم، شیر و پوست در درجات بعدی اهمیت قرار دارند (Mohammadabadi and Sattai Mokhtari, 2013). به طور کلی در بیشترکشورهای جهان هدف از اصلاح نژاد گوسفند سودآوری از طریق بهبود یک یا چند صفت اقتصادی در جامعه است (Soufy et al., 2009). این بهبود میتواند از طریق انتخاب گوسفندان برتر به عنوان والدین نسل آینده بر اساس شایستگی ژنتیکی آنها برای صفات مورد نظر صورت گیرد (Khodabakhshzadeh et al., 2015a; Khodabakhshzadeh et al., 2016a). همگام با افزایش پیشرفتهای ژنتیکی، حفظ تنوع ژنتیکی یک جمعیت برای اطمینان از پاسخ به انتخاب بلند مدت، یک وظیفه مهم برنامههای اصلاح نژادی است (Khodabakhshzadeh et al., 2015a). برنامههای اصلاح نژادی بیشتر در جهت بهبود وضعیت تولیدی حیوانات اهلی عمل میکنندکه توفیق این برنامهها به مقدار تنوع ژنتیکی موجود در گلهها بستگی دارد (Khodabakhshzadeh et al., 2015a).
در پژوهشی، نقشهیابیQTL برای نرخ رشد و وزن بدن از زمان تولد تا 98 هفتگی در گوسفندان یک خانواده با 510 نتاج حاصل از تلاقی برگشتی آواسی× مرینوس انجام و 54 QTLمؤثر بر صفت رشد و وزن بدن در سنین مختلف روی کل ژنوم گوسفند شناسایی شده اند (Raadsma et al, 2009). دو QTL مؤثر بر وزن بدن در 43 هفتگی و 83 هفتگی به ترتیب در موقعیتهای 117 و 357 سانتی مورگان روی کروموزوم 1 به ترتیب در نزدیکی نشانگرهای BM4129 و BMS1789 شناسایی شده اند، همچنین در این بررسی سه QTL مؤثر بر سرعت رشد از تولد تا 43 هفتگی، 43 هفتگی تا 56 هفتگی و 56 هفتگی تا 83 هفتگی به ترتیب در موقعیتهای 118، 357 و 357 سانتی مورگان روی کروموزوم یک به ترتیب در نزدیکی نشانگرهای BM4129و BMS1789شناسایی کردند (Raadsma, 2009). از آنجایی که در پژوهش های پیشین بر روی نژادهای خارجی، مشخص شده است که کروموزوم 1 گوسفند حاوی ژن های ترانسفرین و PIT1 است (Kmiec, 1999)، لذا این کروموزوم برای مطالعهی صفات موثر بر رشد در گوسفند ایرانی نژاد لری- بختیاری انتخاب گردید. با این وجود، در زمینه شناسایی QTL مؤثر بر رشد گوسفندان بومی ایران گزارش های زیادی در دسترس نیست. در صورت شناسایی جایگاههای ژنی مرتبط با صفات کمی، میتوان از روشهای نوین انتخاب ژنتیکی بر مبنای تفاوتهای افراد در سطح DNA آنها استفاده نمود. لذا هدف اصلی این پژوهش، بررسی ارتباط نشانگرهای مولکولی (ریزماهواره) موجود در کروموزوم شماره 1 با وزن تولد و برخی صفات بعد از تولد در گوسفند نژاد لری بختیاری بود.
مواد و روشها
طرح آزمایشی مورد استفاده در پژوهش کنونی، یک طرح ناتنی پدری بود. بدین منظور، تعداد پنج خانواده ناتنی پدری مجموعاً شامل 162 حیوان از ایستگاه پرورش و اصلاح نژاد گوسفند لری- بختیاری واقع در 15 کیلومتری شهرکرد انتخاب گردیدند. دادههای فنوتیپی شامل اندازهگیریهای وزن تولد (BW)، وزن یک ماهگی (W1)، وزن شیرگیری (WW)، وزن شش ماهگی (W6)، دور سینه در شش ماهگی (HG6)، طول بدن در شش ماهگی (BL6)، ارتفاع جدوگاه در شش ماهگی (HT6)، وزن نه ماهگی (W9) و وزن دوازده ماهگی (W12) بودند. تعداد نتاج، میانگین و انحراف معیار فنوتیپی صفات مورد بررسی به تفکیک خانواده های ناتنی در جدول 1 ارائه شدهاند.
جدول 1- میانگین(انحراف معیار فنوتیپی) صفات مورد مطالعه و تعداد نتاج به تفکیک خانواده ناتنی.
Table 1- Traits mean (phenotypic standard deviation) and number of progeny per half-sib family.
|
صفت trait |
خانواده ناتنیhalf-sib family |
کلTotal |
||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
||
|
BW (kg) |
(0.77)5.24 |
(0.95)4.93 |
(0.71)5.06 |
(0.78)5.09 |
(0.99)4.75 |
(0.84)5.01 |
|
W1 (kg) |
13.29(2.79) |
11.99(3.1) |
12.58(1.92) |
13.1(2.9) |
12.32(2.77) |
12.66(2.7) |
|
WW (kg) |
30.42(6.35) |
28.5(5.09) |
29.05(4.75) |
30.6(5.63) |
28.24(5.16) |
29.36(5.4) |
|
W6 (kg) |
43.04(9.58) |
40.81(9.91) |
40.55(9.47) |
41.38(9.18) |
41.64(10.88) |
41.48(9.8) |
|
HG6 (cm) |
78.32(6.74) |
65.34(6.66) |
79.72(4.99) |
78.06(6.2) |
77.03(7.2) |
75.69(6.36) |
|
BL6 (cm) |
66.35(4.73) |
65.44(7.28) |
62.88(3.62) |
64.88(5.13) |
63.81(4.87) |
64.67(5.13) |
|
HT6 (cm) |
66.94(4.68) |
76.91(4.16) |
66.66(4.56) |
65.31(4.9) |
64.34(5.01) |
68.03(4.66) |
|
W9 (kg) |
52.04(6.95) |
53.69(9.97) |
52.42(7.41) |
52.5(5.87) |
51.38(8.82) |
52.41(7.8) |
|
W12 (kg) |
56.11(10.08) |
58.25(11.04) |
56.42(10.81) |
55.21(9.47) |
52.88(12.5) |
55.77(10.78) |
|
تعداد نتاج |
33 |
31 |
31 |
31 |
31 |
157 |
BW: وزن تولد، W1: وزن یک ماهگی، WW: وزن شیرگیری، W6: وزن شش ماهگی، HG6: دور سینه در شش ماهگی، BL6: طول بدن در شش ماهگی، HT6: ارتفاع جدوگاه در شش ماهگیW9: وزن نه ماهگی و W12: وزن دوازده ماهگی.
BW: Birth weight, W1: Live body weight at one month of age, WW: Weaning weight, W6: Live body weight at six months of age, HG6: Heart girth circumference at six months of age, BL6: Body length at 6 months of age, HT6: Wither height at six months of age, W9: Live body weight at 9 months of age, W12: Live body weight at 12 months of age.
از تمامی پنج والد نر و نتاجشان از طریق رگ گردن و به وسیلهی لولههای خلاء حاوی EDTA خونگیری بهعمل آمد. نمونههای خون بلافاصله روی یخ برده شد و به آزمایشگاه انتقال یافتند. استخراج DNAاز خون کامل با استفاده از یک روش استخراج نمکی[1] تغییر یافته انجام گردید. براساس نقشه ژنتیکی نشانگرهای ریزماهوارهای[2] گوسفند(http://rubens.its.unimelb.edu.au/%7Ejillm/jill.htm)، 6 نشانگر ریزماهواره انتخاب گردیدند (جدول2).
جدول 2- مشخصات کلی نشانگرهای ریزماهوارهای به کار گرفته در پژوهش کنونی.
Table 2- Characteristics of the microsatellites markers used in this study.
|
ردیف نشانگر |
نام نشانگر
|
اندازهی مورد انتظار *(bp) |
موقعیت نشانگر** (cM) |
متوسط تعداد باز دو آغازگر (F&R) |
متوسط دمای ذوب ( ) |
|
Marker row |
Marker name |
Expected size (bp)* |
Marker location (cM) |
Average number of primers base pairs (F & R) |
Average melting temperature ( ) |
|
P1 |
INRA011 |
203-239 |
200.6 |
24 |
64.4 |
|
P2 |
MCM137 |
63-111 |
221.7 |
23 |
60.7 |
|
P3 |
MCM130 |
131-159 |
244.5 |
21 |
61.1 |
|
P4 |
LSCV105 |
228-278 |
254 |
24 |
56.9 |
|
P5 |
MAF4 |
260-288 |
279.5 |
22 |
62.1 |
|
P6 |
DIK5034 |
173 |
304.5 |
20 |
58.3 |
*Base pair (جفت باز)، **موقعیت نشانگر روی کروموزوم شماره 1 گوسفند.
ریزماهوارههای انتخاب شده با استفاده از واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) تکثیر شدند. در جدول 3 اجزاء مخلوط واکنش، مقدار و غلظت نهایی آنها در واکنش ارائه شده است.
جدول 3- تکثیر DNA در مخلوط واکنش PCR.
Table 3- DNA amplification in 20 microliter volume of the PCR reaction.
|
غلظت نهایی در واکنش |
مقدار |
غلظت |
مواد واکنش |
|
Final concentration in reacion |
Amount |
Concentration |
Reaction reagents |
|
1X |
2 |
10X |
PCR Buffer |
|
0.2 |
0.4 |
10 |
DNTPs |
|
0.32 |
1.3 |
5 |
Primer mix |
|
1 |
0.1 |
5 |
Taq DNA polymerase |
|
1.5 |
0.6 |
5 |
Mgcl2 |
|
- |
11.85 |
- |
ddH2O |
|
ng 50 |
3 |
ng 16.6 |
DNA |
مراحل واسرشتهسازی اولیه، واسرشتهسازی، اتصال آغازگر به رشتهی الگو و بسط توسط پلی مراز و همچین تعداد چرخههای به کار رفته در آزمایش که در یک دستگاه ترموسایکلر اپندورف و با برنامهی TouchDown انجام شدند، در جدول 4 آمده است. مزیت استفاده از روش Touch Down این است که به دلیل آن که دمای اتصال پرایمرهای مورد استفاده در این آزمایش با یکدیگر متفاوت بودند، از یک دامنهی دمای اتصال پرایمر به رشته الگو استفاده گردید. این کار تا حدودی از ایجاد نوارهای غیراختصاصی می کاهد، این نوارها در چرخههای عادی PCR باعث بروز مشکلاتی در امتیازبندی میشوند (Don et al, 1991). محصولات PCRروی ژل پلیاکریلآمید 6% واسرشتهساز، الکتروفورز شدند و باندها با رنگآمیزی با نیترات نقره، قابل مشاهده شدند.
در مرحله اول، پنج والد نر برای هر 6 نشانگر تعیین ژنوتیپ شدند. با توجه به ماهیت طرح آزمایشی، از والدهای ماده خونگیری بهعمل نیامده بود، لذا این والدین برای نشانگرهای فوق تعیین ژنوتیپ نشدند. از میان 6 نشانگری به کار رفته در این پژوهش نشانگر DIK5034هیچ تکثیری نداد و پنج نشانگر دیگر یعنی INRA011، MCM137، MCM130، LSCV105، MAF4 تکثیر شدند که از این میان نرهای اول و چهارم روی نشانگر 1، نرهای اول، دوم، سوم و پنجم روی نشانگر2، نرهای سوم و چهارم روی نشانگر 3، نرهای اول، دوم، سوم و چهارم روی نشانگر 4 و نرهای اول، دوم، سوم و چهارم روی نشانگر 6 هتروزیگوت بودند. سپس تمامی نتاج مربوط، برای این نشانگرها تعیین ژنوتیپ شدند.
جدول 4- برنامهی Touch Down برای واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR).
Table 4-Touch Down program for polymerase chain reaction (PCR).
|
نام مرحله Cycle step |
مدت زمان مرحله (دقیقه) Time (minute) |
دما Temperature |
تعداد چرخه Number of cycles |
|
واسرشتهسازی اولیه Initial denaturation |
5 |
94 |
- |
|
واسرشتهسازی Denaturation |
1 |
94 |
|
|
اتصال آغازگر به رشتهی الگو Annealing to the DNA template |
1 |
62- 56 |
7 |
|
بسط توسط پلیمراز Extension by polymerase |
2 |
72 |
|
|
واسرشتهسازی Denaturation |
1 |
94 |
|
|
اتصال آغازگر به رشتهی الگو Annealing to the DNA template |
1 |
56 |
30 |
|
بسط توسط پلیمراز Extension by polymerase |
2 |
72 |
|
|
بسط نهایی Final extension |
10 |
72 |
- |
|
نگهداری Storage |
- |
4 |
- |
این کار برای تشکیل فایل ژنوتیپی الزامی بود. برای تشخیص QTLدر یک طرح خانواده ناتنی باید QTL حداقل در یکی از خانوادهها تفرق حاصل نماید. از 5 خانوادهای انتخاب شدهQTL در هر 5 خانواده تفرق پیدا کرد. بطور کلی برای اینکه یک والد اطلاعات مفیدی برای آنالیز QTLفراهم نماید باید هم در جایگاه QTL و هم در جایگاه نشانگر هتروزیگوت باشد (Esmailizadeh et al, 2008).
در این پژوهش، جنسیت، سال تولد، سن مادر و تیپ تولد به عنوان اثرات ثابت در نظر گرفته شدند. اثرات ثابت مدل آماری برای تصحیح صفات فنوتیپی شامل جنسیت، سال تولد، سن مادر و تیپ تولد مورد استفاده قرار گرفتند. همچنین، صفت وزن میش هنگام زایش بهعنوان متغیر کمکی در نظر گرفته شد. آنالیز دادهها با استفاده از نرمافزار آنلاینGridQTL و در دو مرحله صورت گرفت (Seaton et al, 2006). در ابتدا هر یک از خانوادهها به صورت مجزا مورد آنالیز قرار گرفتند و در مرحله ی بعد برای دقت بیشتر، آنالیز بر روی کلیهی خانوادهها (پنج خانواده) انجام گردید. پس از استنباط هاپلوتیپهای به ارث رسیده از طریق والد نر، از روش نقشهیابی درون فاصلهای مبتنی بر رگرسیون ساده برای آنالیز QTL استفاده گردید (Knott et al,1996). درون هر خانوادهی ناتنی، وجود QTL در فواصل cM1 در طول کروموزوم، برازش گردید و آستانههای معنیدار کروموزومی[3] در سطوح 5% و 1% با استفاده از روش آزمون تبدیل[4] محاسبه شدند (Churchill and Doerge,1996). برای تعیین فاصله اطمینان تقریبی برای موقعیت های QTL شناسایی شده، از یک روش بوت استراپ که نوعی نمونه گیری از جمعیت با جایگزینی است استفاده شد (Visscher et al, 1996).
نتایج و بحث
خلاصهی نتایج آنالیز QTL در حالتی که خانواده های دوم، سوم و چهارم بطور مجزا مورد آنالیز قرار گرفت در جدول 5 آورده شده است. در خانواده دوم، QTL معنی دار (05/0>P) مربوط به صفت وزن یک ماهگی (W1) در موقعیت 6/210 سانتیمورگان، در خانواده سوم، QTL معنی دار (05/0>P) مربوط به صفات وزن یک ماهگی (W1)، و وزن شیرگیری (WW) به ترتیب در موقعیت های 6/252 و 6/223 سانتیمورگان و در خانوادهی چهارم، QTL معنی دار (01/0>P) مرتبط با وزن یک ماهگی (W1) در موقعیت 6/254 سانتیمورگان شناسایی شدند. نزدیکترین نشانگرها به این QTL صفات فوق به ترتیب نشانگرهای INRA011، MCM137 و LSCV105 بودند. در بین QTL های شناسایی شده مربوط به W1 در خانواده چهارم و صفت WW در خانواده سوم به ترتیب با اثرات 25 و 24 بیشترین سهم از میانگین این صفات در خانواده های ذکر شده را پوشش داده اند. از طرف دیگر QTL شناسایی شده WW در خانواده 3 و W1 در خانواده 2 به ترتیب با 71/6 و 48/5 بیشترین اثر را به خود اختصاص دادند.
در مرحلهی آخر، یک آنالیز نهایی (جدول 6) بر روی تمامی خانوادهها بهمنظور تخمین دقیقتر موقعیت QTL بر روی کروموزوم 1 انجام گردید. به منظور برآورد دقیق تر موقعیت QTL روی کروموزوم 1 در جمعیت مورد بررسی، آنالیز همزمان روی داده های حاصل از تمام خانواده ها انجام گردید. نتایج حاکی از مکانیابی QTLبرای صفت وزن یک ماهگی(W1) در فاصله موثر صفت مورد بررسی 6/254 سانتی مورگان در سطح (05/0P<) بود (جدول 6 و شکل 1) که با نشانگر LSCV105 پیوستگی دارد.
جدول 5- خلاصهی نتایج آنالیزQTL در خانوادههای دوم، سوم و چهارم (به تفکیک) روی کروموزوم شماره 1 گوسفند لری بختیاری.
Table 5- Summary of QTL analysis results for families 2, 3 and 4 on chromosome1 of Lori-Bakhtiari sheep.
|
صفت |
موقعیت (cM) |
فاصلهی اطمینانa |
خانواده |
اثر QTLهای پدری (S.E) |
اثرات QTLb
|
آماره F |
نشانگرc |
|
Trait |
Location (cM) |
Confidence interval |
Family |
QTL Sire allele effect (S.E.) (kg) |
QTL effectsb |
F statistics |
Marker c |
|
W1 |
210.6 |
- |
2 |
5.48(1.87) |
11.2 |
*8.56 |
INRA011 |
|
W1 |
252.6 |
285.6-211.6 |
3 |
2.43(0.77) |
14 |
*9.79 |
LSCV105 |
|
WW |
223.6 |
- |
3 |
6.71(2.28) |
24 |
*8.62 |
MCM137 |
|
W1 |
254.6 |
214.6-274.6 |
4 |
4.49(1.12) |
25 |
**19.27 |
LSCV105 |
aفاصلهی اطمینان 95% برای موقعیت QTL براساس آزمون بوت استراپ بر حسب سانتیمورگان، bاثر QTL بهصورت درصدی از میانگین صفت، cنزدیکترین نشانگر به QTL، * و ** به ترتیب اثر معنیدار QTL در سطح 5 و 1 درصد در سطح کروموزوم.
aConfidence interval (cM) of the QTL location based on bootstrap resampling, bQTL effect as percentage of the trait mean, c closest marker to the QTL location, *, ** significance of QTL effect at chromosome-wide 5 and 1% levels.
این QTL اثری بین 78/5% (در خانواده 1) تا 3/15% (در خانواده 5) از این صفت را پوشش می دهد. با انجام آنالیز انفرادی روی خانوادهها، QTLمرتبط با صفات W1 و WWبر روی کروموزوم 1 یافت شد ولی با انجام آنالیز کامل خانواهها (به طور توأم) اثر QTL برای صفت WWمعنی دارنشد و در مجموع در هر دو مرحله آنالیز صورت گرفته، یک QTL مرتبط با صفت وزن یک ماهگی (W1) در جمعیت گوسفند نژاد لری بختیاری بر روی کروموزوم 1 یافت شد. محتملترین موقعیت QTL در هر دو مرحلهی آنالیز تقریباً ثابت بود که در هر مرحله فواصل اطمینان متفاوتی بهدست آمده است. نتایج مرحلهی آخر آنالیز که شامل کلیهی خانوادهها بود، قابلیت اعتماد بیشتری دارد.
جدول 6- خلاصهی نتایج آنالیز QTL روی کلیهی خانوادههای مورد مطالعه.
Table 5- Summary of QTL analysis results for all of the studied families.
|
صفت |
موقعیت (cM) |
فاصلهی اطمینانa |
خانواده |
اثر QTL های پدری(S.E) |
اثرات QTLb |
آماره F |
نشانگرc |
|
Trait |
Location (cM) |
Confidence interval |
family |
QTL Sire allele effect (S.E.) (kg) |
QTL effectsb |
F statistics |
Marker c |
|
W1 |
254.6 |
200.6-263.6 |
1 |
0.97(1.18)Kg |
5.78 |
*2.99 |
LSCV105 |
|
W1 |
254.6 |
200.6-263.6 |
2 |
1.17(1.03)Kg |
6.97 |
*2.99 |
LSCV105 |
|
W1 |
254.6 |
200.6-263.6 |
3 |
1.17(1.81)Kg |
6.97 |
*2.99 |
LSCV105 |
|
W1 |
254.6 |
200.6-263.6 |
4 |
1.23(4.23)Kg |
7.33 |
*2.99 |
LSCV105 |
|
W1 |
254.6 |
200.6-263.6 |
5 |
2.58(1.91)Kg |
15.3 |
*2.99 |
LSCV105 |
aفاصلهی اطمینان 95% برای موقعیت QTL براساس آزمون بوت استراپ بر حسب سانتیمورگان، bاثر QTL بهصورت درصدی از میانگین صفت، cنزدیکترین نشانگر به QTL، * و ** به ترتیب اثر معنیدار QTL در سطح 5 و 1 درصد در سطح کروموزوم.
aConfidence interval (cM) of the QTL location based on bootstrap resampling, b QTL effect as percentage of the trait mean, c closest marker to the QTL location, *, ** significance of QTL effect at chromosome-wide 5 and 1% levels.
با توجه به اینکه صفات مورد مطالعه در این تحقیق با یکدیگر همبستگی بالایی دارند و همگی صفات مربوط به رشد میباشند، میتوان نتیجه گرفت که احتمالاً ژن یا ژنهایی در این ناحیه از ژنوم قرار دارند که با رشد در مراحل مختلف زندگی در گوسفند نژاد لری بختیاری مرتبط میباشند. در پژوهش های پیشین بر روی کروموزوم 1 گوسفند، QTLمرتبط با رشد و صفات لاشه شناسایی شدهاند. در پژوهشی Esmailizadeh (2010) QTL معنی دار موثر بر صفت وزن تولد را روی کروموزوم های 1، 3 و 6 در گوسفند کرمانی شناسایی کرد. نتایج پژوهش Kmiec (1999) نشان داد که ژن ترانسفرین روی کروموزوم 1 روی صفت رشد تأثیرگذار بوده است. در پژوهش دیگری با استفاده از یک جمعیت گوسفند مربوط به دو نژاد سافولک و تکسل، ارتباط بخشهایی از ژنوم گوسفند را با صفات رشد و لاشه مورد بررسی قرار داده و تعدادی QTL مؤثر بر این صفات شناسایی شده است.
شکل 1- نتایج آزمون تبدیل در سطوح 5% و 1% برای صفت W1 درآنالیز انفرادی برروی خانوادههای دوم، سوم، چهارم وبه صورت توأم درتمام خانوادهها.
Figure 1- Permutation test results for the individual (2, 3 and 4 families) and across families’ analyses on 5% and 1% significant levels obtained for W1.
در این مطالعه QTL های مؤثر بر صفت رشد بر روی کروموزوم های 1، 2، 3، 4، 5، 6، 11، 18و 20 قرار داشتند که در نژاد سافولک تعداد QTLمؤثر بر صفات عمق ماهیچه، عمق ماهیچه تصحیح شده برای وزن زنده و وزن بدن در 20 هفتگی به ترتیب در موقعیتهای 226، 223 و 306 سانتی مورگان روی کروموزوم 1 شناسایی شده اند. در مطالعه (Raadsma et al, 2009) دو QTLمؤثر روی وزن بدن در 43 هفتگی و 83 هفتگی به ترتیب در موقعیتهای 117 و 357 سانتی مورگان روی کروموزوم 1 و در نزدیکی نشانگرهای BM4129 و BMS1789 و سه QTL مؤثر بر سرعت رشد از تولد تا 43 هفتگی، 43 هفتگی تا 56 هفتگی و 56 هفتگی تا 83 هفتگی به ترتیب در موقعیتهای 118، 357 و 357 سانتی مورگان روی کروموزوم یک به ترتیب در نزدیکی نشانگرهای BM4129و BMS1789شناسایی شده است. QTLشناسایی شده برای وزن یک ماهگی نژاد لری-بختیاری در پژوهش حاضر در دامنه این QTL های گزارش شده قرار داشت (جدول 6).
نتایج این پژوهش نشان داد که QTL شناسایی شده در تمامی خانوادهها تفرق حاصل نمی کرد که این موضوع بیانگر ماهیت جوامع دامی است که متفاوت از جمعیتهای خالص میباشند. نتایج این پژوهش حاکی از عدم تفرق QTL های شناسایی شده در تمامی خانواده های مورد بررسی است (جدول 5) که با توجه با ماهیت ناخالص بودن جمعیت های دامی، این موضوع قابل توجیه است. چرا که برخلاف جمعیت های خالص (مانند لاین های گیاهی خالص شده)، در جمعیت های ناخالص امکان عدم تفرق QTLها در برخی از خانواده ها وجود دارد. علاوه براین، کاهش میزان اطلاعات مفید نشانگرها[5] (IC) میتواند ناشی از فقدان نشانگرهای دارای اطلاعات مفید در یک یا چند خانواده باشد که در این صورت ژنوتیپ احتمالی نشانگر با توجه به ژنوتیپ نشانگرهایی که در فاصلهی دورتری قرار دارند، استنباط شده است. عواملی همچون تعداد افراد فاقد ژنوتیپ و عدم تساوی تفرق آللهای مختلف نشانگر میتوانند بر IC تأثیر بگذارد (Esmailizadeh et al, 2008). از آنجا که این پژوهش در داخل یک نژاد (نه یک جمعیت آمیخته حاصل از تلاقی نژادها) انجام شده است، لذا نتایج این پژوهش میتوانند در برنامههای اصلاح نژادی گوسفند لری بختیاری به کار گرفته شوند که مزیت آن افزایش پیشرفت ژنتیکی خواهد بود. زمانی که از تلاقی بین نژادهای مختلف برای تشکیل جمعیت نقشه یابی استفاده می شود، چون آمیخته های حاصل از نژادهای مورد استفاده در نسل والدین برای تعیین ژنوتیپ به کار می روند، امکان ردیابی QTL شناسایی شده و انتساب آن به یکی از نژادهای مورد استفاده وجود ندارد اما در طرح هایی که از یک نژاد استفاده می شود با اطمینان می توان از QTL شناسایی شده در جهت اهداف اصلاحی در نژاد مورد نظر استفاده کرد.
اگرچه در این پژوهش، روش آنالیز پیوستگی برای تحلیل مولکولی صفات کمی مورد استفاده قرار گرفت، اما با توجه به پیشرفتهای جدید در فنآوری DNA بخصوص ایجاد نقشه ژنتیکی متراکم مبتنی بر چندشکلیهای تک نوکلئوتیدی[6]و تکنیکهای آماری جدید مانند روشهای مبتنی بر عدم تعادل پیوستگی[7]، امکان تحلیل دقیقتر صفات کمی و توسعه آزمونهای مختلف ژنتیکی مرتبط با صفات کمی دارای مکانیسم توارثی پیچیده، بوجود آمده است. مزیت مهم روش LD این است که نیاز به طرح آزمایشی از پیش تعیین شده نداشته و مبتنی بر عدم تعادل موجود در جمعیت بوده و میتوان از حیواناتی که بطور معمول در برنامههای اصلاح نژادی تعیین فنوتیپ میشوند، استفاده نمود. لذا پیشنهاد میشود که در پژوهش های آینده از این فنآوریها برای نقشهیابی QTL در نژاد لری بختیاری استفاده گردد.
منابع
Asadi-Khoshoei E (1999). Estimation of genetic and environmental parameters and production traits in sheep to determine the appropriate selection criterion Lori-Bakhtiari. Ph.D Thesis. Faculty of Agriculture, TarbiatModarres University, Tehran (In Farsi).
Cockett NE, Jackson SP, Snowder GD, Shay TL, Berghmans S, Beever JE, Carpenter C, Georges M )1996(. Polar over dominance at the callipyge locus in sheep. Science 273: 236-238.
Doerge RW, Churchill GA (1996). Permutation test for multiple loci affecting a quantitative character. Genetics 142: 285-294.
Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Mattick JS (1991). Touch down PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Research 19: 4008.
Esmailizadeh A, Mohammadabadi MR, Asadi-Fozy (2008). Mapping genomic regions controlling quantitative traits in domestic animals using simple regression. Iranian Journal of Animal Science 39: 93-83 (In Farsi).
Esmailizadeh, AK (2010). A partial genome scan to identify quantitative trait loci affecting birthweight in Kermani sheep. Small ruminant research 94: 73-78.
Falconer DS, Mackay TFC (1996). Introduction to Quantitative genetics. Ed. Longman, 4 Ed. Chap. 21.
Freking BA, Murphy SK, Wylie AA, Rhodes SJ, Keele JW, Leymaster KA, Jirtle RL, Smith TPL (2002). Identification of the single base change causing the Callipyge muscle hypertrophy phenotype, the only known example of polar over dominance in mammals. Genome Research 12: 1496-1506.
Javanmard A, Mohammadabadi MR, Zarrigabayi GE, Gharahedaghi AA, Nassiry MR, Javadmansh A, Asadzadeh N (2008). Polymorphism within the intron region of the bovine leptin gene in Iranian Sarabi cattle (Iranian Bos taurus). Russian Journal of Genetics 44: 495-497.
Khodabakhshzadeh R, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh Koshkoieh A, Moradi-Shahrebabak H, Ansari Namin S (2015a). Study of mutations available in first-halfexon 2 of GDF9 gene in crossbred sheep born from crossing of Romanov rams with Kermani ewes. Iranian Journal of Animal Science Research 6: 395-403 (In Farsi).
Khodabakhshzadeh R, Mohammadabadi MR, Moradi H, Esmailizadeh AK, Ansari NS (2015b). Identify of G―›A point mutation at positions 477 and 721 in exon 2 of GDF9 gene in Kermani sheep. Modern Genetics 10: 261-268 (In Farsi).
Khodabakhshzadeh R, Mohammadabadi MR, Moradi-Shahrebabak H, Esmailizadeh Koshkoieh A (2016a). Identification of available mutations in the first-half (from 5’ end) of exon 2 of GDF9 gene in crossbred sheep from crossing of Romanov and Lori-Bakhtiari breeds. Animal Production Research 4: 15-26 (In Farsi).
Khodabakhshzadeh R., Mohammadabadi MR, Esmailizadeh Koshkoieh A, Moradi-Shahrebabak H, Bordbar F, Ansari Namin S (2016b). Identification of point mutations in exon 2 of GDF9 gene in Kermani sheep. Polish Journal of Veterinary Sciences 19: 281–289.
Kmiec M (1999). Transferrin Polymorphism venus Growth Rate in Lambs, Polish Long-wool Sheep. II. Analysis of relation between transferrin polymorphism of lamb blood serum versus growth rate of lambs up to age of 5 months. Archiv Fur Tierzucht, 42: 469-480.
Knott SA, Elsen JM, Haley CS (1996). Methods for multiple-marker mapping of quantitative trait loci in half-sib populations. Theoretical and Applied Genetics, 93: 71-80.
McRae AF, Bishop SC, Walling GA, Wilson AD, Visscher PM (2005). Mapping of multiple quantitative trait loci for growth and carcass traits in a complex commercial sheep pedigree. Animal Science, 80: 135-141.
Mohammadabadi MR, Sattayimokhtari R (2013). Estimation of (co) variance components of ewe productivity traits in kermani sheep. Slovak Journal of Animal Science 46: 45-51.
Mousavizadeh A, Mohammadabadi MR, Torabi A, Nassiry MR, Ghiasi, Esmailizadeh AK (2009). Genetic polymorphism at the growth hormone locus in Iranian Talli goats by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP). Iranian Journal of Biotechnology 7: 51-53.
Raadsma HW, Thomson PC, Zenger KR, Lam MK, Jonas E, Cavanagh C, Jones M,Attard G, Palmer D, and Nicholas FW (2009). Mapping quantitative trait loci (QTL) in sheep. I. A new male framework linkage map and QTL for growth rate and body weight. Genetics Selection Evolution, 22: 41-45.
Seaton G, Hernandez J, Grunchec JA, White I, Allen J, De Koning DJ, Knott S (2006, August). GridQTL: a grid portal for QTL mapping of compute intensive datasets. In Proceedings of the 8th world congress on genetics applied to livestock production (Vol. 2006, p. 27). Belo Horizonte Brazil.
Soufy B, Mohammadabadi MR, Shojaeyan K, Baghizadeh A, Ferasaty S, Askari N, Dayani O (2009). Evaluation of Myostatin gene polymorphism in Sanjabi sheep by PCR-RFLP method. Animal Science Reserches 19: 81-89 (In Farsi).
Visscher PM, Thompson R, Haley CS (1996). Confidence intervals in QTL mapping by bootstrapping. Genetics, 143: 1013-1020.
Walling GA, Visscher PM, Willson AD, McTeir BL, Simm G, Bishop SC (2004). Mapping of quantitative trait loci for growth and carcass traits in commercial sheep populations. Journal of Animal Science, 82: 2234-2245.
Weller JI (2001). Quantitative trait loci analysis in animals. CABI Publishing, London.
Zamani P, Akhondi M, Mohammadabadi MR (2015). Associations of Inter-Simple Sequence Repeat loci with predicted breeding values of body weight in sheep. Small Ruminant Research 132: 123-127.
Mapping loci affecting live weight and body size in Lori-Bakhtiari sheep using paternal half-sib design and identification of biomarkers linked to growth rate
Asadi-khoshoei E.1, Horiat R.2, Houshmand S.3, Esmailizadeh A.4*
1 Asistant Professor, Department of animal Science, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, Shahrekord, Iran.
2 Graduate M. Sc. degree, Department of animal Science, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, Shahrekord, Iran.
3 Professor, Department of Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, Shahrekord, Iran.
4 Professor, Department of animal Science, Faculty of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.
Abstract
The aim of this study was to map loci affecting live weight and body size in Lori-Bakhtiari sheep and identification of biomarkers linked to growth rate in sheep. Quantitative trait loci (QTL) linkage analysis in a Lori-Bakhtiari sheep population was conducted using the regression-based interval mapping method. The mapping population consisted of 162 animals related to 5 paternal half families. Phenotypic data were measurements of birth weight (BW), weight at one month of age (W1), weaning weight (WW), weight at six months of age (W6), chest circumference (HG6), body length (BL6), wither height at six months of age (HT6), weight at nine months of age (W9) and yearling weight (W12). Five sires and their progeny were genotyped for microsatellite markers in a candidate region on sheep chromosome 1. Data were analyzed in two phases, individual family analysis and combined family’s analysis using a single-QTL model. Analysis based on individual families revealed QTL related to W1 (210.6 cM), near INRA011 marker segregating in the second family. In the third family, QTL affecting W1 and WW were identified at 252.6 and 223.6 cM, nearby MCM137 and LSCV105 markers, respectively. In addition, in the fourth family, a QTL underlying W1 was detected at 256.6 cM near LSCV105 marker. Combined analysis of all the families resulted to the identification of a QTL associated with W1 at position 254.6 cM relative to the centromere near the LSCV105 marker. There were two strong candidate genes close to the location of the detected QTL, the transferrin and PIT1 genes, thus these genes may account for the observed QTL effects for growth traits in Lori-Bakhtiari sheep.
Keywords: Growth traits, Sheep, half-sib family, microsatellite markers, QTL.
* نویسنده مسئول: علی اسمعیلی زاده تلفن: 0939552973 Email: aliesmaili@uk.ac.ir
1- Salting-out
2- Microsatellite marker
[3] Chromosome wide threshold
[4] Permutation Test
[5] Information Content
1- SNPs
-Linkage Disequilibrium (LD)2
* Corresponding Author: Esmailizadeh, A. Tel: 09395529730 Email: aliesmaili@uk.ac.ir
)
